Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja i selekcja grzybów entomopatogenicznych z próbek glebowych oraz ocena zjadliwości grzybów wobec szkodników owadzich

11.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62882

⸱

28 września 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Entomology, National Chung Hsing University, 2Department of Agricultural biology, Jeonbuk National University, 3Department of Agricultural Convergence Technology, Jeonbuk National University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół oparty na systemie przynęty na mącznika mącznika (Tenebrio molitor), który był używany do izolowania i selekcji grzybów entomopatogenicznych (EPF) z próbek gleby. Skuteczna formuła liczby konidiów (ECN) jest stosowana do wyboru EPF o wysokiej tolerancji na stres w oparciu o cechy fizjologiczne do zwalczania mikrobiologicznego szkodników na polu.

Streszczenie

Grzyby entomopatogeniczne (EPF) są jednym z czynników kontroli mikrobiologicznej w zintegrowanej ochronie przed szkodnikami. Aby zwalczać szkodniki lokalne lub inwazyjne, ważne jest, aby wyizolować i wybrać rodzimy EPF. W związku z tym w tym badaniu zastosowano metodę przynęty glebowej w połączeniu z systemem przynęty na owady (mącznik, Tenebrio molitor) z pewnymi modyfikacjami. Wyizolowany EPF poddano następnie testowi zjadliwości przeciwko agrofagowi rolniczemu Spodoptera litura. Ponadto potencjalne szczepy EPF poddano identyfikacji morfologicznej i molekularnej. Ponadto przeprowadzono test produkcji konidiów i termotolerancji dla obiecujących szczepów EPF i porównano; dane te zostały następnie podstawione do wzoru na efektywną liczbę konidiów (ECN) dla rankingu laboratoriów. System przynęty glebowej i mącznika mącznika oraz formułę ECN można ulepszyć poprzez zastąpienie gatunków owadów i włączenie większej liczby czynników stresowych do oceny komercjalizacji i zastosowania w terenie. Protokół ten zapewnia szybkie i skuteczne podejście do selekcji EPF i poprawi badania nad środkami kontroli biologicznej.

Wprowadzenie

Obecnie, grzyby entomopatogeniczne (EPF) są szeroko stosowane w zwalczaniu mikrobiologicznym szkodników rolniczych, leśnych i ogrodniczych. Zaletami EPF są jego szeroki zakres żywicieli, dobra zdolność adaptacji do środowiska, przyjazny dla środowiska charakter oraz to, że może być stosowany z innymi chemikaliami, aby pokazać synergiczny efekt integrowanej ochrony przed szkodnikami1,2. Do stosowania jako środek do zwalczania szkodników konieczne jest odizolowanie dużej liczby EPF od chorych owadów lub środowiska naturalnego.

Pobieranie próbek tych organizmów od ich gospodarzy pomaga w zrozumieniu geograficznego rozmieszczenia i częstości występowania EPF w naturalnych gospodarzach3,4,5. Jednak zbiór owadów zakażonych grzybami jest zwykle ograniczony przez czynniki środowiskowe i populacje owadów w terenie4. Biorąc pod uwagę, że żywiciele owadów umierają po zakażeniu EPF, a następnie wpadają do gleby, izolacja EPF od próbek gleby może być stabilnym zasobem3,6. Na przykład saprofity są znane z tego, że wykorzystują martwego gospodarza jako zasób do wzrostu. Systemy przynęty glebowej i selektywnego podłoża są szeroko stosowane do wykrywania i izolowania EPF od gleby3,4,7,8,9,10.

W metodzie selektywnej pożywki, rozcieńczony roztwór glebowy jest powlekany na pożywce zawierającej antybiotyki o szerokim spektrum działania (np. chloramfenikol, tetracyklinę lub streptomycynę) w celu zahamowania rozwoju bakterii2,3,9,11. Doniesiono jednak, że metoda ta może zniekształcić różnorodność i gęstość szczepu oraz może spowodować przeszacowanie lub niedoszacowanie wielu społeczności drobnoustrojów6. Ponadto wyizolowane szczepy są mniej chorobotwórcze i konkurują z saprofitami podczas izolacji. Trudno jest wyizolować EPF z rozcieńczonego roztworu glebowego3. Zamiast używać selektywnego podłoża, metoda przynęty glebowej izoluje EPF od zakażonych martwych owadów, które mogą być przechowywane przez 2-3 tygodnie, zapewniając w ten sposób bardziej wydajną i standardową metodę separacji EPF3,4,7,6. Ponieważ metoda jest łatwa w obsłudze, można wyizolować różne szczepy chorobotwórcze przy niskich kosztach4. Dlatego jest szeroko stosowany przez wielu badaczy.

Po porównaniu różnych typów systemów przynęt na owady, Beauveria bassiana i Metarhizium anisopliae są najczęstszymi gatunkami EPF, które występują u owadów należących do Hemiptera, Lepidoptera, Blattella i Coleoptera6,12,13,14. Wśród tych przynęt na owady, Galleria mellonella (rząd Lepidoptera) i Tenebrio molitor (rząd Coleoptera) wykazują wyższe wskaźniki odzysku Beauveria i Metarhizium spp. w porównaniu z innymi owadami. Dlatego G. mellonella i T. molitor są powszechnie stosowane do nęcenia owadów. Z biegiem lat Departament Rolnictwa Stanów Zjednoczonych (USDA) utworzył bibliotekę EPF (Agricultural Research Service Collection of EPF cultures, ARSEF), która zawiera szeroką gamę gatunków, w tym 4081 gatunków Beauveria spp., 18 gatunków Clonostachys spp., 878 gatunków Cordyceps spp., 2473 gatunki Metarhizium spp., 226 gatunków Purpureocillium spp., i 13 gatunków Pochonia spp. między innymi15. Kolejna biblioteka EPF została zbudowana przez Laboratorium Badań Entomologicznych (ERL) z Uniwersytetu Vermont w Stanach Zjednoczonych na ok. 30 lat. Zawiera 1345 szczepów EPF ze Stanów Zjednoczonych, Europy, Azji, Afryki i Bliskiego Wschodu16.

Aby kontrolować lokalne lub inwazyjne szkodniki na Tajwanie, wymagana jest izolacja i selekcja rodzimego EPF. Dlatego w tym protokole zmodyfikowaliśmy i opisaliśmy procedurę metody przynęty glebowej i połączyliśmy ją z systemem przynęty na owady (mącznik, Tenebrio molitor) 17. W oparciu o ten protokół stworzono bibliotekę EPF. Przeprowadzono dwie rundy badań przesiewowych (kwantyfikacja inokulacji) dla wstępnych izolatów EPF. Izolaty EPF wykazały chorobotwórczość dla owadów. Potencjalne szczepy poddano identyfikacji morfologicznej i molekularnej, a następnie poddano dalszej analizie za pomocą testu termotolerancji i produkcji konidialnej. Ponadto zaproponowano również koncepcję efektywnej liczby konidiów (ECN). Korzystając z formuły ECN i analizy głównych składowych (PCA), potencjalne szczepy analizowano pod symulowanym ciśnieniem środowiskowym, aby zakończyć proces tworzenia i badania przesiewowego biblioteki EPF. Następnie zbadano chorobotwórczość obiecujących szczepów EPF pod kątem docelowego agrofaga (np. Spodoptera litura). Obecny protokół integruje dane dotyczące termotolerancji i produkcji konidiów z formułą ECN i analizą PCA, które mogą być używane jako standardowy system rankingowy dla badań związanych z EPF.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Cały schemat blokowy przedstawiono na Rysunku 1.

1. Izolacja i selekcja potencjalnych grzybów entomopatogennych (EPF)

  1. Pobierz próbkę gleby
    1. Usuń 1 cm powierzchniowej warstwy gleby, a następnie za pomocą łopaty pobierz próbkę gleby z głębokości 5–10 cm z każdego miejsca poboru.
      UWAGA: Miejscami poboru próbek powinny być góry, lasy lub obszary słabo zaludnione, aby uniknąć kontaminacji sztucznie rozpylonymi szczepami EPF. Należy upewnić się, że obszary przeznaczone do pobierania próbek gleby są pokryte roślinnością ruderalną na powierzchni. Gleba sucha lub wilgotna nie nadaje się do tego eksperymentu.
    2. Zapisz szczegółowe dane dla każdego punktu poboru prób, w tym współrzędne GPS, wysokość nad poziomem morza, typ pola, średnią roczną temperaturę, roczną sumę opadów, czas zbioru (pora roku), rodzaj gleby oraz wartość pH.
    3. Należy zebrać 100 g próbki gleby do plastikowej torby i przechowywać ją w temperaturze pokojowej, jeśli protokół izolacji grzybów w laboratorium zostanie przeprowadzony w ciągu 3 h.
      UWAGA: Jeśli próbka nie zostanie wykorzystana w ciągu 3 h, należy przechowywać glebę w temperaturze pokojowej, w ciemności. Jeśli eksperyment nie zostanie przeprowadzony niezwłocznie, próbkę gleby można przechowywać w 4 °C przez 1 tydzień przed rozpoczęciem protokołu18,19.
  2. Przynęta i izolacja EPF za pomocą mącznika (Tenebrio molitor)
    1. Umieść 100 g próbki gleby w plastikowym kubku (średnica otworu = 8,5 cm, wysokość = 12,5 cm), a następnie umieść 5 mączników na powierzchni gleby w temperaturze pokojowej w ciemności na 2 tygodnie.
      UWAGA: Można również stosować inne rodzaje plastikowych kubków. Jeśli gleba jest zbyt sucha (spękana lub piaszczysta), należy spryskać ją sterylną wodą ddH2O2O (około 5-10 ml) na glebę. Długość ciała ok. 2,5 cm (14th stadium larwalne) z T. molitor larwy pomagają w przesiewaniu izolatów grzybów20.
    2. Codziennie obserwuj i zapisuj śmiertelność oraz występowanie mykozy u larw; martwe larwy przechowuj w kubku przez 2 tygodnie w celu izolacji grzybów.
      UWAGA: Zarodniki konidia grzybów w próbkach gleby przyłączą się do larw mącznika podczas opisanego wyżej procesu. Mykozę grzybiczą będzie można zaobserwować w momencie, gdy strzępki zaczną wyrastać z błony międzysegmentowej, a następnie całe ciało zostanie pokryte grzybnią. Sporulacja rozpocznie się po 7 dniach, a kolor infekcji grzybiczej zmieni się na kolor masy konidialnej.
    3. Przenieść martwe owady do komory z laminarnym przepływem powietrza i za pomocą sterylnej wykałaczki zebrać konidia. Wysiać je w laboratorium na płytkę (55 mm) z pożywką Sabourauda z dekstrozą o ćwiartkowej koncentracji (¼ SDA).21Inkubować płytkę z kulturą w temperaturze 25 °C przez 7 dni w celu uzyskania kultury pierwotnej grzybów.
      UWAGA: Płytkę ¼ SDA przygotowuje się w następujący sposób: zmieszać 1,5 g bulionu Sabourauda z dekstrozą i 3 g agaru w 200 ml H2Następnie należy sterylizować przez 20 min. Przed zestaleniem należy odlać po ¼ objętości podłoża SDA do każdej szalki Petriego o średnicy 55 mm. Zestalone płytki z ¼ SDA przechowuje się w 4 °C do momentu użycia.
    4. Ponownie wysewiaj każdy pierwotny grzyb z kultury na jedną płytkę SDA o średnicy 55 mm w komorze z laminarnym przepływem powietrza, a następnie inkubuj płytkę z kulturą w temperaturze 25 °C przez 7 dni w celu uzyskania pojedynczych kolonii grzybów.
    5. Powtórz tę reizolację około 2–3 razy i obserwuj pod mikroskopem świetlnym, aby uzyskać pojedyncze i czyste morfologicznie kolonie grzybów.
      UWAGA: Wyizolować wszystkie EPF za pomocą T. molitor-przynętę i przechowywać zgodnie z opisem w następnej sekcji. Separację, konserwację, hodowlę czystą oraz posiewy w kolejnych sekcjach należy przeprowadzić w laminarnym przepływie powietrza.
  3. Przechowywanie izolatów EPF
    1. Za pomocą wycinaka do korka wyciąć 3 bloki agaru o rozmiarze 5 mm z brzegu każdej płytki z izolowaną czystą kulturą grzyba i umieścić je w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml jako jedną powtórkę.
      UWAGA: W celu przechowywania szczepów EPF po 2 zaleca się przygotowanie trzech powtórzeń dla każdego izolatu grzyband test wirulencji. W przypadku ograniczonej przestrzeni magazynowej zaleca się również identyfikację molekularną.
    2. Dodaj 250 µL 0,03% roztworu surfaktantu (Tabela materiałów) i 250 µL do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml 60% glicerolu za pomocą mikropipety, a następnie mieszać na wirówce typu vortex przez 10 s.
    3. Zamknąć probówkę do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml folią parafinową i schłodzić wstępnie w -20 °C lodówce przez 24 h. Następnie przenieść schłodzone zapasy grzybów do -80 °C lodówka do krioterapii.
      UWAGA: W sekcji 1.4 wykorzystano dodatkowe szalki z czystą kulturą grzybów (poza próbkami przechowywanymi w kriokonserwacji).
  4. 1st badanie patogenności izolatów grzybów
    1. Umieść pięć T. molitor larwy bezpośrednio na powierzchni każdej płytki z czystą kulturą grzyba w 25 °C.
    2. Obserwować i rejestrować występowanie mykozy oraz śmiertelność przez 10 dni. Wybrać izolat grzyba do dalszych analiz.
      UWAGA: Do etapu 2 wybierane są izolaty grzybów powodujące 100% śmiertelnoścind test wirulencji w celu potwierdzenia ich zjadliwości wobec T. molitor larwy. Alternatywnie badacz może dostosować kryteria zgodnie z zakresem własnego badania.
  5. 2nd test wirulencji izolatów grzybów
    UWAGA: Na podstawie 1Wstęp badanie patogenności, odzyskanie wybranych izolatów grzybów z -80 °C dla 2nd test wirulencji. Celem 2nd test wirulencji służy do ilościowego określenia patogenności wybranych izolatów grzybów po 1Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. rundę przesiewową.
    1. Zbierz konidia każdego izolatu grzyba, mieszając je w wirówce vorex przez 1 min, a następnie policz liczbę konidiów za pomocą hemocytometru.
    2. Dostosuj stężenie zawiesiny konidiów do poziomu 1 x 107 konidia/ml w 0,03% roztworze surfaktanta (Tabela materiałów).
    3. Rozprzestrzenianie 10 µL zawiesiny grzybowej na płytki z agar Sabouraud (SDA) o średnicy 55 mm i inkubować przez 7 dni w temperaturze 25 °C w ciemności.
    4. Umieść pięć T. molitor larwy bezpośrednio na powierzchni każdej szalki z czystą kulturą grzybów (ok. 6 x 107 konidia). Płytki uszczelnić folią parafinową i inkubować w 25 °C w ciemności.
    5. Obserwować i rejestrować występowanie mykozy oraz śmiertelność przez 10 dni.
    6. Powtórz test (od kroku 1.5.1 do 1.5.5) w trzech powtórzeniach dla każdego izolatu grzyba.
      UWAGA: Do etapu 3 wyselekcjonowano izolaty grzybów powodujące 100% śmiertelnoścird test wirulencji w celu potwierdzenia ich wirulencji wobec docelowego szkodnika.
  6. 3rd test wirulencji izolatów grzybowych wobec docelowego szkodnika (Spodoptera litura na przykład)
    1. Powtórz kroki od 1.5.2 do 1.5.6 dla wybranych izolatów z 2nd wirulencja w celu przetestowania wirulencji przeciwko docelowemu szkodnikowi.
    2. Oblicz LT50 każdego izolatu grzyba22.
      UWAGA: LT50 Wartość dla każdego izolatu grzybowego obliczono za pomocą uogólnionych modeli liniowych (GLM) w programie R studio (wersja 3.4.1); w celu uwzględnienia nadmiernej dyspersji zastosowano kwazibinomialny rozkład błędów oraz funkcję linku logarytmicznego.

2. Identyfikacja molekularna EPF

  1. Ekstrakcja genomowego DNA grzybów
    1. Pobrać ok. 1 cm2 EPF z 7-dniowej płytki ¼ SDA.
    2. Wyekstrahować genomowe DNA grzybów przy użyciu zestawu do ekstrakcji genomowego DNA grzybów zgodnie z instrukcjami producenta23 (Tabela materiałów).
  2. Amplifikacja PCR i sekwencjonowanie DNA
    1. Amplifikować region ITS grzybów metodą PCR z próbki DNA21, używając PCR Master Mix (2x) oraz zestawu starterów ITS1F/ITS4R24 (Tabela 1) według następującego programu PCR: 94 °C przez 1 min, a następnie 35 cykli obejmujących 94 °C przez 30 s, 55 °C przez 30 s oraz 72 °C przez 1 min, a na koniec 7 min finalnej elongacji w 72 °C.
      UWAGA: Zestaw starterów ITS1F/ITS4R służy do identyfikacji na poziomie rodzaju.
    2. Przeprowadzić sekwencjonowanie produktów PCR w komercyjnej usłudze sekwencjonowania.
    3. Użyć wyszukiwania NCBI BLAST w celu znalezienia podobnych grzybów w bazie danych NCBI i wybrać pokrewne gatunki typowe grzybów do analizy filogenetycznej.
      UWAGA: Gatunki grzybów należące do rodzaju Metarhizium lub Beauveria powinny zostać dalej zidentyfikowane na poziomie gatunku przy użyciu zestawu starterów tef-983F/tef-2218R25 (powtórzyć kroki od 2.1.1 do 2.2.3). W przypadku grzybów, które nie należą do rodzajów Metarhizium lub Beauveria, do identyfikacji gatunku można wykorzystać inne markery molekularne, w tym lyazę DNA (APN2), beta-tubulinę (BTUB), największą podjednostkę polimerazy RNA II (RPB1), drugą co do wielkości podjednostkę polimerazy RNA II (RPB2) oraz fragment 3' czynnika elongacji translacji 1 alfa (TEF)25,26.
  3. Analiza filogenetyczna
    1. Użyć oprogramowania ClustalX 2.127 do dopasowania wielu sekwencji z kroków 2.2.2 i 2.2.3. Ręcznie przyciąć regiony sekwencji konserwowanych za pomocą programu GeneDoc28.
    2. Przeprowadzić analizę filogenetyczną za pomocą oprogramowania MEGA729 w oparciu o metody minimum ewolucyjnego (ME), Neighbor-Joining (NJ) oraz maksymalnego wiarygodności (ML).
      UWAGA: Zastosowanie wszystkich trzech metod może pomóc w potwierdzeniu i dokładnym ustaleniu statusu klasyfikacji. Izolaty grzybów przesianne w 1.st badaniu patogenności są wykorzystywane do identyfikacji molekularnej na poziomie rodzaju. Izolaty grzybów przesianne w 2.nd teście wirulencji są wykorzystywane do molekularnej i morfologicznej identyfikacji na poziomie gatunku.

3. Identyfikacja morfologiczna EPF

  1. Obserwacja morfologii kolonii grzyba
    1. Za pomocą aparatu fotograficznego dokumentuj wzrost kolonii kultury grzyba przez 7 dni, zapisując tempo wzrostu, formę (puszystą, zwartą) oraz kolor kolonii.
  2. Obserwacja konidiów i konidioforów
    1. Zeskrob konidia z kolonii czystej kultury grzyba za pomocą pętli do szczepienia i przenieś zarodniki na szkiełko przedmiotowe z 0,1% roztworem Tween 80. Następnie przykryj je szkiełkiem nakrywką w celu obserwacji konidiów pod mikroskopem świetlnym.
    2. Za pomocą skalpela wytnij blok agaru o powierzchni 5 mm2 z pasma strzępek na brzegu kolonii grzyba, a następnie przenieś blok agaru na szkiełko przedmiotowe.
    3. Przeprowadź oczyszczanie w następujący sposób: nanieś 0,1% roztwór Tween 80 na blok agaru za pomocą plastikowego zakraplacza i usuń pęsetą większość nadmiaru konidiów. Następnie przykryj preparat szkiełkiem nakrywką w celu obserwacji pod mikroskopem świetlnym.
      UWAGA: 0,1% Tween 80 można zastąpić innym, silniejszym surfaktantem (Tabela materiałów) w zależności od gatunku grzyba i jego hydrofobowości.
    4. Zmierz i zapisz szerokość oraz długość konidiów i konidioforów, aby porównać różnice między poszczególnymi izolatami grzybów.
    5. Użyj testu ANOVA Welcha oraz testu Gamesa-Howella (test post-hoc) w programie R studio (wersja 3.4.1), aby przeanalizować szerokość i długość konidiów każdego szczepu.
      UWAGA: Analiza danych dotyczących cech morfologicznych może być dostosowana do konkretnych przypadków. Izolaty grzybów przebadane w ramach 3rd testu wirulencji są wykorzystywane do charakterystyki fizjologicznej i rankingu ECN w sekcjach 4 i 5.

4. Badanie produktywności konidiów i termotolerancji

  1. Analiza produkcji konidiów
    1. Kultywuj wybrany izolat grzyba na podłożu ¼ SDA w temperaturze 25 ± 1 °C w ciemności przez 10 dni.
    2. Przygotuj 1 mL zawiesiny konidiów izolatu grzyba w 0,03% roztworze surfaktantu i dostosuj stężenie do 1 x 107 konidiów/mL zgodnie z powyższym opisem.
    3. Nanieś trzy krople po 10 µL zawiesiny konidiów na ¼ SDA i inkubuj w temperaturze 25 °C w ciemności przez 7, 10 i 14 dni w celu policzenia sporulacji grzybów.
      UWAGA: 10 µL to optymalna objętość, aby pobrać blok 5 mm z równomierną sporulacją grzybów po ich wzroście przez 7-14 dni.
    4. Użyj wycinaka do agaru, aby odciąć blok agaru o średnicy 5 mm z centrum kolonii i przenieś go do 1 mL 0,03% roztworu surfaktantu (Tabela materiałów) w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL dla każdego punktu czasowego.
    5. Mieszaj probówkę w vortexie przy 3 000 obr./min w temperaturze pokojowej przez 15 min i użyj hemocytometru do policzenia liczby konidiów.
      UWAGA: Wzór używany do liczenia to liczba konidiów na 25 kwadratów najmniejszej komórki (rozmiar = 0,025 mm2; głębokość komory = 0,1 mm):
      Całkowita liczba konidiów w 5 kwadratach ÷ 80 × (4 × 106)
    6. Powtórz procedurę trzykrotnie dla każdego izolatu.
  2. Analiza termotolerancji
    1. Kultywuj wybrany izolat grzyba na podłożu ¼ SDA w temperaturze 25 ± 1 °C w ciemności przez 10 dni.
    2. Przygotuj 1 mL zawiesiny konidiów izolatu grzyba w 0,03% roztworze surfaktantu i dostosuj stężenie do 1 x 107 konidiów/mL zgodnie z powyższym opisem.
    3. Wymieszaj zawiesinę konidiów w vortexie i podgrzewaj ją w suchej kąpieli w temperaturze 45 °C przez 0, 30, 60, 90 i 120 min. Nanieś trzy krople po 5 µL zawiesiny konidiów na podłoże 55 mm ¼ SDA w każdym punkcie czasowym po ekspozycji na ciepło i inkubuj w temperaturze 25 ± 1 °C przez 18 h.
      UWAGA: Unikaj rozcierania kropel grzyba, aby móc lepiej skupić się na danym obszarze.
    4. Policz liczbę wykiełkowanych zarodników konidiów w pięciu losowo wybranych polach pod mikroskopem świetlnym przy powiększeniu 200x, aby określić stopień kiełkowania.
    5. Wykonaj trzy powtórzenia dla każdego izolatu.

5. Ranking liczby efektywnych konidiów (ECN)

  1. Obliczanie ECN
    UWAGA: Przed obliczeniem całkowitej wartości ECN należy uzyskać dane dotyczące produkcji konidiów oraz termotolerancji każdego potencjalnego szczepu grzyba21.
    1. Oblicz krotność zmiany (FC) produkcji konidiów w każdym punkcie czasowym:
      Wzór na absorpcję przejściową; równanie symboliczne, schemat badania spektroskopowego.
      gdzie x = punkt czasowy zbioru danych; ncp = liczba konidiów po każdym dniu wzrostu; a I = początkowa liczba zaszczepionych konidiów.
    2. Oblicz liczbę konidiów w warunkach stresowych w każdym punkcie czasowym, korzystając z następującego wzoru:
      Równanie przedstawiające obliczanie ECN: ECNy = I × FCx × TT0 × Współczynnik stresu(TTz).
      Gdzie y = ECN w punkcie czasowym poddanym działaniu czynnika; TT0 = wskaźnik kiełkowania konidiów niedostępnych dla stresu cieplnego (= wskaźnik kiełkowania przy 0 min obróbki cieplnej); TTz = współczynnik stresu, będący wskaźnikiem kiełkowania konidiów w różnych czasach obróbki cieplnej (z).
    3. Oblicz całkowity ECN, korzystając z następującego wzoru:
      Równanie równowagi statycznej, ΣECNy = I × FGx × TTo × Współczynnik stresu(TTz), schemat wzoru.
    4. Porównaj ECN każdego szczepu grzyba.
  2. Analiza głównych składowych (PCA) szczepów grzybów
    UWAGA: Analiza PCA potwierdza ranking ECN i pomaga w zrozumieniu korelacji między wartościami cech fizjologicznych. Porównaj wartości ECN i wybierz izolaty EPF o wyższych wartościach ECN.
  3. Użyj oprogramowania R, aby stworzyć PCA za pomocą kodu:
    #Wprowadzenie pliku danych PCA
    ​a = read.table("PCA.csv",sep=',',header=T)
    1. # Przetwarzanie danych próbek
      row.names(a) <- c("NCHU-9","NCHU-11", "NCHU-64", "NCHU-69", "NCHU-95", "NCHU-113")
      X=row.names(a)
      df<- a[2:11]
    2. #Obliczenia PCA
      pca <- prcomp(df, center = TRUE, scale = TRUE)
      vars <- (pca$sdev)^2
      pc1_percent = vars[1] / sum(vars)
      pc2_percent = vars[2] / sum(vars)
      value = pca$x
    3. #Wyjście do pliku wizualizacji PCA
      png(file = 'pca.png', height = 2000, width = 2000, res = 300)
      UWAGA: Do przeprowadzenia analizy głównych składowych (PCA) w celu potwierdzenia rankingu ECN należy użyć danych produkcji konidiów z okresu od 7 do 14 dni oraz wszystkich danych dotyczących termotolerancji.
  4. Wybierz najlepiej rokujące szczepy grzybów na podstawie ECN lub PCA i przeprowadź test wirulencji na docelowych szkodnikach w celu dalszych badań.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Izolacja i selekcjapotencjalnych grzybów entomopatogennych (EPF)
Poprzez zastosowanie Tenebrio molitormetodzie tworzenia biblioteki grzybów entomopatogennych (EPF), liczba grzybów pozbawionych zdolności do zabijania owadów zostałaby wykluczona; w ten sposób można by znacznie zwiększyć wydajność izolacji oraz selekcję EPF. Podczas stosowania tej metody rejestrowano informacje o miejscach poboru próbek, próbkach gleby oraz wskaźnikach kiełkowania grzybów (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Grzyby entomopatogeniczne (EPF) zostały wykorzystane do zwalczania owadów. Istnieje kilka metod izolacji, selekcji i identyfikacji EPF30,31,32. Porównując różne rodzaje metod przynęty na owady, Beauveria bassiana i Metarhizium anisopliae były powszechnie spotykane w przynętach na owady 6,12,13,14.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują, że w tej pracy nie występuje konflikt interesów.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez Grant 109-2313-B-005 -048 -MY3 z Ministerstwa Nauki i Technologii (MOST).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Agar Klasa bakteriologicznaBIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd.AGR001Nadaje się do większości zastosowań w hodowlach komórkowych / biologii molekularnej.
AGAROSE, klasa biotechnologicznaBIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd.AGA001Do elektroforezy DNA.
BioGreen Safe DNA Gel BufferBIOMANSDB001T
Mosiężny świdr korkowyDoggerD89A-44001
Canon kiss x2CanonEOS 450DDo rekordowej morfologii kolonii szczepów
Inkubator o stałej temperaturzeYihder Co., Ltd.LE-509RDHodowla grzybów.
cubee Mini-wirówkaGeneReachMC-CUBEE
DigiGel 10 Cyfrowy system obrazowania żeluTOPBIODGIS-12S
Finnpipette F2 0,2 do 2 i mikro; L PipetaThermo Scientific4642010
Finnpipette F2 1 do 10 i mikro; L PipetaThermo Scientific4642030
Finnpipette F2 10 do 100 i mikro; L PipetaThermo Scientific4642070
Finnpipette F2 100 do 1000 i mikro; L PipetaThermo Scientific4642090
Finnpipette F2 2 do 20 i mikro; L PipetaThermo Scientific4642060
Finnpipette F2 20 do 200 i mikro; L PipetaThermo Scientific4642080
GeneAmp PCR System 9700Applied Biosystems4342718
GenepHlow Gel/PCR Kit GenepHlowGeneaidDFH100
GeniusMajor ScienceMD-01N
Cylinder z podziałką Niestandardowy A 100mLSIBATASABP-1195906Zmierz objętość odczynników.
Ręczny licznik tallySDINO.1055
HemocytometrbiomanAP-0650010Oblicz liczbę zarodników
Pętla inokulacyjnaDoggerD8GA-23000
pokrywkaIDEAHOUSERS92004
Szkło z mikro pokrywąMUTO PURE CHEMICALS CO., LTD24241
System obrazowania mikroskopowegoSAGE VISION CO., LTDSGHD-3.6C
Szkiełka mikroskopoweDOGGERDG75001-07105
Mupid-2plus Elektroforeza żelowa DNAADVANCEAD110
Mikroskop optyczny NikonSAGE VISION CO., LTDEclipse CI-L
Plastikowy kubekIDEAHOUSECS60016
Zestaw drożdży Presto Mini gDNAGeneaidGYBY300Zestaw do ekstrakcji genomowego DNA grzybów
Sabouraud Dextrose Broth (Sabouraud Liquid Medium)HiMedia Leading BioSciences CompanyM033Służy do hodowli drożdży, pleśni i mikroorganizmów kwaśnych.
Ostrze skalpela nr 23Swann-Morton310
Rękojeść skalpela nr 4AGARWAL SURGICALSSSS -FOR-01-91
ŁopataZapisz & BezpiecznyA -1580242 -00
Silwet L-77bioman(phytotech)S7777Surfaktant
Sorvall Legend Micro 17 MikrowirówkaThermo Scientific75002403
Stalowa pęsetaSIPEL ELECTRONIC SAGG-SA
Sterylna szalka PetriegoBIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd.1621Płytkie cylindryczne pojemniki z dopasowanymi pokrywkami, przeznaczone specjalnie do stosowania w mikrobiologii lub hodowlach komórkowych.
ThermoCell MixingBlockBIOERMB-101
Tween 80FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation164-21775
Zamrażarka TwinGuard ULTPanasonic Healthcare Holdings Co., Ltd.MDF-DU302VX-80° C próbka przechowywana.
Pionowa szafka podłogowaChih ChinBSC-3Hodowla grzybów.
Vortex Genie IIScientificSIG560
Torby do przechowywania na zamek błyskawicznyZapisz i BezpiecznyA -1248915 -00
100 pz Drabinka DNAGeneaidDL007-20
° C ZamrażarkaFRIGIDAIREFrigidaireFFFU21M1QW-20° C próbka i odczynniki doświadczalne przechowywane.
2X SuperRed PCR Master MixTOOLSTE-SR01
50X TAE BuforBIOMANTAE501000
Inkubator do suchej kąpieli

Bibliografia

  1. Wraight, S. P., Carruthers, R. I. Biopesticides: use and Delivery. , Springer. 233-269 (1999).
  2. Chase, A., Osborne, L., Ferguson, V. Selective isolation of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae from an artificial potting medium. Florida Entomologist. , 285-292 (1986).
  3. Meyling, N. V. Methods for isolation of entomopathogenic fungi from the soil environment. University of Copenhagen. , Frederiksberg Denmark. Department of Ecology 1-18 (2007).
  4. Zimmermann, G. The 'Galleria bait method'for detection of entomopathogenic fungi in soil. Journal of applied Entomology. 102 (1-5), 213-215 (1986).
  5. Schneider, S., Widmer, F., Jacot, K., Kölliker, R., Enkerli, J. Spatial distribution of Metarhizium clade 1 in agricultural landscapes with arable land and different semi-natural habitats. Applied Soil Ecology. 52, 20-28 (2012).
  6. Hallouti, A., et al. Diversity of entomopathogenic fungi associated with Mediterranean fruit fly (Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae)) in Moroccan Argan forests and nearby area: impact of soil factors on their distribution. BMC Ecology. 20 (1), 1-13 (2020).
  7. Meyling, N. V., Eilenberg, J. Occurrence and distribution of soil borne entomopathogenic fungi within a single organic agroecosystem. Agriculture, Ecosystems and Environment. 113 (1-4), 336-341 (2006).
  8. Skalický, A., Bohatá, A., Šimková, J., Osborne, L. S., Landa, Z. Selection of indigenous isolates of entomopathogenic soil fungus Metarhizium anisopliae under laboratory conditions. Folia Microbiologica. 59 (4), 269-276 (2014).
  9. Veen, K., Ferron, P. A selective medium for the isolation of Beauveria tenella and of Metarrhizium anisopliae. Journal of Invertebrate Pathology. 8 (2), 268-269 (1966).
  10. Goettel, M., Inglis, D. Manual of Techniques in Insect Pathology. Lacy, L. , Academic. Amsterdam. 213-249 (1997).
  11. Luz, C., Netto, M. C. B., Rocha, L. F. N. In vitro susceptibility to fungicides by invertebrate-pathogenic and saprobic fungi. Mycopathologia. 164 (1), 39-47 (2007).
  12. Mantzoukas, S., et al. Trapping entomopathogenic fungi from vine terroir soil samples with insect baits for controlling serious pests. Applied Sciences. 10 (10), 3539(2020).
  13. Goble, T., Dames, J., Hill, M., Moore, S. The effects of farming system, habitat type and bait type on the isolation of entomopathogenic fungi from citrus soils in the Eastern Cape Province, South Africa. BioControl. 55 (3), 399-412 (2010).
  14. Nishi, O., Iiyama, K., Yasunaga-Aoki, C., Shimizu, S. Isolation of entomopathogenic fungi from soil by using bait method with termite, Reticulitermes speratus. Enotomotech. 35, 21-26 (2011).
  15. Castrillo, L. ARS Collection of Entomopathogenic Fungal Cultures (ARSEF). , (2014).
  16. Fungal database WorldWide Collection of Entomopathogenic Fungi. University of Vermont. , Available from: http://www.uvm.edu/~entlab/Fungus.html (2019).
  17. Kim, J. C., et al. Tenebrio molitor-mediated entomopathogenic fungal library construction for pest management. Journal of Asia-Pacific Entomology. 21 (1), 196-204 (2018).
  18. Keyser, C. A., Henrik, H., Steinwender, B. M., Meyling, N. V. Diversity within the entomopathogenic fungal species Metarhizium flavoviride associated with agricultural crops in Denmark. BMC Microbiology. 15 (1), 1-11 (2015).
  19. Quesada-Moraga, E., Navas-Cortés, J. A., Maranhao, E. A., Ortiz-Urquiza, A., Santiago-Álvarez, C. Factors affecting the occurrence and distribution of entomopathogenic fungi in natural and cultivated soils. Mycological Research. 111 (8), 947-966 (2007).
  20. Park, J. B., et al. Developmental characteristics of Tenebrio molitor larvae (Coleoptera: Tenebrionidae) in different instars. International Journal of Industrial Entomology. 28 (1), 5-9 (2014).
  21. Chang, J. -C., et al. Construction and selection of an entomopathogenic fungal library from soil samples for controlling Spodoptera litura. Frontiers in Sustainable Food Systems. 5, 15(2021).
  22. Podder, D., Ghosh, S. K. A new application of Trichoderma asperellum as an anopheline larvicide for eco friendly management in medical science. Scientific reports. 9 (1), 1-15 (2019).
  23. Geneaid Biotech Ltd. Presto Mini gDNA Yeast, Ver. 04.27.17. , Available from: https://www.geneaid.com/data/files/1605664221308055331.pdf (2021).
  24. White, T. J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR protocols: A guide to methods and applications. 18 (1), 315-322 (1990).
  25. Kepler, R. M., Humber, R. A., Bischoff, J. F., Rehner, S. A. Clarification of generic and species boundaries for Metarhizium and related fungi through multigene phylogenetics. Mycologia. 106 (4), 811-829 (2014).
  26. Kepler, R. M. A phylogenetically-based nomenclature for Cordycipitaceae (Hypocreales). IMA Fungus. 8 (2), 335-353 (2017).
  27. National Resource for Biomedical Supercomputing. GeneDoc: a tool for editing and annotating multiple sequence alignments. Pittsburgh Supercomputing Center's National Resource for Biomedical Supercomputing. , Available from: http://www.nrbsc.org/downloads (1997).
  28. Thompson, J. D., Gibson, T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins, D. G. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research. 25 (24), 4876-4882 (1997).
  29. Kumar, S., Stecher, G., Tamura, K. MEGA7: Molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets. Molecular Biology and Evolution. 33 (7), 1870-1874 (2016).
  30. Herlinda, S., Mulyati, S. I. Selection of isolates of entomopathogenic fungi and the bioefficacy of their liquid production against Leptocorisa oratorius nymphs. Microbiology Indonesia. 2 (3), 9(2008).
  31. Herlinda, S., Irsan, C., Mayasari, R., Septariani, S. Identification and selection of entomopathogenic fungi as biocontrol agents for Aphis gossypii from South Sumatra. Microbiology Indonesia. 4 (3), 137-142 (2010).
  32. Montes-Bazurto, L. G., Peteche-Yonda, Y., Medina-Cardenas, H. C., Bustillo-Pardey, A. E. Selection of entomopathogenic fungi for the biological control of Demotispa neivai (Coleoptera: Chrysomelidae) in oil palm plantations in Colombia. Journal of Entomological Science. 55 (3), 388-404 (2020).
  33. Shin, T. -Y., Choi, J. -B., Bae, S. -M., Koo, H. -N., Woo, S. -D. Study on selective media for isolation of entomopathogenic fungi. International Journal of Industrial Entomology. 20 (1), 7-12 (2010).
  34. Sharma, L., Oliveira, I., Torres, L., Marques, G. Entomopathogenic fungi in Portuguese vineyards soils: Suggesting a 'Galleria-Tenebrio-bait method'as bait-insects Galleria and Tenebrio significantly underestimate the respective recoveries of Metarhizium (robertsii) and Beauveria (bassiana). MycoKeys. (38), 1(2018).
  35. Rodríguez, M., Gerding, M., France, A. Selección de Hongos Entomopatógenos para el Control de Varroa destructor (Acari: Varroidae). Chilean journal of agricultural research. 69 (4), 534-540 (2009).
  36. Yang, H., et al. Persistence of Metarhizium (Hypocreales: Clavicipitaceae) and Beauveria bassiana (Hypocreales: Clavicipitaceae) in tobacco soils and potential as biocontrol agents of Spodoptera litura (Lepidoptera: Noctuidae). Environmental entomology. 48 (1), 147-155 (2019).
  37. Muñiz-Reyes, E., Guzmán-Franco, A. W., Sánchez-Escudero, J., Nieto-Angel, R. Occurrence of entomopathogenic fungi in tejocote (C rataegus mexicana) orchard soils and their pathogenicity against R hagoletis pomonella. Journal of Applied Microbiology. 117 (5), 1450-1462 (2014).
  38. Lacey, L. A., et al. Goettel Insect pathogens as biological control agents: Back to the future. Journal of Invertebrate Pathology. 132, 1-41 (2015).
  39. Humber, R. A. Manual of techniques in insect pathology. , Elsevier. 153-185 (1997).
  40. Rehner, S. A., Buckley, E. A Beauveria phylogeny inferred from nuclear ITS and EF1-α sequences: evidence for cryptic diversification and links to Cordyceps teleomorphs. Mycologia. 97 (1), 84-98 (2005).
  41. Quandt, C. A., et al. Phylogenetic-based nomenclatural proposals for Ophiocordycipitaceae (Hypocreales) with new combinations in Tolypocladium. IMA fungus. 5 (1), 121-134 (2014).
  42. Shah, F. A., Wang, C. S., Butt, T. M. Nutrition influences growth and virulence of the insect-pathogenic fungus Metarhizium anisopliae. FEMS Microbiology Letters. 251 (2), 259-266 (2005).
  43. Ignoffo, C. Environmental factors affecting persistence of entomopathogens. Florida Entomologist. , 516-525 (1992).
  44. Rodrigues, I. W., Forim, M., Da Silva, M., Fernandes, J., Batista Filho, A. Effect of ultraviolet radiation on fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae, pure and encapsulated, and bio-insecticide action on Diatraea saccharalis. Advances in Entomology. 4 (3), 151-162 (2016).
  45. Paula, A. R., Ribeiro, A., Lemos, F. J. A., Silva, C. P., Samuels, R. I. Neem oil increases the persistence of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae for the control of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) larvae. Parasites and Vectors. 12 (1), 1-9 (2019).
  46. Morley-Davies, J., Moore, D., Prior, C. Screening of Metarhizium and Beauveria spp. conidia with exposure to simulated sunlight and a range of temperatures. Mycological Research. 100 (1), 31-38 (1996).
  47. Rangel, D. E., Braga, G. U., Flint, S. D., Anderson, A. J., Roberts, D. W. Variations in UV-B tolerance and germination speed of Metarhizium anisopliae conidia produced on insects and artificial substrates. Journal of Invertebrate Pathology. 87 (2-3), 77-83 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Metoda przyn ty glebowejprodukcja konidi wtest termotolerancjiprzesiew patogenno ciidentyfikacja molekularnaSpodoptera liturabiologiczna kontrola
Izolacja i selekcja grzybów entomopatogenicznych z próbek glebowych oraz ocena zjadliwości grzybów wobec szkodników owadzich
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.