Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Test hydrolazy trifosforanu nukleozydów w Toxoplasm gondii i Neospora caninum do wysokoprzepustowych badań przesiewowych przy użyciu ramienia robota

814 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62874

⸱

22 lipca 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Education and Research Center for Pharmaceutical Sciences, Faculty of Pharmacy, Osaka Medical and Pharmaceutical University, 2Independent Scholar, Tokyo, Japan, 3Division of Functional Genomics and Therapeutic Innovation, Research Center for Advanced Genomics, Graduate School of Biomedical Sciences, Nagasaki University, 4School of Chemistry, Chemical Engineering and Life Sciences, School of Materials and Engineering, Wuhan University of Technology, 5Data Science Center, Jichi Medical University, 6Department of Cardiovascular Medicine, The Cardiovascular Institute, 7Department of Immunology and Parasitology, University of Occupational and Environmental Health, 8Division of Cardiology and Metabolism, Center for Molecular Medicine, Jichi Medical University, 9Department of Cardiovascular Medicine, Graduate School of Biomedical Sciences, Nagasaki University Hospital

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Infekcje Toxoplasma gondii i Neospora caninum występują u ludzi i zwierząt i prowadzą do poważnych problemów zdrowotnych. Te dwa pasożyty mają podobne hydrolazy trifosforanu nukleozydów i odgrywają ważną rolę w rozmnażaniu i przetrwaniu. Opracowaliśmy wysokiej jakości test enzymów wymagających użycia ramienia robota.

Streszczenie

Pasożytnicze pierwotniaki infekują ludzi i wiele zwierząt stałocieplnych. Toxoplasma gondii, główny pasożyt pierwotniakowy, jest powszechnie spotykany u pacjentów zakażonych wirusem HIV, biorców przeszczepów narządów i kobiet w ciąży, powodując poważną chorobę, toksoplazmozę. Inny główny pierwotniak, Neospora caninum, który wykazuje wiele podobieństw do Toxoplasma gondii, powoduje poważne choroby u zwierząt, podobnie jak zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego oraz zapalenie mięśni i wielokorzeniowe zapalenie u psów i krów, powodując martwe cielęta. Wszystkie one wykazywały podobne hydrolazy trifosforanu nukleozydów (NTPaza). Neospora caninum ma NcNTPazę, podczas gdy Toxoplasma gondii ma TgNTPazę-I. Uważa się, że enzymy odgrywają kluczową rolę w rozmnażaniu i przetrwaniu. W celu ustalenia związków i/lub ekstraktów zapobiegających zakażeniu pierwotniakami, skupiliśmy się na tych enzymach w celu odkrycia leków. Kolejnym krokiem było opracowanie nowatorskiego, bardzo czułego i bardzo dokładnego testu poprzez połączenie konwencjonalnego testu enzymatycznego z testem fluorescencyjnym w celu określenia zawartości ADP. Potwierdziliśmy również, że nowy test spełnia kryteria umożliwiające przeprowadzenie wysokoprzepustowych badań przesiewowych (HTS) w dwóch enzymach pierwotniaków. Przeprowadziliśmy HTS, zidentyfikowaliśmy 19 związków i sześć ekstraktów odpowiednio z dwóch bibliotek związków syntetycznych i biblioteki ekstraktów pochodzących z bakterii morskich. W niniejszym opracowaniu przedstawiono szczegółowe wyjaśnienie, w jaki sposób przeprowadzać HTS, w tym informacje na temat przygotowania odczynników, urządzeń, ramienia robota itp.

Wprowadzenie

Robotyka została uznana za wyrafinowane i potężne narzędzia do osiągania znaczących przełomów w różnych dziedzinach poza przemysłem i inżynierią produkcji, takich jak biochemia, biologia molekularna i badania kliniczne, a zwłaszcza HTS1,2,3. Toxoplasma gondii jest głównym pasożytem i jednokomórkowym pasożytnictwem eukariontów4, który powoduje poważne problemy zdrowotne u ludzi5 i wielu zwierząt homeotermicznych4, powodując infekcje prowadzące do toksoplazmozy, szczególnie ciężkiego stanu u pacjentów z AIDS6, biorcy przeszczepów narządów7 i kobiety w ciąży8. Neospora caninum należąca do gromady Apicomplexa9 zakaża głównie psy i krowy6, co skutkuje zapaleniem mózgu i rdzenia kręgowego oraz zapaleniem mięśni i wielokorzeniowym zapaleniem u psów10,11 i aborcją u krów12,13. Co więcej, Neospora caninum wykazuje morfologiczne i filogenetyczne bliskie podobieństwa do Toxoplasma gondii9,14. Dodatkowo posiadają hydrolazę trifosforanu nukleozydów (NTPazę; EC3.6.1.15)14. Enzymy te znacznie różnią się od konwencjonalnych ekto-ATPazy14. Pasożyty te wytwarzają znaczną ilość białek NTPazy, 2%-8% całkowitego białka i odgrywają ważną rolę jako uśpione enzymy w swoim stadium tachyzoitu15. Należy zauważyć, że w gęstych granulkach wydzielniczych są one skondensowane16 i wydzielane do parazytoforycznej wakuoli16. Jako biochemiczna cecha enzymatyczna, NTPaza jest aktywowana przez ditiotreitol17. Przewiduje się, że induktory, takie jak związek ditiolu, niezidentyfikowany enzym, taki jak oksydoreduktaza ditiolowo-dwusiarczkowa i inny, wykazują ten sam charakter. Nie zostały one jeszcze zidentyfikowane u pasożytów. Jednak enzym ten odgrywa ważną rolę w uwalnianiu tachyzoitu z zakażonych komórek gospodarza17.

Toxoplasma gondii ma dwie izoformy NTPazy18: enzym typu I TgNTPaza-I i enzym typu II TgNTPaza-II18. Ten pierwszy preferencyjnie wykorzystuje nukleozydy trifosforanowe jako substrat18. Ten ostatni hydrolizuje zarówno nukleozydy trifosforanowe, jak i difosforanowe18. Homologia wynosi 97% w poziomach aminokwasów18. Neospora caninum ma również ortologię TgNTPazy-I o nazwie NcNTPase19. Homologia wynosi 73% w poziomach aminokwasów19. Prof. Asai i prof. Harada wygenerowali rekombinanty obu NTPazy za pomocą E. coli i zmienili ich konstytutywnie aktywne mutanty, jak wcześniej informowano20. Uprzejmie obdarowali dwóch aktywnych mutantów. Oba enzymy mogą przekształcać ATP w ADP in vitro20. Niedawno zmierzyliśmy aktywność NTPazy przy użyciu zawartości ADP hydrolizowanej przez enzymy. Wreszcie, udało nam się ustalić test o wysokim standardzie poprzez proces oznaczania zawartości ADP za pomocą kombinacji fluorescencji i reakcji enzymatycznej, jak wcześniej informowaliśmy21,22. Przeprowadziliśmy również badania przesiewowe o wysokiej przepustowości (HTS)22.

To badanie wprowadza szczegółowe procedury nowatorskiego testu o wysokiej dokładności i dynamicznym zakresie21 oraz szczegółowe wyjaśnienie, jak przygotować odczynniki do pomiaru aktywności enzymu i uzyskania intensywności fluorescencji za pomocą ramienia robota do HTS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Ekspresja i oczyszczanie rekombinowanej TgNTPazy-I i NcNTPazy

  1. Przygotuj plazmid ekspresyjny i wprowadź go do E. coli. szczep BL21.
    UWAGA: Szczegółowe informacje na temat konstrukcji i procedur znajdują się w poprzednim raporcie14. W tym badaniu zarówno konstytutywnie aktywne mutanty TgNTPazy-I, jak i NcNTPazy zostały dzięki uprzejmości prof. Asai i prof. Harady.

2. Przygotowanie i umieszczenie biofluorescencyjnego roztworu reakcyjnego na płytce

  1. Przygotować 2x biofluorescencyjny roztwór reakcyjny zgodnie z opisem w Tabeli 1 na 2 ml mieszanki wzorcowej do 400-dołkowego testu w formacie 384-dołkowym.
  2. Przygotować roztwory podstawowe przy użyciu wody destylowanej (DW) dla każdego wskazanego stężenia, z wyjątkiem resazuryny i N-etylomaleimidu. Pozostałe dwa odczynniki rozpuścić w DMSO w odpowiednim stężeniu. Następnie należy przechowywać odczynniki w temperaturze -30 °C do czasu przeprowadzenia eksperymentów.
  3. Dodać 15 μl 2x biofluorescencyjnego roztworu reakcyjnego do każdej z 368 studzienek (format 384 dołków).
    UWAGA: Pierwsza płytka służy jako zbiornik, w którym znajduje się wystarczająca ilość odczynnika do dwukrotnego przeprowadzenia eksperymentów.

3. Umieść związki testowe lub ekstrakty na dnie każdej studzienki na płytce testowej

  1. Umieść 0,5 μl każdego związku na dnie płytki za pomocą ramienia robota z płytki głównej biblioteki, w tym związki testowe.
  2. Dodaj 0,5 μl DMSO zarówno do kontroli ujemnej, jak i dodatniej.

4. Przygotowanie mieszaniny reakcji enzymatycznej i początek reakcji

  1. Przygotować roztwór reakcji enzymatycznej zgodnie z tabelą 2.
  2. Dodać NTPazę (końcowe stężenie wynosi 0,0002 μg/ml) do 50 ml mieszaniny reakcji enzymatycznej, szybko wymieszać i przenieść do plastikowego zbiornika.
  3. Kontynuuj jednoczesne wstrzykiwanie 4,5 μl do każdej studzienki z wyjątkiem linii kontroli ujemnej za pomocą ramienia robota.
  4. Dodać taką samą ilość mieszaniny reakcji enzymatycznej z PBS zamiast enzymu poprzedzonego jednoczesnym wstrzyknięciem.
  5. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 10 minut.

5. Przeprowadzanie pomiarów aktywności enzymatycznej w czasie rzeczywistym za pomocą czytnika mikropłytek

  1. Po 10 minutach inkubacji jednocześnie dodać 5 μl 2x biofluorescencyjnego roztworu reakcyjnego do każdego dołka natychmiast za pomocą ramienia robota.
  2. Tymczasowo zatrzymaj ramię robota, aby przytrzymać roztwór w każdej końcówce nad miejscem, w którym ma zostać umieszczona płytka.
  3. Po umieszczeniu płytki testowej uruchom ponownie ramię robota.
    UWAGA: Aby uniknąć nasycenia generowanego ADP, należy natychmiast zmierzyć intensywność fluorescencji.
  4. Szybko odwiruj (200 x g przez 1 min) płytkę i umieść płytkę w czytniku płytek.
  5. Rozpocznij pomiar fluorescencji w czasie rzeczywistym przy 540 nm/590 nm (wzbudzenie/emisja) co minutę przez 1 godzinę.

6. Analiza wyników

  1. Obliczyć wartości jako średnią ± błędem standardowym średniej (SEM) ze wskazanych i powtórzonych próbek w każdej grupie doświadczalnej; powtórzyć doświadczenia w celu zapewnienia spójności.
  2. Wykonywanie istotności statystycznej przy użyciu testu t-Studenta.
  3. Oblicz wartości jako statystycznie istotne, jeśli wartości P wynoszą P < 0,05.
  4. Obliczać stosunek sygnału do tła (S/B), stosunek sygnału do szumu (S/N) i współczynnik Z', korzystając z następujących wzorów:
    S/B = Średni ligand/Średni pojazd
    S/N = (Średni ligand - Średni pojazd)/Pojazd odchylenia standardowego
    Współczynnik Z' = 1 - (3 x ligand odchylenia standardowego + pojazd odchylenia standardowego)/(Ligand średni - Średni pojazd)
  5. Upewnij się, że współczynnik S/B, S/N i Z' są odpowiednio większe niż 3, 10 i 0,5.
    UWAGA: Potwierdź, czy każdy eksperyment spełnia ogólne kryterium wystarczające do wykonania HTS, jak stwierdzono w poprzednich raportach23,24.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zasada analizy została podsumowana na Ryc. uzupełniającej 1 i opiera się na wcześniejszym raporcie12,18. Analiza została zaprojektowana w formacie 384-dołkowym, co przedstawiono na Ryc. 1. Na płytce unikano używania skrajnych kolumn po prawej i lewej stronie. Dwie kolumny sąsiadujące ze skrajnymi liniami lewą i prawą wykorzystano odpowiednio jako kontrolę negatywną i kontrolę pozytywną, z enzymem lub bez niego (n = 1...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Udało nam się stworzyć nowatorski test o wysokim zakresie dynamiki i dokładności z połączeniem klasycznego testu enzymatycznego i testu fluorescencyjnego dla ADP, który jest produktem końcowym poprzez ATPazę, w tym ATPazę Tg i Nc22. Aby przeprowadzić HTS, ważne jest, aby test miał lepsze wartości czynnika S/B, S/N i Z' niż klasyczny test enzymatyczny15,22. Dodatkowo, pominięcie etapu zatrzymywania reakcji enzymatycznej z kwasem takim jak H...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnego interesu finansowego w tym badaniu.

Podziękowania

Ta praca była częściowo wspierana przez Platformę Odkrywania Leków, Informatyki i Strukturalnych Nauk Przyrodniczych, dotację na badania naukowe (C) od Japońskiego Towarzystwa Promocji Nauki (JSPS-21K06566). Autorzy serdecznie dziękują Asai (Keio University School of medicine) i Haradzie (Kyoto Institute of Technology) oraz Stephenowi Strattonowi za podarowanie rekombinowanych dwóch aktywnych mutantów NTPazy i jego wkład w przygotowanie tego manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
12-stopniowa stacja robocza EDR-384 SXBiotec Co., Ltd.EDR-384SXRamię robota System pipetowania
384 końcówki studniBiotech Co., Ltd.Wykonane na zamówienie
ADP-heksokinazaAsahi Kasei Pharma Co., Ltd.T-92
ATPDrożdże orientalne, Co, Ltd.45140000
BSAWako Pure Chemical Industries, Sp. z o.o.011-15144
Diaphorase-IUnitika Sp. z o.o.Di-1
DMSONacalai Tesch, Inc.13406-55
Dehydrogenaza G6PDrożdże orientalne, Co, Ltd.306-50143
GlukozaWako Pure Chemical Industries, Ltd.049-31165
Greiner 384 studnia mikropłytka niewiążąca płytka płytka #784900
HEPESWako Pure Chemical Industries, Ltd.342-01375
Mg(CH3COO)2Wako Pure Chemical Industries, Ltd.130-00095
NADPDrożdże orientalne, Co, Ltd.44332000
N-etylomaleimidWako Pure Chemical Industries, Ltd.056-02062
PHERAstar FSBMG LABTECH JAPONIA L.t.d.PHERAstar FSWielomodowy czytnik mikropłytek
ResazurinWako Pure Chemical Industries, Ltd.191-07581
Naczynia laboratoryjne konika morskiego 384 Well Zbiorniki niskoprofiloweS30022 25/CS
TrisHClWako Pure Chemical Industries, Ltd.W01COBQE-4120
Triton X-100Nacalai Tesch, Inc.Nr kat. 35501-02

Bibliografia

  1. Bianca, C. B., et al. A robotic platform to screen aqueous two-phase systems for overcoming inhibition in enzymatic reactions. Bioresource Technology. 280, 37-50 (2019).
  2. Aliaksei, V., Jan, D. B. Robot-scientists will lead tomorrow's biomaterials discovery. Current Opinion in Biomedical Engineering. 6, 74-80 (2018).
  3. Mandeep, D., Kusum, P., Dharini, P., Nikolaos, E. L., Pratyoosh, S. Robotics for enzyme technology: innovations and technological perspectives. Applied Microbiology and Biotechnology. 105, 4089-4097 (2021).
  4. Dubey, J. P. Toxoplasmosis of Animals and Man. , CRC Press. Boca Raton, FL, USA. (1988).
  5. Michael, C., Sneller, H., Clifford, L. Infections in the Immunocompromised Host in Clinical Immunology., 3rd ed. , Elsevirer. Amsterdam, The Netherlands. (2008).
  6. Schäfer, G., et al. Immediate versus deferred antiretroviral therapy in HIV-infected patients presenting with acute AIDS-defining events (toxoplasmosis, Pneumocystis jirovecii-pneumonia): A prospective, randomized, open-label multicenter study (IDEAL-study). AIDS Research and Therapy. 16, 34(2019).
  7. Ramanan, P., et al. Toxoplasmosis in non-cardiac solid organ transplant recipients: A case series and review of literature. Transplant Infectious Disease. 26, 13218(2019).
  8. Rivera, E. M., et al. Toxoplasma gondii seropositivity associated to peri-urban living places in pregnant women in a rural area of Buenos Aires province, Argentina. Parasite Epidemiology and Control. 7, 00121(2019).
  9. Donahoe, S. L., Lindsay, S. A., Krockenberger, M., Phalen, D., Šlapeta, J. A review of neosporosis and pathologic findings of Neospora caninum infection in wildlife. International Journal of Parasitology: Parasites and Wildlife. 4, 216-238 (2015).
  10. Crookshanks, J. L., Taylor, S. M., Haines, D. M., Shelton, G. D. Treatment of canine pediatric Neospora caninum myositis following immunohistochemicalidentification of tachyzoites in muscle biopsies. TheCanadian Veterinary Journal. 48, 506-508 (2007).
  11. Bartner, L. R., et al. Testing for Bartonella ssp. DNA in cerebrospinal fluid of dogs with inflammatory central nervous system disease. Journal of Veterinary Internal Medicine. 32, 1983-1988 (2018).
  12. Changoluisa, D., Rivera-Olivero, I. A., Echeverria, G., Garcia-Bereguiain, M. A., de Waard, J. H. Working group "Applied Microbiology" of the School of Biological Sciences and Engineering at Yachay Tech University. Serology for Neosporosis, Q fever and Brucellosis to assess the cause of abortion in two dairy cattleherds in Ecuador. BMC Veterinary Research. 15, 194(2019).
  13. Serrano-Martínez, M. E., et al. Evaluation of abortions spontaneously induced by Neospora caninum and risk factors in dairy cattle from Lima, Peru. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinaria. 28, 215-220 (2019).
  14. Matoba, K., et al. Crystallization and preliminary X-ray structural analysis of nucleoside triphosphate hydrolases from Neospora caninum and Toxoplasma gondii. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 66, 1445-1448 (2010).
  15. Nakaar, V., Beckers, C. J., Polotsky, V., Joiner, K. A. Basis for substrate specificity of the Toxoplasma gondii nucleoside triphosphate hydrolase. Molecular and Biochemical Parasitology. 97, 209-220 (1998).
  16. Pastor-Fernández, I., et al. The tandemly repeated NTPase (NTPDase) from Neospora caninum is a canonical dense granuleprotein whose RNA expression, protein secretion and phosphorylation coincides with the tachyzoite egress. Parasites and Vectors. 9, 352(2016).
  17. Silverman, J. A., et al. Induced activation of the Toxoplasma gondii nucleoside triphosphate hydrolase leads to depletion of host cell ATP levels and rapid exit of intracellular parasites from infected cells. Journal of Biological Chemistry. 273, 12352-12359 (1998).
  18. Olias, P., Sibley, L. D. Functional analysis of the role of Toxoplasma gondii nucleoside triphosphate hydrolases I and II in acute mouse virulence and immune suppression. Infection and Immunity. 84, 1994-2001 (2016).
  19. Leineweber, M., et al. First Characterization of the Neospora caninum Dense Granule Protein GRA9. BioMed Research International. 2017, 6746437(2017).
  20. Krug, U., Zebisch, M., Krauss, M., Sträter, N. Structural insight into activation mechanism of Toxoplasma gondii nucleoside triphosphatediphosphohydrolases by disulfide reduction. Journal of Biological Chemistry. 287, 3051-3066 (2012).
  21. Kumagai, K., Kojima, H., Okabe, T., Nagano, T. Development of a highly sensitive, high-throughput assay for glycosyltransferases using enzyme-coupled fluorescence detection. Analytical Biochemistry. , 146-155 (2014).
  22. Harada, M., et al. Establishment of novel high-standard chemiluminescent assay for NTPase in two protozoans and its high-throughput screening. Marine Drugs. 18, 161(2020).
  23. Kurata, R., et al. Establishment of novel reporter cells stably maintaining transcription factor-driven human secreted alkaline phosphatase expression. Current Pharmaceutical Biotechnology. 19, 224-231 (2018).
  24. Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4, 67-73 (1999).
  25. Nakajima-Nakano, K., Makioka, A., Yamashita, N., Matsuo, N., Asai, T. Evaluation of serodiagnosis of toxoplasmosis by using the recombinant nucleoside triphosphate hydrolase isoforms expressed in Escherichia coli. Parasitology International. 48, 215-222 (2000).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Toxoplasma gondiianaliza enzymatycznaanaliza fluorescencyjnadetekcja ADPposzukiwanie lek wautomatyzacja z wykorzystaniem ramienia robotapierwotniaki paso ytnicze

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.