Przygotowanie próbki za pomocą korelacyjnego mielenia wiązki jonów w 3D do tomografii krioelektronowej o wysokiej rozdzielczości

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy proces frezowania wiązki jonów z korelacją 3D, który kieruje przygotowaniem próbek komórkowych do tomografii krioelektronowej. Pozycja 3D fluorescencyjnie znakowanych białek będących przedmiotem zainteresowania jest najpierw określana za pomocą mikroskopii kriofluorescencyjnej, a następnie kierowana do mielenia. Protokół jest odpowiedni dla komórek ssaków, drożdży i bakterii.

Streszczenie

Krioelektronowa tomografia (cryo-ET) stała się metodą z wyboru do badania ultrastruktury komórkowej i kompleksów molekularnych w ich naturalnym, zamrożonym i uwodnionym stanie. Jednak cryo-ET wymaga, aby próbki były wystarczająco cienkie, aby nie rozpraszać ani nie blokować padającej wiązki elektronów. W przypadku grubych próbek komórkowych można to osiągnąć przez mielenie wiązką jonów krioogniskowanych (FIB). Protokół ten opisuje, w jaki sposób celować w określone miejsca komórkowe podczas mielenia FIB przy użyciu podejścia korelacyjnego 3D, które łączy dane z trójwymiarowej mikroskopii fluorescencyjnej z informacjami ze skaningowego mikroskopu elektronowego FIB. Korzystając z tej techniki, rzadkie zdarzenia i struktury komórkowe mogą być celowane z dużą dokładnością i wizualizowane w rozdzielczości molekularnej za pomocą kriotransmisyjnej mikroskopii elektronowej (cryo-TEM).

Wprowadzenie

Mielenie skupionej wiązki jonów pozwala na przygotowanie cienkich próbek biologicznych z próbek krioutrwalonych bez problemów często związanych z mechanicznymi cięciami, takich jak ślady noża i artefakty kompresji¹. W połączeniu z krio-tomografią elektronową, mielenie FIB umożliwia badania biologiczne morfologii komórek w wysokiej rozdzielczości i określanie struktury kompleksów makromolekularnych bezpośrednio z wnętrza komórek w rozdzielczości subnanometrowej^2,3,4. Podczas gdy liczne gatunki, takie jak rybosomy, można łatwo znaleźć w losowo pociętych blaszkach FIB, wiele procesów komórkowych opiera się na kolokalizacji kilku kompleksów lub jest zlokalizowanych w określonych miejscach w komórce. W związku z tym konieczne jest skuteczne ukierunkowanie, aby nie utracić interesującej cechy biologicznej podczas procesu mielenia i ograniczyć się do przypadkowych trafień. Konieczne jest zatem podejście korelacyjne, które łączy dane ze skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM)-FIB i mikroskopu światła kriofluorescencyjnego (FLM). Chociaż możliwe jest pominięcie początkowej korelacji i połączenie danych FLM i cryo-ET dopiero po akwizycji TEM^5,6, mielenie skupionej wiązki jonów sterowane fluorescencją umożliwia dokładny wybór obszaru mielenia z wyprzedzeniem, co skutkuje bardziej efektywnym pozyskiwaniem danych. Od momentu powstania⁷, zastosowanie korelowanego 3D mielenia FIB w badaniach biologicznych było ograniczone, aż do niedawna, kiedy poinformowaliśmy o zidentyfikowaniu nowego komory ciecz-ciecz rozdzielanego fazowo (LLPS) w drożdżach przy użyciu tej techniki⁸.

Opisany tutaj jest uogólniony protokół kriokorelowanej mikroskopii świetlnej i elektronowej 3D (CLEM), który może być używany do badania szerokiej gamy próbek, od bakterii po drożdże i komórki ssaków. Chociaż eksperymenty zostały przeprowadzone przy użyciu określonego zestawu instrumentów, poszczególne kroki nie są powiązane z konkretnym sprzętem i mogą być łatwo przeniesione do innych systemów jako rozszerzenie istniejących protokołów^3,5. Lista testowanych urządzeń i sugerowane ustawienia znajdują się w Tabeli materiałów i Tabeli 1. Cztery kluczowe etapy procesu to: (1) przygotowanie próbki, (2) lokalizacja interesujących cech za pomocą mikroskopii kriofluorescencyjnej, (3) korelowane 3D mielenie skupionej wiązki jonów oraz (4) lokalizacja docelowych struktur do pozyskiwania danych krio-ET na lamelach w kriotransmisyjnym mikroskopie elektronowym (Rysunek 1).

Protokół

Rysunek 1: Podsumowanie przepływu pracy z wyborem kluczowych kroków. Cały protokół jest podzielony na cztery etapy w zależności od używanego sprzętu: przygotowanie próbki, w tym zamrażanie wgłębne, mikroskopia kriofluorescencyjna, mielenie wiązki jonów w kriofokusie i mikroskopia krioelektronowa. Dla każdego kroku wyróżnionych jest kilka kluczowych punktów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Hodowla komórkowa i zamrażanie wgłębne siatek

1. Hoduj wybrane komórki i optymalizuj strategie etykietowania i obróbki w temperaturze pokojowej przed przejściem do eksperymentów kriogenicznych. Obiekty zainteresowania są znakowane za pomocą fluorescencyjnych fuzji białek lub barwienia na żywo (np. Halo-Tag, LysoTracker, BODIPY, barwienie żywymi przeciwciałami itp.). Jeśli leczenie środkami chemicznymi lub biologicznymi (małe cząsteczki, specjalne pożywki, siRNA itp.) jest potrzebne do zbadania procesu biologicznego, który Cię interesuje, zoptymalizuj warunki (np. czas, stężenie) za pomocą obrazowania FLM z żywych komórek.
   1. Upewnij się, że interesujące miejsca mogą być z powodzeniem zlokalizowane powyżej tła w wystarczającej liczbie komórek, korzystając z ustawień obrazowania, które jak najdokładniej odpowiadają późniejszym warunkom kriogenicznym (tj. NA, czas ekspozycji itp.).
2. Wybór i przygotowanie siatek
   1. Wybierz siatki o rozmiarze otworów i odstępach odpowiednich dla użytych komórek i znaczników odniesienia (patrz krok 1.3.1). Nie należy używać folii ciągłej bez otworów, ponieważ może to spowodować zbyt dużą ilość resztkowego buforu po osuszeniu, a tym samym zmniejszyć skuteczność witryfikacji i utrudnić wykrywanie kulek odniesienia. W przypadku długotrwałego kontaktu komórek z siatkami należy upewnić się, że podpora siatki i materiał folii są biokompatybilne.
   2. Oczyść plazmowo siatki cryo-EM, aby były bardziej hydrofilowe. Do stosowania w przylegających hodowlach komórkowych należy sterylizować siatki po oczyszczeniu plazmowym promieniowaniem UV przez 20 minut w okapie z przepływem laminarnym. Opcjonalnie siatki mogą być wstępnie poddane działaniu związków, które pomagają w adhezji komórek, takich jak poli-L-lizyna lub konkanawalina A, jak opisano poniżej.
      UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, następujące kombinacje siatki/próbki zostały z powodzeniem wykorzystane w korelacyjnym przepływie pracy cryo-FIB: Drożdże: Cu lub Au, siatka 200, węgiel R1/4 lub folia SiO₂, opcjonalnie pokryta konkanawaliną A; Escherichia coli: Cu lub Au, 200 mesh, węgiel R1/4 lub folia SiO₂; Chlamydomonas reinhardtii: Cu lub Au, siatka 200, folia węglowa R1/2 lub R1/4 lub SiO₂; HeLa: Au, siatka 200, folia R1/4 SiO₂, pokryta poli-L-lizyną; HEK293: Au, siatka 200, folia R1/4 SiO₂, pokryta poli-L-lizyną.
   3. Powłoka Concanavalin A poprawiająca przyczepność komórek drożdży:
      • Przygotować roztwór powlekający 1 mg/ml konkanawaliny A w 10 mM buforze HEPES ze 100 μM CaCl₂, pH 8,5. Umieścić jedną kroplę (50 μl) roztworu powlekającego i dwie krople wody destylowanej oddzielnie na kawałku folii parafinowej.
      • Podnieś oczyszczoną plazmowo siatkę za pomocą pęsety o odwrotnej sile i ostrożnie włóż ją do kropli roztworu powlekającego, unikając ruchów prostopadłych do siatki, aby zapobiec uszkodzeniu folii.
      • Po ~5 s inkubacji umyj siatkę dwa razy, wkładając ją w krople wody w podobny sposób. Na koniec zetrzyj nadmiar płynu, nakładając bibułę filtracyjną z tyłu siatki i pozwól siatce całkowicie wyschnąć przed wyjęciem jej z pęsety. Użyj wysuszonych rusztów do zamrażania wgłębnego.
   4. Powłoka poli-L-lizynowa do hodowli zawiesinowej i przylegających komórek:
      • Przygotować roztwór powlekający składający się z 1 mg/ml poli-L-lizyny w 0,1 M buforze boranu sodu o pH 8,5.
      • Oczyszczone plazmowo siatki należy umieścić w odpowiednim naczyniu do hodowli komórkowej i sterylizować przez 20 minut promieniowaniem UV.
      • Delikatnie dodać wystarczającą ilość roztworu powlekającego, aby pokryć wszystkie kratki i inkubować w temperaturze 37 °C przez co najmniej 2 godziny. Odessać ciecz i delikatnie umyć kratki dwa razy PBS przed wysiewem komórek do pożądanego stężenia.
3. Przygotowanie komórek i kulek referencyjnych
   UWAGA: Kulki referencyjne są wymagane do rejestracji 3D danych fluorescencyjnych z obrazami wykonanymi w mikroskopie FIB/SEM, aby umożliwić frezowanie FIB z korelacją 3D.
   1. Wybierz kulki rozpoznawalne we wszystkich metodach obrazowania, tj. FLM, SEM i IB (zalecana średnica 0,5-1 μm), ale upewnij się, że nie przyćmiewają one docelowej struktury komórkowej podczas obrazowania fluorescencyjnego, aby ułatwić rozróżnienie kulek i interesującej ich cechy biologicznej. Usunąć cytotoksyczne środki konserwujące z kulek odniesienia (np. NaN₃) zgodnie z instrukcją producenta.
      UWAGA: Dla łatwiejszego rozróżnienia między interesującymi cechami biologicznymi a cechami odniesienia, przydatne jest, jeśli widma emisji fluorescencji tylko częściowo się pokrywają, tak aby sygnały można było rozróżnić na podstawie różnic intensywności w kanałach FLM.
   2. Jeśli stosuje się hodowlę zawiesinowy, należy wyhodować komórki do odpowiedniej gęstości (np. drożdże OD₆₀₀ = 0,8, E. coli OD₆₀₀ = 0,8-1,0, C. reinhardtii 1500 komórek/μL) i wykonać zabiegi wymagane w eksperymencie, takie jak zmiana pożywki, dodanie chemikaliów, zagłodzenie itp. Przymocuj oczyszczone plazmowo siatki do pęsety zgodnie z wymaganiami metody zanurzania (ręczna/automatyczna), i nanieść 4 μl zawiesiny komórek zmieszanej z ~1 x 10⁵ kulek/μL zawiesiny kulek odniesienia na stronę folii siatki.
      UWAGA: Określ optymalne rozcieńczenie komórek i powierników w eksperymentach miareczkowania (np. sprawdzając cryo-FLM lub FIB/SEM, patrz poniżej). Jednak w przypadku większości komórek hodowanych w zawiesinie, końcowe stężenie ~1 x 10⁵ kulek/μL 1 μm kulek odniesienia (rozcieńczenie 1:20 z zapasu; szczegółowe informacje w Tabeli Materiałów) okazało się dobrym punktem wyjścia.
   3. Jeśli używana jest kultura przylegająca, należy oczyścić plazmowo i wysterylizować kratki za pomocą promieniowania UV w celu hodowli aseptycznej. W razie potrzeby należy wstępnie pokryć siatki związkami, które wspomagają adhezję komórek (np. poli-l-lizyną, fibronektyną, lamininą; patrz krok 1.2.2). Zasiej i hoduj komórki na siatkach w normalnych szalkach hodowlanych lub szalkach z podpodziałami na siatki.
   4. Próbki należy traktować w razie potrzeby w eksperymencie i utrzymywać komórki w optymalnych warunkach tylko do momentu zamrożenia wgłębnego (np. 37 °C/5% CO₂ dla HEK/HeLa). Ostrożnie wyjmij kratki z naczynia hodowlanego i przymocuj je do pęsety zanurzającej. Nałożyć 4 μl pożywki hodowlanej zmieszanej z powiernikami (1 x 10⁵ kulek/μl dla 1 μm fiducialsów) po stronie zawierającej komórki.
4. Zamrozić komórki metodą wgłębną przy użyciu ręcznej lub automatycznej procedury zamrażania. Jeśli to możliwe, osuszaj siatkę tylko od strony przeciwnej do komórek, aby zapobiec mechanicznemu uszkodzeniu komórek (Rysunek 2A). W dwuramiennych zautomatyzowanych systemach wgłębnych można to osiągnąć, umieszczając arkusz z politetrafluoroetylenu (np. teflonu) zamiast bibuły na podkładce skierowanej w stronę komórek. Przenieś kratki do pojemników do przechowywania i przechowuj je w ciekłym azocie (lN₂) do czasu użycia.
   UWAGA: lN₂ i inne kriogeny mogą powodować poważne uszkodzenia oczu i skóry. Stosować środki ochrony indywidualnej (PPE) i pracować wyłącznie w dobrze wentylowanym pomieszczeniu, aby uniknąć gromadzenia się niebezpiecznych stężeń_N2.
   UWAGA: Wszystkie kolejne etapy najlepiej wykonywać w fazie ciekłej lN₂, aby uniknąć zanieczyszczenia powierzchni ogniw i lameli, ponieważ może to skomplikować dalsze przetwarzanie. Zmniejsz kontakt z pływającymi kryształkami lodu, zawsze używając czystego ciekłego azotu (np. filtra do usuwania pływającego lodu), eliminując niepotrzebne etapy przenoszenia i, jeśli to możliwe, pracując w środowisku o kontrolowanej wilgotności.
5. Zamontuj i przypnij zamrożone wgłębnie siatki w AutoGrids z wycięciem i komórkami skierowanymi do góry (Rysunek 2A) w celu późniejszego obrazowania kriofluorescencyjnego i mielenia FIB. Aby zapewnić prawidłowe wyrównanie próbek w TEM, kierunek mielenia musi być prostopadły do osi nachylenia cryo-ET. W związku z tym umieść znaczniki orientacji (np. grawerowanie laserowe lub usuwalne kropki znacznika) na AutoGrids przed przycinaniem, aby pomóc w tym wyrównaniu (Rysunek 2A).
6. Przesiewaj jakość siatki (Rysunek 2B) na krio-FLM i FIB/SEM. Zoptymalizuj gęstość komórek, czas krzepnięcia i siłę, aby uzyskać równomierny rozkład komórek i kulek. Użyj obrazowania w świetle odbitym na mikroskopie kriofluorescencyjnym lub użyj cryo-FIB-SEM, aby upewnić się, że zarówno komórki, jak i kulki referencyjne są wyraźnie widoczne (Rysunek 2B, białe strzałki).
7. W razie potrzeby powtórz zanurzanie w lepszych warunkach, np. przy zmiennym stężeniu komórek i/lub czasie osuszania. Po znalezieniu odpowiednich parametrów zanurzania nie należy powtarzać badania przesiewowego siatki dla każdej nowej rundy eksperymentów.

Rysunek 2: Selekcja odpowiednich siatek za pomocą SEM i IB. (A) Znaczniki orientacji powinny być umieszczone na AutoGrids prostopadle do kierunku frezowania, aby uprościć prawidłowe ładowanie do TEM. Komórki są montowane przodem do góry w zmontowanej siatce AutoGrid. (B) Po zamrożeniu wgłębnym siatki są sprawdzane w SEM w celu oceny i optymalizacji warunków zanurzania: a) Nie powinno być zbyt wielu komórek na siatce. Na przykład w przypadku komórek HeLa nie używaj więcej niż 1-4 komórek/kwadrat. W przypadku mniejszych komórek, takich jak Saccharomyces cerevisiae (pokazane tutaj), przydatne okazały się grudki 4-6 komórek. b) Koraliki referencyjne (białe strzałki) powinny być wyraźnie widoczne, a wokół komórek nie powinno być zbyt dużo bufora. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Kriofluorescencyjna mikroskopia świetlna

1. Dla każdej siatki uzyskaj przegląd w (szerokokątnym) kontraście fluorescencyjnym i różnicowym kontraście interferencyjnym (DIC) lub w trybie odbitym i wybierz odpowiednie kwadraty siatki z sygnałem fluorescencji. Wybierz pola widoku, które zawierają zarówno interesujące komórki, jak i wystarczającą liczbę znaczników odniesienia (6-12).
   1. Upewnij się, że komórki i koraliki są równomiernie rozmieszczone, niezbyt gęste i skierowane w stronę środka każdego kwadratu. Wybieraj tylko kwadraty dostępne zarówno dla instrumentu FIB-SEM, jak i TEM, stąd te, które znajdują się co najmniej trzy kwadraty od krawędzi siatki na siatkach 200 (Rysunek 3A, wewnątrz czerwonego okręgu).
2. Na każdym z wybranych kwadratów siatki uzyskaj stos fluorescencyjny z krokiem ostrości odpowiednim do późniejszej dekonwolucji, tj. <1/2 osiowego limitu rozdzielczości. Jeśli to możliwe, używaj obiektywów o dużej aperturze numerycznej (NA), aby zwiększyć liczbę fotonów i dokładność lokalizacji.
   1. W mikroskopie konfokalnym z obiektywem NA 0,9 uzyskaj stosy o wielkości kroku 300 nm, nadpróbkując wartość Nyquista. W razie potrzeby nagraj wiele stosów kolorów (Rysunek 2B). Kratki należy przechowywać pod lN₂ do czasu dalszego użycia.
      UWAGA: Aby określić optymalny rozmiar kroku, wybierz wartości obliczone przez oprogramowanie sterujące mikroskopem lub skorzystaj z narzędzi online⁹. Sprawdź, czy sygnał między kanałami nie jest przebijany, ponieważ nadmierne przebijanie jest szkodliwe dla eksperymentów kolokalizacyjnych. Jednak niektóre z nich mogą być korzystne do korygowania aberracji chromatycznych w stosach wielokolorowych.
3. Dekonwolucjonizuj stosy za pomocą odpowiedniego oprogramowania^10,11 i re-slice⁷ je, jeśli wymagany jest izotropowy rozmiar piksela. Dekonwolucja — podobnie jak w temperaturze pokojowej — oczyszcza sygnał FLM i może poprawić dokładność lokalizacji (Rysunek 3C).

Rysunek 3: Wybieranie kwadratów do akwizycji stosu FLM i ulepszanie danych przez dekonwolucję. (A) Przegląd siatki wypełnionej komórkami drożdży wyrażającymi eGFP-Ede1 (zielony) i mCherry-Atg8 (magenta). Wybierz pozycje z dobrym rozmieszczeniem koralików i komórek, ale unikaj krawędzi siatki (zacieniowane na czerwono). Pola wskazują miejsca z dobrym rozkładem komórek, w których pobrano stosy fluorescencyjne. (B) Projekcja maksymalnej intensywności (MIP) wielokolorowego stosu wykonanego na kwadracie z żółtą ramką (od A) po dekonwolucji. Dekonwolucja stosów FLM znacznie czyści niepożądane sygnały tła i pomaga dokładniej zlokalizować koraliki w z, co wynika z dopasowań gaussowskich przed (C) i po dekonwolucji (D) (dopasowania zostały wykonane w 3DCT i są pokazane dla koralika oznaczonego cyfrą 1). Zdjęcia przedstawiają powiększone widoki MIP kanału czerwonego (wzbudzenie: 552 nm, emisja: 585-650 nm). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Mielenie skupionej wiązki jonów

1. Załaduj siatki do instrumentu cryo-FIB-SEM i użyj znaczników wycięcia i/lub orientacji, aby zapewnić właściwą orientację do późniejszego umieszczenia w TEM (Rysunek 2A). Upewnij się, że kierunek frezowania jest prostopadły do osi nachylenia TEM.
2. Stosować system wtrysku gazu (GIS; CpMePtMe₃) w pozycjach etapu wstępnie zdefiniowanych przez konfigurację FIB-SEM w celu pokrycia siatek ochronną warstwą metaloorganiczną. Nie należy stosować zbyt dużo, ponieważ może to później zakłócić lokalizację koralików odniesienia w TEM. Użyj powlekarki plazmowej, aby nałożyć metaliczną platynę, aby zmniejszyć ładowanie próbki.
   UWAGA: Jeśli nie są dostępne żadne ustawienia powlekania GIS, można je łatwo znaleźć, wykonując kolejne rundy krótkiego powlekania (~2 s), a następnie frezowanie FIB. Upewnij się, że próbka może być nadal z powodzeniem cięta przy średnich prądach (~100 pA) bez widocznego obrzeża ochronnej warstwy metaloorganicznej wokół krawędzi lameli. Zarówno czas, jak i odległość igły GIS (w stosunku do próbki) są ważnymi parametrami, które należy wziąć pod uwagę. Nie używaj igły GIS przy ustawieniach temperatury pokojowej (tj. 45 °C), ale tak zimnej, jak to możliwe, aby nadal zapewnić równomierną powłokę (25-27 °C).
3. Zapisz przegląd siatki SEM i wykonaj korelację 2D z przeglądami FLM, aby znaleźć kwadraty siatki, dla których zarejestrowano stosy fluorescencyjne. Ręcznie sprawdź oba widoki lub użyj różnych pakietów oprogramowania^7,10,12, aby znaleźć kwadraty siatki. W tym miejscu nacisk kładziony jest na przybornik korelacji 3D (3DCT)⁷, który wykorzystuje transformację 3D ciała sztywnego z izotropowym skalowaniem między widokami. Doskonały przewodnik po funkcjach 3DCT jest dostępny online¹³.
   1. Zaznacz i zaznacz co najmniej cztery odpowiadające sobie pozycje, np. punkty orientacyjne, takie jak pręty siatki lub otwory w folii nośnej, zarówno w przeglądzie siatki FLM, jak i SEM (kliknij prawym przyciskiem myszy) i oblicz transformację między zaznaczonymi punktami (skoreluj).
   2. Następnie umieść znaczniki w środku odpowiednich kwadratów siatki, dla których uzyskano stosy FLM i przewiduj ich położenie w widoku SEM (korelować; Rysunek 4A).
4. Dla każdego skorelowanego kwadratu siatki należy wykonać obraz wiązki jonów (IB) o niskim natężeniu prądu (≤10 pA) pod wybranym kątem frezowania FIB (10°-25° dla wahadłowca 45° przed pochyleniem). Wybierz pole widzenia (tj. położenie i powiększenie), które odpowiada danym fluorescencji. W przypadku siatek 200 uzyskaj dane fluorescencji i FIB/SEM, aby zawierały pojedyncze kwadraty siatki, w tym paski siatki (patrz Rysunek 3A i Rysunek 4A).
   UWAGA: Mielenie powinno być wykonywane pod jak najmniejszym kątem, aby uniknąć utraty znacznego zakresu kątowego podczas cryo-ET i umożliwić identyfikację wystarczającej liczby kulek odniesienia. Na przykład: przy nachyleniu stolika wynoszącym 17°, wstępnym pochyleniu wahadłowym wynoszącym 45° i nachyleniu belki FIB wynoszącym 52° względem pionu, wstępne pochylenie lameli wynosi 10°, co prawie spełnia preferowany zakres kątowy ±60° w TEM poprzez pochylenie od -50° do +70°, maksimum wielu kriouchwytów TEM.
5. Wykonaj obraz SEM tego samego kwadratu, aby pomóc w identyfikacji odpowiadających im koralików w widoku fluorescencji i wiązki jonów.
6. Wykonaj rejestrację zdekonwolucjonowanego stosu FLM 3D i widoku wiązki jonów 2D dla każdej pozycji za pomocą 3DCT, jak opisano w następujących krokach (Rysunek 4B).
   1. Załaduj odpowiedni ponownie pocięty widok stosu 3D FLM i wiązki jonów (IB) do 3DCT.
      UWAGA: Wielokolorowe dane fluorescencyjne można załadować jako maksymalnie trzy oddzielne jednokanałowe pliki stosu
   .
   2. Wybierz 4 koraliki odniesienia w danych fluorescencyjnych i kliknij prawym przyciskiem myszy listę pozycji, aby określić ich pozycję 3D za pomocą dopasowania Gaussa sygnału w x, y i z. Wybierz odpowiednie koraliki na obrazie IB i wykonaj początkową korelację 3D (korelację).
   3. Iteracyjnie dodawaj więcej koralików na obrazie fluorescencyjnym, doprecyzowuj ich położenie 3D i przewiduj ich położenie w widoku IB, aby szybko dodać więcej koralików do pasowania i sprawdzić dokładność korelacji. W 3DCT wartości błędu średniokwadratowego (RMSE) są podawane w celu oceny spójności korelacji⁷.
      1. Upewnij się, że wartości RMSE są małe i zgodne z dokładnością lokalizacji (~300 nm). Aby określić dokładność korelacji, należy celowo pominąć niektóre koraliki referencyjne wyraźnie rozpoznawalne zarówno w fluorescencji, jak i wiązce jonów na etapie rejestracji. W tym celu należy sprawdzić ich przewidywane i rzeczywiste położenie na obrazie wiązki jonów. Jeśli przewidywana pozycja znacznie różni się od rzeczywistej, powtórz początkową korelację z nowym zestawem powierników.
         UWAGA: Korelacja 6-8 koralików okazała się wystarczająca do dokładnej rejestracji stosów FLM i widoków IB. Jednak dodanie większej liczby wartości odniesienia (do 12-15) w szerokim zakresie wartości z (np. poprzez wybranie koralików na pasku siatki lub w sąsiednich kwadratach) może poprawić dokładność korelacji.
   4. Wybierz docelowe sygnały komórkowe, dopasuj ich pozycję 3D do stosu FLM i zastosuj transformację, aby przewidzieć pozycje docelowe w widoku IB (Rysunek 4B).
      UWAGA: Każdy wpis na liście pozycji FLM, który nie ma odpowiednika na liście IB, będzie traktowany jako sygnał do przewidzenia.
7. Dla każdego skorelowanego kwadratu przenieś przewidywane pozycje interesujących cech do instrumentu FIB-SEM i umieść wzorce frezowania lameli (Rysunek 4C). Zmieniaj pozycje ręcznie (np. mierząc odległość do widocznych punktów orientacyjnych, takich jak komórki lub koraliki referencyjne) lub korzystaj z automatyzacji i skryptów, jak zaimplementowano, na przykład w SerialFIB¹⁴. Jeśli w jednej komórce znajduje się wiele sygnałów, umieść wzorce tak, aby zawierały jak najwięcej interesujących miejsc (POI) w tej samej blasze, aby zwiększyć przepustowość.
8. Najpierw zgrubne, a następnie drobno frezowane lamele do końcowej grubości 150-250 nm. Unikaj kroków (np. cięć odprężających¹⁵), które powodują zwisanie lameli, a tym samym powodują przemieszczenie się rzeczywistej cechy zainteresowania w stosunku do wcześniej nabytych stosów FLM. Użyj manual³ lub automated^14,16,17,18 Procedury frezowania FIB. W przypadku dowolnej metody upewnij się, że interesujący element pozostaje w środku blaszki, symetrycznie ją rozrzedzając od góry i od dołu.
9. Aby ocenić dokładność frezowania dla każdej blaszki, należy wykonać tę samą rejestrację, co w kroku 3.4. Tym razem jednak należy użyć końcowego obrazu IB po frezowaniu FIB i sprawdzić, czy przewidywane pozycje interesujących nas elementów są zawarte w końcowej lameli. Alternatywnie, nałóż obrócone projekcje stosów FLM, uzyskane z danych wyjściowych 3DCT i niestandardowych skryptów¹⁹, z końcowym obrazem IB (Rysunek 4C, mała wstawka).

Rysunek 4: Procedura frezowania FIB z korelacją 3D. (A) Korelacja 2D-2D przeglądów FLM (po lewej) i SEM (po prawej) siatki służy do lokalizacji kwadratów siatki, na których wcześniej wykonano stosy fluorescencyjne. (B) Dla każdego wybranego kwadratu, po rejestracji 3D-2D odpowiadających mu pozycji odniesienia w 3DCT (kolorowe pola), w danych FLM wybierane są pozycje interesujących cech biologicznych. Na podstawie przewidywań odpowiednich pozycji na obrazie wiązki jonów (czerwone kółka) wybierane są miejsca do przygotowania lameli. (C) Obrazy ze skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM) i wiązki jonów (IB) służą do utrzymania celu w środku podczas frezowania. Końcowe grubości 150-250 nm uznano za odpowiednie do dalszego przetwarzania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Skorelacyjny TEM

1. Załaduj kratki do TEM, upewniając się, że orientacja lameli (wynikająca z wycięć lub znaków orientacji) jest prostopadła do osi pochylenia.
   UWAGA: Mikroskopy różnych producentów mogą być sterowane za pomocą różnych programów, np. Tomo5, TOM lub SerialEM²⁰. Tutaj nacisk kładziony jest na to drugie.
2. Uzyskaj montaż siatki i przeglądy dla każdego kwadratu siatki zawierającego lamele. Upewnij się, że powiększenie i czas ekspozycji są odpowiednie do wizualizacji kulek odniesienia na obrazach TEM bez znacznego zwiększania całkowitej dawki elektronów. Zdobądź mapy TEM (montaże) każdej lameli w wysokiej rozdzielczości.
3. Rejestr i 3D-2D korelują stos FLM z kwadratem siatki TEM i przeglądami lameli w 3DCT. Użyj tej samej procedury, jak opisano w kroku 3.6, wybierając odpowiednie pozycje ściegów na obrazach fluorescencji (x, y, z - dopasowanie gaussowskie) i transmisyjnego mikroskopu elektronowego. Następnie wybierz interesujące Cię pozycje w kanałach FLM i przenieś je do przeglądów TEM. Jeśli to konieczne, zastosuj dwuetapową procedurę obejmującą pierwszą korelację między FLM a TEM o małym powiększeniu, a drugą od TEM o małym do dużego powiększeniu (Rysunek 5).
4. Pozycje można przenosić ręcznie (mierząc odległości do punktów orientacyjnych), za pomocą narzędzi do rejestracji i map dostępnych w SerialEM²⁰, czy za pomocą zewnętrznego oprogramowania, takiego jak CorRelator²¹.
5. Ustaw i uruchom serię pochylenia w skorelowanych pozycjach. Należy użyć odpowiedniego powiększenia, rozmycia i dawki całkowitej (szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli materiałów i Tabeli 1). Rozpocznij akwizycję od wstępnego nachylenia określonego przez lamelę (patrz również uwaga w kroku 3.4) i użyj schematu pochylenia symetrycznego dawki²². Użyj akwizycji ręcznej lub wsadowej.

Rysunek 5: Lokalizacja skorelowanych pozycji w TEM. Po udanym frezowaniu FIB z korelacją 3D i transferze do transmisyjnego mikroskopu elektronowego, przeprowadzana jest rejestracja 3D-2D dla każdego zmielonego kwadratu między kulkami odniesienia (kolorowymi pudełkami) w stosach FLM i przeglądach TEM w celu zlokalizowania potencjalnych miejsc dla cryo-ET (czerwone kółka). Następnie można uzyskać większe powiększenie lameli (zoom-in), aby dokładniej ustawić tomogramy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wyniki

Protokół zapewnia przewodnik po potoku używanym do odkrywania odkładania się białka endocytarnego (END) zależnego od domeny EH i endocytozy białka 1 (Ede1) oraz jego degradacji i uwięzienia w ciałach autofagicznych⁸. END to oddzielony fazowo przedział ciecz-ciecz w S. cerevisiae, który buforuje różne białka zaangażowane w endocytozę za pośrednictwem klatryny (CME) po nieudanych zdarzeniach endocytarnych. Jednym z jego głównych składników jest Ede1, który pełni również funkcję składnika CME i selektywnego receptora autofagii do degradacji tego nowego przedziału LLPS. W związku z tym fuzja EGFP Ede1 (EGFP-Ede1) pod kontrolą promotora dehydrogenazy alkoholowej (ADH) została wykorzystana do wizualizacji ENDs, ponieważ nadekspresja Ede1 zakłóca wczesne stadia endocytozy, a zatem konstytutywnie indukuje LLPS.

Na siatce zamrożonej wgłębnie z nadekspresją komórek drożdży EGFP-Ede1 i markerami odniesienia 1 μm, wybrano pięć pozycji do akwizycji stosu FLM w kanale GFP (Rysunek 6A; TFS Corrsight; tryb konfokalny, krok ostrości 300 nm, zakres 10 μm). Siatka została przeniesiona do instrumentu FIB (Quanta 3D FEG), a kwadraty siatki, dla których uzyskano stosy FLM, zostały zidentyfikowane poprzez wykonanie korelacji 2D-2D przeglądów fluorescencji i siatki SEM (porównaj krok 3.2).

Dla każdego z wybranych kwadratów, obrazy wiązki jonów zostały wykonane przy niskim natężeniu prądu (10 pA, 1200x powiększenie), a odpowiednie pozycje odniesienia zostały zarejestrowane w 3DCT. Po wybraniu pozycji z interesującą cechą biologiczną i dopasowaniu ich pozycji 3D do stosu FLM, znaleziona transformacja została zastosowana do przypuszczalnych pozycji END i wybrano miejsca do przygotowania lameli (Rysunek 6B). W przedstawionych tutaj przykładach zastosowano belkę FIB nachyloną pod kątem 11° w stosunku do powierzchni siatki (wstępne pochylenie wahadłowe FIB pod kątem 45°; nachylenie stolika pod kątem 18°). Interesujące pozycje zostały przeniesione, a wzorce FIB zostały narysowane ręcznie (Rysunek 6D) poprzez pomiar odległości przewidywanych pozycji względem widocznych punktów orientacyjnych na obrazie FIB (np., zanieczyszczenia lodem, koraliki odniesienia). Dokładność rejestracji oceniono poprzez celowe pominięcie koralików, które można było wyraźnie zidentyfikować na obrazie FLM i IB, a następnie porównanie ich rzeczywistych i przewidywanych pozycji w widoku wiązki jonów (np. diament w Rysunek 6B,C). Korelacja dla kwadratu pokazanego na Rysunek 6C okazała się dokładna (tj. przewidywana pozycja pozycji koralików FLM idealnie pokrywała się z odpowiadającą im lokalizacją IB, a 3DCT podało wartości RMSE subpikseli dla rejestracji). W ten sposób lamele zostały przycięte w przewidywanych pozycjach (miejsce B) i drobno zmielone do grubości ~200 nm (końcowe przesunięcie wzoru).

Rysunek 6: Reprezentatywne wyniki dla 3D-korelacyjnego celowania w endocytarne depozyty białkowe (END) u drożdży. (A) Przegląd SEM siatki przed frezowaniem. Kolorowe pola wskazują kwadraty siatki, dla których wcześniej pobrano stosy fluorescencji. (B-C) Korelacja 3D w kwadracie siatki. Po zarejestrowaniu kilku odpowiadających sobie koralików odniesienia (kolorowych pól) w danych FLM (B, pokazanych tutaj jako projekcja maksymalnej intensywności) i obrazie wiązki jonów (C), dokładność rejestracji 3D została zweryfikowana poprzez przewidzenie położenia koralika wskazanego przez diament. Następnie przewidywano pozycje sygnału docelowego (czerwone kółka) w widoku wiązki jonów dla dwóch potencjalnych miejsc mielenia. (D) Zbliżenie terenu B pokazujące przewidywane pozycje trzech punktów docelowych (czerwone kółka) i początkowe schematy mielenia (żółte pola). Przewidywano, że czwarta fluorescencyjna punctum będzie znacznie niższa niż druga puncta i dlatego nie jest ukierunkowana podczas mielenia (szare kółko). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Po udanym frezowaniu FIB i przeniesieniu siatki do kriotransmisyjnego mikroskopu elektronowego (Titan Krios działał pod napięciem 300 kV i był wyposażony w bezpośredni detektor elektronów Gatan K2 i filtr energii biokwantowej), w SerialEM zarejestrowano przegląd siatki i użyto go do zlokalizowania kwadratów z lamelami. Dla każdej lameli uzyskano obrazy przeglądowe, a dane FLM zarejestrowano w 3DCT (3D-2D) za pomocą odpowiednich koralików odniesienia. Pozycje interesujących cech biologicznych (Rysunek 7A) zostały następnie przewidziane, korzystając z transformacji obliczonej na podstawie koralików odniesienia. Przeglądy lameli zarejestrowane przy większym powiększeniu zostały zszyte, a interesujące miejsca skorelowane za pomocą wyraźnie widocznych punktów orientacyjnych (np. koralików odniesienia). Alternatywnie, klasyczne przeglądy CLEM mogą być tworzone w różnych programach^10,12.

Na podstawie korelacji, znaleziono cztery potencjalne miejsca do pozyskiwania tomogramu dla blaszki pokazanej na Rysunek 7A. Obejmuje to jednak również pozycję, która nie była celem podczas frezowania FIB skorelowanego z 3D (porównaj Rysunek 6D; szare kółko) oraz pozycję zablokowaną przez zanieczyszczenie lodem (Rysunek 7; szare pola). W związku z tym tomogramy mogły być rejestrowane tylko dla dwóch pozycji (Rysunek 7B). Ogólnie rzecz biorąc, osiągnięto sukces korelacji na poziomie ~75%, tj. blaszki, które przetrwały transfer do struktur TEM i END, znaleziono w przewidywanych miejscach (12 skorelowanych miejsc). Po rekonstrukcji tomogramu, segmentacji i dopasowaniu szablonów, poszczególne struktury END mogą być wizualizowane w ich natywnym kontekście (Rysunek 7C,D). Obejmuje to fenestrowaną retikulum endoplazmatyczne (ER) otaczające END, kropelki lipidów od czasu do czasu stykające się oraz rybosomy, które są wykluczone z przedziału LLPS. Podsumowując, pokazuje to, w jaki sposób korelacyjne mielenie FIB 3D może dostarczyć informacji na poziomie molekularnym o rzadkich procesach biologicznych z nienaruszonych komórek.

Rysunek 7: Reprezentatywne wyniki wizualizacji END za pomocą cryo-ET. (A) Przegląd TEM w małym powiększeniu miejsca mielenia pokazany na Rysunek 6 może być łatwo skorelowany z projekcją maksymalnej intensywności FLM (Rysunek 6B) w celu zlokalizowania interesujących cech biologicznych (czerwone krzyże). (B) W drugim kroku można skorelować widok o większym powiększeniu (zszyty) i ustawić pozycje do akwizycji tomogramu (żółte pola). Lokalizacje wynikające z sygnału poza płaszczyzną (szare pole, porównaj Rysunek 6D) zostały zignorowane. (C-D) Korzystając z tego podejścia 3D-korelacyjnego FIB, depozyt białka endocytarnego (END) można uwidocznić w jego natywnym środowisku. Struktury takie jak retikulum endoplazmatyczne (ER), rybosomy, błony i kropelki lipidów mogą być identyfikowane i wizualizowane. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ustawienia czyszczenia plazmowego
Odkurzacz plazmowy Harrick PDG-3XG :	Ustawienie częstotliwości radiowej: "HI", 30 s; Plazma N2
Ustawienia tłoka
TFS Vitrobot Mk IV:	100% wilgotności; siła plamy = 8; czas klotowania = 10 s; czas oczekiwania 0 s; (powinno to działać w przypadku większości zawiesin i przylegających komórek)
Pozycje i godziny FIB GIS
Quanta 3D FEG:	Nachylenie = 0, Obrót = -180, Pozycja Z = 13.5, Nastawa temperatury =26.15° , Czas = 8 s
TFS Scios:	Nachylenie = 0, Obrót = -180, Pozycja Z = 9.8, Nastawa temperatury =28° C, Czas = 7 s
TFS Aquilos 1:	Pozycja predefiniowana przez oprogramowanie, Nastawa temperatury = 28° , Czas = 7 s
TFS Aquilos 2:	Pozycja predefiniowana przez oprogramowanie, Nastawa temperatury = 28°, Czas = 7 s
Ustawienia napylarki FIB Sputter
System kworum:	W komorze przygotowania kworum: 10 mA, 40 s
TFS Scios:	10 W, 500 V, 250 mA, 0.2 mbar, 15 s
TFS Aquilos 1:	1kV, 10 mA, 10 Pa, 15 s
TFS Aquilos 2:	1kV, 10 mA, 10 Pa, 15 s
Akwizycja Tomogramu
Tytan Krios Gi2	Kamera K2, filtr energii Gatan Bioquantum
	20 szczelina eV; symetryczny schemat nachylenia dawki (Hagen) z krokami co 2°; start od +10° (wstępne pochylenie lameli!) do +70° i -50°
Tytan Krios Gi4	Sokół 4; Filtr energetyczny Selectris X
	10 szczelina eV; symetryczny schemat nachylenia dawki (Hagen) z krokami co 2°; start od +10° (wstępne pochylenie lameli!) do +70° i -50°
Przejęcie FLM
Corrsight (tryb konfokalny)	Cel: Zeiss EC Plan-Neofluar 40×/0.9 NA Pol; Parametry akwizycji stosu: rozmiar piksela x-y = 161,25 nm, rozmiar kroku z = 300 nm.
Leica SP8 - kriokonfokalny	Obiektyw: Leica HCX PL APO 50x / 0.90 CLEM; Parametry akwizycji stosu: rozmiar piksela x-y = 84 nm, rozmiar kroku z = 300 nm.

Tabela 1: Lista testowanych urządzeń i sugerowane ustawienia.

Dyskusja

1. Kluczowe etapy protokołu

Optymalizacja parametrów hodowli komórkowych i zagłębiania siatki ma fundamentalne znaczenie dla tego przepływu pracy. Na początku projektu warto zainwestować czas w optymalizację strategii tagowania, rozmieszczenia komórek i koralików fiducial oraz przetestowanie różnych parametrów przygotowania siatki i bibuły. Praca z optymalnie zamrożoną próbką wgłębną znacznie ułatwi dalsze przetwarzanie.

Podobnie jak w przypadku każdego eksperymentu TEM, wymagane są próbki ciała szklistego. W przypadku dużych komórek ssaków, takich jak HeLa, preferowane są 1-2 komórki na kwadrat siatki, ale komórki mogą być nadal szkliste przy większej gęstości. Opcjonalnie witryfikację można poprawić w komórkach ssaków (np. HEK293, HeLa) poprzez inkubację z 2,5-10% (v/v) glicerolem dodanym do pożywki hodowlanej 10 minut przed zanurzeniem²³. Jeśli to możliwe, można zastosować wzór siatki, aby zapewnić idealne rozmieszczenie i rozmieszczenie komórek, poprawiając w ten sposób witryfikację i późniejszą korelację²⁴.

Podczas gdy określone komórki mogą być wybierane podczas przepływu pracy, zbyt mała liczba komórek, które wykazują interesującą cechę biologiczną, znacznie zmniejszy ogólną przepustowość. Aby poprawić korelację w komórkach POI-dodatnich, należy stosować wystarczająco jasne fluorofory. Jest to szczególnie ważne na endogennych poziomach ekspresji. Odkryliśmy, że w warunkach kriogenicznych mVenus często działał lepiej niż EGFP ze względu na zwiększoną jasność²⁵ i przesunięcie hipsochromiczne, co sprawia, że nadaje się do standardowych konfiguracji filtrów GFP w warunkach kriogenicznych²⁶. W przypadku struktur docelowych nieprzypominających punktów należy również wziąć pod uwagę kompromis między długością fali a dokładnością lokalizacji (granica dyfrakcji Abbego).

Wydajna korelacja 3D wymaga również, aby siatki były stabilne mechanicznie i były obsługiwane z dużą ostrożnością. Podczas gdy można stosować standardowe siatki złote lub miedziane z podparciem węglowym, wskaźnik sukcesu można znacznie zwiększyć poprzez zastosowanie sztywniejszych folii SiO₂ w zależności od projektu. Jednak nie ustalono jeszcze jednoznacznie, czy (a) stabilność mechaniczna, czy (b) dopasowanie współczynników rozszerzalności cieplnej (podłoże vs. folia) w celu zmniejszenia krio-marszczenia²⁷, jest najważniejszym czynnikiem udanej korelacji 3D. Ponadto do zbierania delikatnych siatek Au można stosować naczynia pokryte polidimetylosiloksanem⁵.

Oprócz zapewnienia stabilności próbki, staranny dobór parametrów obrazowania FLM jest niezbędny do uzyskania wysokiej jakości stosów fluorescencyjnych, które nadają się do optymalnego celowania podczas mielenia FIB. W związku z tym zaleca się również testowanie różnych technik odszumiania²⁸ lub dekonwolucji na danych FLM, ponieważ może to znacznie poprawić lokalizację sygnałów referencyjnych i komórkowych. Podczas korelacji sygnału fluorescencji z obrazami FIB-SEM ważne jest dobre próbkowanie kulek odniesienia. Powinny być dobrze rozmieszczone wokół komórek i możliwie na różnych wysokościach z. Dobrą praktyką jest również walidacja spójności korelacji poprzez sprawdzenie przewidywanych i rzeczywistych pozycji koralików, które zostały celowo pominięte w modelu odniesienia, ale mogą być wyraźnie skorelowane na oko. Wartości RMSE 3DCT powinny być również zawsze brane pod uwagę w celu sprawdzenia spójności rejestracji.

Ponieważ osadzanie się zmielonego materiału i resztkowej wody z komory FIB-SEM (tj. ponowne zanieczyszczenie) zwiększa efektywną grubość lameli poprzez dodanie materiału amorficznego po obu jej stronach, utrzymywanie drobno zmielonych lameli w mikroskopie przez dłuższy czas na ogół obniża jakość danych TEM z powodu dodatkowych zdarzeń rozpraszania elektronów. W związku z tym frezowanie najczęściej odbywa się w dwóch etapach: najpierw wszystkie pozycje są frezowane z grubsza (tj. do około 800 nm), a następnie drobno (do ~150-250 nm), a siatka jest rozładowywana natychmiast po zakończeniu ostatniej lameli. Lepszy sukces korelacji można jednak osiągnąć poprzez obróbkę interesujących pozycji w sposób specyficzny dla danego miejsca, a więc wykonywanie frezowania zgrubnego i dokładnego na tej samej lameli bezpośrednio po drugiej, ponieważ nie pozostawia to czasu na zginanie lub deformację. Zmniejsza to jednak maksymalną liczbę lameli, które można wyprodukować na siatkę, w zależności od szybkości ponownego zanieczyszczenia systemu. Przy wydajności 20 nm/h w ciągu 1-1,5 godziny wytwarza się 4-6 lameli.

Ruch całej siatki lub zgrubnie frezowanych lameli >300 nm spowoduje słabą lub nieudaną korelację (patrz również ograniczenia omówione poniżej). Dlatego należy go regularnie sprawdzać, np. porównując obrazy IB przed, w trakcie i po frezowaniu FIB. Miejsca, które wykazują znaczny ruch (>300 nm), należy wyrzucić. Zoptymalizuj przygotowanie próbki (tj. wybór typu siatki, gęstości komórek i parametrów zagłębiania; patrz rozdział 1 protokołu) i strategię mielenia, aby uniknąć tych ruchów. Gięcie lameli można znacznie zmniejszyć, frezując na miejscu, jak opisano w kroku 3.6 i zmniejszając szerokość lameli. Jak wspomniano wcześniej, chociaż nacięcia^{odprężające 15} zostały zaprojektowane w celu zmniejszenia wyginania się lameli, często skutkują one skoordynowanym ruchem odsprzężonej lameli, skutecznie zapobiegając w ten sposób korelacji. Do rozwiązania tego problemu można zastosować zintegrowane systemy FLM.

2. Modyfikacje i rozwiązywanie problemów z metodą

Zdecydowanie zaleca się przeprowadzenie dokładnej charakterystyki próbki w obrazowaniu żywych komórek przed przejściem do warunków kriogenicznych. Optymalizacja próbek komórkowych, schematów leczenia i wiedza o tym, jakiego rodzaju sygnału należy się spodziewać przed wejściem do krioprzepływu pracy, może znacznie poprawić jego wskaźnik sukcesu.

W przedstawionym tutaj przepływie pracy samodzielny mikroskop fluorescencyjny z kriostolikiem służy do obrazowania próbek, a następnie przenosi siatki do mikroskopu z skupioną wiązką jonów. Został on jednak przetestowany na systemach, w których mikroskop fluorescencyjny jest zintegrowany z komorą FIB-SEM, a zatem do uzyskania obrazów fluorescencyjnych nie jest wymagane przenoszenie próbki 29,30,31. Korzystając z takich zintegrowanych systemów, można obrazować interesujące pozycje w trakcie i po mieleniu FIB w celu sprawdzenia obecności docelowego sygnału fluorescencji bez zwiększania ryzyka zanieczyszczenia końcowych lameli. Należy jednak pamiętać o parametrach optycznych stosowanych mikroskopów, ponieważ np. obiektyw o niskim NA ograniczy precyzję, z jaką można zlokalizować kulki referencyjne i sygnały docelowe. Niemniej jednak, zintegrowane konfiguracje FLM pomogą również lepiej radzić sobie z niewielkimi deformacjami siatek i lameli, ponieważ stosy FLM mogą być stale aktualizowane i porównywane z aktualnymi widokami SEM i IB.

Jako alternatywę dla obrazowania fluorescencyjnego blaszki pomiędzy mieleniem FIB a akwizycją danych TEM, korelacja post-TEM może być wykorzystana do weryfikacji prawidłowego rozmieszczenia i frezowania lameli ^5,6.

Na wszystkich etapach przepływu pracy korelacyjnej, ale szczególnie podczas TEM, zaleca się tworzenie nakładki rzutowanych danych fluorescencyjnych na obrazy FIB-SEM/TEM. Takie klasyczne widoki CLEM pomagają bardziej intuicyjnie zrozumieć, która część komórek jest zawarta w blaszkach. Służy to również jako przydatna kontrola poprawności w celu zweryfikowania dokładności korelacji.

3. Ograniczenia metody

Podejście FIB oparte na korelacji 3D wymaga próbek, które mogą być dostarczane z kulkami odniesienia. W związku z tym metoda ta jest obecnie ograniczona do siatek zamrażanych wgłębnie. W przypadku próbek (tkankowych) zamrożonych pod wysokim ciśnieniem (HPF) można obecnie wykonać tylko korelacje 2D-2D. Potencjalnie rozwiązaniem tego problemu mogą być wewnętrzne markery odniesienia (np. organelle, barwione kropelki lipidów)^32,33. Ostateczny wskaźnik powodzenia korelacji zależy od wielu czynników, w tym jakości próbki, ustawienia mikroskopii fluorescencyjnej, grubości lameli i wielkości docelowej struktury. Szacuje się, że dokładność korelacji przy użyciu opisanego podejścia do rejestracji 3D mieści się w zakresie 200-300 nm na końcowym obrazie IB, co w przybliżeniu odpowiada typowej grubości lameli frezowanych FIB⁷. W związku z tym struktury komórkowe znacznie mniejsze niż ta będą obecnie trudne do ukierunkowania. Dodatkowo, nadmierny ruch w miejscu frezowania (>300 nm) również zmniejsza dokładność korelacji, co jest problemem, który potencjalnie można rozwiązać za pomocą konfiguracji FLM zintegrowanych z instrumentami FIB/SEM. Lamele, które wykazują silne odkształcenia lub wygięcia podczas frezowania, powinny być w każdym przypadku wyłączone z dalszego przepływu pracy.

Ogólnie rzecz biorąc, obrazowanie kriofluorescencyjne jest obecnie ograniczone przez kryterium dyfrakcji Abbego. Dzięki bardziej rutynowemu zastosowaniu (i komercjalizacji) superrozdzielczych metod cryo-FLM, możliwe może stać się dokładniejsze celowanie w struktury komórkowe, zwłaszcza po zintegrowaniu z FIB/SEM do operacji w locie.

4. Znaczenie metody

Zwłaszcza w porównaniu z technikami nieukierunkowanymi i post-korelacji, skorelowane z 3D podejście do frezowania FIB pozwala na wybór odpowiednich pozycji przed czasochłonnym i zasobochłonnym etapem TEM. W ten sposób umożliwia bardziej efektywne gromadzenie danych i planowanie projektów. Co więcej, skorelowane dane dotyczące fluorescencji dodają warstwę informacji, które mogą mieć kluczowe znaczenie dla interpretacji tomogramów i integracji wyników krio-ET w projektach wieloskalowych, zwłaszcza gdy mamy do czynienia z nieustrukturyzowanymi zespołami białek lub zbyt małymi, aby można było dopasować matrycę i uśrednić subtomogram.

5. Znaczenie i potencjalne przyszłe zastosowania

W połączeniu z zaawansowanymi procesami pracy, takimi jak kriolifting z próbek HPF^34,35, krio-FIB-SEM objętość³⁶ i obrazowanie fluorescencyjne w superrozdzielczości 26,37,38,39, przygotowanie lameli ukierunkowanych na 3D daje perspektywę nie tylko preparowania procesów biologicznych w izolowanych komórkach, ale także udostępnienia tkanek i próbek pacjentów do mielenia FIB i kriotomografii elektronowej. W związku z tym pozwoli na analizę procesów patologicznych w wysokiej rozdzielczości, a tym samym będzie integralnym elementem konstrukcyjnym biopsji w nanoskali.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Autogrids	Thermo Fisher Scientific / Domowe	1036173 (bez wycięcia), 1205101 (z wycięciem)
C-ringi	Thermo Fisher Scientific	1036171
Corrsight z modułem kriogenicznym	Thermo Fisher Scientific		FLM Alternatywa 1
Dynabeads MyOne COOH	Thermo Fisher Scientific	65011	zalecany 1 &mikro; m koraliki referencyjne
EM Grids R1/4 SiO2	Quantifoil	N1-S13nAu20-01
Kamera Falcon 4 z filtrem energii po kolumnie Selectris X	Kamera/filtr	Thermo Fisher
FIB Aquilos 1	Thermo Fisher Scientific		FIB Alternatywa 1
FIB Aquilos 2	Thermo Fisher Scientific		FIB Alternatywa 2
FIB Quanta 3D FEG	Thermo Fisher Scientific		FIB Alternatywa 3
FIB Scios	Thermo Fisher Scientific		FIB Alternatywa 4
Kamera szczytowa K2 z pokolumnowym filtrem energetycznym 968 Quantum K2	Alternatywa		kamery/filtra Quantum
Leica TCS SP8 z modułem kriogenicznym	Thermo Fisher Scientific		FLM Alternative 2
Odkurzacz plazmowy PDC-3XG
(0,25 mm)	plastx24.de	11645	Przycięte do tych samych wymiarów co bibuła filtracyjna
TEM Titan Krios XFEG 300 kV Gi2	Thermo Fisher Scientific		TEM Alternatywa 1
TEM Titan Krios XFEG 300 kV Gi4	Thermo Fisher Scientific		TEM Alternatywa 2
Imager THUNDER  EM Cryo CLEM	Thermo Fisher Scientific		FLM Alternative 3
Vitrobot Mark IV	Thermo Fisher Scientific		alternatywnie użyj tłoka ręcznego
Bibuła filtracyjna Whatman	Sigma Aldrich	10311807	średnicy 55 mm; musi być przycięty, aby pasował do Vitrobot