Artykuł metodologiczny

Synteza i charakterystyka nanocząstek poli(beta-aminoestrów) obciążonych mRNA do celów szczepień

DOI:

10.3791/62889

⸱

13 sierpnia 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Grup d’Enginyeria de Materials (Gemat), Institut Químic de Sarrià (IQS), Universitat Ramon Llull (URL)

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj przedstawiono prosty protokół produkcji nanocząsteczek mRNA opartych na polimerach poli(beta aminoestrowych), który można łatwo dostosować poprzez zmianę kapsułkowanego mRNA. Opisano również przebieg syntezy polimerów, nanocząstek oraz ich niezbędną charakterystykę in vitro. Dodano również dowód słuszności koncepcji dotyczący szczepień.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szczepienia są jednym z głównych sukcesów współczesnego społeczeństwa i są niezbędne w kontrolowaniu i zapobieganiu chorobom. Tradycyjne szczepionki składały się z całości lub frakcji czynnika zakaźnego. Nadal jednak istnieją wyzwania, a nowe technologie szczepionek są obowiązkowe. W tym kontekście stosowanie mRNA do celów uodparniających wykazało zwiększoną skuteczność, czego dowodem jest szybkie zatwierdzenie dwóch szczepionek mRNA zapobiegających zakażeniu SARS-CoV-2. Oprócz skuteczności w zapobieganiu infekcjom wirusowym, szczepionki mRNA mogą być również stosowane w leczeniu raka.

Niemniej jednak, niestabilność mRNA i jego szybkie usuwanie z organizmu spowodowane obecnością nukleaz uniemożliwia jego bezpośrednie dostarczanie. W tym kontekście nanoleki, a w szczególności nanocząstki polimerowe, są krytycznymi systemami dostarczania mRNA. W związku z tym celem niniejszego artykułu jest opisanie protokołu formulacji i testu kandydata na szczepionkę mRNA opartego na zastrzeżonych nanocząstkach polimerowych. W tym miejscu omówiona zostanie synteza i charakterystyka chemiczna zastosowanych polimerów poli(beta-aminoestrów), ich kompleksowanie z mRNA w celu wytworzenia nanocząstek oraz metodologia ich liofilizacji. Jest to kluczowy krok w kierunku obniżenia kosztów magazynowania i dystrybucji. Na koniec wskazane zostaną wymagane testy w celu wykazania ich zdolności do transfekcji in vitro i dojrzałych modelowych komórek dendrytycznych. Protokół ten przyniesie korzyści społeczności naukowej zajmującej się szczepieniami ze względu na jego dużą wszechstronność, która umożliwia tym szczepionkom zapobieganie lub leczenie wielu różnych chorób.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroby zakaźne stanowią poważne zagrożenie dla milionów ludzi na całym świecie i nadal są jedną z głównych przyczyn zgonów w niektórych krajach rozwijających się. Szczepienia profilaktyczne są jedną z najskuteczniejszych interwencji współczesnego społeczeństwa w celu zapobiegania i kontroli chorób zakaźnych1,2. Te kluczowe kamienie milowe nauki w XX-wiecznym znaczeniu zostały zauważone przez niedawną światową pandemię Covid-19 spowodowaną wirusem SARS-CoV-23. Uznając znaczenie posiadania skutecznych szczepionek w celu ograniczenia rozprzestrzeniania się choroby, wspólne wysiłki wszystkich społeczności biomedycznych z powodzeniem zaowocowały wieloma szczepionkami profilaktycznymi dostępnymi na rynku w czasie krótszym niż rok4.

Tradycyjnie, szczepionki składały się z atenuowanych (żywe, zmniejszone zjadliwości) lub inaktywowanych (cząstki śmierci) wirusów. Jednak w przypadku niektórych chorób, w przypadku których nie ma marginesu błędu bezpieczeństwa, cząsteczki wirusa nie są możliwe, a zamiast nich stosuje się podjednostki białkowe. Niemniej jednak podjednostki zwykle nie umożliwiają połączenia więcej niż jednego epitopu/antygenu, a adiuwanty są wymagane do zwiększenia siły działania szczepienia5,6. W związku z tym istnieje oczywiste zapotrzebowanie na nowe rodzaje szczepionek.

Jak wykazano podczas obecnej pandemii, nowe kandydatki na szczepionki oparte na kwasach nukleinowych mogą być korzystne pod względem unikania długich procesów rozwoju i zapewniania wysokiej wszechstronności, jednocześnie produkując niezbędną szczepionkę pacjenta. Tak jest w przypadku szczepionek mRNA, które początkowo zostały zaprojektowane jako eksperymentalne szczepionki przeciwnowotworowe. Dzięki ich naturalnej zdolności do wytwarzania odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla antygenu3,5,6,7. Będąc mRNA, cząsteczką kodującą białko antygenowe, zmieniającą się tylko tak samo, szczepionka może być szybko dostosowana do uodparniania innych wariantów tego samego mikroorganizmu, różnych szczepów, innych zakaźnych mikroorganizmów, a nawet stać się leczeniem immunoterapeutycznym raka. Ponadto są korzystne pod względem kosztów produkcji na dużą skalę. Jednak mRNA ma poważną przeszkodę, która utrudnia ich nagie podawanie: jego stabilność i integralność są zagrożone w pożywkach fizjologicznych, pełnych nukleaz. Z tego powodu wymagane jest użycie nanometrycznego nośnika, który chroni go i wektoryzuje mRNA do komórek prezentujących antygen2,8.

W tym kontekście, poli(beta aminoestry) (pBAE) to klasa biokompatybilnych i biodegradowalnych polimerów, które wykazały niezwykłą zdolność do kompleksowania mRNA w nanometrycznych cząsteczkach, dzięki swoim ładunkom kationowym9,10,11. Polimery te składają się z wiązań estrowych, co ułatwia ich degradację przez esterazy w warunkach fizjologicznych. Wśród kandydatów do biblioteki pBAE, te funkcjonalizowane oligopeptydami kationowymi wykazały większą zdolność do tworzenia małych nanocząstek, aby skutecznie przenikać do komórek przez endocytozę i transfekować zamknięty w kapsułkach materiał genowy. Ponadto, dzięki ich zdolności buforowej, zakwaszenie przedziału endosomalnego umożliwia ucieczkę endosomalną12,13. Mianowicie, niedawno opublikowano specyficzny rodzaj pBAE, w tym hydrofobowe ugrupowania na ich szkielecie (tzw. C6 pBAE) w celu zwiększenia ich stabilności i kombinacji end-oligopeptyd (60% polimeru zmodyfikowanego trilizyną i 40% polimeru tri-histydyną), który selektywnie transfekuje komórki prezentujące antygen po podaniu pozajelitowym i wytwarza prezentację antygenu kodowaną przez mRNA, a następnie immunizację myszy14. Ponadto wykazano również, że preparaty te mogą obejść jeden z głównych etapów wąskiego gardła preparatów nanomedycznych: możliwość ich liofilizacji bez utraty ich funkcjonalności, co umożliwia długoterminową stabilność w środowiskach miękkich, suchych15.

W tym kontekście, celem obecnego protokołu jest udostępnienie społeczności naukowej procedury tworzenia nanocząsteczek mRNA poprzez podanie opisu krytycznych kroków w protokole i umożliwienie produkcji skutecznych szczepionek do zapobiegania chorobom zakaźnym i leczenia nowotworów.

Poniższy protokół opisuje kompletny trening syntezy oligopeptydów modyfikowanych na końcu poli(beta aminoestrów) - polimerów OM-pBAE, które będą dalej wykorzystywane do syntezy nanocząstek. W protokole uwzględniono również formułę nanocząstek. Ponadto zapewnione są kluczowe etapy dla powodzenia procedury i reprezentatywnych wyników, aby zapewnić, że otrzymane preparaty spełniają wymagane cechy charakterystyki kontroli jakości w celu określenia wyniku pozytywnego lub negatywnego. Protokół ten jest podsumowany w Rysunek 1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Synteza polimeru pBAE z końcowymi oligopeptydami (OM-pBAE)

  1. Polimeryzacja C6-pBAE
    1. Dodać 5-amino-1-pentanol (38 mmol; MW = 103,16 Da) 1-heksyloamina (38 mmol; MW = 101,19 Da) do okrągłodennej szklanej kolby (100 ml). Następnie dodać diakrylan 1,4-butanodiolu (82 mmol; MW = 198,22 Da).
    2. Podgrzej wstępnie kąpiel oleju silikonowego w temperaturze 90 °C, umieść kolbę okrągłodenną w łaźni olejowej i mieszaj mieszaninę za pomocą mieszadła magnetycznego przez noc (~18 h). Następnie wyjąć produkt z kolby okrągłodennej i umieścić go w zamrażarce w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Produkt ma postać lepkiego proszku i wyjmuje się go z kolby za pomocą szpatułki. Niezbędna jest walidacja struktury otrzymanego polimeru za pomocą 1H-NMR. Widma NMR zarejestrowano w instrumencie pracującym na częstotliwości 400 MHz (patrz tabela materiałów) przy użyciu chloroformu-d iD2Ojako rozpuszczalników. Pobrano około 10 mg każdego estru poli(β-aminowego) i rozpuszczono w 1 ml deuterowanego rozpuszczalnika.
  2. Reakcja z peptydami w celu otrzymania OM-pBAE
    1. Dodać 25 ml 0,1 M HCl do wybranych peptydów, np. peptydu Cys-His-His-His z kwasem trifluorooctowym (TFA, 200 mg), do uprzednio zważonej 50 ml probówki wirówkowej, która może wytrzymać liofilizację i ręcznie mieszać przez noc, aby uzyskać klarowny roztwór.
    2. Zamrozić roztwór w temperaturze -80 °C przez 1 godzinę i zamrozić otrzymany chlorowodorek peptydu.
      UWAGA: Sprawdź, czy ostateczna waga odpowiada wartości teoretycznej.
    3. Sporządzić roztwór C6-pBAE (0,031 mmol) w sultlenku dimetylu. Sporządzić również roztwór chlorowodorku peptydu (0,078 mmol) w dimetylosulfotlenku.
    4. Wymieszaj oba roztwory w zakręcanej tubce i przykręć nakrętkę. Mieszać roztwór mieszaniny w łaźni wodnej o kontrolowanej temperaturze 25 °C przez 20 godzin za pomocą mieszadła magnetycznego.
    5. Dodać mieszaninę do eteru dietylowego/acetonu w stosunku 7:3 (v/v). Powstałą zawiesinę odwirować w temperaturze 25 000 x g w temperaturze 4 °C w celu usunięcia rozpuszczalnika. Następnie dwukrotnie przemyć ciało stałe eterem dietylowym/acetonem w proporcji 7:3 (v/v). Następnie wysuszyć produkt w próżni (<0,2 atm).
    6. Sporządzić roztwór 100 mg/ml produktu w suloctlenku dimetylu. Otrzymany produkt nosi nazwę C6-peptide-pBAE. Niezbędne jest zweryfikowanie struktury otrzymanego polimeru za pomocą 1H-NMR, aby potwierdzić zanik sygnałów olefin związanych z końcowymi akrylanami. Jeśli polimer nie jest używany, można go zamrozić w temperaturze -20 °C.

2. Powstawanie polipleksów

UWAGA: Wszystkie procedury powinny być wykonywane w klimatyzowanym pomieszczeniu, aby utrzymać stałą temperaturę.

  1. Rozmrozić polimery C6-peptide-pBAE i wymieszać roztwór.
  2. Odpipetować polimer, wymieszać w górę i w dół i przygotować roztwór 12,5 mM (V1) w octanie sodu (NaAc). Następnie zmieszaj mieszaninę i odczekaj 10 minut.
  3. Przygotować mRNA w stężeniu 0,5 mg/ml i wymieszać pipetując (V2).
    UWAGA: Bardzo ważne jest, aby unikać wirowania mRNA.
  4. Zwirować mieszaninę polimerów przy końcowym stężeniu, aby uzyskać jednorodny roztwór między polimerem podstawowym w DMSO a buforem octanowym .
    UWAGA: Końcowe stężenie polimeru zależy od wybranego stosunku N/P (grupy azotowe do fosforanowego). Stosunek N/P zależy od każdego konkretnego mRNA, które ma być użyte. Na przykład w przypadku enkapsulacji eGFP zastosowano stosunek 25:1, jak wcześniej informowano14.
  5. Zmieszać roztwór materiału genetycznego i roztwór peptydu C6-peptidepBAE (25x stężenia mRNA) w stosunku 1:1 (Vi = V1 + V2).
    UWAGA: C6-peptide-pBAE jest ładowany do probówki mikrowirówkowej, w której mRNA jest dodawane przez pipetowanie w górę iw dół w celu wymieszania. Po przygotowaniu polipleks, kwas nukleinowy i stężenia peptydu C6-pBAE są rozcieńczane do połowy.
  6. Inkubować w temperaturze 25 °C przez 30 minut w termobloku. Wytrącić się wodą wolną od RNaz w stosunku 1:2, dodając próbkę do wstępnie załadowanej probówki wirówki z wodą.
  7. Dodać substancje pomocnicze. Dodać taką samą objętość jak mieszaninę mRNA i pBAE (Vi) w HEPES 20 mM i sacharozy 4%, pipetując w górę iw dół. W tym momencie próbka została rozcieńczona 3x.

3. Liofilizacja polipleksów

  1. Natychmiast zamrozić w temperaturze -80 °C zamrażarkę poprzedniego roztworu polyplex przez 1 godzinę.
  2. Suszenie wstępne należy przeprowadzić, wykonując następujące czynności: (1) 1 h w temperaturze -60 °C i 0,001 hPa; (2) 1 h w temperaturze -40 °C i 0,0001 hPa; (3) 4 h w temperaturze -20 °C i 0,0001 hPa; (4) 12 h w temperaturze 5 °C i 0,0001 hPa.
  3. Przechowywać w temperaturze -20 °C natychmiast, aby uniknąć ponownego nawodnienia do czasu użycia.

4. Zawiesina Polyplex

UWAGA: Ten protokół opisuje proces używany do rekonstrukcji liofilizowanych nanocząstek peptydu-pBAE w celu ich dalszego wykorzystania do charakteryzacji, analizy in vitro lub in vivo.

  1. Pobrać liofilizowane nanocząstki z temperatury -20 °C w momencie użycia i szybko dodać odpowiednią ilość wody depirogenowanej (DEPC) w celu ponownego rozproszenia ciała stałego w celu osiągnięcia pożądanego stężenia.
    UWAGA: Objętość będzie taka sama jak początkowa objętość nanocząstek, jeśli przewiduje się takie samo stężenie, ale będzie ona wskazana dla każdego eksperymentu.
  2. Delikatnie pipetować aż do całkowitego wymieszania, dołączając płyn do pipety.
    UWAGA: Upewnij się, że na ściance fiolki nie pozostał żaden materiał.
  3. Po rozpuszczeniu energicznie pipetować w górę i w dół, unikając pęcherzyków powietrza.
    UWAGA: Próbka powinna mieć kolor od przezroczystego do półprzezroczystego, który jest bardziej widoczny przy wyższych stężeniach
  4. Próbki należy przechowywać na lodzie lub w temperaturze 4 °C przez maksymalny okres 24 godzin po rozpuszczeniu. Unikaj zamrażania.

5. Charakterystyka Polyplex

  1. Dynamiczne rozpraszanie światła
    UWAGA: Średnicę hydrodynamiczną (nm), wskaźnik polidyspersyjności (PDI) i ładunek powierzchniowy nanocząstek mierzono w temperaturze 25 °C, długości fali lasera 633 nm i detektorze sygnału 173°, przy użyciu analizatora potencjału Zeta (patrz tabela materiałów).
    1. Średnica hydrodynamiczna (nm)
      1. Przygotować nanocząstki, dokładnie mieszając mRNA i pBAE, pipetując materiał genowy do frakcji polimerowej do końcowego stężenia mRNA 0,25 mg/ml, jak opisano powyżej (krok 2).
      2. Wstępnie przepłucz mikrokuwetę przefiltrowanym środkiem rozcieńczającym, aby całkowicie oczyścić ją z zanieczyszczeń. Następnie napełnij kuwetę co najmniej 50 μl roztworu próbki i zakryj ją. Następnie wprowadź próbkę do instrumentu DLS, upewnij się, że komórka jest prawidłowo włożona.
        UWAGA: Pożywka rozcieńczająca jest filtrowana za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm.
      3. Otwórz utworzony plik Standardowa procedura operacyjna (SOP) i wprowadź żądaną nazwę próbki. Wybierz Pomiar rozmiaru.
        UWAGA: Wszystkie parametry potrzebne do utworzenia SOP dla pomiarów rozmiaru są podane w Tabeli 1.
      4. Uruchom pomiar wielkości cząstek za pomocą DLS, klikając Play.
        UWAGA: Po usłyszeniu potrójnego sygnału dźwiękowego analiza jest zakończona.
      5. Wybierz wyniki odpowiadające próbce na arkuszu pomiarowym, aby uzyskać średnią wielkość cząstek, średni PDI, odchylenie standardowe i grafikę. Po zakończeniu wyjmij ogniwo ze sprzętu DLS.
      6. Usuń próbkę, zachowaj ją do analizy potencjału zeta, a następnie wyczyść i przepłucz ogniwo wodą dejonizowaną. Na koniec osusz oczyszczoną kuwetę pod strumieniem sprężonego powietrza.
    2. Ładunek powierzchniowy (mV)
      1. Przygotować nanocząstki, dokładnie mieszając mRNA i pBAE, pipetując materiał genowy do frakcji polimerowej do końcowego stężenia mRNA 0,25 mg/ml, jak opisano wcześniej powyżej (krok 2, tworzenie Polyplex). Następnie zamroź i wysusz roztwór.
        UWAGA: W takim przypadku, w celu pomiaru ładunku powierzchniowego, zdecydowanie zaleca się liofilizację próbki przed wykonaniem pomiarów mających na celu ponowne zdyspergowanie próbki w odpowiednim buforze, symulując warunki ciała dotyczące pH i stężenia elektrolitu.
      2. Zawiesić liofilizowaną próbkę za pomocą wody. Rozcieńczyć próbkę w stosunku 1/10 w wodzie (stężenie końcowe 0,025 mg/ml).
      3. Wstępnie przepłucz jednorazową złożoną komórkę kapilarną (kuwetę potencjału zeta) przefiltrowanym medium rozcieńczającym, aby całkowicie oczyścić ją z zanieczyszczeń. Następnie napełnij kuwetę rozcieńczonymi nanocząstkami za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml i zakryj obie strony wypełniaczy.
        UWAGA: Dyspersja nanocząstek musi wypełnić objętość dostępną w kuwecie (~1 ml), zwracając szczególną uwagę na tworzenie się pęcherzyka, co może zaburzać pomiary.
      4. Wprowadzić próbkę do DLS; upewnić się, że komórka jest prawidłowo włożona.
      5. Otwórz plik SOP utworzony do analizy potencjału zeta i wprowadź żądaną nazwę próbki. Wybierz Zeta-Potential Measurement.
        UWAGA: Parametry do stworzenia SOP dla pomiarów potencjału zeta są podane w Tabeli 2.
      6. Uruchom pomiar potencjału zeta za pomocą DLS, klikając na Play.
        UWAGA: Po usłyszeniu potrójnego sygnału dźwiękowego analiza jest zakończona.
      7. Wybierz wyniki odpowiadające próbce na karcie pomiarowej, aby uzyskać średni potencjał zeta, odchylenie standardowe i grafikę. Po zakończeniu wyjmij ogniwo ze sprzętu DLS.
      8. Pobrać próbkę i zachować ją, jeśli jest to konieczne. Następnie wyczyść i wypłucz kuwetę wodą dejonizowaną, a następnie ponownie etanolem i wodą. Na koniec wysuszyć oczyszczoną kuwetę pod strumieniem sprężonego powietrza.
        UWAGA: Aby przeanalizować dane, użyj zalecanego oprogramowania.
  2. Analiza śledzenia nanocząstek (NTA)
    UWAGA: Średnicę hydrodynamiczną (nm) i stężenie nanocząstek mierzono w temperaturze 25 °C, długości fali lasera 488 nm za pomocą analizatora śledzenia nanocząstek (patrz tabela materiałów).
    1. NTA i przygotowanie próbki
      1. Włącz komputer i sprzęt. Najpierw sprawdź, czy wszystkie komponenty są prawidłowo podłączone. Następnie otwórz zalecane oprogramowanie. Oprogramowanie sprawdzi, czy wszystkie akcesoria są prawidłowo podłączone.
      2. Podłącz górną płytę, w tym przypadku ogniwo O-ring, do modułu laserowego.
        UWAGA: Nie przekręcaj tej części.
      3. Najpierw napełnij komorę buforem i/lub wodą dejonizowaną za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml. Powtórz procedurę co najmniej dwa razy. Unikaj wprowadzania pęcherzyków do komory.
      4. Przygotować próbkę, rozcieńczając 1/1000 w wodzie dejonizowanej od stężenia użytego do pomiaru wielkości DLS. Przygotuj co najmniej 1 ml i załaduj go do strzykawki o pojemności 1 ml, unikając wprowadzania bąbelków.
      5. Załaduj próbki do komory za pomocą strzykawki. Następnie podłącz moduł laserowy do dużej komory NTA.
        UWAGA: Duża komora oznacza przestrzeń, w której komora jest umieszczona do pomiaru.
    2. Optymalizacja obrazu
      1. Najpierw w Sprzęcie sprawdź, czy wybrano kamerę i odpowiedni laser.
        UWAGA: Tutaj jest tylko jedna kamera i Blue Laser 488 nm.
      2. Zacznij od poziomu kamery na poziomie 0 i naciśnij Uruchom kamerę w oknie przechwytywania.
        UWAGA: W tym momencie dostosuj następujące parametry. Pozycja wiązki (można ją przesuwać w górę iw dół na ekranie). Poziom kamery: unikaj przesyconych pikseli. Ostrość (koło boczne): staraj się ustawić ostrość tak dobrze, jak to możliwe. Lepiej jest mieć cząstki z halo niż cząstki nieostrzone. Stężenie: Dostosuj stężenie tak, aby zawierało od 10 do 100 cząstek na pole.
    3. Nagrywanie wideo
      1. W oprogramowaniu przejdź do okna Measurement Selection - SOP (w lewym dolnym rogu) i wybierz Standard Measurement.
        UWAGA: Zaprogramuj do wykonania trzech pomiarów po 30 s każdy (aby umożliwić oprogramowaniu wykonanie obliczeń średniej i odchylenia standardowego). Podaj nazwę i ścieżkę folderu (w polu Podstawowa nazwa pliku), aby zapisać rekordy próbki. Po prawidłowym skonfigurowaniu parametrów SOP naciśnij przycisk Utwórz i uruchom skrypt. Po zmierzeniu pierwszej replikacji program poprosi o dodanie nowej próbki. Następnie do komory należy wprowadzić kolejną frakcję próbki, naciskając tłok strzykawki. Na koniec powtórz czynność po raz trzeci, aby przeanalizować trzecią replikę.
    4. Przetwarzanie wideo
      1. Ponownie dostosuj wzmocnienie ekranu i próg wykrywania po zakończeniu trzech pomiarów, aby przeanalizować zmierzone cząstki. W tym momencie w każdej klatce powinno pojawić się około 100 cząstek do przeprowadzenia analizy (spodziewane są wysokie czerwone krzyżyki i niskie niebieskie krzyżyki).
      2. Po zakończeniu analizy należy wyeksportować wyniki do pliku pdf. Ponadto możliwy jest eksport jako filmy i pliki Excel.
    5. Czyszczenie NTA
      UWAGA: Zamknij wszystkie otwarte pomiary przed zbadaniem następującej próbki; Ponieważ generowane pliki są ogromne i zależą od komputera, nie jest łatwo utrzymać więcej niż jeden otwarty.
      1. Oczyścić komorę NTA poprzez wielokrotne spłukiwanie wodą przed wykonaniem kolejnego pomiaru, aż do momentu, gdy nie zaobserwuje się żadnych cząstek; następnie przepłukać zastosowany bufor (PBS), aby kontynuować pomiary.
      2. Przepłucz powietrze wewnątrz komory i wysusz je mikroskopijnym papierem po zakończeniu ostatniego pomiaru w ciągu dnia.
      3. Scharakteryzuj rozmiar i kształt za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronicznej (TEM). Przygotuj próbki. 30 μL końcowej objętości wystarcza do charakterystyki TEM.
        UWAGA: Można mierzyć zarówno świeże, jak i liofilizowane - po ponownym zawieszeniu - nanocząstki.
      4. Upuść 10 μl próbki na miedzianą siatkę pokrytą węglem. Pozostaw do wyschnięcia na 10 minut. Usuń nadmiar płynu, jeśli to konieczne, delikatnie stukając w bibułę filtracyjną.
      5. Wlej 10 μl roztworu octanu uranylu (2% w/v) w celu barwienia negatywnego. Pozostaw do wyschnięcia na 1 minutę. W razie potrzeby usuń nadmiar płynu, delikatnie stukając w bibułę filtracyjną.
      6. Wprowadzić próbkę do mikroskopu i zeskanować (napięcie robocze 80 kV).
        UWAGA: Do dalszej analizy obrazów można użyć odpowiedniego oprogramowania.
  3. Skuteczność hermetyzacji
    1. Przygotowanie próbki
      1. Przygotuj nanocząstki o pożądanym stężeniu, a następnie zamroź je i wysusz. Następnie ponownie zawiesić nanocząstki i rozcieńczyć je do końcowego stężenia 6 μg/ml.
      2. Przygotować 1x bufor TE z 20x roztworu podstawowego.
        UWAGA: Vt (objętość całkowita) = (liczba próbek x 100 μL x 4) (liczba próbek x 290 μl) + 2 ml.
      3. Przygotować bufor TE z 3 μg/μL heparyny z zapasu 100 μg/μL.
        UWAGA: Vt = liczba próbek x 50 μL x 2.
      4. Przygotowanie norm
      5. Przygotuj wzorzec RNA w zakresie od 0,2 μg/ml do 0,025 μg/ml w 1x bufor Tris-EDTA (TE) (tabela S1A).
        UWAGA: Użyj mRNA w standardzie RNA w przypadku, gdy różni się on od rybosomalnego RNA.
      6. Przygotować wzorzec RNA:pBAE z heparyną (tabela S1B). Przygotować wzorzec heparyny (tabela S1C).
      7. Przygotuj 96-dołkową płytkę w następujący sposób.
        1. Załaduj 295 μl buforu TE na pierwszy tor płytki 96-dołkowej (tyle studzienek, ile próbek do analizy). Następnie załadować 50 μl 1x buforu TE na tory B i C (duplikaty dla każdej próbki).
        2. Załadować 50 μl 1x buforu TBE z 3 μg/μl heparyny na tory D i E (duplikaty dla każdej próbki). Następnie załaduj po 100 μl każdego wzorca na pasy F, G i H (duplikaty dla każdego standardu).
        3. Załadować 5 μl każdej próbki na tor A (stężenie w każdym studzience wynosi 0,1 μg/ml). Dokładnie wymieszać pipetując i załadować 50 μl każdej próbki do czterech studzienek poniżej (dwie z nich zawierają 50 μl buforu 1x TE i dwie kolejne zawierają 1 x bufor TE z 3 μg/μL heparyny).
      8. Inkubować próbkę przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Przygotować odczynnik RiboGreen zgodnie z protokołem producenta (patrz Tabela Materiałów) w 1x bufor TE.
        UWAGA: Rozcieńczyć w stosunku 1:200 i wirować. Chronić przed światłem. Vt = liczba pełnych studzienek x 100 μL.
      9. Załaduj 100 μl roztworu RiboGreen do każdej studzienki. Wykrywanie fluorescencji za pomocą czytnika mikropłytek o długości fali wzbudzenia 500 nm i długości fali emisji 525 nm.
    2. Analiza wyników
      1. Przygotuj trzy krzywe kalibracyjne
        UWAGA: Po pierwsze, wzorzec rybosomalnego RNA. W tej krzywej kalibracyjnej należy interpolować próbki, które nie zawierają heparyny. Po drugie, mRNA:pBAE z heparyną. Interpoluj w tej krzywej kalibracyjnej próbkę, która zawiera heparynę. Po trzecie, heparyna. Służy do zapewnienia, że stężenie robocze mieści się w zakresie liniowym.
      2. Oblicz skuteczność enkapsulacji (EE%) w następujący sposób:
        figure-protocol-1

6. Charakterystyka in vitro

  1. Mikroskopia fluorescencyjna do oceny jakościowej
    1. Umieścić 96-dołkową płytkę pod mikroskopem po 24 godzinach od transfekcji. Rozpocznij wizualizację komórek za pomocą obiektywu 10x.
      UWAGA: W tym przypadku stosuje się ogniwa HeLa. Komórki są lokalizowane w trybie transmisji (jasne pole) i w tym czasie należy dostosować ostrość.
      1. Najpierw zastosuj balans bieli, aby odwołać się do oprogramowania na temat tła próbek. Następnie uzyskaj obraz, aby nałożyć go na obraz fluorescencyjny podczas analizy.
    2. Zmień tryb mikroskopu na tryb odbicia (fluorescencja) i przesuń koło filtrów na niebieski laser (488 nm), aby uwidocznić eGFP.
      UWAGA: W tym momencie należy dostosować czas ekspozycji i wzmocnienie. Wzmocnienie musi być dostosowane w wartościach od 3 do 5, aby uniknąć artefaktów i nadmiaru sygnału tła. Regulacja czasu naświetlania zależy od skuteczności transfekcji (od ms do 1 s).
    3. Zdobądź obrazy dla wszystkich warunków lub studzienek, wykorzystując ten sam czas naświetlania, aby porównać wszystkie próbki.
  2. Cytometria przepływowa (FC) do oceny ilościowej
    1. Użyj pipety wielokanałowej, aby przygotować 96-dołkową płytkę do eksperymentu z cytometrią przepływową.
      UWAGA: Podczas pracy z komórkami póładherentnymi, takimi jak w linii komórkowej JAWSII, odzyskaj całą objętość podłoża i przechowuj ją na innej 96-dołkowej płytce. Nie należy dążyć do tego podłoża, ponieważ może ono zawierać znaczną liczbę transfekowanych komórek.
    2. Oczyść komórki (używane są tutaj komórki HeLa) 100 μL/studzienkę 1x PBS i odessać. Następnie dodać 25 μl/basenik trypsyny i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
    3. Po odłączeniu komórek dodaj wcześniej odzyskane podłoże, aby zatrzymać działanie trypsyny i utrwalić komórki, dodając 31,25 μl / studzienkę formaliny 10% przez 20 minut (końcowe stężenie 2,5%).
      UWAGA: W tym momencie ważne jest, aby zobrazować stan komórek za pomocą mikroskopii, aby zapewnić odłączenie komórek. Zdecydowanie zaleca się kilkakrotne pipetowanie w górę i w dół, aby ułatwić oderwanie komórek i uniknąć ich aglomeracji. Zapewni to wiarygodny wynik.
    4. Włącz cytometr przepływowy i oprogramowanie. W oprogramowaniu ustaw odpowiednie warunki do eksperymentu (rodzaj płytki, objętość próbki i inne parametry, takie jak wstrząsanie, płukanie między próbkami.
      UWAGA: Dla kroku 6.2.5 natężenie przepływu powinno wynosić 120 μl/min. Mieszaj jeden cykl co 1 minutę i dobrze spłukuj jeden cykl każdy. Mieszanie jest niezbędne, aby utrzymać komórki rozproszone w pożywce i umożliwić lepszą analizę poszczególnych komórek. Ponadto płukanie jest konieczne w celu oczyszczenia mikrofluidyki cytometru między próbkami. Na koniec sprawdź, czy jest wystarczająca ilość i czy wszystkie komponenty są prawidłowo podłączone.
    5. Ustaw odpowiednie parametry, aby określić ilościowo procent dodatnio transfekowanych komórek.
      1. Najpierw wyświetl dane przepływu na wykresie punktowym FSC (światło rozproszone do przodu) i SCC (światło rozproszone z boku), aby odróżnić komórki od zanieczyszczeń. Następnie wykreślany jest kolejny wykres punktowy porównujący amplitudę (FSC-A) i wysokość (FSC-H) w celu bramkowania i rozróżniania poszczególnych komórek.
        UWAGA: Populacja nieleczona pozwala na bramkowanie populacji odpowiadających komórkom dodatnio transfekowanym. Następnie przeprowadza się kwantyfikację dodatnio transfekowanych komórek na odpowiednim kanale na wykresie histogramu. W związku z tym dodatnio transfekowane komórki muszą być reprezentowane jako kontinuum zdarzeń na histogramie.

7. Testy funkcjonalności in vitro: zdolność do aktywacji modelowych komórek odpornościowych za pomocą albuminy jaja kurzego (OVA) jako antygenowego modelowego mRNA

  1. Płytka 10 000 komórek/dołek (tutaj używane są komórki JAWSII) na 96-dołkowej płytce dzień przed transfekcją.
    UWAGA: Ułóż tyle dołków, ile jest to wymagane, aby uzyskać potrójne dawki dla każdego warunku. Pozostawić komórki na płytce przez co najmniej 12 godzin (zalecana jest inkubacja przez noc).
  2. Przygotować NP pBAE zgodnie z opisem w PONIŻSZEJ UWAGA, aby transfekować 0,6 μg mRNA na studzienkę.
    UWAGA: Jako kontrolę pozytywną, transfekować komórki za pomocą odczynnika do transfekcji. Tutaj użyliśmy 0,1 μg mRNA na studzienkę i 0,25 μl odczynnika do transfekcji na studzienkę. zakupiono mRNA kodujące dla OVA (patrz Tabela Materiałów). Jest poliadenylowany, modyfikowany 5-metoksyurydyną i zoptymalizowany dla systemów ssaków, a także chroniony przez zamknięcie końcówki ze strukturą Cap1, zastrzeżoną metodą od dostawcy.
  3. Inkubować 96-dołkową płytkę przez 24 godziny w inkubatorze z suchym powietrzem w temperaturze 37 °C i 5% CO2,
    UWAGA: Po tym czasie nie należy aspirować do nośnika, ponieważ może on zawierać pewną liczbę komórek. Odzyskaj komórki i zapisz je w innym dołku lub płytce.
  4. Umyj komórki pozostałe na studzience 25 μl 1x PBS. Następnie należy go zassać i dodać 25 μl trypsyny i inkubować płytkę przez 5 minut w temperaturze 37 °C, aby oderwać komórki. Zatrzymaj reakcję trypsyny, dodając wcześniej odzyskane podłoże do dołka korespondenta.
  5. Odwirować płytkę o sile 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zassać pożywkę. Dodać 50 μl/basenik 1x PBS i 2,5% formaliny. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 20 minut w celu utrwalenia komórek.
  6. Powtórz kroki 7.5 i 7.5.1. Następnie dodać 50 μl/basenik 1x PBS i 3% BSA (bufor blokujący) i inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Ponownie powtórzyć kroki 7.5 i 7.5.1, a następnie dodać 50 μl/basenik przeciwciała pierwszorzędowego (mysi α-OVA) w 1x PBS i 3% BSA i inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
  7. Powtórzyć kroki 7.5 i 7.5.1, a następnie przemyć komórki 50 μl/studzienkę 1x PBS. Aspiruj pożywkę, a następnie dodaj roztwór przeciwciał drugorzędowych (α-mouse-AlexaFluor488/PerCP i Cy5.5-CD11b/APC-CD86) w 1x PBS i 3% BSA. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
  8. Odwirować płytkę o sile 400 x g przez 5 minut. Następnie umyj komórki 50 μl/studzienkę 1x PBS. Następnie odwirować (400 x g przez 5 min), zasysać, a następnie ponownie zawiesić komórki w 100 μl / studzienka 1x PBS i 2,5% formaliny.
  9. Przeanalizuj go za pomocą cytometrii przepływowej, jak opisano powyżej (krok 6.2).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Synteza i charakterystyka polimerów
Procedura syntezy OM-pBAE jest opisana w Rysunek 2. Jak pokazuje Rysunek 2A, pierwszym krokiem do uzyskania OM-pBAE jest synteza C6-pBAE poprzez dodanie amin (1-heksyloaminy i 5-amino-1-pentanolu, stosunek 1:1) do diakrylanu (diakrylanu 1,4-butanodiolu). Reakcję tę przeprowadza się w temperaturze 90 °C przez 20 godzin, przy ciągłym mieszaniu. Następnie roztwór oligopeptydów dodaje się do roztworu polimeru C6 otrzyma...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po wybuchu pandemii Covid-19 w ubiegłym roku znaczenie szczepionek w zakresie kontroli chorób zakaźnych stało się kluczowym elementem8. Wysiłki naukowców z całego świata umożliwiły wprowadzenie na rynek wielu szczepionek. Po raz pierwszy w historii szczepionki mRNA wykazały swój wcześniej hipotetyczny sukces, dzięki szybkiemu projektowi ze względu na ich zdolność do adaptacji do każdego nowego antygenu w ciągu kilku miesięcy 5,6,21

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia ani nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wsparcie finansowe od MINECO/FEDER (granty SAF2015-64927-C2-2-R, RTI2018-094734-B-C22 i COV20/01100) jest potwierdzone. CGF przyznało jej stypendium doktoranckie IQS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Diakrylan 1,4-butanodioluSigma Aldrich123048
1-heksyloaminaSigma Aldrich219703
5-amino-1-pentanolSigma Aldrich411744
AcetonPanreac141007
Przeciwciało CD11bPrzeciwciało BD550993
CD86Bioligend105007
ChlorohydroksydPanreac181023
Chloroform-dSigma Aldrich151823
peptyd Cys-His-His-HisOntoresCustom
Cys-Lys-Lys-Lys peptydOntores Custom
D2OSigma Aldrich151882
Odczynnik DEPC do wody wolnej od rnazySigma AldrichD5758Ten odczynnik jest ważny do uzdatniania wody MilliQ w celu usunięcia wszelkich RNaz z
Dietyl eterPanreac212770
dimetylosulfotlenekSigma Aldrich276855
HEPESSigma AldrichH3375
mRNA EGFPTriLink TechnologiesL-7601
mRNA OVATriLink TechnologieL-7610
Zestaw RiboGreenThermoFisherR11490
octan soduSigma Aldrich71196
sacharozaSigma AldrichS0389
Kwas trifluorooctowySigma Aldrich302031
Trypsyna-EDTAFisher Scientific11570626
α- mysz Przeciwciało AlexaFluor488AbcamAb450105
Equipment
Nanoparticle Tracking AnalyzerMalvern PanalyticalNanoSight NS300
Spektrometr magnetycznego rezonansu magnetycznegoVarian400 MHz
ZetaSizerMalvern PanalyticalNano ZSDla potencjału zeta i hydrodynamiczne określanie rozmiaru
Software
NanoSight Oprogramowanie NTAMalvern PanalyticalMAN0515-02-PL-00
Oprogramowanie NovoExpressAgilentNie określono
Oprogramowanie ZetaSizerMalvern PanalyticalDTS AplikacjaDo analizy ładunku powierzchniowego i rozmiarów hydrodynamicznych

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chumakov, K., Benn, C. S., Aaby, P., Kottilil, S., Gallo, R. Can existing live vaccines prevent COVID-19. Science. 368 (6496), 1187-1188 (2020).
  2. Zhang, C., Maruggi, G., Shan, H., Li, J. Advances in mRNA vaccines for infectious diseases. Frontiers in Immunology. 10, 1-13 (2019).
  3. Wherry, E. J., Jaffee, E. M., Warren, N., D'Souza, G., Ribas, A. How did we get a COVID-19 vaccine in less than 1 year. Clinical Cancer Research. 27 (8), 2136-2138 (2021).
  4. Folegatti, P. M., et al. Safety and immunogenicity of the ChAdOx1 nCoV-19 vaccine against SARS-CoV-2: a preliminary report of a phase 1/2, single-blind, randomised controlled trial. The Lancet. 396 (10249), 467-478 (2020).
  5. Geall, A. J., Mandl, C. W., Ulmer, J. B. RNA: The new revolution in nucleic acid vaccines. Seminars in Immunology. 25 (2), 152-159 (2013).
  6. Ulmer, J. B., Geall, A. J. Recent innovations in mRNA vaccines. Current Opinion in Immunology. 41, 18-22 (2016).
  7. Kranz, L. M., et al. Systemic RNA delivery to dendritic cells exploits antiviral defence for cancer immunotherapy. Nature. 534 (7607), 396-401 (2016).
  8. Milane, L., Amiji, M. Clinical approval of nanotechnology-based SARS-CoV-2 mRNA vaccines: impact on translational nanomedicine. Drug Delivery and Translational Research. 1 (4), 3(2020).
  9. Green, J. J., Langer, R., Anderson, D. G. A combinatorial polymer library approach yields insight into nonviral gene delivery. Accounts of Chemical Research. 41 (6), 749-759 (2008).
  10. Guerrero-Cázares, H., et al. Biodegradable polymeric nanoparticles show high efficacy and specificity at DNA delivery to human glioblastoma in vitro and in vivo. ACS Nano. 8 (5), 5141-5153 (2014).
  11. Kozielski, K. L., Tzeng, S. Y., Hurtado De Mendoza, B. A., Green, J. J. Bioreducible cationic polymer-based nanoparticles for efficient and environmentally triggered cytoplasmic siRNA delivery to primary human brain cancer cells. ACS Nano. 8 (4), 3232-3241 (2014).
  12. Segovia, N., Dosta, P., Cascante, A., Ramos, V., Borrós, S. Oligopeptide-terminated poly(β-amino ester)s for highly efficient gene delivery and intracellular localization. Acta Biomaterialia. 10 (5), 2147-2158 (2014).
  13. Dosta, P., Segovia, N., Cascante, A., Ramos, V., Borrós, S. Surface charge tunability as a powerful strategy to control electrostatic interaction for high efficiency silencing, using tailored oligopeptide- modified poly (beta-amino ester)s (PBAEs). Acta Biomaterialia. 20, 82-93 (2015).
  14. Fornaguera, C., et al. mRNA delivery system for targeting antigen-presenting cells in vivo. Advanced Healthcare Materials. 7 (17), 180033(2018).
  15. Fornaguera, C., Castells-Sala, C., Lázaro, M. Á, Cascante, A., Borrós, S. Development of an optimized freeze-drying protocol for OM-PBAE nucleic acid polyplexes. International Journal Pharmaceutics. 569, (2019).
  16. Fornaguera, C., Solans, C. Analytical methods to characterize and purify polymeric nanoparticles. International Journal of Polymer Science. , (2018).
  17. Fornaguera, C., Solans, C. Characterization of polymeric nanoparticle dispersions for biomedical applications: size, surface charge and stability. Pharmaceutical Nanotechnology. 6 (3), 147-164 (2018).
  18. Sahin, U., Karikó, K., Türeci, Ö MRNA-based therapeutics-developing a new class of drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (10), 759-780 (2014).
  19. Fan, Y. N., et al. Cationic lipid-assisted nanoparticles for delivery of mRNA cancer vaccine. Biomaterials Science. 6 (11), 3009-3018 (2018).
  20. Le Moignic, A., et al. Preclinical evaluation of mRNA trimannosylated lipopolyplexes as therapeutic cancer vaccines targeting dendritic cells. Journal of Controlled Release. 278, 110-121 (2018).
  21. Banerji, A., et al. mRNA vaccines to prevent COVID-19 disease and reported allergic reactions: Current evidence and approach. Journal of Allergy and Clinical Immunology: In Practice. 9 (4), 1423-1437 (2021).
  22. Kaczmarek, J. C., Kowalski, P. S., Anderson, D. G. Advances in the delivery of RNA therapeutics: from concept to clinical reality. Genome Medicine. 9 (1), 1-16 (2017).
  23. Dosta, P., et al. Delivery of anti-microRNA-712 to inflamed endothelial cells using poly(β-amino ester) nanoparticles conjugated with VCAM-1 targeting peptide. Advanced Healthcare Materials. , 1-11 (2021).
  24. Segovia, N., et al. Hydrogel doped with nanoparticles for local sustained release of siRNA in breast cancer. Advanced Healthcare Materials. 4 (2), 271-280 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

szczepionki mRNAsynteza nanocz stekdostarczanie mRNAnanocz stki polimerowemetoda liofilizacjicytometria przep ywowaaktywacja kom rek dendrytycznychmikroskopia fluorescencyjnawydajno enkapsulacji

Powiązane artykuły