Kwantyfikacja poziomów zmian morfologicznych i zwyrodnień neuronów dopaminergicznych u Caenorhabditis elegans

Summary

W tym artykule pokazujemy, jak używać siedmiopunktowego systemu punktacji do konsekwentnego ilościowego określania zmian w morfologii dendrytów neuronów dopaminergicznych u C. elegans. System ten jest przeznaczony do analiz testów neurodegeneracji dopaminergicznej z wykorzystaniem genetycznych, chemicznych i opartych na wieku modeli zaburzeń neurodegeneracyjnych.

Abstract

Utrata neuronów dopaminowych jest związana z patologią choroby Parkinsona (PD), bardzo rozpowszechnionej choroby neurodegeneracyjnej, która dotyka ponad 10 milionów ludzi na całym świecie. Ponieważ wiele szczegółów na temat etiologii choroby Parkinsona pozostaje nieznanych, potrzebne są badania badające genetyczne i środowiskowe czynniki przyczyniające się do choroby Parkinsona, aby odkryć metody zapobiegania, zarządzania i leczenia. Właściwa charakterystyka utraty neuronów dopaminergicznych może być istotna nie tylko dla badań nad chorobą Parkinsona, ale także dla innych coraz bardziej rozpowszechnionych zaburzeń neurodegeneracyjnych.

Istnieją potwierdzone genetyczne i chemiczne modele neurodegeneracji dopaminergicznej w systemie modelowym Caenorhabditis elegans, z łatwą wizualizacją neurobiologii, wspieraną przezroczystością nicieni i niezmienną architekturą neuronalną. W szczególności zmiany morfologiczne neuronów dopaminergicznych Hermafrodytycznego C. elegans można uwidocznić za pomocą szczepów z fluorescencyjnymi reporterami napędzanymi przez promotory specyficzne dla komórki, takie jak gen transportera dopaminy dat-1, który ulega ekspresji wyłącznie w ich ośmiu neuronach dopaminergicznych.

Dzięki możliwościom tego systemu modelowego i odpowiedniej technologii, wiele laboratoriów badało neurodegenerację dopaminergiczną. Jednak sposób analizy danych jest niespójny, a większość obecnej literatury wykorzystuje binarne analizy punktowe, które wychwytują obecność zwyrodnienia, ale nie zawierają pełnych szczegółów progresji utraty neuronów. W tym miejscu wprowadzamy uniwersalny system punktacji do oceny zmian morfologicznych i zwyrodnień dendrytów neuronów głowowych C. elegans. Ta siedmiopunktowa skala pozwala na analizę pełnego zakresu morfologii dendrytów, od zdrowych neuronów do całkowitej utraty dendrytów, oraz z uwzględnieniem szczegółów morfologicznych, w tym załamań, rozgałęzień, pęcherzyków i pęknięć. Dzięki temu systemowi punktacji naukowcy mogą określić ilościowo subtelne zmiany związane z wiekiem, a także bardziej dramatyczne zmiany wywołane chemikaliami. Na koniec udostępniamy praktyczny zestaw obrazów z komentarzem, które można wykorzystać do trenowania, kalibrowania i oceny spójności punktacji badaczy nowych w tej metodzie. Powinno to poprawić spójność w obrębie laboratorium i między nimi, zwiększając rygor i odtwarzalność.

Introduction

Choroba Parkinsona (PD) jest coraz powszechniejszą chorobą neurodegeneracyjną, dotykającą do 10 milionów osób na całym świecie¹. Mężczyźni i osoby starsze są bardziej narażone na rozwój choroby Parkinsona; średni wiek zachorowania wynosi 60 lat, a częstość występowania PD wzrasta z 0,3% częstości występowania w populacji ogólnej do 3% u osób powyżej 80 roku życia^1,2. Chociaż szczegóły patologii PD nie są w pełni zrozumiałe, to postępujące zaburzenie wiąże się z utratą neuronów dopaminergicznych w obszarze istoty czarnej śródmózgowia. Przypuszczalne mechanizmy tej utraty neuronów obejmują dysfunkcję mitochondriów, stres oksydacyjny i stan zapalny². Przyczyny i czynniki ryzyka choroby są nadal badane, ale obejmują kombinację czynników środowiskowych i genetycznych¹. Na przykład badania wykazały pozytywne powiązania między stosowaniem pestycydów przez całe życie a chorobą Parkinsona, a także genetyczną podatnością na rodzinną chorobę Parkinsona < klasa = "xref">1^,< klasa sup = "xref">3.

System modelowy C. elegans, pierwotnie opracowany częściowo do badań neurobiologicznych⁴, dobrze nadaje się do oceny utraty neuronów dopaminergicznych in vivo. Nass i jego współpracownicy byli pionierami w stosowaniu C. elegans w neurodegeneracji dopaminergicznej⁵, a od tego czasu wiele grup przyjęło robaka jako udany model PD i dysfunkcji dopaminergicznej6^{,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20}. C. elegans są dobrymi modelami chorób neurodegeneracyjnych z wielu tych samych powodów, dla których są tak popularnym organizmem modelowym dla innych dziedzin biologii; Ich przezroczystość pozwala na badanie in vivo procesów komórkowych, manipulacja genetyczna u robaków jest stosunkowo szybka i łatwa, mają krótki czas generacji wynoszący około trzech dni i są łatwe w utrzymaniu²¹. Większość modeli robaków PD należy do jednej z trzech kategorii: modele oparte na wieku, modele chemiczne i modele genetyczne. Zdolność do synchronizacji populacji robaków pozwala na badanie neurodegeneracji związanej z wiekiem dla opartego na wieku modelu chorób neurodegeneracyjnych związanych ze starzeniem się, takiego jak PD²². Ekspozycje chemiczne indukujące defekty neuronalne podobne do PD zostały ustalone przy użyciu różnych substancji chemicznych, w tym 6-hydroksydopaminy (6-OHDA), rotenonu i 1-metylo-4-fenylo-1,2,3,6-tetrahydropirydyny (MPTP)²². Robaki są również z powodzeniem stosowane jako modele genetyczne choroby Parkinsona; Szczepy z wybranymi nokautami genów neuronalnych mogą modelować różne choroby neurodegeneracyjne1^,4. Kombinacje czynników genetycznych i środowiskowych lub "interakcji gen-środowisko", które prawdopodobnie odgrywają główną rolę w PD^{2,17,23,24,25,26,27,28}, zostały zbadane przez kilka grup przy użyciu C. elegans. Wreszcie, zaobserwowano również neurodegenerację dopaminergiczną związaną z wiekiem^29,30. W przypadku użycia odpowiedniego transgenicznego szczepu neuronalnego w obrazowaniu fluorescencyjnym, każdy z tych modeli robaków PD może być wykorzystany do badania neurodegeneracji dopaminergicznej.

Kwantyfikacja zmian w morfologii neuronów jest kluczowym elementem badań neurodegeneracyjnych. U C. elegans wiele fluorescencyjnych szczepów reporterowych wykorzystano do wizualizacji zmian morfologicznych i utraty neuronów. Szczepy nadające się do obrazowania neuronów zawierają białko fluorescencyjne związane z promotorami specyficznymi dla komórki. Do testów neurodegeneracji dopaminergicznej nasze laboratorium wykorzystało szczep BY200 [vtIs1 (dat-1p::GFP, rol-6)], który ma znacznik białka zielonej fluorescencji (GFP) w genie dat-1, ulegający ekspresji w neuronach dopaminergicznych. Należy pamiętać, że fenotyp rolki BY200 ma bardzo niską penetrację i jest rzadko obserwowany. Inne popularne szczepy używane do tego typu obrazowania to BY250 [dat-1p::GFP], BY273 [baEx18[dat-1p::GFP+dat-1p::WT α-syn]], BZ555 [egIs1 [dat-1p::GFP]] i kilka innych dostępnych w Caenorhabditis Genetics Center (CGC) lub na żądanie w określonych laboratoriach^1,21,22,29. Szczepy te zazwyczaj pozwalają na wizualizację wszystkich trzech klas neuronów dopaminergicznych: neuronów głowowych (), przednich deirydowych (ADE) i postdeirydowych (PDE). C. elegans nie ulega naturalnej ekspresji białka alfa synukleiny, ale szczepy takie jak BY273 zostały zaprojektowane do jego ekspresji. Zauważamy jednak, że prezentowany przez nas system punktacji został opracowany przy użyciu BY200, który nie wyraża alfa synukleiny i musiałby zostać zweryfikowany z tym szczepem (lub jakimkolwiek innym nowym szczepem) przed użyciem. Dodatkowe neurony dopaminergiczne są obecne u samców, ale rzadko są brane pod uwagę, ponieważ samce zwykle stanowią <1% populacji C. elegans. Tutaj skupimy się na czterech neuronach dopaminergicznych znajdujących się w okolicy głowy C. elegans. Ten zestaw neuronów jest łatwo zlokalizowany pod mikroskopią fluorescencyjną, jest obecny zarówno u robaków hermafrodytowych, jak i męskich, zwykle nie pokrywa się z innymi obszarami autofluorescencji i jest powszechnie opisywany w badaniach na robakach. Warto zauważyć, że chociaż neurony te nie są mielinizowane, neurony grzbietowe (CEPD) są bezpośrednio wystawione na działanie pseudocelomicznego płynu ustrojowego, podczas gdy neurony brzuszne nie są. Zdrowy zestaw dendrytów jest zwykle wyświetlany jako stosunkowo proste, nieprzerwane linie. Zdegenerowane dendryty mogą wykazywać dowolną kombinację nieregularności i oznak uszkodzenia, w tym wyraźne kropki zwane pęcherzykami wzdłuż linii dendrytu i pęknięcia w linii dendrytu. Przykłady neuronów na różnych poziomach degeneracji można zobaczyć na Rysunek 1.

Chociaż neurodegeneracja dopaminergiczna jest badana przez coraz większą liczbę laboratoriów C. elegans, istnieje duża różnorodność w metodach analitycznych ilościowego określania uszkodzeń neuronów dopaminergicznych^{29,31,32,33,34}. Wiele opublikowanych badań donosiło o obecności lub braku somy z binarnym systemem punktacji neuronów zwyrodnieniowych w porównaniu z neuronami typowymi lub dzikimi^31,32. Te metody punktacji mogą zidentyfikować pewne stresory, które indukują neurodegenerację, ale nie mogą określić ilościowo szczegółów progresji bardziej subtelnych uszkodzeń neuronów ani łatwo wykryć różnic między neurodegeneracją wywołaną przez unikalne substancje chemiczne lub inne zmienne. Ponadto systemy punktacji skoncentrowane na ciałach komórek mogą nie być wrażliwe na mniej poważne poziomy uszkodzeń lub na uszkodzenia neuronów wpływające tylko na część komórki, taką jak dendryt. Ponieważ dendryt wydaje się mieć największy zakres konsekwentnie wykrywalnych zmian morfologicznych w odpowiedzi na stresory chemiczne, wybraliśmy je jako podstawę naszej analizy. Prezentowany przez nas system punktacji został zmodyfikowany z wielopunktowych skal opartych na morfologii dendrytów, które były wcześniej używane w naszym lab^29,33. System ten rozszerza te pięcio- i sześciopunktowe skale do siedmiopunktowej, aby uwzględnić zmiany morfologiczne związane z wiekiem, takie jak wyższa oczekiwana liczba załamań u dendrytów u starszych dorosłych, oraz rozróżnić między poważnymi uszkodzeniami a całkowitą utratą dendrytów. Celem wprowadzenia tego systemu punktacji jest zapewnienie możliwości uchwycenia kompleksowego obrazu neurodegeneracji na wszystkich poziomach uszkodzenia neuronów i zapewnienie uniwersalnego systemu wspierającego spójność w badaniach nad neurodegeneracją dopaminergiczną C. elegan. Ponieważ punktacja jest z natury subiektywna, bardzo ważne jest, aby zmaksymalizować spójność między osobami oceniającymi i zaślepić osobę oceniającą na tożsamość obrazów za pomocą ręcznego zaślepiania lub automatycznego programu do zaślepiania³⁵. Aby poprawić spójność, prezentujemy serię obrazów szkoleniowych i wykorzystujemy możliwości wideo JoVE, aby szczegółowo zademonstrować nasz system punktacji. Zalecamy korzystanie z systemu, który zarówno pozwala na automatyczną ślepą punktację, jak i pozwala osobie oceniającej na ilościowe określenie swojej spójności punktacji poprzez ponowną ocenę podzbioru obrazów. Jest to szczególnie ważne w przypadku łączenia lub porównywania danych pochodzących od wielu naukowców lub szkolenia naukowców, którzy nie mają doświadczenia w ocenianiu.

Protocol

1. Przygotowanie robaków do obrazowania

UWAGA: Zobacz powiązany artykuł wideo JoVe³¹: https://www.jove.com/v/835/

1. Dla każdej grupy eksperymentalnej należy pipetować lub pobierać od 20 do 30 robaków na platformę obrazowania kompatybilną z mikroskopem obrazowym. Najpopularniejsze platformy obejmują 2% wkładki z żelu agarozowego zamontowane na szkiełkach podstawowych z szkiełkiem nakrywkowym³¹ oraz płytki 96-dołkowe zawierające studzienki o objętości równej lub mniejszej niż 100 μl ciekłego podłoża.
2. Sparaliżuj robaki, dodając do robaków 30-90 mM azydku sodu (NaN₃), 2,5-8,5 mM lewamizolu HCl lub innego środka paraliżującego. W przypadku paraliżowania w płynie należy użyć wyższego stężenia środka paraliżującego niż w przypadku paraliżowania na podkładkach agarozowych. Delikatnie dotknij platformy obrazowania, aby wymieszać.
3. Pozwól robakom całkowicie sparaliżować.
   UWAGA: Może to potrwać kilka minut.

2. Obraz Neurony dopaminergiczne

1. Zlokalizuj obszary głowy robaków pod jednokolorową fluorescencją GFP za pomocą mikroskopu obrazowego zdolnego do pobierania stosów z.
   1. Zwracaj uwagę na ustawienia ekspozycji i przysłony; unikaj prześwietlenia dendrytów i utrzymuj spójne ustawienia we wszystkich próbach. Spraw, aby dendryty były tak jasne, jak to konieczne, aby uzyskać wyraźną wizualizację; Zazwyczaj prowadzi to do prześwietlenia SOMA.
      UWAGA: Obrazy zawarte w tym protokole zostały zarejestrowane przy użyciu 400-krotnego powiększenia.
2. Przewiń fokus, aby znaleźć górną i dolną granicę, w której dendryty są wyraźne. Ustaw je jako górną i dolną granicę przechwytywania obrazu z-stack
.
3. Kliknij, aby przechwycić obrazy z-stack dla każdego robaka.
   UWAGA: Wszystkie poniższe kroki można wykonać w dowolnym momencie.

3. Przygotowanie obrazów neuronów dopaminergicznych do oceny punktowej

1. Dla każdego stosu z otwórz plik obrazu za pomocą oprogramowania mikroskopu lub zewnętrznego oprogramowania do analizy obrazu, załaduj stos do oprogramowania i skompresuj stos do jednego spłaszczonego obrazu.
2. Ślepe obrazy między grupami terapeutycznymi i w ich obrębie ręcznie lub za pomocą oprogramowania do automatycznego zaślepiania.

4. Wynik dendrytów neuronów dopaminergicznych

1. Pracuj z jednym obrazem neuronu na raz. Wybierz jeden z czterech dendrytów, aby ocenić pod kątem pęcherzyków, pęknięć i nieregularności, w tym zagięć, załamań i krzywych. Punktacja od lewej do prawej, gdy nos znajduje się u góry obrazu, jest zalecana, aby zapewnić powtarzalność punktacji.
2. Korzystając z poniższych wskazówek, przypisz jedną wartość punktacji do dendrytu. Zobacz Rysunek 1 dla reprezentatywnych przykładów obrazów punktacji.
   0- brak uszkodzeń, "idealne" neurony
   1- nieregularne (załamania, krzywizny itp.)
   2- <5 pęcherzyków
   3- 5-10 pęcherzyków < br / > 4->10 pęcherzyków i/lub pęknięć usuwających <25% całkowitego dendrytu
   5- Pęknięcie, 25-75% usuniętego dendrytu
   6- Złamanie, > 75% usunięto dendryt
   1. Jeśli w obrębie jednego dendrytu spełnionych jest wiele kryteriów (tj. załamania i pęcherzyki), przypisz najwyższy odpowiedni wynik.
   2. Nie nacinaj dendrytów, które nie są wyraźnie widoczne, ze względu na problemy z przechwytywaniem obrazu, nakładanie się na inne dendryty itp. W przypadku powiększania spłaszczonego obrazu stosu Z należy pamiętać o powiększonych pikselach przypominających fałszywe pęcherze.
3. Powtórz te czynności dla każdego dendrytu. Powtórz te czynności dla wszystkich obrazów.
4. Zapisz wszystkie wyniki. W tym momencie wyniki mogą być odślepione.

5. Przygotowanie i prezentacja danych

1. Oblicz całkowitą liczbę dendrytów w każdej grupie terapeutycznej przypisanej do każdego wyniku neurodegeneracji. Oblicz całkowitą liczbę dendrytów z nacięciem w każdej grupie badanej.
2. Podziel wyniki neurodegeneracji przez całkowitą liczbę dendrytów uzyskanych w grupie leczonej. Przedstaw dane jako proporcję dendrytów w grupie leczonej przy każdym wyniku neurodegeneracji.

6. Wykonaj analizę statystyczną

1. Za pomocą oprogramowania do programowania lub ręcznie uruchom test chi-kwadrat w celu uzyskania niezależności między wszystkimi parami grup leczenia, które mają być porównane. W stosownych przypadkach zastosować poprawkę Bonferroniego wartości p w zależności od liczby porównywanych grup doświadczalnych w celu uwzględnienia wielokrotnych porównań.
   UWAGA: Ten test określi znaczące różnice między dwiema grupami, ale szczegóły dotyczące rodzaju różnicy muszą być kwalifikowane na oko.
   1. Wybierz porównania między grupami eksperymentalnymi. Będzie się to różnić w zależności od projektu eksperymentalnego.
      UWAGA: W naszych eksperymentach zazwyczaj grupy kontrolne są porównywane z odpowiednimi grupami leczenia, wszystkie kontrole są porównywane i wszystkie terapie są porównywane.

7. Ćwicz punktację z zestawem ćwiczeń obrazów neuronów dopaminergicznych

1. Zobacz Plik Uzupełniający 1, aby zapoznać się z zestawem obrazów neuronów prezentujących pełen zakres naszego systemu punktacji wraz z komentarzem i kluczem punktacji. Ten zestaw ćwiczeń ma na celu przeszkolenie badaczy, którzy nie znają tej metody, i zapewnienie wiarygodności między oceniającymi.

8. Rozważ alternatywne opcje protokołu

1. Zamiast przechwytywać stosy z, wykonaj nacinanie pod mikroskopem, bez zapisywania lub układania obrazów.
   UWAGA: Ta opcja zmniejsza wymagania dotyczące możliwości technologicznych, ale usuwa opcję tworzenia archiwum obrazów neuronów, do których można wrócić w późniejszym czasie, wymaga ręcznego zaślepienia i zezwala na zaślepienie tylko między grupami leczonymi, a nie w ich obrębie.
2. Zamiast tworzyć pojedynczy skompresowany obraz na stos, zakończ ocenianie, przewijając obrazy każdego z-stack.
   UWAGA: Ta opcja może być łatwiejsza dla niektórych oceniających i zmniejsza ryzyko zobaczenia fałszywych pęcherzyków na robakach, które poruszały się podczas obrazowania i pozwala na ocenę nakładających się dendrytów, ale wymaga ręcznego zaślepienia i pozwala na zaślepienie tylko między grupami leczonymi, a nie w ich obrębie.

Results

Opisany tutaj system punktacji został użyty do oceny neurodegeneracji w stadium larwalnym L4 BY200 [vtIs1 (dat-1p::GFP, rol-6)] C. elegans po ekspozycji na rotenon. Wyniki tego eksperymentu są pokazane w Rysunek 2 i reprezentują zdolność naszego systemu punktacji do wykrywania i ilościowego określania zmiennych poziomów uszkodzeń neuronów dopaminergicznych. Rotenon jest naturalnie występującym inhibitorem kompleksu I łańcucha transportu elektronów, stosowanym w niektórych pestycydach, piscydach i insektycydach^36,37. Należy pamiętać, że praca z toksycznymi chemikaliami, takimi jak rotenon, jest z natury niebezpieczna, a wszystkie laboratoria powinny przestrzegać wszystkich przepisów dotyczących użytkowania i utylizacji określonych przez ich instytucje. W tym eksperymencie ekspozycje na ciekły rotenon w dwóch dawkach, 0,03 μM i 0,5 μM, wraz z grupą kontrolną, rozpoczęto natychmiast po lizie 0,5 M wodorotlenku sodu/1% podchlorynu sodu w celu zebrania jaj³⁸. Jaja wykluły się w pełnej klasie K-medium^33,39 z 0,25% dimetylosulfotlenku (DMSO), a robaki pozostawały w płynie przez ~48 godzin do połowy stadium larwalnego L4, w którym to momencie zostały usunięte z ekspozycji chemicznej i przygotowane, zobrazowane i, przy użyciu Rysunek 1 jako odniesienie, ocenione zgodnie z powyższymi krokami protokołu. W przypadku wyższej dawki 0,5 μM rotenonu, jaja zostały zebrane 24 godziny wcześniej, aby uwzględnić opóźnienie rozwojowe wywołane rotenonem i upewnić się, że wszystkie robaki były zsynchronizowane w momencie obrazowania.

Rysunek 2 dodatkowo pokazuje, jak nasze laboratorium wizualizuje dane zebrane za pomocą tego systemu punktacji. Na tym rysunku można docenić reakcję neurodegeneracyjną zależną od dawki, a konkretny podział rozkładu wyników jest wyraźnie wyświetlany. Te konkretne wyniki pokazują, w jaki sposób uszkodzenia neuronów mogą objawiać się na różne sposoby. Na przykład grupa narażona na 0,03 μM narażona na rotenon ma zmniejszony odsetek zdrowych neuronów z wynikiem 0 w porównaniu z grupą kontrolną, ale ma również zmniejszony odsetek 5 punktów. Wykrycie tego szczegółu dotyczącego rozkładu wyników między grupami eksperymentalnymi podkreśla czułość naszego siedmiopunktowego systemu punktacji. Dane te zostały przeanalizowane pod kątem istotności statystycznej zgodnie z protokołem, przy użyciu testu chi-kwadrat niezależności z poprawką Bonferroniego.

Rysunek 1. Reprezentatywne obrazy systemu oceny morfologicznej i zwyrodnienia neuronów dopaminowych. Ten skonsolidowany wykres zawiera przykłady neuronów w każdym wyniku i jest przeznaczony do wykorzystania jako odniesienie do oceniania. W tym przypadku każdy oznaczony wynik odpowiada najbardziej uszkodzonemu dendrytowi w każdym robaku, jak wskazuje strzałka w każdym panelu. Zdjęcia te zostały wykonane przy użyciu protokołu opisanego w tym artykule z BY200 C. elegans. Proszę zapoznać się z plikiem uzupełniającym 1, aby uzyskać zestaw punktowanych obrazów z komentarzem, które można wykorzystać do szkolenia osób początkujących w tej metodzie punktacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. BY200 L4 morfologia neuronów dopaminowych i wyniki zwyrodnienia po ekspozycji na rotenon. Na tym rysunku przedstawiono reprezentatywne wyniki analizowane przy użyciu opisanych tutaj metod punktacji. Uwidocznione większe proporcje uszkodzonych neuronów dopaminergicznych z wyższymi stężeniami ekspozycji na rotenon analizowano statystycznie za pomocą testów chi-kwadrat na niezależność. Obie grupy leczone rotenonem uzyskały statystycznie istotne wartości p w porównaniu z grupą kontrolną. Różne litery oznaczają różnicę statystyczną. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający 1. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

Protokół ten pokazuje, jak wykorzystać siedmiopunktową skalę opracowaną w naszym laboratorium do ilościowego określenia poziomów zmian morfologicznych i degeneracji neuronów dopaminergicznych u C. elegans. Stworzyliśmy i udostępniliśmy tę skalę jako narzędzie do standaryzacji analizy pracy neurodegeneracji dopaminergicznej u robaków. Uznając znaczenie badania szlaków zaangażowanych w wysoce rozpowszechnione choroby neurodegeneracyjne, wielu badaczy wykorzystuje przydatność modelu C. elegans do wizualizacji neurobiologicznej do badania neurodegeneracji 29,31,32,33^. Jednak nie podjęto jeszcze wysiłku, aby zmniejszyć dużą zmienność w sposobie ilościowego oznaczania uszkodzeń neuronów w badaniach nad neurodegeneracją u robaków. Przedstawiony tu system punktacji ma zatem na celu promowanie spójności analiz i umożliwienie porównania między badaniami.

Nasz system punktacji może być wykorzystany do analizy danych pochodzących z eksperymentów C . elegans, które wykorzystują specyficzne dla komórki reportery fluorescencyjne, które pozwalają na wizualizację neuronów dopaminergicznych - w szczególności dendrytów. W szczególności szczepy oznaczone genem dat-1 do wizualizacji GFP neuronów dopaminergicznych są zgodne z tym protokołem punktacji, chociaż istnieje wiele innych powiązanych transgenicznych modeli PD. Możliwe, że ten system punktacji byłby również przydatny w przypadku tych modeli; Należy to jednak zweryfikować przed ich użyciem. W szczególności możliwe jest (ale nie przetestowane zgodnie z naszą wiedzą), że szczepy z mCherry mogą nie być dobrze przystosowane do tego protokołu, ponieważ agregacja mCherry może być nie do odróżnienia od pęcherzyków lub prowadzić do stresu komórkowego. Zamiast przedstawiać komentarz do wszystkich konkretnych modeli choroby Parkinsona i powiązanych zaburzeń neurodegeneracyjnych, skupiamy się na samej ocenie danych dotyczących neurodegeneracji. Ponadto protokół ten koncentruje się tylko na morfologii neuronów i nie uwzględnia poziomów fluorescencji somy. Testy neurodegeneracji mogą być wykonywane równolegle z testami behawioralnymi istotnymi dla chorób neurodegeneracyjnych, takich jak eksperymenty dotyczące lokomocji, długości życia i długości zdrowia. Poziomy zwyrodnienia w ustalonych chemicznych, opartych na wieku i genetycznych modelach PD można również potwierdzić i uszczegółowić za pomocą tego systemu punktacji. Modele pomiarowe, czynniki przyczyniające się i szlaki związane z chorobą Parkinsona i innymi chorobami neurodegeneracyjnymi mogą wzbogacić wiedzę naukową na temat tych zaburzeń i wskazać, jak radzić sobie z rosnącą populacją osób dotkniętych chorobą. Uzyskanie porównywalnych wyników neurodegeneracji w całej literaturze jest kluczem do osiągnięcia tego celu.

Aby zinterpretować wyniki uzyskane z tego systemu punktacji, proponujemy rozważenie każdego ocenionyego dendrytu jako n = 1, ponieważ różne neurony w tym samym robaku często reagują inaczej na leczenie. Może to wynikać z faktu, że tylko neurony CEPD są bezpośrednio narażone na działanie pseudocelomicznego płynu ustrojowego. W związku z tym pozwala to na przedstawienie rozkładu wyników grup eksperymentalnych jako proporcji całkowitej liczby dendrytów zdobytych w każdej grupie. Ta metoda, zastosowana w przypadku reprezentatywnych wyników pokazanych tutaj, pozwala na łatwe porównanie między grupami leczenia, uwzględnia zróżnicowane odpowiedzi w obrębie tego samego robaka i jest łatwa do analizy za pomocą testu chi-kwadrat uzupełnionego poprawką Bonferroniego dla wielokrotnych porównań. Przykładowy szablon do rejestrowania wyników neuronów i obliczania wartości procentowych można znaleźć w pliku uzupełniającym 2. Rozważyliśmy dwie alternatywne metody analizy danych i zidentyfikowaliśmy błędy w każdej z nich. Pierwszą opcją jest uśrednienie wyników czterech neuronów dla każdego robaka. To parametryzuje dane; Zakłada jednak liniową zależność ze wzrostem wyniku i traci informacje o wszelkich zmianach w odpowiedzi na leczenie w obrębie tego samego robaka. Drugą opcją jest zsumowanie wyników wszystkich czterech neuronów dla każdego robaka, co również parametryzuje dane. Zakłada to nadal liniową zależność między wynikami, jednak bardziej kompetentnie uwzględnia różnice w obrębie każdego robaka niż uśrednione wyniki, rozszerzając parametry możliwych wyników. Niezależnie od tego, czy poszczególni badacze zdecydują się wyświetlić swoje dane, wyniki powinny być brane pod uwagę wraz ze zmiennymi eksperymentalnymi, takimi jak szczep i wiek robaków; Na przykład starsze robaki mają wyższy oczekiwany wyjściowy poziom zwyrodnienia.

Podczas interpretacji wyników oceny neurodegeneracji, badacze powinni również zdawać sobie sprawę z kilku zastrzeżeń i ograniczeń metody punktacji. Po pierwsze, konieczne są pewne wymagania technologiczne, aby uchwycić obrazy nadające się do punktacji. Mikroskop obrazowy musi obsługiwać kanały fluorescencyjne oraz ustawienia powiększenia i ekspozycji, które pozwalają na wyraźną wizualizację dendrytów. Jak zauważono w protokole, wymagania technologiczne mogą zostać zmniejszone poprzez dostosowanie protokołu, takie jak ocenianie obrazów na żywo przez pole mikroskopowe, zamiast przechwytywania obrazów w celu zarchiwizowania i oceny w późniejszym czasie. Po drugie, możliwe metody analizy statystycznej dla tych danych są ograniczone, ponieważ dane są nieparametryczne. Zakłada się, że skala punktacji jest progresywna, ale nie można jej uznać za liczbową, ponieważ istnieją dyskretne opcje punktacji, a wzrost punktacji niekoniecznie jest proporcjonalny do siebie w odniesieniu do funkcji biologicznej. Z tych powodów testy niezależności chi-kwadrat najlepiej nadają się do tego typu danych, co oznacza, że analiza statystyczna zależy od obserwatora w celu określenia kierunku dowolnej istotności statystycznej. Warto zauważyć, że test chi-kwadrat analizuje również tylko różnice w rozkładzie wyników i nie jest w stanie dostarczyć dowodów na różnice w określonych kategoriach punktacji. Wreszcie, funkcjonalne znaczenie zmian morfologicznych określonych ilościowo przez ten system punktacji nie zostało jeszcze zbadane.

Przyszłe kierunki rozwoju tego systemu punktacji obejmują określenie podstaw biologicznych i korelacji z indywidualnymi wynikami neuronów. Badanie znaczenia funkcjonalnego (np. sygnalizacji neuronalnej, zachowania robaków) wszystkich punktów na skali punktacji dostarczy informacji, w jaki sposób lepiej przełożyć wyniki na wnioski mające zastosowanie do zrozumienia przyczyn i konsekwencji chorób neurodegeneracyjnych oraz opracowania opcji profilaktyki i leczenia. Przyszłe badania nad neurodegeneracją u robaków powinny mieć na celu odkrycie powiązań z innymi morfologiami, takimi jak kształt i rozmiar robaków. Ponadto badania nad neurodegeneracją mogą być wspierane przez badanie innych reporterowych szczepów C. elegans w celu pomiaru punktów końcowych, takich jak bioenergetyka, produkcja reaktywnych form tlenu i morfologia mitochondriów.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Płytka 96-dołkowa	VWR	29442-056	Do obrazowania w studzienkach
Blinder	Solibyte Solutions LLC		Darmowe oprogramowanie, które żaluzji między i w obrębie przesłanych zestawów plików graficznych
BY200 [vtIs1 (dat-1p::GFP, rol-6)]	Aschner Lab		C. elegans szczep odpowiedni do obrazowania fluorescencyjnego neuronów dopaminergicznych. Może być zastępowany przez inne szczepy z fluorescencyjnym reporterem napędzanym przez specyficzne dla komórek promotory Dostępne na życzenie w laboratorium Meyera
kompletne K-medium			51 mM chlorek sodu, 32 mM chlorek potasu, 3 mM chlorek wapnia, 3 mM siarczan magnezu, 13 mM cholesterol
Szkiełka nakrywkowe 22x22mm, szkło nr 1	VWR VistaVision	48366-067	Do obrazowania na szkiełkach
Dimetylosulfotlenek (DMSO)	Sigma-Aldrich	472301	Rozpuszczalnik do ekspozycji na rotenon
ImageJ	National Institutes of Health	ImageJ 1.5e lub nowszy. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https:// imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016.	Sotware do manipulacji obrazem
Mikroskop fluorescencyjny Keyence BZ-X All-in-one	Keyence		Służy do fluorescencyjnego przechwytywania obrazów neuronów dopaminergicznych. Może być zastąpiony przez inne mikroskopy nadające się do obrazowania fluorescencyjnego o wysokiej rozdzielczości
Szkiełka mikroskopowe 3x1"	VWR VistaVision	16004-420	Do obrazowania na szkiełkach
Rotenon	Sigma-Aldrich	R8875	Inhibitor kompleksu łańcucha transportu elektronów I
Azydek sodu (NaN_3)	Sigma-Aldrich	S2002	Paralityczny
wodorotlenek sodu	Sigma-Aldrich	S2770	Do lizy wybielacza
Podchloryn sodu	VWR	RC7495.5-32	Do lizy wybielacza
Chlorowodorek tetramizolu (lewamizolu) (HCl)	Sigma-Aldrich	L9756	Paralityk