Artykuł metodologiczny

Izolacja i selekcja grzybów entomopatogenicznych z próbek glebowych oraz ocena zjadliwości grzybów wobec szkodników owadzich

DOI:

10.3791/62882

⸱

28 września 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Entomology, National Chung Hsing University, 2Department of Agricultural biology, Jeonbuk National University, 3Department of Agricultural Convergence Technology, Jeonbuk National University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół oparty na systemie przynęty na mącznika mącznika (Tenebrio molitor), który był używany do izolowania i selekcji grzybów entomopatogenicznych (EPF) z próbek gleby. Skuteczna formuła liczby konidiów (ECN) jest stosowana do wyboru EPF o wysokiej tolerancji na stres w oparciu o cechy fizjologiczne do zwalczania mikrobiologicznego szkodników na polu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Grzyby entomopatogeniczne (EPF) są jednym z czynników kontroli mikrobiologicznej w zintegrowanej ochronie przed szkodnikami. Aby zwalczać szkodniki lokalne lub inwazyjne, ważne jest, aby wyizolować i wybrać rodzimy EPF. W związku z tym w tym badaniu zastosowano metodę przynęty glebowej w połączeniu z systemem przynęty na owady (mącznik, Tenebrio molitor) z pewnymi modyfikacjami. Wyizolowany EPF poddano następnie testowi zjadliwości przeciwko agrofagowi rolniczemu Spodoptera litura. Ponadto potencjalne szczepy EPF poddano identyfikacji morfologicznej i molekularnej. Ponadto przeprowadzono test produkcji konidiów i termotolerancji dla obiecujących szczepów EPF i porównano; dane te zostały następnie podstawione do wzoru na efektywną liczbę konidiów (ECN) dla rankingu laboratoriów. System przynęty glebowej i mącznika mącznika oraz formułę ECN można ulepszyć poprzez zastąpienie gatunków owadów i włączenie większej liczby czynników stresowych do oceny komercjalizacji i zastosowania w terenie. Protokół ten zapewnia szybkie i skuteczne podejście do selekcji EPF i poprawi badania nad środkami kontroli biologicznej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecnie, grzyby entomopatogeniczne (EPF) są szeroko stosowane w zwalczaniu mikrobiologicznym szkodników rolniczych, leśnych i ogrodniczych. Zaletami EPF są jego szeroki zakres żywicieli, dobra zdolność adaptacji do środowiska, przyjazny dla środowiska charakter oraz to, że może być stosowany z innymi chemikaliami, aby pokazać synergiczny efekt integrowanej ochrony przed szkodnikami1,2. Do stosowania jako środek do zwalczania szkodników konieczne jest odizolowanie dużej liczby EPF od chorych owadów lub środowiska naturalnego.

Pobieranie próbek tych organizmów od ich gospodarzy pomaga w zrozumieniu geograficznego rozmieszczenia i częstości występowania EPF w naturalnych gospodarzach3,4,5. Jednak zbiór owadów zakażonych grzybami jest zwykle ograniczony przez czynniki środowiskowe i populacje owadów w terenie4. Biorąc pod uwagę, że żywiciele owadów umierają po zakażeniu EPF, a następnie wpadają do gleby, izolacja EPF od próbek gleby może być stabilnym zasobem3,6. Na przykład saprofity są znane z tego, że wykorzystują martwego gospodarza jako zasób do wzrostu. Systemy przynęty glebowej i selektywnego podłoża są szeroko stosowane do wykrywania i izolowania EPF od gleby3,4,7,8,9,10.

W metodzie selektywnej pożywki, rozcieńczony roztwór glebowy jest powlekany na pożywce zawierającej antybiotyki o szerokim spektrum działania (np. chloramfenikol, tetracyklinę lub streptomycynę) w celu zahamowania rozwoju bakterii2,3,9,11. Doniesiono jednak, że metoda ta może zniekształcić różnorodność i gęstość szczepu oraz może spowodować przeszacowanie lub niedoszacowanie wielu społeczności drobnoustrojów6. Ponadto wyizolowane szczepy są mniej chorobotwórcze i konkurują z saprofitami podczas izolacji. Trudno jest wyizolować EPF z rozcieńczonego roztworu glebowego3. Zamiast używać selektywnego podłoża, metoda przynęty glebowej izoluje EPF od zakażonych martwych owadów, które mogą być przechowywane przez 2-3 tygodnie, zapewniając w ten sposób bardziej wydajną i standardową metodę separacji EPF3,4,7,6. Ponieważ metoda jest łatwa w obsłudze, można wyizolować różne szczepy chorobotwórcze przy niskich kosztach4. Dlatego jest szeroko stosowany przez wielu badaczy.

Po porównaniu różnych typów systemów przynęt na owady, Beauveria bassiana i Metarhizium anisopliae są najczęstszymi gatunkami EPF, które występują u owadów należących do Hemiptera, Lepidoptera, Blattella i Coleoptera6,12,13,14. Wśród tych przynęt na owady, Galleria mellonella (rząd Lepidoptera) i Tenebrio molitor (rząd Coleoptera) wykazują wyższe wskaźniki odzysku Beauveria i Metarhizium spp. w porównaniu z innymi owadami. Dlatego G. mellonella i T. molitor są powszechnie stosowane do nęcenia owadów. Z biegiem lat Departament Rolnictwa Stanów Zjednoczonych (USDA) utworzył bibliotekę EPF (Agricultural Research Service Collection of EPF cultures, ARSEF), która zawiera szeroką gamę gatunków, w tym 4081 gatunków Beauveria spp., 18 gatunków Clonostachys spp., 878 gatunków Cordyceps spp., 2473 gatunki Metarhizium spp., 226 gatunków Purpureocillium spp., i 13 gatunków Pochonia spp. między innymi15. Kolejna biblioteka EPF została zbudowana przez Laboratorium Badań Entomologicznych (ERL) z Uniwersytetu Vermont w Stanach Zjednoczonych na ok. 30 lat. Zawiera 1345 szczepów EPF ze Stanów Zjednoczonych, Europy, Azji, Afryki i Bliskiego Wschodu16.

Aby kontrolować lokalne lub inwazyjne szkodniki na Tajwanie, wymagana jest izolacja i selekcja rodzimego EPF. Dlatego w tym protokole zmodyfikowaliśmy i opisaliśmy procedurę metody przynęty glebowej i połączyliśmy ją z systemem przynęty na owady (mącznik, Tenebrio molitor) 17. W oparciu o ten protokół stworzono bibliotekę EPF. Przeprowadzono dwie rundy badań przesiewowych (kwantyfikacja inokulacji) dla wstępnych izolatów EPF. Izolaty EPF wykazały chorobotwórczość dla owadów. Potencjalne szczepy poddano identyfikacji morfologicznej i molekularnej, a następnie poddano dalszej analizie za pomocą testu termotolerancji i produkcji konidialnej. Ponadto zaproponowano również koncepcję efektywnej liczby konidiów (ECN). Korzystając z formuły ECN i analizy głównych składowych (PCA), potencjalne szczepy analizowano pod symulowanym ciśnieniem środowiskowym, aby zakończyć proces tworzenia i badania przesiewowego biblioteki EPF. Następnie zbadano chorobotwórczość obiecujących szczepów EPF pod kątem docelowego agrofaga (np. Spodoptera litura). Obecny protokół integruje dane dotyczące termotolerancji i produkcji konidiów z formułą ECN i analizą PCA, które mogą być używane jako standardowy system rankingowy dla badań związanych z EPF.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Cały schemat blokowy jest pokazany w Rysunek 1.

1. Izolacja i selekcja potencjalnych grzybów entomopatogenicznych (EPF)

  1. Pobrać próbkę gleby
    1. Usunąć 1 cm gleby z powierzchni, a następnie zebrać glebę na głębokości 5-10 cm za pomocą łopaty z każdego miejsca pobierania próbek.
      UWAGA: Miejsca pobierania próbek powinny znajdować się na obszarach górskich, leśnych lub słabo zaludnionych, aby uniknąć zanieczyszczenia sztucznie rozpylonymi szczepami EPF. Upewnij się, że obszary do pobierania próbek gleby są pokryte chwastami na powierzchni. Sucha gleba lub wilgotna gleba nie nadaje się do tego eksperymentu.
    2. Zapisz szczegóły każdego miejsca pobierania próbek, w tym GPS, wysokość, rodzaj pola, roczną temperaturę, roczne opady, czas zbierania (porę roku), rodzaj gleby i wartość pH.
    3. Zebrać 100 g próbki gleby do plastikowej torby i utrzymywać ją w temperaturze pokojowej, jeśli poddaje się ją protokołowi izolacji grzybów w laboratorium, w ciągu 3 godzin
      UWAGA: Jeśli próbki nie można użyć w ciągu 3 godzin, przechowuj glebę w temperaturze pokojowej w ciemnych warunkach. Jeśli eksperyment nie zostanie przeprowadzony natychmiast, próbka gleby może być przechowywana w temperaturze 4 °C przez 1 tydzień do rozpoczęcia protokołu18,19.
  2. Przynęta i izolacja EPF z mącznikiem młynarkiem (Tenebrio molitor)
    1. Umieść 100 g próbki gleby w plastikowym kubku (średnica nakrętki = 8,5 cm, wysokość = 12,5 cm), a następnie umieść 5 mącznika na powierzchni gleby w temperaturze pokojowej w ciemności na 2 tygodnie.
      UWAGA: Można również stosować inne rodzaje plastikowych pojemników na kubki. Jeśli gleba jest zbyt sucha (popękana lub piaszczysta), spryskaj gleby sterylizowanym ddH2O (około 5-10 ml). Długość ciała ok. 2,5 cm (14stadium) larw T. molitor pomaga w ekranach izolacji grzybów20.
    2. Codziennie obserwuj i rejestruj larwy pod kątem śmiertelności i grzybicy; martwe larwy należy przechowywać w kubku do 2 tygodni w celu izolacji grzybów.
      UWAGA: Zarodniki konidiów grzybowych w próbkach gleby przyczepią się do larw mącznika młynarka podczas powyższego procesu. Grzybicę grzybiczą będzie obserwowana, gdy strzępki wyrastają z błony międzysegmentowej, a następnie całe ciało zostanie pokryte grzybnią. Zarodnikowanie rozpocznie się po 7 dniach, a kolor infekcji grzybiczej zmieni się na kolor masy konidiów.
    3. Przenieś martwe owady na czystą ławkę i użyj sterylnej wykałaczki, aby zebrać konidia. Umieść je na pożywce z agarem z dekstrozą Sabouraud o mocy ćwiartki mocy (1/4 SDA) (55 mm) w laboratory21. Inkubować płytkę hodowlaną w temperaturze 25 °C przez 7 dni, aby uzyskać pierwotną kulturę grzybów.
      UWAGA: Płytkę 1/4 SDA przygotowuje się w następujący sposób: Wymieszaj 1,5 g bulionu dekstrozowego Sabouraud i 3 g agaru w 200 mlH2O, a następnie sterylizuj przez 20 min. Podwielokrotność 1/4 SDA na każdą szalkę Petriego o średnicy 55 mm przed zestaleniem. Zestalone płytki 1/4 SDA są przechowywane w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
    4. Ponownie rozpylić każdą kulturę pierwotną na jednej płytce o średnicy 55 mm 1/4 SDA w przepływie laminarnym i inkubować płytkę hodowlaną w temperaturze 25 °C przez 7 dni, aby uzyskać pojedyncze kolonie grzybów.
    5. Powtórz tę ponowną izolację ~ 2-3 razy i obserwuj pod mikroskopem świetlnym, aby uzyskać pojedyncze i czyste morfologiczne kolonie grzybów.
      UWAGA: Odizoluj cały EPF za pomocą przynęty T. molitor i przechowuj zgodnie z opisem w poniższej sekcji. Separacja, konserwacja, czysta kultura i smugowanie muszą być wykonywane w przepływie laminarnym w kolejnych sekcjach.
  3. Przechowywanie izolatów EPF
    1. Wyciąć 3 bloki agaru o średnicy 5 mm na krawędzi każdej izolowanej płytki z czystymi grzybami za pomocą świdra korkowego i umieścić je w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml jako jeden powtórzenie.
      UWAGA: Zaleca się trzy powtórzenia dla każdego izolatu grzyba do przechowywania szczepów EPF po 2badaniu wirulencji. Identyfikacja molekularna jest również zalecana, jeśli przestrzeń do przechowywania jest ograniczona.
    2. Dodać 250 μl 0,03% roztworu środka powierzchniowo czynnego (tabela materiałów) i 250 μl 60% glicerolu do probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml za pomocą mikropipety, a następnie wirować przez 10 s.
    3. Zamknąć probówkę do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml folią parafinową i schłodzić ją w lodówce o temperaturze -20 °C przez 24 godziny. Następnie przenieś wstępnie schłodzone zapasy grzybów do lodówki o temperaturze -80 °C w celu kriokonserwacji.
      UWAGA: W sekcji 1.4 użyto bardzo czystych płytek do hodowli grzybów (oprócz próbek kriogennie konserwowanych).
  4. 1. badanie chorobotwórczości dla izolatów grzybów
    1. Umieścić pięć larw T. molitor bezpośrednio na powierzchni każdej płytki z czystymi kulturami grzybów w temperaturze 25 °C.
    2. Obserwuj i rejestruj grzybicę i śmiertelność przez 10 dni. Wybierz izolat grzyba do dalszej analizy.
      UWAGA: Izolaty grzybów powodujące 100% śmiertelność są wybierane do 2.testu wirulencji, aby potwierdzić ich zjadliwość wobec larw T. molitor. Alternatywnie, badacz może dostosować kryteria zgodnie z własnym badaniem.
  5. 2. badanie wirulencji izolatów grzybów
    UWAGA: Na podstawie 1.badania przesiewowego chorobotwórczości odzyskaj wybrane izolaty grzybów z -80 °C do 2.testu wirulencji. Celem 2.testu wirulencji jest ilościowe określenie chorobotwórczości wybranych izolatów grzybów po 1. rundzie badań przesiewowych.
    1. Zbierz konidia z każdego izolatu grzyba, wirując przez 1 minutę i policz liczbę konidiów za pomocą hemocytometru.
    2. Doprowadzić zawiesinę konidiów do stężenia 1 x 107 konidiów/ml w 0,03% roztworze środka powierzchniowo czynnego (tabela materiałów).
    3. Rozprowadzić 10 μl zawiesiny grzybów na płytkach 1/4 SDA o średnicy 55 mm i rosnąć przez 7 dni w temperaturze 25 °C w ciemności.
    4. Umieść pięć larw T. molitor bezpośrednio na powierzchni każdej czystej płytki kultury grzybów (ok. 6 x 107 konidiów). Uszczelnić płytki folią parafinową i inkubować w temperaturze 25 °C w ciemności.
    5. Obserwuj i rejestruj grzybicę i śmiertelność przez 10 dni.
    6. Powtórzyć badanie (od kroku 1.51 do 1.5.5) w trzech egzemplarzach dla każdego izolatu grzyba.
      UWAGA: Izolaty grzybów powodujące 100% śmiertelność są wybierane do 3. testu wirulencji, aby potwierdzić ich zjadliwość w celu zwalczania szkodnika.
  6. 3.badanie wirulencji izolatów grzybów na obecność szkodnika docelowego (na przykład Spodoptera litura)
    1. Powtórzyć kroki od 1.5.2 do 1.5.6 z wybranymi izolatami od 2. zjadliwości w celu zbadania zjadliwości przeciwko zwalczanemu agrofagowi.
    2. Oblicz LT50 każdego izolatu grzyba22.
      UWAGA: LT50 każdego izolatu grzyba obliczono za pomocą uogólnionych modeli liniowych (GLM) przy użyciu R studio (wersja 3.4.1); Rozkład błędów quasidwumianowych i funkcja łącza logarytmicznego mogą być używane do uwzględnienia nadmiernego rozproszenia.

2. Identyfikacja molekularna EPF

  1. Ekstrakcja genomowego DNA grzybów
    1. Zebrać ok. 1 cm2 EPF z 7-dniowej płytki 1/4 SDA.
    2. Wyodrębnij genomowe DNA grzyba za pomocą zestawu do ekstrakcji genomowego DNA grzyba zgodnie z instrukcjami producenta23 (Tabela materiałów).
  2. Amplifikacja PCR i sekwencjonowanie DNA
    1. Amplifikacja regionu ITS grzyba metodą PCR próbki DNA21 przy użyciu zestawu starterów PCR Master Mix (2x), ITS1F/ITS4R class24 (Tabela 1) z następującym programem PCR: 94 °C przez 1 min, a następnie 35 cykli po 94 °C przez 30 s, 55 °C przez 30 s i 72 °C przez 1 min, następnie końcowe wydłużenie o 7 minut w temperaturze 72 °C.
      UWAGA: Zestaw starterów ITS1F/ITS4R służy do identyfikacji na poziomie rodzaju.
    2. Sekwencjonuj PCR za pomocą komercyjnej usługi sekwencjonowania.
    3. Użyj NCBI BLAST, wyszukaj podobne grzyby w bazie danych NCBI i wybierz względny typ grzyba do analizy filogenetycznej.
      UWAGA: Gatunki grzybów należące do rodzaju Metarhizium lub Beauveria powinny być dalej identyfikowane na poziomie gatunku za pomocą tef-983F/tef-2218R primer set25 (powtórz kroki od 2.1.1 do 2.2.3). W przypadku grzybów, które nie należą do rodzajów Metarhizium lub Beauveria, do identyfikacji gatunku można użyć innych markerów molekularnych, w tym liazy DNA (APN2), beta tubuliny (BTUB), największej podjednostki polimerazy RNA II (RPB1), drugiej co do wielkości podjednostki polimerazy RNA II (RPB2) i 3' części czynnika wydłużenia translacji 1 alfa (TEF)25,Lokal mieszkalny 26.
  3. Analiza filogenetyczna
    1. Użyj oprogramowania ClustalX 2.127, aby wyrównać wiele sekwencji z kroków 2.2.2 i 2.2.3. Przytnij region zachowanych sekwencji ręcznie za pomocą GeneDoc28.
    2. Przeprowadź analizę filogenetyczną za pomocą oprogramowania MEGA729 w oparciu o metody minimalnej ewolucji (ME), łączenia sąsiadów (NJ) i maksymalnego prawdopodobieństwa (ML).
      UWAGA: Wykonanie wszystkich trzech metod może pomóc w potwierdzeniu i dokładnym określeniu statusu klasyfikacji. Izolaty grzybów przesiewane za pomocą 1.badania przesiewowego chorobotwórczości są wykorzystywane do identyfikacji molekularnej na poziomie rodzaju. Izolaty grzybów przesiewane za pomocą 2. testu wirulencji są wykorzystywane do identyfikacji molekularnej i morfologicznej na poziomie gatunku.

3. Identyfikacja morfologiczna EPF

  1. Obserwacja morfologii kolonii grzybów
    1. Użyj aparatu, aby uchwycić wzrost kolonii kultur grzybów przez 7 dni i zarejestrować wzrost, formę (puszyste, jędrne) i kolor kolonii.
  2. Obserwacja konidiów i konidioforów
    1. Zeskrobać konidia z kolonii grzybów czystej kultury za pomocą pętli inokulacyjnej i przenieść zarodniki na szkiełko z 0,1% roztworem Tween 80. Następnie przykryj szkiełkiem nakrywkowym w celu lekkiej obserwacji mikroskopowej konidiów.
    2. Za pomocą skalpela przeciąć blok agaru o średnicy 5 mmi 2 z pasma strzępek na krawędzi kolonii grzybów, a następnie przenieść blok agaru na szkiełko podstawowe.
    3. Wykonaj czyszczenie w następujący sposób: Dodaj 0,1% roztwór Tween 80 na blok agaru za pomocą plastikowego zakraplacza i zmyj większość nadmiaru konidiów za pomocą pęsety. Następnie przykryj go szkiełkiem nakrywkowym w celu obserwacji mikroskopowej.
      UWAGA: 0,1% Tween 80 można zastąpić innym, silniejszym środkiem powierzchniowo czynnym (tabela materiałów) w zależności od gatunku grzyba i hydrofobowości.
    4. Zmierz i zapisz szerokość i długość konidiów i konidioforów, aby porównać różnice między różnymi izolatami grzybów.
    5. Użyj testu ANOVA firmy Welch i testu Gamesa-Howella (test post-hoc), aby przeanalizować szerokość i długość konidialną każdego szczepu za pomocą R studio (wersja 3.4.1).
      UWAGA: Analiza danych cech morfologicznych może być dostosowywana do poszczególnych przypadków. Izolaty grzybów przesiewane za pomocą 3. testu wirulencji są wykorzystywane do charakterystyki fizjologicznej i klasyfikacji ECN w sekcjach 4 i 5.

4. Badanie produktywności konidialnej i termotolerancji

  1. Test produkcji konidialnej
    1. Wyhodować wybrany izolat grzyba na 1/4 pożywki SDA w temperaturze 25 ± 1 °C w ciemności przez 10 dni.
    2. Przygotować 1 ml zawiesiny konidialnej izolatu grzybów w 0,03% roztworze środka powierzchniowo czynnego i dostosować do 1 x 107 konidiów/ml, jak opisano powyżej.
    3. Upuść trzy kropelki po 10 μl zawiesiny konidialnej na 1/4 SDA i inkubuj w temperaturze 25 °C w ciemności przez 7, 10 i 14 dni, aby policzyć zarodnikowanie grzybów.
      UWAGA: 10 μL to najlepsza objętość do zebrania bloku 5 mm z równomiernym zarodnikowaniem grzybów po wzroście grzybów przez 7-14 dni.
    4. Za pomocą świdra korkowego odłączyć blok agaru o średnicy 5 mm od środka kolonii i przenieść do 1 ml 0,03% roztworu środka powierzchniowo czynnego (tabela materiałów) w probówce mikrowirówki o pojemności 1,5 ml w każdym punkcie czasowym.
    5. Wirować rurkę z prędkością 3,000 obr./min w temperaturze pokojowej przez 15 minut i użyć hemocytometru, aby policzyć liczbę konidiów.
      UWAGA: Wzór używany do liczenia to liczba konidiów na 25 kwadratów najmniejszej komórki (rozmiar = 0,025 mm2; głębokość komory = 0,1 mm):
      Łączna liczba konidiów w 5 kwadratach ÷ 80 × (4 × 106)
    6. Powtórz trzy razy dla każdego izolatu.
  2. Test termotolerancji
    1. Wyhodować wybrany izolat grzyba na 1/4 pożywki SDA w temperaturze 25 ± 1 °C w ciemności przez 10 dni.
    2. Przygotować 1 ml zawiesiny konidialnej izolatu grzybów w 0,03% roztworze środka powierzchniowo czynnego i dostosować do 1 x 107 konidiów/ml, jak opisano powyżej.
    3. Zawiesinę konidialną należy zwirować i podgrzać w suchej łaźni o temperaturze 45 °C przez 0, 30, 60, 90 i 120 minut. Upuść trzy krople po 5 μl zawiesiny konidialnej na pożywkę 55 mm 1/4 SDA w każdym punkcie czasowym po ekspozycji na ciepło i inkubuj w temperaturze 25 ± 1 °C przez 18 h.
      UWAGA: Unikaj rozprzestrzeniania kropelek grzyba, aby móc lepiej skupić się na obszarze.
    4. Policz liczbę kiełkujących zarodników konidiów za pomocą pięciu losowo wybranych pól pod 200-krotną mikroskopią świetlną, aby określić szybkość kiełkowania.
    5. Wykonać trzy powtórzenia dla każdego izolatu.

5. Ranking efektywnej liczby konidiów (ECN)

  1. Obliczanie ECN
    UWAGA: Uzyskaj dane dotyczące produkcji konidialnej i tolerancji termicznej każdego potencjalnego szczepu grzyba przed obliczeniem całkowitej ECN21.
    1. Oblicz zmianę fałdu (FC) produkcji konidialnej w każdym punkcie czasowym:
      figure-protocol-1
      gdzie, x = punkt czasowy dla gromadzenia danych; ncp = liczba konidiów po każdym dniu wzrostu; i I = początkowa liczba wysianych konidiów.
    2. Oblicz liczbę konidiów pod wpływem obciążenia w każdym punkcie czasowym, korzystając z następującego wzoru:
      figure-protocol-2
      gdzie, y = numer ECN punktu czasowego poddanego zabiegowi; TT0 = zdolność kiełkowania konidiów niepoddanych stresowi cieplnemu (= zdolność kiełkowania 0 min obróbki cieplnej); TTz = współczynnik naprężenia to zdolność kiełkowania konidiów w różnych momentach obróbki cieplnej (z).
    3. Oblicz całkowitą wartość ECN, korzystając z następującego wzoru:
      figure-protocol-3
    4. Porównaj ECN każdego szczepu grzyba.
  2. Analiza głównych składowych (PCA) szczepów grzybów
    UWAGA: Analiza PCA potwierdza ranking ECN i pomaga w zrozumieniu korelacji między fizjologicznymi wartościami charakteru. Porównaj wartości ECN i wybierz izolaty EPF o wyższych wartościach ECN.
  3. Użyj oprogramowania R, aby utworzyć PCA, kodując:
    #Input plik danych PCA
    a = read.table("PCA.csv",sep=',',header=T)
    1. # Przetwarzanie przykładowych danych
      row.names(a) <- c("NCHU-9","NCHU-11", "NCHU-64", "NCHU-69", "NCHU-95", "NCHU-113")
      X=nazwa_wiersza(a)
      DF<- A[2:11]
    2. #PCA obliczenia
      pca <- prcomp(df, center = TRUE, scale = TRUE)
      vars <- (pca$sdev)^2
      pc1_percent = zmienne[1] / suma(zmienne)
      pc2_percent = zmienne[2] / suma(zmienne)
      wartość = PCA$X
    3. #Output plik wizualizacji PCA
      png(plik = 'pca.png', wysokość = 2000, szerokość = 2000, res = 300)
      UWAGA: Użyj 7 do 14 dni produkcji konidialnej i wszystkich danych termotolerancji, aby przeprowadzić analizę głównych składowych (PCA) w celu potwierdzenia rankingu ECN.
  4. Wybierz najlepiej działające szczepy grzybów na podstawie ECN lub PCA i przeprowadź test wirulencji docelowych szkodników w celu dalszych badań.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Izolacja i selekcja potencjalnych grzybów entomopatogenicznych (EPF)
Stosując metodę budowy biblioteki grzybów entomopatogenicznych (EPF) za pośrednictwem Tenebrio molitor, liczba grzybów bez aktywności zabijającej owady zostałaby wykluczona; W ten sposób można by znacznie zwiększyć skuteczność izolacji i wybór EPF. Podczas stosowania tej metody zarejestrowano informacje o miejscach pobierania próbek, próbkach gleby i wskaźnikach kiełkowania grzybów (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Grzyby entomopatogeniczne (EPF) zostały wykorzystane do zwalczania owadów. Istnieje kilka metod izolacji, selekcji i identyfikacji EPF30,31,32. Porównując różne rodzaje metod przynęty na owady, Beauveria bassiana i Metarhizium anisopliae były powszechnie spotykane w przynętach na owady 6,12,13,14.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują, że w tej pracy nie występuje konflikt interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez Grant 109-2313-B-005 -048 -MY3 z Ministerstwa Nauki i Technologii (MOST).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Agar Klasa bakteriologicznaBIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd.AGR001Nadaje się do większości zastosowań w hodowlach komórkowych / biologii molekularnej.
AGAROSE, klasa biotechnologicznaBIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd.AGA001Do elektroforezy DNA.
BioGreen Safe DNA Gel BufferBIOMANSDB001T
Mosiężny świdr korkowyDoggerD89A-44001
Canon kiss x2CanonEOS 450DDo rekordowej morfologii kolonii szczepów
Inkubator o stałej temperaturzeYihder Co., Ltd.LE-509RDHodowla grzybów.
cubee Mini-wirówkaGeneReachMC-CUBEE
DigiGel 10 Cyfrowy system obrazowania żeluTOPBIODGIS-12S
Finnpipette F2 0,2 do 2 i mikro; L PipetaThermo Scientific4642010
Finnpipette F2 1 do 10 i mikro; L PipetaThermo Scientific4642030
Finnpipette F2 10 do 100 i mikro; L PipetaThermo Scientific4642070
Finnpipette F2 100 do 1000 i mikro; L PipetaThermo Scientific4642090
Finnpipette F2 2 do 20 i mikro; L PipetaThermo Scientific4642060
Finnpipette F2 20 do 200 i mikro; L PipetaThermo Scientific4642080
GeneAmp PCR System 9700Applied Biosystems4342718
GenepHlow Gel/PCR Kit GenepHlowGeneaidDFH100
GeniusMajor ScienceMD-01N
Cylinder z podziałką Niestandardowy A 100mLSIBATASABP-1195906Zmierz objętość odczynników.
Ręczny licznik tallySDINO.1055
HemocytometrbiomanAP-0650010Oblicz liczbę zarodników
Pętla inokulacyjnaDoggerD8GA-23000
pokrywkaIDEAHOUSERS92004
Szkło z mikro pokrywąMUTO PURE CHEMICALS CO., LTD24241
System obrazowania mikroskopowegoSAGE VISION CO., LTDSGHD-3.6C
Szkiełka mikroskopoweDOGGERDG75001-07105
Mupid-2plus Elektroforeza żelowa DNAADVANCEAD110
Mikroskop optyczny NikonSAGE VISION CO., LTDEclipse CI-L
Plastikowy kubekIDEAHOUSECS60016
Zestaw drożdży Presto Mini gDNAGeneaidGYBY300Zestaw do ekstrakcji genomowego DNA grzybów
Sabouraud Dextrose Broth (Sabouraud Liquid Medium)HiMedia Leading BioSciences CompanyM033Służy do hodowli drożdży, pleśni i mikroorganizmów kwaśnych.
Ostrze skalpela nr 23Swann-Morton310
Rękojeść skalpela nr 4AGARWAL SURGICALSSSS -FOR-01-91
ŁopataZapisz & BezpiecznyA -1580242 -00
Silwet L-77bioman(phytotech)S7777Surfaktant
Sorvall Legend Micro 17 MikrowirówkaThermo Scientific75002403
Stalowa pęsetaSIPEL ELECTRONIC SAGG-SA
Sterylna szalka PetriegoBIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd.1621Płytkie cylindryczne pojemniki z dopasowanymi pokrywkami, przeznaczone specjalnie do stosowania w mikrobiologii lub hodowlach komórkowych.
ThermoCell MixingBlockBIOERMB-101
Tween 80FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation164-21775
Zamrażarka TwinGuard ULTPanasonic Healthcare Holdings Co., Ltd.MDF-DU302VX-80° C próbka przechowywana.
Pionowa szafka podłogowaChih ChinBSC-3Hodowla grzybów.
Vortex Genie IIScientificSIG560
Torby do przechowywania na zamek błyskawicznyZapisz i BezpiecznyA -1248915 -00
100 pz Drabinka DNAGeneaidDL007-20
° C ZamrażarkaFRIGIDAIREFrigidaireFFFU21M1QW-20° C próbka i odczynniki doświadczalne przechowywane.
2X SuperRed PCR Master MixTOOLSTE-SR01
50X TAE BuforBIOMANTAE501000
Inkubator do suchej kąpieli

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wraight, S. P., Carruthers, R. I. Biopesticides: use and Delivery. , Springer. 233-269 (1999).
  2. Chase, A., Osborne, L., Ferguson, V. Selective isolation of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae from an artificial potting medium. Florida Entomologist. , 285-292 (1986).
  3. Meyling, N. V. Methods for isolation of entomopathogenic fungi from the soil environment. University of Copenhagen. , Frederiksberg Denmark. Department of Ecology 1-18 (2007).
  4. Zimmermann, G. The 'Galleria bait method'for detection of entomopathogenic fungi in soil. Journal of applied Entomology. 102 (1-5), 213-215 (1986).
  5. Schneider, S., Widmer, F., Jacot, K., Kölliker, R., Enkerli, J. Spatial distribution of Metarhizium clade 1 in agricultural landscapes with arable land and different semi-natural habitats. Applied Soil Ecology. 52, 20-28 (2012).
  6. Hallouti, A., et al. Diversity of entomopathogenic fungi associated with Mediterranean fruit fly (Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae)) in Moroccan Argan forests and nearby area: impact of soil factors on their distribution. BMC Ecology. 20 (1), 1-13 (2020).
  7. Meyling, N. V., Eilenberg, J. Occurrence and distribution of soil borne entomopathogenic fungi within a single organic agroecosystem. Agriculture, Ecosystems and Environment. 113 (1-4), 336-341 (2006).
  8. Skalický, A., Bohatá, A., Šimková, J., Osborne, L. S., Landa, Z. Selection of indigenous isolates of entomopathogenic soil fungus Metarhizium anisopliae under laboratory conditions. Folia Microbiologica. 59 (4), 269-276 (2014).
  9. Veen, K., Ferron, P. A selective medium for the isolation of Beauveria tenella and of Metarrhizium anisopliae. Journal of Invertebrate Pathology. 8 (2), 268-269 (1966).
  10. Goettel, M., Inglis, D. Manual of Techniques in Insect Pathology. Lacy, L. , Academic. Amsterdam. 213-249 (1997).
  11. Luz, C., Netto, M. C. B., Rocha, L. F. N. In vitro susceptibility to fungicides by invertebrate-pathogenic and saprobic fungi. Mycopathologia. 164 (1), 39-47 (2007).
  12. Mantzoukas, S., et al. Trapping entomopathogenic fungi from vine terroir soil samples with insect baits for controlling serious pests. Applied Sciences. 10 (10), 3539(2020).
  13. Goble, T., Dames, J., Hill, M., Moore, S. The effects of farming system, habitat type and bait type on the isolation of entomopathogenic fungi from citrus soils in the Eastern Cape Province, South Africa. BioControl. 55 (3), 399-412 (2010).
  14. Nishi, O., Iiyama, K., Yasunaga-Aoki, C., Shimizu, S. Isolation of entomopathogenic fungi from soil by using bait method with termite, Reticulitermes speratus. Enotomotech. 35, 21-26 (2011).
  15. Castrillo, L. ARS Collection of Entomopathogenic Fungal Cultures (ARSEF). , (2014).
  16. Fungal database WorldWide Collection of Entomopathogenic Fungi. University of Vermont. , Available from: http://www.uvm.edu/~entlab/Fungus.html (2019).
  17. Kim, J. C., et al. Tenebrio molitor-mediated entomopathogenic fungal library construction for pest management. Journal of Asia-Pacific Entomology. 21 (1), 196-204 (2018).
  18. Keyser, C. A., Henrik, H., Steinwender, B. M., Meyling, N. V. Diversity within the entomopathogenic fungal species Metarhizium flavoviride associated with agricultural crops in Denmark. BMC Microbiology. 15 (1), 1-11 (2015).
  19. Quesada-Moraga, E., Navas-Cortés, J. A., Maranhao, E. A., Ortiz-Urquiza, A., Santiago-Álvarez, C. Factors affecting the occurrence and distribution of entomopathogenic fungi in natural and cultivated soils. Mycological Research. 111 (8), 947-966 (2007).
  20. Park, J. B., et al. Developmental characteristics of Tenebrio molitor larvae (Coleoptera: Tenebrionidae) in different instars. International Journal of Industrial Entomology. 28 (1), 5-9 (2014).
  21. Chang, J. -C., et al. Construction and selection of an entomopathogenic fungal library from soil samples for controlling Spodoptera litura. Frontiers in Sustainable Food Systems. 5, 15(2021).
  22. Podder, D., Ghosh, S. K. A new application of Trichoderma asperellum as an anopheline larvicide for eco friendly management in medical science. Scientific reports. 9 (1), 1-15 (2019).
  23. Geneaid Biotech Ltd. Presto Mini gDNA Yeast, Ver. 04.27.17. , Available from: https://www.geneaid.com/data/files/1605664221308055331.pdf (2021).
  24. White, T. J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR protocols: A guide to methods and applications. 18 (1), 315-322 (1990).
  25. Kepler, R. M., Humber, R. A., Bischoff, J. F., Rehner, S. A. Clarification of generic and species boundaries for Metarhizium and related fungi through multigene phylogenetics. Mycologia. 106 (4), 811-829 (2014).
  26. Kepler, R. M. A phylogenetically-based nomenclature for Cordycipitaceae (Hypocreales). IMA Fungus. 8 (2), 335-353 (2017).
  27. National Resource for Biomedical Supercomputing. GeneDoc: a tool for editing and annotating multiple sequence alignments. Pittsburgh Supercomputing Center's National Resource for Biomedical Supercomputing. , Available from: http://www.nrbsc.org/downloads (1997).
  28. Thompson, J. D., Gibson, T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins, D. G. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research. 25 (24), 4876-4882 (1997).
  29. Kumar, S., Stecher, G., Tamura, K. MEGA7: Molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets. Molecular Biology and Evolution. 33 (7), 1870-1874 (2016).
  30. Herlinda, S., Mulyati, S. I. Selection of isolates of entomopathogenic fungi and the bioefficacy of their liquid production against Leptocorisa oratorius nymphs. Microbiology Indonesia. 2 (3), 9(2008).
  31. Herlinda, S., Irsan, C., Mayasari, R., Septariani, S. Identification and selection of entomopathogenic fungi as biocontrol agents for Aphis gossypii from South Sumatra. Microbiology Indonesia. 4 (3), 137-142 (2010).
  32. Montes-Bazurto, L. G., Peteche-Yonda, Y., Medina-Cardenas, H. C., Bustillo-Pardey, A. E. Selection of entomopathogenic fungi for the biological control of Demotispa neivai (Coleoptera: Chrysomelidae) in oil palm plantations in Colombia. Journal of Entomological Science. 55 (3), 388-404 (2020).
  33. Shin, T. -Y., Choi, J. -B., Bae, S. -M., Koo, H. -N., Woo, S. -D. Study on selective media for isolation of entomopathogenic fungi. International Journal of Industrial Entomology. 20 (1), 7-12 (2010).
  34. Sharma, L., Oliveira, I., Torres, L., Marques, G. Entomopathogenic fungi in Portuguese vineyards soils: Suggesting a 'Galleria-Tenebrio-bait method'as bait-insects Galleria and Tenebrio significantly underestimate the respective recoveries of Metarhizium (robertsii) and Beauveria (bassiana). MycoKeys. (38), 1(2018).
  35. Rodríguez, M., Gerding, M., France, A. Selección de Hongos Entomopatógenos para el Control de Varroa destructor (Acari: Varroidae). Chilean journal of agricultural research. 69 (4), 534-540 (2009).
  36. Yang, H., et al. Persistence of Metarhizium (Hypocreales: Clavicipitaceae) and Beauveria bassiana (Hypocreales: Clavicipitaceae) in tobacco soils and potential as biocontrol agents of Spodoptera litura (Lepidoptera: Noctuidae). Environmental entomology. 48 (1), 147-155 (2019).
  37. Muñiz-Reyes, E., Guzmán-Franco, A. W., Sánchez-Escudero, J., Nieto-Angel, R. Occurrence of entomopathogenic fungi in tejocote (C rataegus mexicana) orchard soils and their pathogenicity against R hagoletis pomonella. Journal of Applied Microbiology. 117 (5), 1450-1462 (2014).
  38. Lacey, L. A., et al. Goettel Insect pathogens as biological control agents: Back to the future. Journal of Invertebrate Pathology. 132, 1-41 (2015).
  39. Humber, R. A. Manual of techniques in insect pathology. , Elsevier. 153-185 (1997).
  40. Rehner, S. A., Buckley, E. A Beauveria phylogeny inferred from nuclear ITS and EF1-α sequences: evidence for cryptic diversification and links to Cordyceps teleomorphs. Mycologia. 97 (1), 84-98 (2005).
  41. Quandt, C. A., et al. Phylogenetic-based nomenclatural proposals for Ophiocordycipitaceae (Hypocreales) with new combinations in Tolypocladium. IMA fungus. 5 (1), 121-134 (2014).
  42. Shah, F. A., Wang, C. S., Butt, T. M. Nutrition influences growth and virulence of the insect-pathogenic fungus Metarhizium anisopliae. FEMS Microbiology Letters. 251 (2), 259-266 (2005).
  43. Ignoffo, C. Environmental factors affecting persistence of entomopathogens. Florida Entomologist. , 516-525 (1992).
  44. Rodrigues, I. W., Forim, M., Da Silva, M., Fernandes, J., Batista Filho, A. Effect of ultraviolet radiation on fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae, pure and encapsulated, and bio-insecticide action on Diatraea saccharalis. Advances in Entomology. 4 (3), 151-162 (2016).
  45. Paula, A. R., Ribeiro, A., Lemos, F. J. A., Silva, C. P., Samuels, R. I. Neem oil increases the persistence of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae for the control of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) larvae. Parasites and Vectors. 12 (1), 1-9 (2019).
  46. Morley-Davies, J., Moore, D., Prior, C. Screening of Metarhizium and Beauveria spp. conidia with exposure to simulated sunlight and a range of temperatures. Mycological Research. 100 (1), 31-38 (1996).
  47. Rangel, D. E., Braga, G. U., Flint, S. D., Anderson, A. J., Roberts, D. W. Variations in UV-B tolerance and germination speed of Metarhizium anisopliae conidia produced on insects and artificial substrates. Journal of Invertebrate Pathology. 87 (2-3), 77-83 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Metoda przyn ty glebowejprodukcja konidi wtest termotolerancjiprzesiew patogenno ciidentyfikacja molekularnaSpodoptera liturabiologiczna kontrola

Powiązane artykuły