Artykuł metodologiczny

Protokół analizy i konsolidacji danych wyjściowych TrackMate do pomiaru dwuwymiarowej ruchliwości komórek za pomocą śledzenia jądrowego

DOI:

10.3791/62885

⸱

18 grudnia 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Colorado Boulder, 2Department of Applied Mathematics, University of Colorado Boulder

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół do wysokoprzepustowego pomiaru ruchliwości komórek w keratynocytach HaCaT opisuje metody zbierania i przetwarzania obrazów jąder komórkowych oraz śledzenia cząstek za pomocą wtyczki ImageJ TrackMate.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zbiorowa migracja komórkowa odgrywa kluczową rolę w wielu podstawowych procesach biologicznych, w tym w rozwoju, gojeniu się ran i przerzutach raka. Aby zrozumieć regulację ruchliwości komórek, musimy być w stanie łatwo i konsekwentnie ją mierzyć w różnych warunkach. W tym miejscu opisujemy metodę pomiaru i ilościowego określania ruchliwości pojedynczych komórek i objętości keratynocytów HaCaT za pomocą barwienia jądrowego. Ta metoda obejmuje skrypt MATLAB do analizowania plików wyjściowych TrackMate w celu obliczenia przemieszczeń, współczynników ruchliwości i kątów trajektorii w pojedynczych komórkach i zbiorczo dla miejsca obrazowania. Ten skrypt analizy ruchliwości pozwala na szybką, prostą i skalowalną analizę szybkości ruchliwości komórek na podstawie danych TrackMate i może być szeroko stosowany do identyfikacji i badania regulacji ruchliwości w komórkach nabłonkowych. Udostępniamy również skrypt MATLAB do reorganizacji filmów mikroskopowych zebranych pod mikroskopem i konwersji ich na stosy TIF, które można zbiorczo analizować za pomocą wtyczki ImageJ TrackMate. Wykorzystując tę metodologię do zbadania ról połączeń adherenowych i dynamiki cytoszkieletu aktyny w regulacji ruchliwości komórek w keratynocytach HaCaT, wykazujemy dowody na to, że aktywność Arp2 / 3 jest wymagana dla podwyższonej ruchliwości obserwowanej po wyczerpaniu α-kateniny w keratynocytach HaCaT.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Precyzyjna, responsywna regulacja ruchliwości komórek w komórkach nabłonkowych jest kluczowa dla gojenia się ran i uzupełniania warstwy nabłonkowej. Brak utrzymania ruchliwości może prowadzić do problemów z rozwojem embrionalnym i gojeniem się ran1, a nadaktywna sygnalizacja ruchliwości jest kluczowym czynnikiem przyczyniającym się do przerzutów raka2.

Zrozumienie komórkowej kontroli ruchliwości keratynocytów HaCaT dostarcza ważnych informacji na temat tych procesów. Przedstawione tutaj procedury zapewniają spójne pomiary i obliczenia średniej wielkości ruchliwości komórkowej na poziomie pojedynczej komórki lub populacji. Użyliśmy tej metody do pomiaru ruchliwości keratynocytów HaCaT po zaburzeniach genetycznych lub leczeniu inhibitorami małocząsteczkowymi, aby zrozumieć sygnalizację komórkową, która kontroluje szybkość ruchliwości. Dostarczony skrypt MATLAB mierzy zarówno średnią prędkość, jak i średni kierunek ruchliwości dla każdej komórki.

Zbiorowa ruchliwość komórek jest kluczowa dla przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego zarówno w rozwoju, jak i w przerzutach raka3. Komórki osiągają ruchliwość poprzez koordynację adhezji, polaryzacji, wypukłości i retrakcji4. Procesy te opierają się w dużej mierze na skoordynowanej regulacji dynamicznego cytoszkieletu aktynowego. Aktywacja GTPazy Rac1 za PI3K lub różnymi receptorowymi kinazami tyrozynowymi polaryzuje komórkę, powodując polimeryzację aktyny5. Dynamika cytoszkieletu aktyny jest regulowana przez tę i inne GTPazy, w których pośredniczy Rho, które są aktywowane przez różne czynniki wzrostu. Te GTPazy za pośrednictwem Rho aktywują następnie kompleks Arp2/3, który stymuluje rozgałęzianie się aktyny6. Ta dynamika cytoszkieletu aktynowego jest ściśle związana z innym kluczowym regulatorem ruchliwości: połączeniami międzykomórkowymi. Szczególnie interesuje nas, w jaki sposób połączenia adherenów, które tworzą silne zrosty między komórkami, współdziałają z cytoszkieletem aktyny, aby utrzymać integralność tkanki7.

Wcześniej wykazaliśmy, że keratynocyty HaCaT wyrażające knockdown α-kateniny za pośrednictwem shRNA wykazują wyższe wskaźniki ruchliwości niż te wyrażające niekontrolowaną kontrolę shRNA8. Chcemy wykorzystać opracowane przez nas narzędzia do analizy ruchliwości, aby lepiej zrozumieć mechanizm tej podwyższonej ruchliwości po wyczerpaniu α-kateniny. α-katenina jest wymaganym składnikiem cytozolowym połączeń adherens9. Uczestniczy w połączeniach adherenowych poprzez interakcję z ß-kateniną, którą wiąże jako monomer10,11. Jednak α-katenina może również dysocjować od połączeń adherens, tworząc homodimer, który wiąże i wiąże włókna aktynowe, co hamuje aktywność Arp2/310,11. Chociaż α-katenina nie oddziałuje bezpośrednio z aktyną, gdy jest związana z ß-kateniną, nadal może ułatwiać lub wzmacniać koordynację między połączeniami adherens a cytoszkieletem poprzez wiązanie z winkuliną, która stabilizuje filamenty aktynowe12.

Chociaż wtyczka TrackMate dla ImageJ jest dobrze znaną metodą śledzenia cząstek, która może być używana do śledzenia jąder komórkowych, stwierdziliśmy, że dostępne narzędzia do analizowania, analizowania i konsolidacji danych wyjściowych TrackMate w celu obliczenia ruchliwości komórek dla wielu miejsc obrazowania nie były zintegrowane i były trudne w użyciu dla osób bez doświadczenia w wielu językach programowania. Tinevez i Herbert oferują podstawowe informacje na temat korzystania z TrackMate, ale sekcja analizy przemieszczenia średniokwadratowego wymaga znacznych umiejętności MATLAB13. Istniejące metody wyodrębniania wskaźników ruchliwości z filmów z mikroskopii poklatkowej oferują bardziej złożone analizy trójwymiarowe, ale wymagają większej wiedzy programistycznej14,15. Pathfinder, oprogramowanie do śledzenia i analizy ruchliwości komórek, opracowane wcześniej w naszym laboratorium, mierzy prędkość i kierunek migracji komórek, ale jest wykonywalne tylko na komputerach z systemem Windows i wymaga ograniczającego środowiska Java Runtime16. Ponieważ TrackMate jest tak niezawodnym i dobrze udokumentowanym narzędziem, opracowaliśmy prostą metodę generowania, analizowania i organizowania dużych dwuwymiarowych zestawów danych TrackMate za pomocą MATLAB. Nasz skrypt usuwa również powtarzające się punkty danych całkowitych, które czasami występują w danych wyjściowych TrackMate po tym, jak śledzona komórka przekroczy miejsce obrazowania, umożliwiając włączenie komórek o wysokiej ruchliwości i/lub kierunkowości do analizy bez uwzględniania tych fałszywych punktów danych. Udostępniamy również skrypt do reorganizacji obrazów zebranych na ImageXpress Micro XL w stosy TIFF, które można analizować zbiorczo za pomocą TrackMate.

W tym protokole, komórki są umieszczane na 96-dołkowej płytce obrazowej. Po pozostawieniu wystarczającej ilości czasu, aby komórki przylgnęły do dna płytki, traktujemy je barwnikiem jądrowym Hoechst i wszelkimi małymi cząsteczkami, których wpływ na ruchliwość jest interesujący. Zbieramy obrazy jąder komórkowych w ciągu pięciu lub więcej godzin, po czym sekwencje obrazów są przetwarzane na odjęte w tle stosy TIFF za pomocą MATLAB. Te stosy TIFF są analizowane za pomocą wtyczki ImageJ TrackMate, która rejestruje i śledzi każdą pojedynczą komórkę w różnych punktach czasowych17. Po wygenerowaniu ścieżek komórek dla wszystkich miejsc obrazowania używamy niestandardowego skryptu MATLAB, aby usunąć fałszywe punkty danych, które pojawiają się po opuszczeniu pola obrazowania przez komórki i obliczyć średnie współczynniki ruchliwości dla każdego miejsca obrazowania. Skrypt analizuje tylko komórki, które są śledzone dla określonej przez użytkownika minimalnej liczby punktów czasowych i umożliwia użytkownikowi filtrowanie komórek według całkowitej odległości i/lub przebytego kierunku. Wynikiem jest średnie przemieszczenie, średni kierunek ruchu, całkowity przemieszczenie i ogólny kierunek ruchu dla każdej komórki, które są używane do obliczania średnich objętościowych tych wartości dla wszystkich komórek w miejscu obrazowania. Protokół ten może być wykonywany zbiorczo w dużych eksperymentach obrazowych, co nadaje się do stosunkowo wysokoprzepustowej analizy ruchliwości (Rysunek 1).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla komórkowa i przygotowanie płytki obrazowej

  1. Hodowla komórek HaCaT w pożywce do hodowli komórkowych (zmodyfikowana pożywka Eagle's Medium firmy Dulbecco uzupełniona 2 mM L-glutaminą, 100 U/ml penicyliny/streptomycyny i 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej) w temperaturze 37 °C i 5% dwutlenku węgla w wilgotnym inkubatorze.
  2. Zasiej pożądaną liczbę komórek na studzienkę (używamy 5000 - 20 000 komórek / dołek) w 96-dołkowej płytce obrazowej, takiej jak 96-dołkowa mikropłytka polistyrenowa. Do trzech dołków dodaj tylko pożywkę (bez komórek).
  3. Oprzyj płytkę na całkowicie płaskiej powierzchni przez 20 - 30 minut, aby komórki mogły przyczepić się do dna płytki z równomiernym rozkładem przestrzennym.
  4. Przenieść płytkę do nawilżonego inkubatora do hodowli komórkowych (37 °C, 5% dwutlenku węgla) na 4-6 godzin, aby komórki całkowicie przylegały do dna płytki.
  5. Usunąć pożywkę z płytki i zastąpić pożywką do hodowli komórkowych z 2 μg/ml barwnika Hoechsta (rozcieńczenie 1:5000 roztworu podstawowego 1 mg/ml).
  6. Płytkę z powrotem umieścić w nawilżonym inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% dwutlenku węgla) na 2 godziny.
  7. Delikatnie umyj płytkę trzykrotnie 100 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami na studzienkę przed dodaniem 90 μl pożywki do obrazowania (bez czerwieni fenolowej Zmodyfikowanej pożywki Dulbecco Eagle's Medium uzupełnionej 2 mM L-glutaminy, 100 U/ml penicyliny/streptomycyny i 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej) do każdej studzienki.
  8. W przypadku pomiaru działania inhibitorów małocząsteczkowych lub innych efektorów, należy traktować komórki bezpośrednio przed obrazowaniem.

2. Obrazowanie

  1. Zobrazuj płytkę (w tym studzienki zawierające tylko pożywkę) w 10-krotnym powiększeniu w mikroskopie z nawilżoną komorą środowiskową o temperaturze 37 °C i 5% dwutlenku węgla.
    UWAGA: Skrypty analityczne w tym protokole są pisane dla danych zebranych za pomocą mikroskopu szerokokątnego ImageXpress Micro XL firmy Molecular Devices.
  2. Zbieraj obrazy zgodnie z rozdzielczością czasową wymaganą przez eksperyment. Aby uzyskać najlepsze wyniki, rejestruj co najmniej 4 punkty czasowe na godzinę przez co najmniej 5 godzin. W przypadku pomiaru wpływu inhibitorów małocząsteczkowych lub innych zaburzeń na komórki, należy obrazować przez co najmniej 5 godzin po oczekiwanym czasie uzyskania efektu. Na naszych potrzeby obrazujemy 100 8-minutowych punktów czasowych o łącznym czasie obrazowania 13 h 20 min.

3. Przetwarzanie obrazu

  1. Użyj dostarczonego niestandardowego skryptu MATLAB "ImageReorganizer.m", aby usunąć obrazy miniatur i zreorganizować pliki obrazów według miejsca, a nie punktu czasowego. ImageXpress wyświetla pliki w tej organizacji folderów: "[Nazwa eksperymentu] > [RRRR-MM-DD] > [Numer uruchomienia] > Timepoint_[Punkt czasowy] > [Pliki obrazów]". Po reorganizacji obrazów skrypt ten wykonuje odejmowanie tła od obrazów z każdego punktu czasowego przy użyciu uśrednionych i rozmytych gaussowskich obrazów studni tylko multimedialnych z tego punktu czasowego. Ten skrypt następnie organizuje obrazy odjęte w tle w stos TIFF dla każdego miejsca obrazowania. Każdy stos TIFF ma nazwę "[Well]_[Site].tif".
    1. Jeśli eksperyment trwał dłużej niż jeden dzień, połącz zawartość folderów [Numer uruchomienia] ze wszystkich dni, tak aby wszystkie podfoldery "Timepoint_[Punkt czasu]" znajdowały się w tym samym folderze "[Numer uruchomienia]".
    2. Zauważ, że ten skrypt wymaga funkcji MATLAB int2strz18. Wprowadź lokalną ścieżkę do tej funkcji po "addpath" w wierszu 2.
    3. Wprowadź wiersze dla źródeł tylko dla multimediów jako "puste wiersze" w wierszu 9, a kolumny jako "puste kolumny" w wierszu 10.
    4. Wprowadź wiersze dla studni doświadczalnych jako "wiersze" w wierszu 15, a kolumny jako "kolumny" w wierszu 16. Wprowadź liczbę miejsc obrazowania na studnię oraz "miejsc" w wierszu 17.
    5. Wprowadź nazwę ścieżki do folderu "[Numer uruchomienia]" w pasku ścieżki w programie MATLAB i uruchom skrypt.

4. Śledzenie komórek

UWAGA: TrackMate może być uruchomiony na wszystkich stosach TIFF w wyznaczonym katalogu przy użyciu nieco zmodyfikowanej wersji skryptu Run_TrackMate_Headless.groovy od Tinevez et al.17 lub może być wykonany ręcznie dla każdego stosu TIFF z osobna. Uruchamiamy FIJI ręcznie na kilku przykładowych stosach TIFF, aby upewnić się, że używamy prawidłowych parametrów, zanim uruchomimy skrypt Groovy na wszystkich stosach TIFF przy użyciu tych parametrów.

  1. Aby uruchomić wtyczkę TrackMate w FIDŻI dla wszystkich stosów TIFF w folderze, pobierz i użyj skryptu Run_TrackMate_Headless.groovy z Tinevez et al.17 zgodnie z dostarczonym przez nich protokołem. Używamy nieco zmodyfikowanej wersji tego skryptu, która pozwala nam łatwo wsadować zarówno pliki wejściowe, jak i nazwy plików wyjściowych oraz wprowadzać wszystkie parametry za pomocą jednego graficznego interfejsu użytkownika do wprowadzania. Poniżej znajdują się szczegółowe instrukcje dotyczące korzystania z tego zmodyfikowanego skryptu, który jest dostępny tutaj jako TrackMate_Headless_Mod.groovy.
    1. Otwórz skrypt na FIDŻI, wybierając File>Open, a następnie przechodząc do lokalizacji skryptu TrackMate_Headless_Mod.groovy.
    2. Wybierz pozycję Uruchom.
    3. Wprowadź katalog, w którym znajdują się stosy TIFF (domyślne dane wyjściowe z "StackGenerator.m" powinny mieć postać "[Nazwa eksperymentu] > [RRRR-MM-DD] >> stosy") jako "Katalog wejściowy".
    4. Utwórz katalog wyjściowy i wprowadź jego nazwę ścieżki jako "Katalog wyjściowy". Wartość domyślna dla rozszerzenia pliku powinna mieć wartość ".tif; ", jeśli nie, wprowadź ".tif" jako "Rozszerzenie pliku".
    5. Aby uruchomić TrackMate tylko na podzbiorze plików w katalogu, użyj przestrzeni wejściowej po "Nazwa pliku zawiera", aby je uwzględnić. W przeciwnym razie pozostaw to miejsce puste.
    6. Zaznacz opcję "Zachowaj strukturę katalogów podczas zapisywania".
    7. Wprowadź "Promień plamki", "Próg jakości", "Maksymalny odstęp między klatkami", "Maksymalna odległość łączenia" i "Maksymalna odległość zamykania przerwy" w pikselach zgodnie z żądanymi ustawieniami. Zwykle używamy odpowiednio 3,5, 18, 2, 15 i 40 dla jąder HaCaT przy 10-krotnym powiększeniu.
    8. Wybierz opcję OK. Ten skrypt powinien wyprowadzić plik XML dla każdego stosu TIFF w wyznaczonym katalogu wyjściowym.
  2. Alternatywnie, uruchom wtyczkę TrackMate w FIJI ręcznie dla każdego stosu TIFF zgodnie z protokołem opisanym w Tinevez et al.13
    1. Otwórz stos TIFF w FIDŻI i otwórz wtyczkę TrackMate, wybierając Wtyczki >Tracking > TrackMate na pasku menu.
    2. Jeśli w wyskakującym okienku zostanie wyświetlony monit "Wygląda na to, że ten obraz ma 1 punkt czasowy, ale [liczba punktów czasowych] wycinki. Czy chcesz zamienić litery Z i T?" wybierz opcję Tak.
    3. W TrackMate v4.0.1 użyj ustawień domyślnych, z wyjątkiem "Szacowana średnica plamy" (używamy 7.000 pikseli dla jąder HaCaT przy 10-krotnym powiększeniu) i progu (używamy 18.000, ale będzie się to różnić w zależności od użytego mikroskopu i intensywności barwnika Hoechst).
    4. Użyj funkcji Podgląd, aby zapewnić zoptymalizowane wykrywanie cząstek i w razie potrzeby dostosować średnicę plamki i ustawienia progowe.
    5. W przypadku opcji "Maksymalna odległość zamykania odstępów" ustawienia domyślne często działają dla podstawowej ruchliwości HaCaT, ale maksymalna odległość zamykania luki może wymagać zwiększenia do 40,0 pikseli w warunkach, które zwiększają ruchliwość.
    6. Wizualnie potwierdź, że śledzenie jest zoptymalizowane z minimalnymi przerwami w śladach komórek.
    7. W obszarze Wybierz akcję [sic] wybierz opcję Eksportuj ścieżki do pliku XML i wykonaj.
    8. Powtórz te czynności dla wszystkich stosów TIFF.

5. Kwantyfikacja wskaźników ruchliwości

UWAGA: Użyj dostarczonego niestandardowego skryptu MATLAB "TrackMateAnalysis.m", aby usunąć nieudane ślady i określić ilościowo ruchliwość wszystkich plików wyjściowych TrackMate. Skrypt usuwa ścieżki, które wychodzą poza ramkę (których lokalizacja jest domyślnie śledzona jako liczby całkowite) oraz ścieżki, które są śledzone przez mniej niż określoną liczbę punktów czasowych. Skrypt usuwa ścieżki, które wychodzą poza ramkę (których lokalizacja jest domyślnie śledzona jako liczby całkowite) oraz ścieżki, które są śledzone przez mniej niż określoną liczbę punktów czasowych. Wynikiem jest średnie przemieszczenie na punkt czasowy dla pojedynczych komórek i wszystkich komórek w miejscu obrazowania. (Przykładowe dane wyjściowe: 'Output.mat')

  1. Zauważ, że ten skrypt wymaga dostarczonej funkcji MATLAB "import_trackmate_xml.m". Wprowadź lokalną ścieżkę do tej funkcji po "addpath" w wierszu 4.
  2. W wierszu 7 wskaż minimalną liczbę punktów czasowych, w których cząstka powinna być śledzona, aby została uwzględniona w skonsolidowanych danych wyjściowych.
  3. W wierszach 12 i 13 wskaż zakres przebytych odległości (w pikselach), które powinny zostać uwzględnione w filtrowanej analizie. Aby uwzględnić wszystkie możliwe przebyte odległości, wprowadź zakres od 0 do szerokości pola obrazowania.
  4. W wierszach 14 i 15 należy wskazać zakres trajektorii (w stopniach), które powinny zostać uwzględnione w analizie z filtrem. Aby uwzględnić wszystkie możliwe trajektorie, wprowadź zakres od 0 do 360.
  5. Uruchom skrypt w folderze zawierającym wszystkie wyjściowe pliki XML TrackMate.
    UWAGA: Skrypt generuje i zapisuje strukturę komórek MATLAB zawierającą wszystkie dane wygenerowane w tej analizie. Tables{1,:} zawiera listę nazw wyjściowych plików XML Trackmate dla każdego miejsca obrazowania analizowanego przez ten skrypt. Tabele{2,:} to podstruktura zawierająca pozycje (piksele), przemieszczenia (piksele) i kąty ruchu (stopnie, gdzie 0° oznacza kierunek ruchu w prawo w obrębie miejsca obrazowania) dla wszystkich pojedynczych komórek w każdym punkcie czasowym. Zawiera również całkowitą przebytą odległość (piksele), średnią ruchliwość (piksele/punkt czasowy), średni kąt podróży (stopnie) dla każdej komórki we wszystkich punktach czasowych, a także całkowity kąt podróży między pierwszym a ostatnim punktem czasowym dla każdej komórki. 3. i 4. wiersz tabel zawierają odpowiednio wartości średniej i odchylenia standardowego (piksele/punkt czasowy) dla wszystkich komórek we wszystkich punktach czasowych w każdym miejscu obrazowania. Wiersze 5 i 6 zawierają odpowiednio wartości średniej i odchylenia standardowego dla całkowitej odległości przebytej (piksele) przez wszystkie komórki we wszystkich punktach czasowych w każdym miejscu obrazowania. Wiersze 7 i 8 zawierają wartości średnie i odchylenia standardowego dla całkowitego kąta ruchu (stopnie) między pierwszym a ostatnim punktem czasowym dla wszystkich komórek w miejscu obrazowania. Podczas gdy wiersze 3–8 tabel zawierają te wartości dla wszystkich komórek, które spełniają minimalne kryteria śledzenia punktów czasowych, wiersze 9–14 zawierają te same wartości, ale tylko dla komórek, które spełniają kryteria filtrowania wskazane przez użytkownika.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby upewnić się, że nasz skrypt analityczny jest wiarygodny i spójny, zmierzyliśmy ruchliwość keratynocytów HaCaT w trzech niezależnych eksperymentach. Odkryliśmy, że podczas gdy odchylenie standardowe ruchliwości komórek było zmienne między eksperymentami (prawdopodobnie ze względu na wrażliwość komórek HaCaT na konfluencję i bodźce mechaniczne), średnia ruchliwość była konsekwentnie replikowana w wielu eksperymentach bez statystycznie istotnych różnic między powtórzeniami zgodnie z dwustronnym testem t studenta (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisana powyżej metodologia i narzędzia analityczne zapewniają prosty i skalowalny sposób pomiaru i ilościowego określania ruchliwości keratynocytów HaCaT, który wykorzystuje MATLAB i wymaga minimalnego doświadczenia w programowaniu. Protokół ten wymaga barwienia i obrazowania jąder komórkowych w ciągu co najmniej 5 godzin. Chociaż zbieranie danych można przeprowadzić na dowolnym odpowiednim mikroskopie, protokół ten zapewnia skrypt do przetwarzania obrazów zebranych za pomocą mikroskopu ImageXpress Micro XL na stos TIFF...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

X.L. i University of Colorado Boulder mają interes finansowy w rozwoju inhibitorów HDAC do celów terapeutycznych oraz posiadają udziały w OnKure. X.L. jest współzałożycielem i członkiem rady dyrektorów firmy OnKure, która uzyskała licencję na zastrzeżone inhibitory HDAC z University of Colorado Boulder. OnKure nie jest zaangażowany w projekt eksperymentalny ani w finansowanie tego badania.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Danielowi Messengerowi, Lewisowi Bakerowi, Douglasowi Chapnickowi, Adrianowi Ramirezowi, Quannin Xu i innym członkom laboratoriów Liu i Bortz za ich spostrzeżenia i rady. Dziękujemy Jian Tay za podzielenie się swoją wiedzą na temat MATLAB i za napisanie funkcji do importu XML. Dziękujemy Josephowi Dragavonowi z BioFrontiers Advanced Light Microscopy Core za jego wsparcie w zakresie mikroskopii i obrazowania. Dziękujemy Theresie Nahreini i Nicole Kethley z Cell Culture Core Facility za ich wsparcie w zakresie hodowli komórkowych. Praca ta była wspierana przez granty z National Cancer Institute i National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institutes of Health (R01AR068254) dla X. L. i National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) R01GM126559 dla D.B. i X. L. G.E.W. i E.N.B. były wspierane przez grant na szkolenie przeddoktoranckie z NIGMS (T32GM08759). ImageXpress Micro XL był wspierany przez National Center for Research Resources (S10 RR026680). Projekt FACSAria był wspierany przez Narodowe Instytuty Zdrowia (S10OD021601).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
96-dołkowe płaskie, przezroczyste dno z czarnego polistyrenu poddane działaniu TC, pakowane pojedynczo, z pokrywką, sterylneCorning3603
Zmodyfikowany orzeł średni (wysoki poziom D-glukozy) firmy Dulbecco)Life Technologies Corporation/Thermo Fisher Scientific12800-082
Płodowa surowica bydlęcaSigma-Aldrich IncF0926
Modyfikowana pożywka orła Fluorobrite Dulbecco (wysoka zawartość D-glukozy, 3,7 g/l wodorowęglanu sodu, bez L-glutaminy, bez czerwieni fenolowej)Gibco/Thermo Fisher ScientificA18967-01
GlutaminePlusR& D Systems Inc.R90210
Hoechst 33342, trichlorowodorek, trójwodzianInvitrogen/Thermo Fisher ScientificH21492
Penicylina streptomycynaLife Technologies Corporation/Thermo Fisher Scientific15140-122
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiGibco/Thermo Fisher Scientific14190-144

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Li, L., He, Y., Zhao, M., Jiang, J. Collective cell migration: Implications for wound healing and cancer invasion. Burns & Trauma. 1 (1), 21-26 (2015).
  2. Stuelten, C. H., Parent, C. A., Montell, D. J. Cell motility in cancer invasion and metastasis: insights from simple model organisms. Nature Reviews Cancer. 18 (5), 296-312 (2018).
  3. Campbell, K., et al. Collective cell migration and metastases induced by an epithelial-to-mesenchymal transition in Drosophilaintestinal tumors. Nature Communications. 10 (1), 1-10 (2019).
  4. Devreotes, P., Horwitz, A. R. Signaling networks that regulate cell migration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), (2015).
  5. Parri, M., Chiarugi, P. Rac and Rho GTPases in cancer cell motility control. Cell Communication and Signaling. 8 (1), 23(2010).
  6. Sumida, G. M., Yamada, S. Rho GTPases and the downstream effectors actin- related protein 2/3 (Arp2/3) complex and myosin II induce membrane fusion at self-contacts. The Journal of Biological Chemistry. 290 (6), 3238-3247 (2015).
  7. Alberts, B., et al. Cell junctions. Molecular Biology of the Cell., 4th edition. , (2002).
  8. Bunker, E. N., Wheeler, G. E., Chapnick, D. A., Liu, X. Suppression of α-catenin and adherens junctions enhances epithelial cell proliferation and motility via TACE- mediated TGF-α autocrine/paracrine signaling. Molecular Biology of the Cell. 32 (4), 348-361 (2021).
  9. Niessen, C. M. Tight junctions/adherens junctions: basic structure and function. Journal of Investigative Dermatology. 127 (11), 2525-2532 (2007).
  10. Drees, F., Pokutta, S., Yamada, S., Nelson, W. J., Weis, W. I. α-Catenin is a molecular switch that binds E-cadherin-β-catenin and regulates actin-filament assembly. Cell. 123 (5), 903-915 (2005).
  11. Yamada, S., Pokutta, S., Drees, F., Weis, W. I., Nelson, W. J. Deconstructing the cadherin-catenin-actin complex. Cell. 123 (5), 889-901 (2005).
  12. Rangarajan, E., Izard, T. The cytoskeletal protein α-catenin unfurls upon binding to vinculin. The Journal of Biological Chemistry. 287 (22), 18492-18499 (2012).
  13. Tinevez, J. -Y., Herbert, S. The NEMO dots assembly: single-particle tracking and analysis. Bioimage Data Analysis Workflows. , 67-97 (2020).
  14. Visweshwaran, S. P., Maritzen, T. A simple 3D cellular chemotaxis assay and analysis workflow suitable for a wide range of migrating cells. MethodsX. 6, 2807-2821 (2019).
  15. Wu, P. -H., Giri, A., Wirtz, D. Statistical analysis of cell migration in 3D using the anisotropic persistent random walk model. Nature Protocols. 10, 517-527 (2015).
  16. Chapnick, D. A., Jacobsen, J., Liu, X. The development of a novel high throughput computational tool for studying individual and collective cellular migration. PloSOne. 8 (12), 82444(2013).
  17. Tinevez, J. -Y., et al. TrackMate: an open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  18. Vargas Aguilera, C. A. int2strz.m. MATLAB Commons. , (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

TrackMate AnalysisTwo Dimensional MotilityHaCaT KeratinocytesMATLAB ScriptMotility QuantificationAdherens JunctionsActin CytoskeletonEpithelial Cells
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły