Artykuł metodologiczny

Ulepszony test ochrony enzymatycznej do badania internalizacji Staphylococcus aureus i wewnątrzkomórkowej skuteczności związków przeciwdrobnoustrojowych

DOI:

10.3791/62903

⸱

8 września 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1CIRI, Centre International de Recherche en Infectiologie, GIMAP team, University of Lyon, INSERM U1111, CNRS, UMR5308, ENS Lyon, UCBL1, University of St-Etienne, France, 2Department of Infectious Agents and Hygiene, University Hospital of St-Etienne, St-Etienne, France, 3Department of Infectious Diseases, University Hospital of St-Etienne, St-Etienne, France, 4CIRI, Centre International de Recherche en Infectiologie, Staphylococcal Pathogenesis team, University of Lyon, INSERM U1111, CNRS UMR5308, ENS Lyon, UCBL1, University of Lyon, Lyon, France, 5Department of Bacteriology, Institute for Infectious Agents, Hospices Civils de Lyon, Lyon, France

* These authors contributed equally

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół ma na celu opisanie sposobu badania zakresu internalizacji Staphylococcus aureus i jego zdolności do przetrwania wewnątrz ludzkiej komórki gospodarza, a także wewnątrzkomórkowej skuteczności związków przeciwdrobnoustrojowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Staphylococcus aureus wyraża czynniki wirulencji, które wywołują jego internalizację w komórkach eukariontycznych i przetrwanie w różnych subkomórkowych kompartmentach. W artykule opisano test ochrony enzymatycznej w celu zbadania zakresu internalizacji S. aureus i jego wewnątrzkomórkowego przeżycia w przylegających nieprofesjonalnych komórkach fagocytarnych (NPPC), a także wewnątrzkomórkowej skuteczności związków przeciwdrobnoustrojowych. NPPC są uprawiane na płytce wielodołkowej, aż osiągną 100% konfluencji. Kultury S. aureus są hodowane przez noc w pożywce do hodowli komórkowych. Zawiesinę bakteryjną rozcieńcza się w zależności od liczby komórek w studzince, aby zaszczepić komórki przy kontrolowanej wielokrotności infekcji. Zaszczepione komórki inkubuje się przez 2 godziny, aby umożliwić internalizację bakterii przez NPPC, po czym do pożywki hodowlanej dodaje się lizostafinę, aby selektywnie zabijać bakterie zewnątrzkomórkowe. Lizostafina jest obecna w pożywce hodowlanej przez pozostałą część eksperymentu.

W tym momencie, zainfekowane komórki mogą być inkubowane ze związkami przeciwdrobnoustrojowymi, aby ocenić ich wewnątrzkomórkową aktywność przeciwko S. aureus. Następnie komórki są myte trzykrotnie w celu usunięcia leków, a następnie określa się ilościowo wewnątrzkomórkowe obciążenie S. aureus poprzez hodowlę na płytkach agarowych. Alternatywnie, w celu zbadania czynników wirulencji gronkowcowej zaangażowanych w przeżycie wewnątrzkomórkowe i toksyczność komórkową, lizostafina może być inaktywowana proteinazą K, aby wyeliminować potrzebę etapów mycia. Ta końcówka poprawia wiarygodność wewnątrzkomórkowego oznaczania obciążenia bakteryjnego, zwłaszcza jeśli komórki mają tendencję do odrywania się od płytki hodowlanej, gdy stają się silnie zakażone z powodu namnażania się wewnątrzkomórkowego S. aureus. Protokoły te mogą być stosowane z praktycznie wszystkimi typami przylegających NPPC oraz z modelami 3D hodowli komórkowych, takimi jak organoidy.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Staphylococcus aureus jest zarówno zagrażającym życiu patogenem, jak i bakterią komensalną skóry i błony śluzowej, która kolonizuje dwa miliardy osób na całym świecie1. U ludzi nosiciele S. aureus przez nos mają zwiększone ryzyko zakażenia własnym szczepem nosicielstwa; jednak wieloczynnikowe determinanty nosicielstwa błony śluzowej S. aureus są nadal niejasne1,2. Oprócz ostrych infekcji, u pacjentów mogą również rozwinąć się przewlekłe infekcje S. aureus, które często są trudne do wyleczenia3. Lepsze zrozumienie interakcji gospodarz-patogen podczas kolonizacji i infekcji ma kluczowe znaczenie dla opracowania nowych strategii terapeutycznych i poprawy leczenia pacjenta.

In vitro, S. aureus może wywołać swoją internalizację w komórkach gospodarza, wyrażając integrynę α5β14. Trójstronna interakcja między gronkowcowymi białkami wiążącymi fibronektynę zakotwiczonymi w ścianie komórkowej S. aureus, fibronektyną i integryną β1 ulegającą ekspresji na powierzchni komórki gospodarza jest dobrze znana jako główny szlak internalizacji S. aureus w NPPC, takich jak keratynocyty, osteoblasty, fibroblasty oraz komórki nabłonkowe i śródbłonkowe4. Ostatnie badania pokazują, że S. aureus można znaleźć w ludzkich komórkach podczas kolonizacji nosa5,6 i infection7. Jednak rola rezerwuaru wewnątrzkomórkowego w patogenezie zakażenia S. aureus pozostaje niejasna. Komórki gospodarza mogą działać jako schronienie dla S. aureus, który jest chroniony zarówno przed układem odpornościowym8, jak i większością związków przeciwdrobnoustrojowych6,9.

Test ochrony lizostafiny, opisany przez Proctor10 wcześniej w latach 80., umożliwia badanie czynników bakteryjnych i gospodarza zaangażowanych w internalizację izolatów S. aureus. Lizostafina to bakteriocyna wytwarzana przez Staphylococcus simulans, która wykazuje silne działanie przeciwko prawie wszystkim izolatom S. aureus, w tym szczepom opornym na antybiotyki11. Lizostafina została użyta do zniszczenia tylko zewnątrzkomórkowego S. aureus, aby umożliwić liczenie tylko żywotnych bakterii wewnątrzkomórkowych12. Technika ta była szeroko stosowana i przyczyniła się do odkrycia kilku czynników wirulencji S. aureus. Gentamycyna, sama i w połączeniu z lizostafiną, jest również szeroko stosowana do badania bakterii wewnątrzkomórkowych.

Jednak ostatnie badania wykazały, że gentamycyna dostaje się do komórek eukariotycznych i dociera do zinternalizowanych bakterii w sposób zależny od czasu i stężenia13. Badanie to wykazało również, że lizostafina nie wnika do komórek eukariotycznych, co potwierdza, że test ochrony enzymatycznej oparty na lizostafinach (EPA) jest najdokładniejszym testem do ilościowego określania wewnątrzkomórkowego obciążenia S. aureus przez kulturę13. Niezależnie od tego, jaki związek jest używany do niszczenia bakterii zewnątrzkomórkowych (np. lizostafina lub gentamycyna), należy go usunąć poprzez przemycie komórek przed posiewem wewnątrzkomórkowego S. aureus na płytkach agarowych. Kolejne płukania mogą skutkować odklejaniem się komórek, zwłaszcza komórek słabo przylegających (np. komórek silnie zakażonych), co prowadziłoby do niedoszacowania wewnątrzkomórkowego obciążenia S. aureus. W artykule tym szczegółowo opisano, w jaki sposób EPA może być wykorzystany do ilościowego określenia wewnątrzkomórkowego obciążenia S. aureus oraz do pomiaru wewnątrzkomórkowej skuteczności związków przeciwdrobnoustrojowych przy użyciu modelu in vitro. Warto zauważyć, że zaproponowano prostą metodę mającą na celu poprawę wiarygodności kwantyfikacji obciążenia wewnątrzkomórkowego poprzez unikanie intensywnych płukania.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla ludzkich komórek nabłonkowych

  1. Przygotuj kompletną pożywkę hodowlaną ze zmodyfikowaną pożywką Eagle (DMEM) firmy Dulbecco o wysokiej zawartości glukozy i czerwienią fenolową, uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) bez antybiotyków.
  2. Hodować komórki nabłonkowe A549 w kompletnej pożywce w temperaturze 36 ± 1 °C w 5% CO2 . Upewnij się, że użyto naczynia hodowlanego o odpowiedniej wielkości, aby mieć wystarczającą liczbę komórek do kolejnych etapów (patrz krok 1.10).
    UWAGA: Jedna kolbao średnicy 75 cm 2 (T-75) wystarcza do wysiewu dwóch 24-dołkowych płytek i subhodowli komórek.
  3. Dwa dni przed zakażeniem należy przygotować pojedynczą płytkę 24-dołkową.
  4. Wyjąć i wyrzucić zużytą pożywkę hodowlaną z kolby T-75 i przemyć komórki jednorazowo 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco.
  5. Dodać 5 ml trypsyny-EDTA i inkubować komórki przez 5 minut w temperaturze 36 ± 1 °C w 5% CO2 .
  6. Dodać 5 ml kompletnej pożywki hodowlanej i przenieść komórki do probówki.
  7. Odwirowywać komórki przez 5 minut w temperaturze 300 × g.
  8. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 10 ml świeżej, kompletnej pożywki hodowlanej.
  9. Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek (lub komory liczącej).
  10. Rozcieńczyć komórki w kompletnej pożywce hodowlanej, aby przygotować 30 ml zawiesiny komórek o stężeniu 2,0 × 105 komórek/ml.
  11. Dodać 1 ml zawiesiny komórkowej do każdego dołka na płytce 24-dołkowej, co odpowiada gęstości komórek około 1,0 × 105 komórek/cm² dla powierzchni studzienki 2 cm².
  12. Inkubować komórki przez 48 godzin w temperaturze 36 ± 1 °C w 5% CO2 aż do osiągnięcia 100% konfluencji.
    UWAGA: Oprócz warunków, które mają być badane, trzy studzienki powinny być zarezerwowane do zliczania komórek w dniu zakażenia (patrz krok 3.1.4). W zależności od liczby warunków, które mają być badane, można przygotować do dwóch płytek 24-dołkowych jednocześnie. Wolumeny wskazane w protokole powinny zostać odpowiednio zwiększone.

2. Hodowla szczepów S. aureus

  1. Dwa dni przed zakażeniem przygotuj kompletną pożywkę infekcyjną z DMEM o wysokiej zawartości glukozy bez czerwieni fenolowej, uzupełnioną 10% FBS bez antybiotyków.
  2. Rozmrozić szczepy S. aureus do badania na płytkach agarowych.
  3. Inkubować płytki agarowe przez 18-24 godziny w temperaturze 36 ± 1 °C.
  4. Dzień przed inokulacją zaszczepić jedną kolonię szczepu S. aureus do badania w 10 ml kompletnej pożywki infekcyjnej.
  5. Inkubować bakterie przez 18-24 godziny w temperaturze 36 ± 1 °C z wytrząsaniem przy 160 obr./min. Używaj probówek o pojemności 50 ml trzymanych pod kątem 45°, aby uniknąć osadzania się bakterii.
    UWAGA: Przed rozpoczęciem pracy z nowym szczepem zaleca się sprawdzenie jego wrażliwości na lizostafinę w tych samych warunkach hodowli, które będą wykorzystywane do dalszych eksperymentów (pożywka, obciążenia bakteryjne oraz stężenie lizostafin i czas inkubacji). Ważne jest również, aby określić obciążenie bakteryjne odpowiadające OD600 nm wynoszącemu 0,5, ponieważ może się ono nieznacznie różnić w zależności od szczepu. Warunki hodowli szczepów bakteryjnych można dostosować do celu doświadczalnego.

3. Test zakażenia S. aureus

  1. Oznaczanie gęstości i żywotności komórek
    1. Wyjąć zużytą pożywkę hodowlaną i wyrzucić ją z trzech studzienek przeznaczonych do liczenia komórek A549.
    2. Dodać 1 ml kompletnej pożywki infekcyjnej zawierającej 5 μg/ml Hoechst 33342 i 1 μg/ml jodku propidyny.
      UWAGA: Hoechst 33342 jest znanym mutagenem i należy obchodzić się z nim ostrożnie. Jodek propidyny, potencjalny mutagen, musi być traktowany ostrożnie i utylizowany w bezpieczny sposób zgodnie z obowiązującymi przepisami.
    3. Inkubować komórki przez 30 minut w temperaturze 36 ± 1 °C w 5% CO2 .
    4. Policz liczbę komórek i oblicz ich żywotność za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z polem magnetycznym.
      UWAGA: Jeśli mikroskop fluorescencyjny nie jest dostępny, gęstość i żywotność komórek można obliczyć za pomocą barwienia błękitem trypanowym za pomocą komory do liczenia komórek.
  2. Przygotowanie zawiesiny bakteryjnej
    1. Dozować 25 ml kompletnej pożywki infekcyjnej do probówki i podgrzać w temperaturze 36 ± 1 °C.
    2. Dostosuj zawiesinę S. aureus do OD600 nm 0,5 w kompletnym pożywce infekcyjnej za pomocą miernika gęstości komórek.
    3. Przygotuj 20 ml zawiesiny bakteryjnej do inokulacji komórek, rozcieńczając 0,5 OD600 nm w kompletnej pożywce infekcyjnej, aby uzyskać wielokrotność infekcji (MOI) 1 w zależności od liczby komórek w dołku.
      UWAGA: MOI odpowiada liczbie bakterii dodanych na komórkę w każdym dołku. Na przykład, aby osiągnąć MOI 1 z 1,0 × 106 komórek na studzienkę, przygotuj zawiesinę bakteryjną w ilości 2,0 ×10 6 jtk/ml, tak aby można było dodać 106 jtk w objętości 500 μl (patrz krok 3.3.3). MOI można dostosować w zależności od typów komórek i szczepów bakterii, które mają być testowane.
    4. Użyj automatycznej spiralnej płytki, aby określić obciążenie S. aureus rozcieńczonej zawiesiny bakteryjnej, która ma być użyta do etapu inokulacji komórek.
    5. Inkubować płytki agarowe przez 18-24 godziny w temperaturze 36 ± 1 °C.
    6. Następnego dnia policz liczbę kolonii za pomocą licznika kolonii, aby obliczyć dokładny MOI dla każdego testowanego szczepu.
      UWAGA: Jeśli nie jest dostępna automatyczna spiralna płaska, obciążenie bakteryjne można określić przez seryjne rozcieńczanie na płytce agarowej. Szczegółowe informacje można znaleźć w podręczniku analizy bakteriologicznej14.
  3. Inokulacja komórek
    1. Obserwuj każdy dołek na 24-dołkowej płytce za pomocą mikroskopii w małym powiększeniu, aby upewnić się, że komórki są zdrowe i rosną zgodnie z oczekiwaniami.
    2. Wyjąć i wyrzucić zużytą pożywkę do hodowli komórkowych z płytki 24-dołkowej.
    3. Dodaj 500 μl zawiesiny bakteryjnej do inokulacji do każdej studzienki ze 100% zlewającymi się komórkami.
    4. Inkubować komórki przez 2 godziny w temperaturze 36 ± 1 °C i 5% CO2,
      UWAGA: zaleca się użycie trzech dołków płytki dla każdego badanego stanu (trzykrotnie) oraz wykonanie co najmniej trzech niezależnych eksperymentów. Opóźnienie inkubacji można dostosować w zależności od celu doświadczalnego.
  4. Kwantyfikacja bakterii wewnątrzkomórkowych za pomocą ulepszonego testu ochrony enzymatycznej (iEPA)
    1. Przygotuj 7 ml 4x buforu do lizy z 3,5 ml 2% Triton X-100 w sterylnej wodzie i 3,5 ml trypsyny-EDTA.
    2. Przygotować roztwór podstawowy lizostafiny o stężeniu 10 mg/ml w buforze octanowym i podwielokrotność 25 μl w kriowialach. Przechowywać w temperaturze -80 °C do 6 miesięcy.
    3. Przygotować 250 μl świeżego roztworu roboczego lizostafiny o stężeniu 1 mg/ml, mieszając 25 μl roztworu podstawowego lizostafiny (10 mg/ml) i 225 μl 0,1 M tris-HCl. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 48 godzin.
    4. Przygotować 6,25 ml kompletnej pożywki infekcyjnej uzupełnionej lizostafiną, dodając 6 ml kompletnej pożywki infekcyjnej do 250 μl roztworu roboczego lizostafiny.
    5. Do każdej studzienki dodać 250 μl kompletnej pożywki infekcyjnej uzupełnionej lizostafiną i delikatnie wymieszać płytkę, obracając ją ręcznie.
    6. Inkubować komórki przez 1 godzinę w temperaturze 36 ± 1 °C w 5% CO2 , aby lizostafina zabiła bakterie zewnątrzkomórkowe.
    7. Pod koniec czasu inkubacji dodać 10 μl proteinazy K w stężeniu 20 mg/ml do każdego dołka w celu inaktywacji lizostafiny.
    8. Inkubować komórki przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
    9. Dodaj 250 μl 4x buforu do lizy, aby lizować komórki przez szok osmotyczny.
    10. Inkubować komórki przez 10 minut w temperaturze 36 ± 1 °C.
    11. Dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół dziesięć razy na dnie studzienki, aby upewnić się, że komórki są w pełni zlizowane i homogenizowane.
    12. Użyj automatycznej spiralnej płytki, aby określić obciążenie S. aureus każdej studzienki.
    13. Inkubować płytki agarowe przez 18-24 godziny w temperaturze 36 ± 1 °C.
    14. Następnego dnia policz liczbę kolonii za pomocą licznika kolonii, aby obliczyć wewnątrzkomórkowe obciążenie S. aureus każdej studzienki.
  5. Pomiar wewnątrzkomórkowej skuteczności związków przeciwdrobnoustrojowych za pomocą testu ochrony enzymatycznej (EPA)
    1. Przygotuj 25 ml 1x buforu do lizy z 3,125 ml 2% Triton X-100 w sterylnej wodzie, 6,25 ml trypsyny-EDTA i 15,625 ml sterylnej wody.
    2. Przygotować 250 μl świeżego roztworu roboczego lizostafiny o stężeniu 1 mg/ml, mieszając 25 μl roztworu podstawowego lizostafiny (10 mg/ml) i 225 μl 0,1 M tris-HCl.
    3. Przygotować 25 ml kompletnej pożywki infekcyjnej uzupełnionej lizostafiną, dodając 24,75 ml kompletnej pożywki infekcyjnej do 250 μl roztworu roboczego lizostafiny.
    4. Dla każdego badanego związku przeciwdrobnoustrojowego należy przygotować 3,1 ml kompletnej pożywki infekcyjnej uzupełnionej lizostafiną i związkiem przeciwdrobnoustrojowym w stężeniu, które ma być badane.
    5. Wyjąć i wyrzucić zużytą pożywkę do hodowli komórkowych z płytki 24-dołkowej.
    6. Dodać 1 ml kompletnej pożywki infekcyjnej uzupełnionej lizostafiną.
    7. Inkubować komórki przez 1 godzinę w temperaturze 36 ± 1 °C w 5% CO2 , aby lizostafina zabiła bakterie zewnątrzkomórkowe.
    8. Wyjąć i wyrzucić pożywkę uzupełnioną lizostafiną z płytki 24-dołkowej.
    9. Napełnij trzy studzienki 1 ml pożywki uzupełnionej lizostafiną oraz związkiem przeciwdrobnoustrojowym, który ma być badany.
    10. Powtórzyć krok 3.5.9 dla każdego badanego związku przeciwdrobnoustrojowego.
    11. W celu uzyskania warunków kontrolnych należy napełnić trzy studzienki 1 ml pożywki uzupełnionej lizostafiną bez żadnego związku przeciwdrobnoustrojowego.
    12. Inkubować komórki przez 24 godziny w temperaturze 36 ± 1 °C w 5% CO2 .
    13. Pod koniec okresu inkubacji usunąć i wyrzucić zużytą pożywkę i delikatnie umyć każdą studzienkę trzy razy sterylnym DPBS z CaCl2 i MgCl2.
    14. Dodaj 1 ml 1x buforu do lizy do każdej studzienki, aby odłączyć i zlizować komórki przez szok osmotyczny.
    15. Inkubować komórki przez 10 minut w temperaturze 36 ± 1 °C.
    16. Dokładnie wymieszaj, pipetując w górę i w dół dziesięć razy w całym dołku, aby upewnić się, że komórki są w pełni zlizowane i homogenizowane.
    17. Użyj automatycznej spiralnej płytki, aby określić obciążenie S. aureus każdej studzienki.
    18. Inkubować płytki agarowe przez 18-24 godziny w temperaturze 36 ± 1 °C.
    19. Następnego dnia policz liczbę kolonii za pomocą licznika kolonii, aby obliczyć wewnątrzkomórkowe obciążenie S. aureus w każdej studzience.
      UWAGA: Aktywność wewnątrzkomórkową każdego związku przeciwdrobnoustrojowego należy obliczyć zgodnie z obciążeniem bakteryjnym w warunkach kontrolnych. Ważne jest również sprawdzenie cytotoksyczności wszystkich związków przeciwdrobnoustrojowych, aby udowodnić, że różnice zaobserwowane między grupą kontrolną a związkami nie są spowodowane śmiercią komórki.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wyniki internalizacji S. aureus przez komórki nabłonkowe A549 są przedstawione w Rysunek 1A. Komórki A549 inokulowano S. aureus SF8300 WT i SF8300Δ fnbA / B, który nie ma białek wiążących fibronektynę A i B, przy MOI 1 przez 2 godziny. Aby zniszczyć zewnątrzkomórkowy S. aureus, lizostafinę dodano do pożywki hodowlanej, a komórki inkubowano przez 1 godzinę. Następnie lizostafina została usunięta przez przemywanie w kierunku EPA lub inaktywowana proteinazą K w celu uzyskania iEPA. Następnie komórki zostały rozerwane w buforze do lizy, a obciążenie bakteryjne określono ilościowo za pomocą hodowli. Przy użyciu EPA średnie obciążenia wewnątrzkomórkowe wynosiły odpowiednio 4,46 i 0,49 Log CFU/ml dla SF8300 WT i SF8300Δ fnbA/B (Rysunek 1A, zielone paski). Stosując iEPA, średnie obciążenia wewnątrzkomórkowe wynosiły odpowiednio 4,53 i 0,56 Log CFU/ml dla SF8300 WT i SF8300Δ fnbA/B (Rysunek 1A, czerwone paski). Warto zauważyć, że zarówno EPA, jak i iEPA wykazały podobne wyniki, co można wytłumaczyć łatwością przeprowadzania płukania, gdy komórki są w dobrym stanie, oraz dlatego, że cytotoksyczność indukowana przez S. aureus jest bardzo niska w tych warunkach eksperymentalnych (dane nie pokazane).

Wyniki wewnątrzkomórkowej aktywności wankomycyny, ryfampicyny i lewofloksacyny przeciwko S. aureus są przedstawione w Rysunek 1B. Aby zmierzyć wewnątrzkomórkową aktywność tych antybiotyków, komórki HaCaT inokulowano S. aureus ATCC 29213 przy MOI 1 przez 2 godziny. Komórki inkubowano z lizostafiną, z lub bez badanych związków przeciwdrobnoustrojowych, przez 24 godziny. Następnie lizostafina i związki przeciwdrobnoustrojowe zostały usunięte przez mycie. Komórki zostały zakłócone w buforze do lizy, a obciążenie bakteryjne określono ilościowo za pomocą hodowli. Średnie ładunki wewnątrzkomórkowe wynosiły odpowiednio 4,57, 4,51, 3,03 i 2,91 log CFU / ml dla kontroli, wankomycyny (50 μg / ml), ryfampicyny (7 μg / ml) i lewofloksacyny (10 μg / ml) (Figura 1B).

figure-results-1
Rysunek 1: Wewnątrzkomórkowe obciążenie Staphylococcus aureus w komórkach nabłonkowych. (A) Test ochrony enzymatycznej (zielone paski) i ulepszony test ochrony enzymatycznej (czerwone paski) w komórkach A549 zakażonych S. aureus SF8300 WT i ΔfnbA/B. (B) Wewnątrzkomórkowa aktywność związków przeciwdrobnoustrojowych w komórkach HaCaT zakażonych S. aureus ATCC 29213. Słupki reprezentują średnie wartości z trzech niezależnych eksperymentów przeprowadzonych w trzech egzemplarzach. Słupki błędów reprezentują odchylenia standardowe. p < 0,0001. Skróty: Ctrl = kontrola; CFU = jednostki tworzące kolonie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisane tutaj testy są cenne dla badania zakresu internalizacji i wewnątrzkomórkowego przeżycia S. aureus w NPPC, a także wewnątrzkomórkowej skuteczności związków przeciwdrobnoustrojowych 6,15,16. Niektóre kroki w obu protokołach testowych mogą być krytyczne. Stan zdrowia i gęstość komórek muszą być doskonale kontrolowane i spójne między niezależnymi eksperymentami. Inokulum bakteryjne musi być starannie standaryzowane, aby uzyskać rzeczywisty MOI zbliżony do docelowego teoretycznego MOI. Ogólnie rzecz biorąc, należy zachować ostrożność, aby nie odłączyć żadnej z komórek podczas pipetowania. Mycie w celu usunięcia lizostafiny i antybiotyków jest krytycznym krokiem w EPA. Stwierdzono, że stosowanie proteinazy K poprawia ten etap, gdy nie stosuje się antybiotyku (patrz poniżej). Wreszcie, co nie mniej ważne, komórki powinny być całkowicie odłączone w każdym dołku i dokładnie zhomogenizowane po inkubacji z buforem do lizy, aby wiarygodnie określić ilościowo obciążenie wewnątrzkomórkowe S. aureus.

W niektórych przypadkach mogą wystąpić problemy i najpierw należy sprawdzić kilka punktów. W przypadku braku odtwarzalności należy pamiętać, że S. aureus może tworzyć grudki, co sprawia, że oznaczanie ilościowe za pomocą absorbancji jest niedokładne. Zbrylanie się bakterii można zwiększyć poprzez etapy wirowania i mycia, jeśli pożywka hodowlana ma zostać zastąpiona (np. w celu wyeliminowania wydzielanego białka). Zawiesinę bakteryjną należy zużyć szybko, ponieważ bakterie nadal rozwijają się w temperaturze pokojowej. Skuteczność lizostafiny może się zmniejszyć z powodu nieprawidłowych warunków przechowywania, nieoptymalnego pH dla aktywności enzymów w pożywkach hodowlanych, zmienności aktywności enzymatycznej między partiami i dostawcami oraz braku wrażliwości na lizostafiny niektórych szczepów w określonych warunkach wzrostu. Czerwień fenolowa może mieć lekkie działanie bakteriostatyczne, zwłaszcza gdy podłoże hodowlane jest stosunkowo ubogie w składniki odżywcze w porównaniu z typowymi bulionami używanymi do hodowli bakterii. Dlatego zaleca się stosowanie pożywki do hodowli komórkowych bez czerwieni fenolowej, która również poprawia fluorescencyjne obserwacje mikroskopowe poprzez redukcję szumu tła.

Chociaż metoda ta jest cennym narzędziem do badania losów wewnątrzkomórkowych różnych szczepów, należy wziąć pod uwagę pewne ograniczenia metody. Zastosowanie bardzo wysokiego MOI może przeciążyć zdolność internalizacji przez NPPC i wyrównać różnice między różnymi badanymi szczepami. Zakres internalizacji większości szczepów cytotoksycznych może być niedoszacowany, ponieważ lizostafina (lub antybiotyki) szybko niszczy S. aureus , który jest uwalniany przez uszkodzone komórki. W związku z tym eksperymenty o wydłużonym czasie trwania (tj. w celu zbadania przeżycia wewnątrzkomórkowego lub wewnątrzkomórkowej aktywności antybiotyków) są łatwiejsze do przeprowadzenia ze szczepami o niskiej cytotoksyczności. Dlatego czas inkubacji i MOI należy dokładnie dostosować do zjadliwości szczepu, typu komórki i celu eksperymentalnego.

Opisana tutaj metoda z użyciem lizostafiny jest bardziej wiarygodna niż te oparte na gentamycynie, ponieważ w przeciwieństwie do lizostafiny, gentamycyna ma tendencję do internalizacji przez komórki gospodarza13. Drugą zaletą jest możliwość dezaktywacji lizostafiny. Hamowanie aktywności lizostafin zostało zgłoszone przez Kim i wsp.13 przy użyciu EDTA do chelatacji jonów lub 1,10-fenantroliny; Jednak nadal wymagane jest intensywne mycie, aby usunąć enzym przed posiewem bakterii. W tym przypadku proteinaza K umożliwia szybką inaktywację lizostafiny. Zaobserwowaliśmy, że komórki mają tendencję do odrywania się od płytki hodowlanej, gdy stają się silnie zakażone z powodu namnażania się wewnątrzkomórkowego S. aureus. Pomijając ostatni etap mycia, metoda iEPA znacznie uprościła obsługę techniczną i umożliwiła odzyskanie zinternalizowanych bakterii w luźno przylegających lub już odłączonych komórkach.

Bardziej skoncentrowane odczynniki i zastosowane w iEPA pomogły również zmniejszyć wysiłek związany z pipetowaniem i zminimalizować utratę komórek. Ponadto iEPA może być stosowany z komórkami w zawiesinie, a także z organoidami, które są trudne do umycia. Podsumowując, testy ochrony enzymatycznej umożliwiają badanie zakresu internalizacji i losów wewnątrzkomórkowych S. aureus, a także wewnątrzkomórkowej aktywności leków przeciwdrobnoustrojowych z różnymi modelami in vitro . Należy wprowadzić ulepszenia, aby lepiej scharakteryzować związek między internalizacją a cytotoksycznością, aby lepiej docenić znaczenie opracowania leków zdolnych do dotarcia do S. aureus wewnątrz komórki.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szczepy złociste S. SF8300 WT i SF8300Δ fnbA/B zostały hojnie podarowane przez prof. Binh Diep (Uniwersytet Kalifornijski, San Francisco, USA). Prace te zostały wsparte grantem stowarzyszenia FINOVI (#AO13 FINOVI) pod egidą Fundacji na rzecz Uniwersytetu w Lyonie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Płytka 24-dołkowaCORNING-FALCON353047
Linia komórkowa A549ATCCCCL-185
Roztwór buforowy octanu pH 4,6Fluka31048Służy do przygotowania roztworu podstawowego lizostpahiny o stężeniu 10 mg/ml w 20 mM octanu sodu.
AMBICIN (rekombinowana lizostafina)AMBILSPN-50Liofilizowana rekompensacyjna lizostafina. Zamrożenie w temperaturze -80 stopni Celsjusza; C do długotrwałego przechowywania.
COS - agar kolumbijski + 5% krwi owczejBiomerieux43049Zamiast tego można użyć dowolnej płytki agarowej odpowiedniej do uprawy gronkowców.
Densytometr WPA CO8000Biochrom Sp. z o.o.80-3000-45Gęstościomierz
Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Średnia, wysoka glukoza z czerwienią fenolowąSigma-AldrichD6429
Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Średnia, wysoka glukoza bez czerwieni fenolowejSigma-AldrichD1145
Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiSigma-AldrichD8537
Dulbecco′ s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami z MgCl2 i CaCl2, sterylnie filtrowanaSigma-AldrichD8662
Dulbecco′ s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami, sterylnie filtrowanaSigma-AldrichD8537
Rozcieńczalnik EasyspiralInterscience414000Automatyczny rozcieńczalnik i spirala
plater Surowica bydlęca płoduGibco10270-106
Linia komórkowa HaCaTObsługa linii komórkowych (CLS)300493
Hoechst 33342, Trichlorowodorek, Trójwodzian, 10 mg/ml Roztwór w wodzieFisher scientific11534886
Jodek propidyny, 1,0 mg/ml roztwór w wodzieInvitrogenP3566
Proteinaza K, rekombinowana 20 mg/mlEurobioGEXPRK01-B5> 30 U/mg, lot 901727
Scan 4000Interscience438000Automatyczny licznik kolonii
Sterylna wodaKolba600500
T-75CORNING-FALCON353136
TC20 Automatyczny licznik komórekBiorad1450102Automatyczny licznik komórek
Tris 1 M pH 8,0InvitrogenAM9855GSłuży do przygotowania roztworu roboczego lizostafiny o stężeniu 1 mg/ml w 0,1 M Tris-HCl.
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
Trypsyna - roztwór EDTASigma-AldrichT39240,05% trypsyna wieprzowa i 0,02% EDTA w Hanks′ Zrównoważony roztwór soli z czerwienią fenolową
Szerokokątny mikroskop fluorescencyjnyNikonTi2
hodowlana OTEC

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Verhoeven, P. O., et al. Detection and clinical relevance of Staphylococcus aureus nasal carriage: an update. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 12 (1), 75-89 (2014).
  2. Gagnaire, J., et al. Epidemiology and clinical relevance of Staphylococcus aureus intestinal carriage: a systematic review and meta-analysis. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 15 (8), 767-785 (2017).
  3. Tong, S. Y. C., Davis, J. S., Eichenberger, E., Holland, T. L., Fowler, V. G. Staphylococcus aureus infections: epidemiology, pathophysiology, clinical manifestations, and management. Clinical Microbiology Reviews. 28 (3), 603-661 (2015).
  4. Josse, J., Laurent, F., Diot, A. Staphylococcal adhesion and host cell invasion: fibronectin-binding and other mechanisms. Frontiers in Microbiology. 8, 2433(2017).
  5. Hanssen, A. -M., et al. Localization of Staphylococcus aureus in tissue from the nasal vestibule in healthy carriers. BMC Microbiology. 17 (1), 89(2017).
  6. Rigaill, J., et al. Evaluation of the intracellular efficacy of antimicrobial agents used for Staphylococcus aureus decolonization in a cell model mimicking nasal colonization. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 73 (11), 3044-3048 (2018).
  7. Yang, D., et al. Novel insights into Staphylococcus aureus deep bone infections: the Involvement of osteocytes. mBio. 9 (2), 00415-00418 (2018).
  8. Tuchscherr, L., et al. Staphylococcus aureus phenotype switching: an effective bacterial strategy to escape host immune response and establish a chronic infection. EMBO Molecular Medicine. 3 (3), 129-141 (2011).
  9. Valour, F., et al. Antimicrobial activity against intraosteoblastic Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (4), 2029-2036 (2015).
  10. Proctor, R. A., Prendergast, E., Mosher, D. F. Fibronectin mediates attachment of Staphylococcus aureus to human neutrophils. Blood. 59 (4), 681-687 (1982).
  11. Climo, M. W., Ehlert, K., Archer, G. L. Mechanism and suppression of lysostaphin resistance in oxacillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (5), 1431-1437 (2001).
  12. Bur, S., Preissner, K. T., Herrmann, M., Bischoff, M. The Staphylococcus aureus extracellular adherence protein promotes bacterial internalisation by keratinocytes independent of fibronectin-binding proteins. Journal of Investigative Dermatology. 133 (8), 2004-2012 (2013).
  13. Kim, J. -H., Chaurasia, A. K., Batool, N., Ko, K. S., Kim, K. K. Alternative enzyme protection assay to overcome the drawbacks of the gentamicin protection assay for measuring entry and intracellular survival of Staphylococci. Infection and Immunity. 87 (5), 00119(2019).
  14. Maturin, L., Peeler, J. T. Aerobic plate count. Bacteriological Analytical Manual., Edition 8, Revision A. 3, Available from: https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-3-aerobic-plate-count 3(2021).
  15. Kolenda, C., et al. Evaluation of the activity of a combination of three bacteriophages alone or in association with antibiotics on Staphylococcus aureus embedded in biofilm or internalized in Osteoblasts. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 64 (3), 02231(2020).
  16. Abad, L., et al. Antibiofilm and intraosteoblastic activities of rifamycins against Staphylococcus aureus: promising in vitro profile of rifabutin. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 75 (6), 1466-1473 (2020).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Sprostowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Improved Enzyme Protection Assay to Study Staphylococcus aureus Internalization and Intracellular Efficacy of Antimicrobial Compounds
Posted by JoVE Editors on 1/19/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Improved Enzyme Protection Assay to Study Staphylococcus aureus Internalization and Intracellular Efficacy of Antimicrobial Compounds. One of the affiliations was updated.

The fifth affiliation was updated from:

Département de Bactériologie, Institut des Agents Infectieux, Hospices Civils de Lyon, Lyon, France

to:

Department of Bacteriology, Institute for Infectious Agents, Hospices Civils de Lyon, Lyon, France 

Tagi

Prze ywalno bakterii wewn trzkom rkowychskuteczno przeciwdrobnoustrojowanieprofesjonalne kom rki fagocytuj celeczenie lizostafininaktywacja proteinaz Kilo ciowe oznaczanie adunku wewn trzkom rkowegokom rki nab onkowe A549model infekcji organoid w

Powiązane artykuły