Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Synteza i charakterystyka nanocząstek poli(beta-aminoestrów) obciążonych mRNA do celów szczepień

4.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62889

⸱

13 sierpnia 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Grup d’Enginyeria de Materials (Gemat), Institut Químic de Sarrià (IQS), Universitat Ramon Llull (URL)

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj przedstawiono prosty protokół produkcji nanocząsteczek mRNA opartych na polimerach poli(beta aminoestrowych), który można łatwo dostosować poprzez zmianę kapsułkowanego mRNA. Opisano również przebieg syntezy polimerów, nanocząstek oraz ich niezbędną charakterystykę in vitro. Dodano również dowód słuszności koncepcji dotyczący szczepień.

Streszczenie

Szczepienia są jednym z głównych sukcesów współczesnego społeczeństwa i są niezbędne w kontrolowaniu i zapobieganiu chorobom. Tradycyjne szczepionki składały się z całości lub frakcji czynnika zakaźnego. Nadal jednak istnieją wyzwania, a nowe technologie szczepionek są obowiązkowe. W tym kontekście stosowanie mRNA do celów uodparniających wykazało zwiększoną skuteczność, czego dowodem jest szybkie zatwierdzenie dwóch szczepionek mRNA zapobiegających zakażeniu SARS-CoV-2. Oprócz skuteczności w zapobieganiu infekcjom wirusowym, szczepionki mRNA mogą być również stosowane w leczeniu raka.

Niemniej jednak, niestabilność mRNA i jego szybkie usuwanie z organizmu spowodowane obecnością nukleaz uniemożliwia jego bezpośrednie dostarczanie. W tym kontekście nanoleki, a w szczególności nanocząstki polimerowe, są krytycznymi systemami dostarczania mRNA. W związku z tym celem niniejszego artykułu jest opisanie protokołu formulacji i testu kandydata na szczepionkę mRNA opartego na zastrzeżonych nanocząstkach polimerowych. W tym miejscu omówiona zostanie synteza i charakterystyka chemiczna zastosowanych polimerów poli(beta-aminoestrów), ich kompleksowanie z mRNA w celu wytworzenia nanocząstek oraz metodologia ich liofilizacji. Jest to kluczowy krok w kierunku obniżenia kosztów magazynowania i dystrybucji. Na koniec wskazane zostaną wymagane testy w celu wykazania ich zdolności do transfekcji in vitro i dojrzałych modelowych komórek dendrytycznych. Protokół ten przyniesie korzyści społeczności naukowej zajmującej się szczepieniami ze względu na jego dużą wszechstronność, która umożliwia tym szczepionkom zapobieganie lub leczenie wielu różnych chorób.

Wprowadzenie

Choroby zakaźne stanowią poważne zagrożenie dla milionów ludzi na całym świecie i nadal są jedną z głównych przyczyn zgonów w niektórych krajach rozwijających się. Szczepienia profilaktyczne są jedną z najskuteczniejszych interwencji współczesnego społeczeństwa w celu zapobiegania i kontroli chorób zakaźnych1,2. Te kluczowe kamienie milowe nauki w XX-wiecznym znaczeniu zostały zauważone przez niedawną światową pandemię Covid-19 spowodowaną wirusem SARS-CoV-23. Uznając znaczenie posiadania skutecznych szczepionek w celu ograniczenia rozprzestrzeniania się choroby, wspólne wysiłki wszystkich społeczności biomedycznych z powodzeniem zaowocowały wieloma szczepionkami profilaktycznymi dostępnymi na rynku w czasie krótszym niż rok4.

Tradycyjnie, szczepionki składały się z atenuowanych (żywe, zmniejszone zjadliwości) lub inaktywowanych (cząstki śmierci) wirusów. Jednak w przypadku niektórych chorób, w przypadku których nie ma marginesu błędu bezpieczeństwa, cząsteczki wirusa nie są możliwe, a zamiast nich stosuje się podjednostki białkowe. Niemniej jednak podjednostki zwykle nie umożliwiają połączenia więcej niż jednego epitopu/antygenu, a adiuwanty są wymagane do zwiększenia siły działania szczepienia5,6. W związku z tym istnieje oczywiste zapotrzebowanie na nowe rodzaje szczepionek.

Jak wykazano podczas obecnej pandemii, nowe kandydatki na szczepionki oparte na kwasach nukleinowych mogą być korzystne pod względem unikania długich procesów rozwoju i zapewniania wysokiej wszechstronności, jednocześnie produkując niezbędną szczepionkę pacjenta. Tak jest w przypadku szczepionek mRNA, które początkowo zostały zaprojektowane jako eksperymentalne szczepionki przeciwnowotworowe. Dzięki ich naturalnej zdolności do wytwarzania odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla antygenu3,5,6,7. Będąc mRNA, cząsteczką kodującą białko antygenowe, zmieniającą się tylko tak samo, szczepionka może być szybko dostosowana do uodparniania innych wariantów tego samego mikroorganizmu, różnych szczepów, innych zakaźnych mikroorganizmów, a nawet stać się leczeniem immunoterapeutycznym raka. Ponadto są korzystne pod względem kosztów produkcji na dużą skalę. Jednak mRNA ma poważną przeszkodę, która utrudnia ich nagie podawanie: jego stabilność i integralność są zagrożone w pożywkach fizjologicznych, pełnych nukleaz. Z tego powodu wymagane jest użycie nanometrycznego nośnika, który chroni go i wektoryzuje mRNA do komórek prezentujących antygen2,8.

W tym kontekście, poli(beta aminoestry) (pBAE) to klasa biokompatybilnych i biodegradowalnych polimerów, które wykazały niezwykłą zdolność do kompleksowania mRNA w nanometrycznych cząsteczkach, dzięki swoim ładunkom kationowym9,10,11. Polimery te składają się z wiązań estrowych, co ułatwia ich degradację przez esterazy w warunkach fizjologicznych. Wśród kandydatów do biblioteki pBAE, te funkcjonalizowane oligopeptydami kationowymi wykazały większą zdolność do tworzenia małych nanocząstek, aby skutecznie przenikać do komórek przez endocytozę i transfekować zamknięty w kapsułkach materiał genowy. Ponadto, dzięki ich zdolności buforowej, zakwaszenie przedziału endosomalnego umożliwia ucieczkę endosomalną12,13. Mianowicie, niedawno opublikowano specyficzny rodzaj pBAE, w tym hydrofobowe ugrupowania na ich szkielecie (tzw. C6 pBAE) w celu zwiększenia ich stabilności i kombinacji end-oligopeptyd (60% polimeru zmodyfikowanego trilizyną i 40% polimeru tri-histydyną), który selektywnie transfekuje komórki prezentujące antygen po podaniu pozajelitowym i wytwarza prezentację antygenu kodowaną przez mRNA, a następnie immunizację myszy14. Ponadto wykazano również, że preparaty te mogą obejść jeden z głównych etapów wąskiego gardła preparatów nanomedycznych: możliwość ich liofilizacji bez utraty ich funkcjonalności, co umożliwia długoterminową stabilność w środowiskach miękkich, suchych15.

W tym kontekście, celem obecnego protokołu jest udostępnienie społeczności naukowej procedury tworzenia nanocząsteczek mRNA poprzez podanie opisu krytycznych kroków w protokole i umożliwienie produkcji skutecznych szczepionek do zapobiegania chorobom zakaźnym i leczenia nowotworów.

Poniższy protokół opisuje kompletny trening syntezy oligopeptydów modyfikowanych na końcu poli(beta aminoestrów) - polimerów OM-pBAE, które będą dalej wykorzystywane do syntezy nanocząstek. W protokole uwzględniono również formułę nanocząstek. Ponadto zapewnione są kluczowe etapy dla powodzenia procedury i reprezentatywnych wyników, aby zapewnić, że otrzymane preparaty spełniają wymagane cechy charakterystyki kontroli jakości w celu określenia wyniku pozytywnego lub negatywnego. Protokół ten jest podsumowany w Rysunek 1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Synteza polimeru pBAE z końcowymi oligopeptydami (OM-pBAE)

  1. Polimeryzacja C6-pBAE
    1. Do kolby okrągłodennej z szkła (100 mL) dodać 5-amino-1-pentanol (38 mmol; MW = 103,16 Da) oraz 1-heksyloaminę (38 mmol; MW = 101,19 Da). Następnie dodać diakrylan 1,4-butanodiolu (82 mmol; MW = 198,22 Da).
    2. Podgrzać kąpiel z oleju silikonowego do 90 °C, umieścić kolbę okrągłodenną w kąpieli olejowej i mieszać mieszaninę za pomocą magnetycznego mieszadełka przez noc (~18 h). Następnie wyjąć produkt z kolby i umieścić go w zamrażarce w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Produkt ma postać lepkiego proszku i jest wyjmowany z kolby za pomocą szpatułki. Niezbędne jest potwierdzenie struktury otrzymanego polimeru za pomocą 1H-NMR. Widma NMR zarejestrowano na aparaturze 400 MHz (patrz Tabela materiałów), stosując chloroform-d i D2O jako rozpuszczalniki. Około 10 mg każdego poli(β-aminoestru) rozpuszczono w 1 mL deuterowanego rozpuszczalnika.
  2. Reakcja z peptydami w celu otrzymania OM-pBAE
    1. Do wybranych peptydów, np. peptydu Cys-His-His-His z kwasem trifluorooctowym (TFA, 200 mg), dodać 25 mL 0,1 M HCl w uprzednio zważonej probówce wirówkowej o pojemności 50 mL, odpornej na liofilizację; mieszać ręcznie przez noc do uzyskania klarownego roztworu.
    2. Zamrozić roztwór w temperaturze -80 °C przez 1 h, a następnie liofilizować otrzymany chlorek peptydu.
      UWAGA: Sprawdzić, czy masa końcowa odpowiada wartości teoretycznej.
    3. Przygotować roztwór C6-pBAE (0,031 mmol) w dimetylosulfotlenku. Przygotować również roztwór chlorku peptydu (0,078 mmol) w dimetylosulfotlenku.
    4. Zmieszać oba roztwory w probówce z nakrętką i zakręcić ją. Mieszać mieszaninę w kąpieli wodnej o kontrolowanej temperaturze 25 °C przez 20 h przy użyciu magnetycznego mieszadełka.
    5. Dodać mieszaninę do eteru Lotskiego/acetonu w stosunku 7:3 (v/v). Wirować otrzymaną zawiesinę z prędkością 25 000 x g w temperaturze 4 °C w celu usunięcia rozpuszczalnika. Następnie dwukrotnie przemyć osad eterem Lotskiego/acetonem w stosunku 7:3 (v/v). Produkt wysuszyć w próżni (<0,2 atm).
    6. Przygotować roztwór produktu o stężeniu 100 mg/mL w dimetylosulfotlenku. Otrzymany produkt nazwano C6-peptide-pBAE. Niezbędne jest potwierdzenie struktury otrzymanego polimeru za pomocą 1H-NMR w celu potwierdzenia zaniku sygnałów olefinowych związanych z końcowymi grupami akrylowymi. W przypadku braku bieżącego użycia, polimer można zamrozić w temperaturze -20 °C.

2. Tworzenie polipleksów

UWAGA: Wszystkie procedury powinny być wykonywane w pomieszczeniu klimatyzowanym w celu utrzymania stałej temperatury.

  1. Rozmrozić polimery C6-peptide-pBAE i wymieszać roztwór za pomocą wirówki vortexowej.
  2. Przenieść mieszaninę polimerów pipetą (metodą mieszania w górę i w dół) i przygotować roztwór o stężeniu 12,5 mM (V1) w octanie sodu (NaAc). Następnie wymieszać mieszaninę wirówką vortexową i odczekać 10 min.
  3. Przygotować mRNA o stężeniu 0,5 mg/mL i wymieszać poprzez pipetowanie (V2).
    UWAGA: Niezwykle ważne jest, aby nie mieszać mRNA za pomocą wirówki vortexowej.
  4. Wymieszać mieszaninę polimeru o stężeniu końcowym za pomocą wirówki vortexowej, aby uzyskać jednorodny roztwór z zapasu polimeru w DMSO i buforu octanowego.
    UWAGA: Końcowe stężenie polimeru zależy od wybranego stosunku N/P (grup azotowych do grup fosforanowych). Stosunek N/P zależy od konkretnego użytego mRNA. Na przykład w przypadku enkapsulacji eGFP zastosowano stosunek 25:1, zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami14.
  5. Wymieszać roztwór materiału genetycznego i roztwór C6-peptide-pBAE (25-krotność stężenia mRNA) w stosunku 1:1 (Vi = V1 + V2).
    UWAGA: C6-peptide-pBAE znajduje się w probówce do mikrowirówki, do której dodaje się mRNA, mieszając za pomocą pipety. Po przygotowaniu stężenia poliplesku, kwasu nukleinowego i C6-peptide-pBAE ulegają dwukrotnemu rozcieńczeniu.
  6. Inkubować w temperaturze 25 °C przez 30 min w bloku grzejnym. Wytrącić, dodając próbkę w stosunku 1:2 do wody wolnej od RNaz w uprzednio przygotowanej probówce do mikrowirówki.
  7. Dodać substancje pomocnicze. Dodać taką samą objętość, jak w przypadku mieszaniny mRNA i pBAE (Vi), w HEPES 20 mM i sacharozie 4%, mieszając za pomocą pipety. W tym momencie próbka została rozcieńczona 3-krotnie.

3. Liofilizacja polipleksów

  1. Natychmiast zamrozić wcześniej przygotowany roztwór polipleksów w zamrażarce o temperaturze -80 °C na 1 h.
  2. Przeprowadzić suszenie pierwotne zgodnie z poniższymi etapami: (1) 1 h w -60 °C i 0,001 hPa; (2) 1 h w -40 °C i 0,0001 hPa; (3) 4 h w -20 °C i 0,0001 hPa; (4) 12 h w 5 °C i 0,0001 hPa.
  3. Przechowywać natychmiast w temperaturze -20 °C do momentu użycia, aby uniknąć rehydratacji.

4. Resuspensja polipleksów

UWAGA: Niniejszy protokół opisuje proces wykorzystywany do rekonstrukcji liofilizowanych nanocząsteczek C6-peptide-pBAE w celu ich dalszego wykorzystania w charakterystyce, analizach in vitro lub in vivo.

  1. Wyjąć liofilizowane nanocząstki z temperatury -20 °C bezpośrednio przed użyciem i szybko dodać odpowiednią ilość wody beztropogennej (DEPC), aby redyspergować substancję stałą do uzyskania pożądanej koncentracji.
    UWAGA: Objętość będzie taka sama jak początkowa objętość nanocząstek, jeśli planowana jest ta sama koncentracja, jednak zostanie ona wskazana dla każdego eksperymentu.
  2. Delikatnie pipetować do całkowitego resuspensowania, mieszając ciecz za pomocą pipety.
    UWAGA: Należy upewnić się, że na ściankach fiolki nie pozostał żaden materiał.
  3. Po rozpuszczeniu energicznie pipetować w górę i w dół, unikając powstawania pęcherzyków powietrza.
    UWAGA: Próbka powinna mieć wygląd od przezroczystego do półprzezroczystego, co jest bardziej widoczne przy wyższych stężeniach
  4. Po rekonstytucji przechowywać próbki na lodzie lub w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 24 h. Unikać zamrażania.

5. Charakterystyka polypleksów

  1. Dynamiczne rozpraszanie światła
    UWAGA: Średnicę hydrodynamiczną (nm), indeks polidyspersyjności (PDI) oraz ładunek powierzchniowy nanocząsteczek mierzono w temperaturze 25 °C, przy długości fali lasera 633 nm i detektorze sygnału pod kątem 173°, używając analizatora potencjału zeta (patrz Tabela materiałów).
    1. Średnica hydrodynamiczna (nm)
      1. Przygotować nanocząsteczki, dokładnie mieszając mRNA i pBAE poprzez pipetowanie materiału genetycznego do frakcji polimeru do końcowego stężenia mRNA 0,25 mg/mL, zgodnie z wcześniejszym opisem (krok 2).
      2. Wstępnie wypłukać mikrok comics kuwetę przefiltrowanym medium rozcieńczającym, aby całkowicie oczyścić ją z zanieczyszczeń. Następnie napełnić kuwetę co najmniej 50 µL roztworu próbki i ją zamknąć. Następnie wprowadzić próbkę do instrumentu DLS, upewniając się, że celę wstawiono prawidłowo.
        UWAGA: Medium rozcieńczające jest filtrowane przy użyciu filtra strzykawkowego 0,22 µm.
      3. Otworzyć utworzony plik Standardowej Procedury Operacyjnej (SOP) i wprowadzić żądaną Nazwę próbki. Wybrać Pomiar rozmiaru.
        UWAGA: Wszystkie parametry potrzebne do utworzenia SOP dla pomiarów rozmiaru znajdują się w Tabeli 1.
      4. Uruchomić pomiar wielkości cząstek metodą DLS, klikając Play.
        UWAGA: Analiza jest zakończona po usłyszeniu potrójnego sygnału dźwiękowego.
      5. Wybrać wyniki odpowiadające próbce w arkuszu pomiarowym, aby uzyskać średnią wielkość cząstek, średnie PDI, odchylenie standardowe oraz wykresy. Po zakończeniu wyjąć celę z urządzenia DLS.
      6. Usunąć próbkę, zachowując ją do analizy potencjału zeta, a następnie oczyścić i wypłukać celę wodą dejonizowaną. Na koniec osuszyć oczyszczoną kuwetę strumieniem sprężonego powietrza.
    2. Ładunek powierzchniowy (mV)
      1. Przygotować nanocząsteczki, dokładnie mieszając mRNA i pBAE poprzez pipetowanie materiału genetycznego do frakcji polimeru do końcowego stężenia mRNA 0,25 mg/mL, zgodnie z wcześniejszym opisem (krok 2, Formowanie polipleksów). Następnie zamrozić i wysuszyć roztwór.
        UWAGA: W przypadku pomiaru ładunku powierzchniowego zdecydowanie zaleca się liofilizację próbki przed wykonaniem pomiarów, aby ponownie zdyspergować próbkę w odpowiednim buforze, symulując fizjologiczne warunki pH i stężenia elektrolitów w organizmie.
      2. Resuspendować liofilizowaną próbkę w wodzie. Rozcieńczyć próbkę 1/10 w wodzie (stężenie końcowe 0,025 mg/mL).
      3. Wstępnie wypłukać jednorazową składaną celę kapilarną (kuwetę do potencjału zeta) przefiltrowanym medium rozcieńczającym, aby całkowicie oczyścić ją z zanieczyszczeń. Następnie napełnić kuwetę rozcieńczonymi nanocząsteczkami za pomocą strzykawki 1 mL i zamknąć obie strony wypełniaczy.
        UWAGA: Dyspersja nanocząsteczek musi wypełnić dostępną objętość kuwety (~1 mL), zwracając szczególną uwagę na powstawanie pęcherzyków powietrza, które mogłyby zaburzyć pomiary.
      4. Wprowadzić próbkę do DLS; upewnić się, że celę wstawiono prawidłowo.
      5. Otworzyć plik SOP utworzony dla analizy potencjału zeta i wprowadzić żądaną Nazwę próbki. Wybrać Pomiar potencjału zeta.
        UWAGA: Parametry do utworzenia SOP dla pomiarów potencjału zeta podano w Tabeli 2.
      6. Uruchomić pomiar potencjału zeta za pomocą DLS, klikając Play.
        UWAGA: Analiza jest zakończona po usłyszeniu potrójnego sygnału dźwiękowego.
      7. Wybrać wyniki odpowiadające próbce w arkuszu pomiarowym, aby uzyskać średni potencjał zeta, odchylenie standardowe oraz wykresy. Po zakończeniu wyjąć celę z urządzenia DLS.
      8. Usunąć próbkę i zachować ją, jeśli jest to konieczne. Następnie oczyścić i wypłukać celę kuwety wodą dejonizowaną, potem etanolem, a następnie ponownie wodą. Na koniec osuszyć oczyszczoną kuwetę strumieniem sprężonego powietrza.
        UWAGA: Do analizy danych należy użyć zalecanego oprogramowania.
  2. Analiza śledzenia nanocząsteczek (NTA)
    UWAGA: Średnicę hydrodynamiczną (nm) i stężenie nanocząsteczek mierzono w temperaturze 25 °C, przy długości fali lasera 488 nm, używając analizatora śledzenia nanocząsteczek (patrz Tabela materiałów).
    1. Przygotowanie NTA i próbki
      1. Włączyć komputer i urządzenie. Najpierw sprawdzić, czy wszystkie komponenty są prawidłowo podłączone. Następnie otworzyć zalecane oprogramowanie. Program sprawdzi, czy wszystkie akcesoria są poprawnie połączone.
      2. Zamocować płytkę górną, w tym celę z o-ringiem, w module laserowym.
        UWAGA: Nie dokręcać zbyt mocno tej części.
      3. Najpierw napełnić komorę buforem i/lub wodą dejonizowaną za pomocą strzykawki 1 mL. Powtórzyć procedurę co najmniej dwa razy. Unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza do komory.
      4. Przygotować próbkę, rozcieńczając ją 1/1000 w wodzie dejonizowanej ze stężenia użytego w pomiarze rozmiaru DLS. Przygotować co najmniej 1 mL i pobrać do strzykawki 1 mL, unikając wprowadzania pęcherzyków.
      5. Wprowadzić próbki do komory za pomocą strzykawki. Następnie włożyć moduł laserowy do głównej komory NTA.
        UWAGA: Główna komora to przestrzeń, w której umieszcza się celę do pomiaru.
    2. Optymalizacja obrazu
      1. Najpierw w sekcji Hardware sprawdzić, czy wybrano odpowiednią Kamerę oraz właściwy laser.
        UWAGA: W tym przypadku dostępna jest tylko jedna kamera i niebieski laser 488 nm.
      2. Rozpocząć z poziomem kamery ustawionym na 0 i nacisnąć Start Camera w oknie przechwytywania.
        UWAGA: Na tym etapie należy dostosować następujące parametry: Położenie wiązki (może być przesuwana w górę i w dół ekranu), Poziom kamery (należy unikać nasycenia pikseli), Ostrość (boczne pokrętło) (należy starać się ustawić ostrość jak najlepiej; lepiej, aby cząstki miały halo, niż żeby były nieostre), Stężenie (dostosować stężenie tak, aby w polu widzenia znajdowało się od 10 do 100 cząstek).
    3. Nagrywanie wideo
      1. W oprogramowaniu przejść do okna Measurement Selection- SOP (lewy dół) i wybrać Standard Measurement.
        UWAGA: Zaprogramować wykonanie trzech pomiarów po 30 s każdy (aby umożliwić oprogramowaniu obliczenie średniej i odchylenia standardowego). Podać nazwę i ścieżkę do folderu (w polu Base filename), aby zapisać rekordy próbki. Po prawidłowym ustawieniu parametrów SOP nacisnąć Create oraz Run Script. Po zmierzeniu pierwszej powtórki program poprosi o dodanie nowej próbki. Następnie należy wprowadzić do komory kolejną frakcję próbki, naciskając tłok strzykawki. Na koniec powtórzyć procedurę trzeci raz, aby przeanalizować trzecią powtórkę.
    4. Przetwarzanie wideo
      1. Po zakończeniu trzech pomiarów ponownie dostosować Wzmocnienie ekranu (Screen Gain) oraz Próg detekcji (Detection Threshold), aby przeanalizować zmierzone cząstki. W tym momencie w każdej klatce powinno pojawić się około 100 cząstek w celu przeprowadzenia analizy (oczekiwane są wysokie czerwone i niskie niebieskie krzyżyki).
      2. Po zakończeniu analizy wyeksportować wyniki do pliku pdf. Możliwy jest również eksport do plików wideo i excel.
    5. Czyszczenie NTA
      UWAGA: Zamknąć wszystkie otwarte pomiary przed analizą kolejnej próbki; generowane pliki są ogromne i w zależności od komputera utrzymanie więcej niż jednego otwartego pliku może być utrudnione.
      1. Oczyścić komorę NTA poprzez wielokrotne płukanie wodą przed wykonaniem kolejnego pomiaru, aż do momentu, gdy nie będą obserwowane żadne cząstki; następnie przepłukać używanym buforem (PBS), aby kontynuować pomiary.
      2. Po zakończeniu ostatniego pomiaru w danym dniu przedmuchać komorę powietrzem i osuszyć ją papierem do celów mikroskopowych.
      3. Określić rozmiar i kształt za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM). Przygotować próbki. Do charakterystyki TEM wystarczy 30 µL objętości końcowej.
        UWAGA: Pomiary mogą być wykonywane zarówno dla świeżych, jak i liofilizowanych (po resuspensji) nanocząsteczek.
      4. Nanieść 10 µL próbki na miedzianą siatkę pokrytą węglem. Pozostawić do wyschnięcia na 10 min. Jeśli to konieczne, usunąć nadmiar cieczy, delikatnie dotykając papieru filtrującego.
      5. Nanieść 10 µL roztworu octanu uranylu (2% w/v) w celu barwienia negatywowego. Pozostawić do wyschnięcia na 1 min. Jeśli to konieczne, usunąć nadmiar cieczy, delikatnie dotykając papieru filtrującego.
      6. Wprowadzić próbkę do mikroskopu i zeskanować (napięcie pracy 80 kV).
        UWAGA: Do dalszej analizy obrazów można użyć odpowiedniego oprogramowania.
  3. Wydajność enkapsulacji
    1. Przygotowanie próbki
      1. Przygotować nanocząsteczki o żądanym stężeniu, zamrozić i wysuszyć je. Następnie resuspendować nanocząsteczki i rozcieńczyć je do końcowego stężenia 6 µg/mL.
      2. Przygotować bufor 1x TE z roztworu stokowego 20x.
        UWAGA: Vt (Objętość całkowita) = (liczba próbek x 100 µL x 4) (liczba próbek x 290 µL) + 2 mL.
      3. Przygotować bufor TE z 3 µg/µL heparyny z roztworu stokowego 100 µg/µL.
        UWAGA: Vt = Liczba próbek x 50 µL x 2.
      4. Przygotować standardy
      5. Przygotować standard RNA w zakresie od 0,2 µg/mL do 0,025 µg/mL w buforze 1x Tris-EDTA (TE) (Tabela S1A).
        UWAGA: W standardzie RNA użyć mRNA, jeżeli różni się on od RNA rybosomalnego.
      6. Przygotować standard RNA:pBAE z heparyną (Tabela S1B). Przygotować standard heparyny (Tabela S1C).
      7. Przygotować płytkę 96-dołkową w następujący sposób:
        1. Nanieść 295 µL buforu TE do pierwszego rzędu płytki 96-dołkowej (tyle dołków, ile próbek do analizy). Następnie nanieść 50 µL buforu 1x TE do rzędów B i C (duplikaty dla każdej próbki).
        2. Nanieść 50 µL buforu 1x TBE z 3 µg/µL heparyny do rzędów D i E (duplikaty dla każdej próbki). Następnie nanieść 100 µL każdego standardu do rzędów F, G i H (duplikaty dla każdego standardu).
        3. Nanieść 5 µL każdej próbki do rzędu A (stężenie w każdym dołku wynosi 0,1 µg/mL). Wymieszać dokładnie poprzez pipetowanie i nanieść 50 µL każdej próbki do czterech dołków poniżej (dwóch zawierających 50 µL buforu 1x TE i dwóch zawierających bufor 1x TE z 3 µg/µL heparyny).
      8. Inkubować próbkę przez 30 min w 37 °C. Przygotować odczynnik RiboGreen zgodnie z protokołem producenta (patrz Tabela materiałów) w buforze 1x TE.
        UWAGA: Rozcieńczyć 1:200 i wymieszać w wirówce (vortex). Chronić przed światłem. Vt = Liczba pełnych dołków x 100 µL.
      9. Nanieść 100 µL roztworu RiboGreen do każdego dołka. Wykryć fluorescencję za pomocą czytnika mikropłytek przy długości fali wzbudzenia 500 nm i długości fali emisji 525 nm.
    2. Analiza wyników
      1. Przygotować trzy krzywe kalibracyjne
        ​UWAGA: Po pierwsze, standard RNA rybosomalnego. Na tej krzywej kalibracyjnej interpolować próbki, które nie zawierają heparyny. Po drugie, mRNA:pBAE z heparyną. Na tej krzywej kalibracyjnej interpolować próbki zawierające heparynę. Po trzecie, heparyna. Służy do upewnienia się, że stężenie robocze mieści się w zakresie liniowym.
      2. Obliczyć wydajność enkapsulacji (EE%) w następujący sposób:
        równanie wydajności enkapsulacji mRNA, EE%=(1-(mRNA wolne/mRNA całkowite))*100, formuła.

6. Charakterystyka in vitro

  1. Mikroskopia fluorescencyjna do oceny jakościowej
    1. Po 24 h od transfekcji umieścić płytkę 96-dołkową pod mikroskopem. Rozpocząć wizualizację komórek przy użyciu obiektywu 10x.
      UWAGA: W tym przypadku zastosowano komórki HeLa. Komórki są lokalizowane w trybie transmisyjnym (pole jasne), a w tym czasie należy dostosować ostrość.
      1. Najpierw przeprowadzić balans bieli, aby skalibrować oprogramowanie względem tła próbek. Następnie wykonać obraz, który zostanie nałożony na obraz fluorescencyjny podczas analizy.
    2. Zmienić tryb mikroskopu na tryb refleksyjny (fluorescencję) i ustawić koło filtrów na laser niebieski (488 nm), aby wizualizować eGFP.
      UWAGA: Na tym etapie należy dostosować czas ekspozycji (Exposure time) oraz wzmocnienie (Gain). Wzmocnienie należy ustawić w zakresie od 3 do 5, aby uniknąć artefaktów i nadmiaru sygnału tła. Dostosowanie czasu ekspozycji zależy od wydajności transfekcji (od ms do 1 s).
    3. Wykonać obrazy dla wszystkich warunków lub dołków, stosując ten sam czas ekspozycji, aby umożliwić porównanie wszystkich próbek.
  2. Cytometria przepływowa (FC) do oceny ilościowej
    1. Użyć pipety wielokanałowej do przygotowania płytki 96-dołkowej do eksperymentu cytometrii przepływowej.
      UWAGA: W przypadku pracy z komórkami półprzylegającymi, takimi jak w linii komórkowej JAWSII, należy odzyskać całą objętość medium i przechowywać ją w innej płytce 96-dołkowej. Nie należy odsysać tego medium, ponieważ może ono zawierać znaczną liczbę transfektowanych komórek.
    2. Przemyć komórki (tutaj zastosowano komórki HeLa) za pomocą 100 µL/dołek 1x PBS, a następnie odessać ciecz. Następnie dodać 25 µL/dołek trypsyny i inkubować w 37 °C przez 5 min.
    3. Po odklejeniu się komórek dodać wcześniej odzyskane medium, aby zatrzymać działanie trypsyny, a następnie utrwalić komórki, dodając 31,25 µL/dołek formaliny 10% na 20 min (stężenie końcowe 2,5%).
      UWAGA: Na tym etapie kluczowe jest zwizualizowanie stanu komórek pod mikroskopem, aby upewnić się, że komórki się odkleiły. Zdecydowanie zaleca się kilkukrotne pipetowanie w górę i w dół, aby pomóc komórkom w odklejeniu się i uniknąć ich aglomeracji. Zapewni to wiarygodny wynik.
    4. Włączyć cytometr przepływowy oraz oprogramowanie. W oprogramowaniu ustawić odpowiednie warunki eksperymentu (typ płytki, objętość próbki oraz inne parametry, takie jak mieszanie i płukanie między próbkami).
      UWAGA: Dla kroku 6.2.5 przepływ powinien wynosić 120 µL/min. Mieszanie należy ustawić na jeden cykl co 1 min, a płukanie na jeden cykl dla każdego dołka. Mieszanie jest niezbędne do utrzymania komórek w rozproszeniu w medium, co pozwala na lepszą analizę pojedynczych komórek. Ponadto płukanie jest konieczne do oczyszczenia mikrofluidyki cytometru między próbkami. Na koniec sprawdzić, czy jest wystarczająca ilość buforów i czy wszystkie komponenty są prawidłowo podłączone.
    5. Ustawić odpowiednie parametry w celu ilościowego określenia odsetka dodatnio transfektowanych komórek.
      1. Najpierw wyświetlić dane przepływowe na wykresie rozrzutu FSC (światło rozproszone w przód) względem SSC (światło rozproszone pod kątem), aby odróżnić komórki od debris. Następnie wykreślić kolejny wykres rozrzutu porównujący amplitudę (FSC-A) względem wysokości (FSC-H), aby wyznaczyć bramkę i wyodrębnić pojedyncze komórki.
        UWAGA: Populacja nieleczona pozwala na wyznaczenie bramki dla populacji odpowiadających dodatnio transfektowanym komórkom. Następnie ilościowe oznaczenie dodatnio transfektowanych komórek jest przeprowadzane na odpowiednim kanale na wykresie histogramu. Zatem dodatnio transfektowane komórki muszą być reprezentowane jako kontinuum zdarzeń na histogramie.

7. Testy funkcjonalne in vitro: zdolność do aktywacji modelowych komórek odpornościowych z wykorzystaniem owalbuminy (OVA) jako modelowego mRNA antygenowego

  1. Dzień przed transfekcją wysiać 10 000 komórek/dołek (w tym przypadku użyto komórek JAWSII) na płytkę 96-dołkową.
    UWAGA: Wysiać tyle dołków, ile jest wymaganych do uzyskania powtórzeń trzykrotnych dla każdego warunku. Pozostawić komórki do przytwierdzenia do płytki przez co najmniej 12 h (zalecana inkubacja przez noc).
  2. Przygotować nanocząsteczki (NPs) pBAE zgodnie z opisem w poniższej UWADZE, aby przetransfekować 0,6 µg mRNA na dołek.
    UWAGA: Jako kontrolę pozytywną przetransfekować komórki za pomocą odczynnika do transfekcji. W tym przypadku zastosowano 0,1 µg mRNA na dołek oraz 0,25 µL odczynnika do transfekcji na dołek. Zakupiono mRNA kodujące OVA (patrz Tabela materiałów). Jest ono poliadenylowane, zmodyfikowane 5-metoksyurydyną i zoptymalizowane dla systemów ssaków, a także zabezpieczone poprzez end-capping strukturą Cap1, przy użyciu zastrzeżonej metody dostawcy.
  3. Inkubować płytkę 96-dołkową przez 24 h w inkubatorze z suchym powietrzem w temperaturze 37 °C i 5% CO2.
    UWAGA: Po tym czasie nie odsysać medium, ponieważ może ono zawierać pewną liczbę komórek. Odzyskać komórki i przechować je w innym dołku lub na innej płytce.
  4. Przemyć pozostałe w dołkach komórki 25 µL 1x PBS. Następnie odessać płyn i dodać 25 µL trypsyny, po czym inkubować płytkę przez 5 min w 37 °C w celu odklejenia komórek. Przerwać reakcję trypsyny, dodając wcześniej odzyskane medium do odpowiedniego dołka.
  5. Wirować płytkę z prędkością 400 x g przez 5 min w 4 °C. Odessać medium. Dodać 50 µL/dołek 1x PBS i 2,5% formaliny. Inkubować w 4 °C przez 20 min w celu utrwalenia komórek.
  6. Powtórzyć kroki 7.5 i 7.5.1. Następnie dodać 50 µL/dołek 1x PBS i 3% BSA (bufor blokujący) i inkubować przez 30 min w 4 °C. Ponownie powtórzyć kroki 7.5 i 7.5.1, a następnie dodać 50 µL/dołek przeciwciała pierwszorzędowego (mysie α-OVA) w 1x PBS i 3% BSA i inkubować przez 30 min w 4 °C.
  7. Powtórzyć kroki 7.5 i 7.5.1, a następnie przemyć komórki 50 µL/dołek 1x PBS. Odessać medium, a następnie dodać roztwór przeciwciał wtórnych (α-mouse-AlexaFluor488/PerCP oraz Cy5.5-CD11b/APC-CD86) w 1x PBS i 3% BSA. Inkubować przez 1 h w 4 °C.
  8. Wirować płytkę z prędkością 400 x g przez 5 min. Następnie przemyć komórki 50 µL/dołek 1x PBS. Następnie wirować (400 x g przez 5 min), odessać i resuspenderć komórki w 100 µL/dołek 1x PBS i 2,5% formaliny.
  9. Przeanalizować próbkę za pomocą cytometrii przepływowej, zgodnie z powyższym opisem (krok 6.2).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Synteza i charakterystyka polimeru
Procedura syntezy OM-pBAE przedstawiona jest na Rysunku 2. Jak pokazuje Rysunek 2A, pierwszym krokiem w celu otrzymania OM-pBAE jest synteza C6-pBAE poprzez dodanie amin (1-heksyloaminy i 5-amino-1-pentanolu w stosunku 1:1) do diakrylanu (diakrylanu 1,4-butanodiolu). Reakcję tę przeprowadzono w temperaturze 90 °C przez 20 h przy stałym mieszaniu. Następnie do roztworu polimeru C6 otrzymanego w poprzedniej r...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Po wybuchu pandemii Covid-19 w ubiegłym roku znaczenie szczepionek w zakresie kontroli chorób zakaźnych stało się kluczowym elementem8. Wysiłki naukowców z całego świata umożliwiły wprowadzenie na rynek wielu szczepionek. Po raz pierwszy w historii szczepionki mRNA wykazały swój wcześniej hipotetyczny sukces, dzięki szybkiemu projektowi ze względu na ich zdolność do adaptacji do każdego nowego antygenu w ciągu kilku miesięcy 5,6,21

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia ani nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

Wsparcie finansowe od MINECO/FEDER (granty SAF2015-64927-C2-2-R, RTI2018-094734-B-C22 i COV20/01100) jest potwierdzone. CGF przyznało jej stypendium doktoranckie IQS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Diakrylan 1,4-butanodioluSigma Aldrich123048
1-heksyloaminaSigma Aldrich219703
5-amino-1-pentanolSigma Aldrich411744
AcetonPanreac141007
Przeciwciało CD11bPrzeciwciało BD550993
CD86Bioligend105007
ChlorohydroksydPanreac181023
Chloroform-dSigma Aldrich151823
peptyd Cys-His-His-HisOntoresCustom
Cys-Lys-Lys-Lys peptydOntores Custom
D2OSigma Aldrich151882
Odczynnik DEPC do wody wolnej od rnazySigma AldrichD5758Ten odczynnik jest ważny do uzdatniania wody MilliQ w celu usunięcia wszelkich RNaz z
Dietyl eterPanreac212770
dimetylosulfotlenekSigma Aldrich276855
HEPESSigma AldrichH3375
mRNA EGFPTriLink TechnologiesL-7601
mRNA OVATriLink TechnologieL-7610
Zestaw RiboGreenThermoFisherR11490
octan soduSigma Aldrich71196
sacharozaSigma AldrichS0389
Kwas trifluorooctowySigma Aldrich302031
Trypsyna-EDTAFisher Scientific11570626
α- mysz Przeciwciało AlexaFluor488AbcamAb450105
Equipment
Nanoparticle Tracking AnalyzerMalvern PanalyticalNanoSight NS300
Spektrometr magnetycznego rezonansu magnetycznegoVarian400 MHz
ZetaSizerMalvern PanalyticalNano ZSDla potencjału zeta i hydrodynamiczne określanie rozmiaru
Software
NanoSight Oprogramowanie NTAMalvern PanalyticalMAN0515-02-PL-00
Oprogramowanie NovoExpressAgilentNie określono
Oprogramowanie ZetaSizerMalvern PanalyticalDTS AplikacjaDo analizy ładunku powierzchniowego i rozmiarów hydrodynamicznych

Bibliografia

  1. Chumakov, K., Benn, C. S., Aaby, P., Kottilil, S., Gallo, R. Can existing live vaccines prevent COVID-19. Science. 368 (6496), 1187-1188 (2020).
  2. Zhang, C., Maruggi, G., Shan, H., Li, J. Advances in mRNA vaccines for infectious diseases. Frontiers in Immunology. 10, 1-13 (2019).
  3. Wherry, E. J., Jaffee, E. M., Warren, N., D'Souza, G., Ribas, A. How did we get a COVID-19 vaccine in less than 1 year. Clinical Cancer Research. 27 (8), 2136-2138 (2021).
  4. Folegatti, P. M., et al. Safety and immunogenicity of the ChAdOx1 nCoV-19 vaccine against SARS-CoV-2: a preliminary report of a phase 1/2, single-blind, randomised controlled trial. The Lancet. 396 (10249), 467-478 (2020).
  5. Geall, A. J., Mandl, C. W., Ulmer, J. B. RNA: The new revolution in nucleic acid vaccines. Seminars in Immunology. 25 (2), 152-159 (2013).
  6. Ulmer, J. B., Geall, A. J. Recent innovations in mRNA vaccines. Current Opinion in Immunology. 41, 18-22 (2016).
  7. Kranz, L. M., et al. Systemic RNA delivery to dendritic cells exploits antiviral defence for cancer immunotherapy. Nature. 534 (7607), 396-401 (2016).
  8. Milane, L., Amiji, M. Clinical approval of nanotechnology-based SARS-CoV-2 mRNA vaccines: impact on translational nanomedicine. Drug Delivery and Translational Research. 1 (4), 3(2020).
  9. Green, J. J., Langer, R., Anderson, D. G. A combinatorial polymer library approach yields insight into nonviral gene delivery. Accounts of Chemical Research. 41 (6), 749-759 (2008).
  10. Guerrero-Cázares, H., et al. Biodegradable polymeric nanoparticles show high efficacy and specificity at DNA delivery to human glioblastoma in vitro and in vivo. ACS Nano. 8 (5), 5141-5153 (2014).
  11. Kozielski, K. L., Tzeng, S. Y., Hurtado De Mendoza, B. A., Green, J. J. Bioreducible cationic polymer-based nanoparticles for efficient and environmentally triggered cytoplasmic siRNA delivery to primary human brain cancer cells. ACS Nano. 8 (4), 3232-3241 (2014).
  12. Segovia, N., Dosta, P., Cascante, A., Ramos, V., Borrós, S. Oligopeptide-terminated poly(β-amino ester)s for highly efficient gene delivery and intracellular localization. Acta Biomaterialia. 10 (5), 2147-2158 (2014).
  13. Dosta, P., Segovia, N., Cascante, A., Ramos, V., Borrós, S. Surface charge tunability as a powerful strategy to control electrostatic interaction for high efficiency silencing, using tailored oligopeptide- modified poly (beta-amino ester)s (PBAEs). Acta Biomaterialia. 20, 82-93 (2015).
  14. Fornaguera, C., et al. mRNA delivery system for targeting antigen-presenting cells in vivo. Advanced Healthcare Materials. 7 (17), 180033(2018).
  15. Fornaguera, C., Castells-Sala, C., Lázaro, M. Á, Cascante, A., Borrós, S. Development of an optimized freeze-drying protocol for OM-PBAE nucleic acid polyplexes. International Journal Pharmaceutics. 569, (2019).
  16. Fornaguera, C., Solans, C. Analytical methods to characterize and purify polymeric nanoparticles. International Journal of Polymer Science. , (2018).
  17. Fornaguera, C., Solans, C. Characterization of polymeric nanoparticle dispersions for biomedical applications: size, surface charge and stability. Pharmaceutical Nanotechnology. 6 (3), 147-164 (2018).
  18. Sahin, U., Karikó, K., Türeci, Ö MRNA-based therapeutics-developing a new class of drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (10), 759-780 (2014).
  19. Fan, Y. N., et al. Cationic lipid-assisted nanoparticles for delivery of mRNA cancer vaccine. Biomaterials Science. 6 (11), 3009-3018 (2018).
  20. Le Moignic, A., et al. Preclinical evaluation of mRNA trimannosylated lipopolyplexes as therapeutic cancer vaccines targeting dendritic cells. Journal of Controlled Release. 278, 110-121 (2018).
  21. Banerji, A., et al. mRNA vaccines to prevent COVID-19 disease and reported allergic reactions: Current evidence and approach. Journal of Allergy and Clinical Immunology: In Practice. 9 (4), 1423-1437 (2021).
  22. Kaczmarek, J. C., Kowalski, P. S., Anderson, D. G. Advances in the delivery of RNA therapeutics: from concept to clinical reality. Genome Medicine. 9 (1), 1-16 (2017).
  23. Dosta, P., et al. Delivery of anti-microRNA-712 to inflamed endothelial cells using poly(β-amino ester) nanoparticles conjugated with VCAM-1 targeting peptide. Advanced Healthcare Materials. , 1-11 (2021).
  24. Segovia, N., et al. Hydrogel doped with nanoparticles for local sustained release of siRNA in breast cancer. Advanced Healthcare Materials. 4 (2), 271-280 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

szczepionki mRNAsynteza nanocz stekdostarczanie mRNAnanocz stki polimerowemetoda liofilizacjicytometria przep ywowaaktywacja kom rek dendrytycznychmikroskopia fluorescencyjnawydajno enkapsulacji
Synteza i charakterystyka nanocząstek poli(beta-aminoestrów) obciążonych mRNA do celów szczepień
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.