Utlenianie β kwasów tłuszczowych jest niezbędnym szlakiem metabolicznym odpowiedzialnym za wytwarzanie energii w wielu różnych typach komórek, w tym w hepatocytach. W tym miejscu opisujemy metodę pomiaru β-oksydacji kwasów tłuszczowych w świeżo wyizolowanych hepatocytach pierwotnych przy użyciu 14znakowanych C kwasów palmitynowych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Pomiar β-oksydacji kwasów tłuszczowych w zawiesinie świeżo wyizolowanych hepatocytów myszy
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Utlenianie β kwasów tłuszczowych jest kluczowym szlakiem metabolicznym, który zaspokaja zapotrzebowanie wątroby na energię i dostarcza substratów i kofaktorów dla dodatkowych procesów, takich jak ketogeneza i glukoneogeneza, które są niezbędne do utrzymania homeostazy glukozy w całym organizmie i wspierania funkcji narządów pozawątrobowych na czczo. Utlenianie β kwasów tłuszczowych zachodzi w mitochondriach i peroksysomach i jest regulowane przez wiele mechanizmów, w tym wychwyt i aktywację kwasów tłuszczowych, poziomy ekspresji enzymów oraz dostępność kofaktorów, takich jak koenzym A i NAD+. W testach, które mierzą β-oksydację kwasów tłuszczowych w homogenatach wątroby, liza komórek i powszechne dodawanie suprafizjologicznych poziomów kofaktorów maskują skutki tych mechanizmów regulacyjnych. Ponadto integralność organelli w homogenatach jest trudna do kontrolowania i może się znacznie różnić w zależności od preparatu. Pomiar β-oksydacji kwasów tłuszczowych w nienaruszonych hepatocytach pierwotnych pokonuje powyższe pułapki. Protokół ten opisuje metodę pomiaru β-oksydacji kwasów tłuszczowych w zawiesinie świeżo wyizolowanych pierwotnych hepatocytów myszy inkubowanych z 14znakowanymi C kwasem palmitynowym. Unikając godzin lub dni hodowli, metoda ta ma tę zaletę, że lepiej zachowuje poziomy ekspresji białek i aktywność szlaku metabolicznego pierwotnej wątroby, w tym aktywację β-oksydacji kwasów tłuszczowych obserwowaną w hepatocytach wyizolowanych od myszy na czczo w porównaniu z myszami karmionymi.
Wprowadzenie
Utlenianie β kwasów tłuszczowych jest niezbędnym procesem w metabolizmie lipidów, zapewniając kataboliczny szlak równoważący syntezę kwasów tłuszczowych i ich przyjmowanie z diety. Proces ten generuje energię dla wielu narządów, w tym mięśnia sercowego, kory nerkowej i wątroby na czczo, i wykorzystuje kwasy tłuszczowe uzyskane z diety, lipolizy tkanki tłuszczowej i wewnętrznych zapasów trójglicerydów1,2.
Utlenianie kwasów tłuszczowych poprzez szlak β-oksydacji powoduje sekwencyjne skrócenie tłuszczowego łańcucha acylowego o dwa atomy węgla na raz, uwalniane jako acetylo-CoA, a proces ten zachodzi zarówno w mitochondriach, jak i w peroksysomach. Podczas gdy większość kwasów tłuszczowych ulega tylko β-oksydacji, niektóre są utleniane przy różnych atomach węgla przed wejściem na ten szlak. Na przykład kwasy tłuszczowe podstawione 3-metylem, takie jak kwas fitanowy, ulegają usunięciu jednego węgla przez α-utlenianie w peroksysomach przed wejściem na szlak β-utleniania. Podobnie, niektóre kwasy tłuszczowe są najpierw przekształcane w dikarboksylowe kwasy tłuszczowe przez utlenianie końcowej grupy metylowej (ω-oksydacja) w retikulum endoplazmatycznym, zanim zostaną preferencyjne utlenione w peroksysomach przez β-oksydację3.
Niezależnie od konkretnych organelli, kwas tłuszczowy musi najpierw zostać przekształcony w tioester koenzymu A (CoA) lub acylo-CoA, który ma zostać utleniony przez szlak β-oksydacji. β-Utlenianie długołańcuchowych acylo-CoA w macierzy mitochondrialnej wymaga transportu karnitynowego do ich translokacji, gdzie palmitoilotransferaza karnityny 1 (CPT1) katalizuje przemianę acylo-CoA do acylokarnityny i jest enzymem ograniczającym szybkość w tym procesie4. Po translokacji do macierzy mitochondrialnej, acylo-CoA są ponownie formowane i służą jako substraty dla maszynerii utleniania β mitochondriów. W stanie na czczo acetylo-CoA wytwarzany w wyniku β-oksydacji w mitochondriach wątrobowych jest przede wszystkim kierowany do ketogenezy. Peroksysomy służą jako główne miejsce β-utleniania bardzo długołańcuchowych, rozgałęzionych i dikarboksylowych kwasów tłuszczowych. Peroksysomy nie wymagają transportu karnityny do importu substratów kwasów tłuszczowych, zamiast tego importują odpowiedni acylo-CoAs poprzez aktywność transporterów kasety wiążącej ATP (ABC) ABCD1-35. W peroksysomach acylo-CoA są następnie utleniane przez dedykowany zestaw enzymów, różniący się od maszynerii utleniania mitochondrialnych kwasów tłuszczowych β. Zarówno mitochondria, jak i peroksysomy wymagają również dostarczania NAD + i wolnego CoA do utleniania tłuszczowych łańcuchów acylowych. Wykazano, że poziom CoA w wątrobie wzrasta w odpowiedzi na post, co wspiera zwiększone tempo utleniania kwasów tłuszczowych, które występuje w tym stanie6. Ponadto zwiększona degradacja CoA w peroksysomach powoduje selektywny spadek utleniania peroksysomalnych kwasów tłuszczowych7. Dlatego proces utleniania kwasów tłuszczowych w komórce jest regulowany przez poziomy ekspresji i aktywność enzymów biorących udział w aktywacji, transporcie i utlenianiu kwasów tłuszczowych, a także stężenia kofaktorów i innych metabolitów w wielu przedziałach subkomórkowych.
Procedury wykorzystujące homogenaty tkankowe do pomiaru utleniania kwasów tłuszczowych niszczą architekturę komórkową regulującą i wspierającą ten proces, prowadząc do zbierania danych, które nie odzwierciedlają dokładnie metabolizmu in vivo. Podczas gdy techniki wykorzystujące posiane hepatocyty pierwotne zachowują ten system, hodowla izolowanych komórek przez dłuższy czas powoduje utratę profilu ekspresji genów in vivo, który był obecny w komórkach, gdy nadal żyły w obrębie zwierzęcia8,9. Poniższy protokół opisuje metodę izolowania pierwotnych hepatocytów i oznaczania ich zdolności do utleniania β kwasów tłuszczowych bezpośrednio po izolacji i w zawiesinie, przy użyciu kwasu [1-14C]palmitynowego. Test opiera się na pomiarze promieniotwórczości związanej z metabolitami rozpuszczalnymi w kwasie (ASM) lub produktami, takimi jak acetylo-CoA, wytwarzanymi w wyniku β-utleniania kwasu palmitynowego [1-14C]kwasu palmitynowego10,11.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury eksperymentalne przeprowadzone na myszach (C57BL/6J, samce, w wieku 9-11 tygodni) zostały zatwierdzone przez Instytucjonalne Komitety ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Zachodniej Wirginii.
1. Izolacja hepatocytów
- Przygotowanie
- Na kilka dni przed izolacją hepatocytów należy przygotować bufory i pożywki do hodowli komórkowych wymienione w Tabeli 1. Ustawić łaźnię wodną z temperaturą 37 °C w pobliżu miejsca, w którym będzie przeprowadzany zabieg chirurgiczny.
- W dniu izolacji hepatocytów, pod laminarnym dygestorium, przenieść 35 mL Buforu 1 do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 50 mL oraz 70 mL Buforu 2 do sterylnego zlewka lub butelki o pojemności 100 mL.
- Do obu buforów dodać antybiotyki: gentamycynę (50 µg/mL) oraz penicylinę/streptomycynę (1x).
- Przenieść 20 mL Buforu 2 przygotowanego w kroku 1.1.3 do naczynia hodowlano-kulturowego o średnicy 100 mm i umieścić na lodzie.
- Pozostałe 50 mL Buforu 2 przenieść do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 50 mL. Probówki 50 mL zawierające Bufor 1 i Bufor 2 z dodatkiem antybiotyków umieścić w łaźni wodnej ustawionej na 37 °C i pozostawić do ogrzania przez co najmniej 15 min przed rozpoczęciem perfuzji.
UWAGA: W przypadku przeprowadzania wielu izolacji hepatocytów podczas jednej sesji, należy odpowiednio zwiększyć liczbę przygotowanych alikwotów Buforu 1 i Buforu 2 z dodatkiem antybiotyków. - Rozmrozić alikwot roztworu kolagenazy i przechowywać na lodzie.
UWAGA: Przy prawidłowym przechowywaniu nie stwierdzono istotnej utraty aktywności enzymatycznej w roztworach kolagenazy, które były mrożone i rozmrażane do 3 razy i zużyte w ciągu 3 tygodni od przygotowania. - Przygotować narzędzia chirurgiczne i pompę perystaltyczną. Sterylizować przewody pompy perystaltycznej poprzez przepłukanie 15 mL 70% etanolu, a następnie 15 mL wody sterylnej.
- Do linii wyjściowej podłączyć igłę 22 G (Rysunek 1A). Jako łącznik dobrze sprawdza się pusty filtr cewnika. Wypełnić przewody Buforem 1 i sprawdzić przewody, łącznik oraz igłę, aby upewnić się, że nie ma w nich pęcherzyków powietrza.
Rysunek 1: Aparatura do perfuzji i perfundowana wątroba. (A) Pompa perystaltyczna z linią wylotową podłączoną do igły użytej do kaniulacji i perfuzji wątroby. (B) Prawidłową kaniulację wskazuje natychmiastowe i jednorodne blaknięcie wątroby. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
- Perfuzja i dysocjacja wątroby
- Zanurz mysz w narkozie poprzez inhalację izofluranu z powietrzem medycznym jako gazem nośnym, stosując 4% izofluranu do indukcji i 1,5% izofluranu w celu utrzymania znieczulenia. Sprawdź głębokość narkozy, oceniając utratę odruchu pieszowego.
- W przypadku braku reakcji na uciśnięcie palca u nogi, umieść mysz w pozycji grzbietnej na stole operacyjnym, wyprostuj kończyny i przymocuj je do stołu za pomocą pinów.
- Obficie spryskaj brzuch i klatkę piersiową myszy 70% etanolem.
- Za pomocą pęsety unieś skórę i ścianę brzucha w pobliżu podstawy brzucha i przetnij je bocznie, po obu stronach linii środkowej aż do przepony, aby odsłonić narządy.
- Odsłoń żyłę główną dolną (IVC), przesuwając jelita na prawą stronę i delikatnie odchylając płaty wątroby do góry. Wsuń mały przedmiot cylindryczny, np. nasadkę igły, pod plecy myszy, aby lekko przechylić IVC i ułatwić jej kaniulację (Rycina 1B).
- Uruchom pompę z najniższą prędkością i przy płynącym Buforze 1 wprowadź igłę do IVC.
- Przetnij żyłę wrotną, aby zmniejszyć ciśnienie i umożliwić odpływ krwi oraz buforów perfuzyjnych, a następnie natychmiast zwiększ szybkość przepływu do 7 mL/min. Jeśli procedura zostanie wykonana prawidłowo, wątroba w ciągu kilku sekund równomiernie zblednie (Rycina 1B).
- Aby uzyskać bardziej spójne wyniki, przytrzymuj igłę w pozycji ręcznie przez cały czas trwania perfuzji.
- Wykonaj perfuzję wątroby ciepłym Buforem 1. Aby uniknąć wprowadzenia pęcherzyków powietrza, upewnij się, że linia wprowadzona do probówki z Buforem 1 pozostaje stale zanurzona.
- W trakcie perfuzji dodaj 130 µL roztworu kolagenazy do Buforu 2 i wymieszaj, pipetując w górę i w dół lub mieszając pipetą serologiczną 5 mL lub 10 mL.
- Gdy objętość w probówce z Buforem 1 spadnie do około 5 mL, powoli dodaj 5 mL Buforu 2 do Buforu 1, pipetując przy ściance probówki. Celem jest uniknięcie wprowadzenia pęcherzyków powietrza do linii podczas zmiany Buforu 1 na Bufor 2.
- Odczekaj, aż objętość ponownie spadnie do 5 mL i powoli dodaj kolejne 5 mL Buforu 2. Powtórz tę czynność jeszcze raz. W miarę zastępowania Buforu 1 przez Bufor 2 i rozpoczęcia dysocjacji, wątroba zacznie pęcznieć.
- Dodaj pozostały Bufor 2 do probówki, która pierwotnie zawierała Bufor 1. Zatrzymaj perfuzję, gdy w probówce pozostanie około 5-10 mL Buforu 2.
UWAGA: Podczas perfuzji wątroby Buforem 2, żyłę wrotną można okresowo zaciskać pęsetą przez 5 s. Krok ten jest opcjonalny, ale wynikający z niego wzrost ciśnienia w całej wątrobie może poprawić jej dysocjację, a tym samym zwiększyć końcową wydajność hepatocytów. - Ostrożnie wycięj wątrobę i przenieś ją do 100 mm szalki hodowlanej zawierającej 20 mL lodowatego Buforu 2, odstawionego w kroku 1.1.4.
- Pod laminarnym dygestorium delikatnie rozdrobnij wątrobę za pomocą nożyczek chirurgicznych i pęsety.
- Dodaj około 20 mL lodowatego M199 do zawiesiny hepatocytów i przefiltruj ją przez sito komórkowe 100 µm, używając tłoka strzykawki, aby delikatnie wspomóc uwalnianie dodatkowych hepatocytów z większych fragmentów wątroby.
- Przemyj 100 mm szalkę hodowlaną i sito komórkowe dodatkowym M199, aż probówka zbiorcza zostanie wypełniona.
- Wirowarkuj zawiesinę przy 50 x g przez 2 min w temperaturze 4 °C. Ostrożnie odessij nadsącz i delikatnie resuspenduj osad hepatocytów w 30 mL zimnego M199 poprzez delikatne mieszanie okrężne.
- Wykonaj pelletowanie hepatocytów zgodnie z opisem w kroku 1.2.18. Powtórz przemywanie jeszcze raz.
- Resuspenduj hepatocyty w 10 mL ciepłego M199 i określ żywotność oraz wydajność, stosując metodę wykluczania trypan blue oraz hemocytometr12.
- Rozcieńcz komórki w M199 ogrzanym do 37 ºC do końcowego stężenia 1,0 x 106 żywych komórek/mL i natychmiast rozpocznij analizę.
2. Analiza β-oksydacji kwasów tłuszczowych
UWAGA: Analizę przeprowadza się w trzech powtórzeniach, a każda mieszanina reakcyjna zawiera 750,000 komórek, 1.35 mg/mL albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 100 µM kwasu palmitynowego oraz 0.4 µCi [1-14C]kwasu palmitynowego w końcowej objętości 2 mL.
OSTROŻNIE: Związki promieniotwórcze są niebezpieczne. Nabywanie, obchodzenie się, przechowywanie i utylizację materiałów promieniotwórczych należy przeprowadzać zgodnie z przepisami instytucjonalnymi, stanowymi i federalnymi.
- Przygotowanie
- Na kilka dni przed analizą przygotować roztwory kwasu palmitynowego i BSA (Tabela 1) i przechowywać je w temperaturze -20 °C.
- W dniu analizy wykonać kroki 2.1.3-2.1.9 przed rozpoczęciem perfuzji wątroby.
- Odmrozić roztwory kwasu palmitynowego i BSA. Przygotować mieszaninę substratową dla wielu reakcji z nadmiarem 20%-30%; typowy układ analizy przedstawiono w Tabeli 2.
- Do probówek mikrocentryfużowych odmierzyć 13,5 µL roztworu BSA na każdą reakcję i ogrzać do 41 °C, a następnie dodać 1 µL 200 mM roztworu kwasu palmitynowego (stosunek molowy BSA: kwas palmitynowy = 1:5) na każdą reakcję.
UWAGA: W przypadku dozowania roztworów przygotowanych z użyciem rozpuszczalników organicznych, takich jak radioaktywne i nieradioaktywne roztwory kwasu palmitynowego, zaleca się stosowanie pipety wypierającej z odpowiednimi końcówkami. - Wigorystycznie wymieszać w wirówce typu vortex i inkubować w 41 °C, aby ułatwić tworzenie rozpuszczalnego kompleksu kwasu palmitynowego z BSA. Podczas inkubacji okresowo mieszać w vortexie.
- Mieszanina początkowo będzie mętna, ale całkowicie się wyklaruje po 20-30 min inkubacji w 41 °C. Przechowywać w 41 °C do momentu rozpoczęcia reakcji.
- Do probótek mikrocentryfużowych 1,5 mL odmierzyć 133 µL 1 M kwasu nadchlorowego w celu zatrzymania reakcji.
OSTROŻNIE: Kwas nadchlorowy jest silnym kwasem i silnym utleniaczem. Do pracy z tym związkiem wymagany jest odpowiedni sprzęt ochronny. - Do probówki odmierzyć 485,5 µL M199 na każdą reakcję i przechowywać w 37 °C, aby rozcieńczyć radioaktywny kompleks BSA: kwas palmitynowy przygotowany w krokach 2.1.4-2.1.6 przed rozpoczęciem reakcji.
- Do probótek o okrągłym dnie o pojemności 14 mL (tyle, ile jest próbek) odmierzyć 750 µL M199. Jeśli jest to wymagane, dodać inhibitory β-oksydacji kwasów tłuszczowych, takie jak etomoksyr, rotenon i antymycyna, w tym kontrolę nośnika (Tabela 2).
- Podczas etapów płukania hepatocytów, 10-15 min przed rozpoczęciem reakcji, przenieść probówki przygotowane w kroku 2.1.9 do wytrząsanej łaźni wodnej ustawionej na 37 °C i 180-200 rpm.
- Rozpoczęcie, zatrzymanie i analiza reakcji β-oksydacji kwasów tłuszczowych
- Jeśli żywotność hepatocytów jest akceptowalna (zazwyczaj ≥ 75%, Rysunek 2), dla każdej reakcji przenieść 0,8 µL [1-14C]kwasu palmitynowego (0,5 mCi/mL) do probówki mikrocentryfużowej zawierającej wyklarowany roztwór BSA: kwas palmitynowy (kroki 2.1.4-2.1.6). Wymieszać w vortexie i zwrócić do łaźni wodnej w 41 °C.
- Aby wyrównać temperaturę hepatocytów do 37 °C i poddać je preinkubacji z inhibitorami (jeśli są obecne), niezwłocznie po końcowym resuspensowaniu hepatocytów (krok 1.2.21), przenieść 750 µL zawiesiny hepatocytów pipetą 1 mL do każdej z probótek o okrągłym dnie 14 mL w wytrząsanej łaźni wodnej (kroki 2.1.9-2.1.10) i krótko wymieszać w vortexie przy niskich obrotach.
- Każde dodanie odstępować o 30 s i inkubować przez 15 min. Aby odłożyć próbkę do oznaczenia białka, przenieść kolejną porcję hepatocytów do probówki mikrocentryfużowej 1,5 mL i wirować przy 3 000 x g przez 5 min.
UWAGA: Podczas dozowania zawiesinę hepatocytów należy stale obracać lub delikatnie mieszać pipetą 1 mL, aby zapobiec sedymentacji i dużej zmienności liczby komórek między próbkami. - Usunąć nadosad i przechowywać osad w -80 °C do czasu pomiaru całkowitej ilości białka w próbce w celu normalizacji wyników (Rysunek 3).
- Podczas preinkubacji hepatocytów w 37 °C, dodać radioaktywny kompleks BSA: kwas palmitynowy do ciepłego medium z punktu 2.1.8 i przechowywać w 37 °C do rozpoczęcia reakcji. Jest to końcowa mieszanina substratowa.
- Aby rozpocząć reakcje, wyjąć hepatocyty z łaźni wodnej i dodać 500 µL mieszaniny substratowej.
- Wymieszać w vortexie przy niskich obrotach przez 5 s, aby całkowicie resuspensować komórki, i zwrócić do łaźni wodnej. Powtórzyć dla wszystkich próbek, zachowując odstępy 30 s.
- Inkubować przez 15 min. Rozpocząć zestaw reakcji i natychmiast je zatrzymać (patrz kroki 2.2.10-2.2.11), aby określić tło radioaktywności (Tabela 2).
- Przenieść dwie porcje (200-250 µL) pozostałej mieszaniny substratowej do 6 mL fiolek scyntylacyjnych i odstawić do pomiaru. Wykorzystać te pomiary do obliczenia radioaktywności odpowiadającej całkowitej liczbie nmoli kwasu palmitynowego dostępnego do utleniania w 500 µL mieszaniny substratowej.
- Aby zatrzymać reakcje, wyjąć hepatocyty z łaźni wodnej, resuspensować je w vortexie przy umiarkowanej prędkości, a następnie przenieść 400 µL zawiesiny hepatocytów do probótek mikrocentryfużowych zawierających kwas nadchlorowy.
- Natychmiast zakręcić probówki. Powtórzyć tę sekwencję dla wszystkich próbek, zachowując odstępy 30 s.
- Wigorystycznie wymieszać w vortexie probówki mikrocentryfużowe 1,5 mL, a następnie odwirować je przy 13 000 x g przez 10 min.
- Przenieść 300 µL nadosadu do 6 mL fiolki scyntylacyjnej, dodać 4 mL płynu scyntylacyjnego i zmierzyć radioaktywność w próbkach oraz w porcjach mieszaniny substratowej (krok 2.2.9) za pomocą licznika scyntylacyjnego.
OSTROŻNIE: Po wirowaniu otwierać probówki pod dygestorium, aby uniknąć wdychania 14C-CO2 powstałego w wyniku całkowitego utleniania 14C-acetylo-CoA generowanego przez β-oksydację kwasów tłuszczowych i uwalnianego w warunkach kwasowych.
| Składniki buforów/pożywek | Ilość | Stężenie końcowe | Instrukcje |
| Roztwór C | |||
| KCl | 1,79 g | 480 mM | Dopełnić wodą do 50 mL. Przechowywać w 4 °C |
| MgSO₄4 heptahydrat | 1,48 g | 120 mM | |
| KH2PO4 | 0,81 g | 119 mM | |
| Bufor Krebsa-Henseleita (KHB), bezwapniowy | |||
| NaCl | 7,0 g | 120 mM | Dodać wodę do objętości 900 ml, dostosować pH do 7,4 i uzupełnić końcową objętość do 1 l. Przechowywać w 4 °C |
| NaHCO33 | 2,0 g | 24 mM | |
| 1 M HEPES pH 7,45 | 5 mL | 5 mM | |
| Glukoza | 1 lub 2 g | 5,6 lub 11 mM | |
| Roztwór C | 10 ml | ||
| Bufor 1 | |||
| KHB | 500 ml | Wymieszać składniki i wysterylizować przez filtr. Przechowywać w temperaturze 4 °C | |
| 50 mM EGTA | 1,0 mL | 0,1 mM | |
| Bufor 2 | |||
| KHB | 500 ml | Wymieszać składniki i wysterylizować przez filtr. Przechowywać w temperaturze 4 °C | |
| 1 M CaCl22 dwuwodnotepad | 686 µL | 1,4 mM | |
| Roztwór gentamycyny | |||
| Siarczan gentamycyny | 0,5 g | 50 mg/ml | Dopełnić wodą do 10 ml i wysterylizować przez filtrację. Rozdzielić na alikwoty i przechowywać w temperaturze -20 °C |
| Roztwór kolagenazy | |||
| mieszanina kolagenazy I i II | 10 mg | 7 mg/ml | Rozpuścić całą zawartość fiolki w 1,43 ml wody. Rozdzielić na alykwooty i przechowywać w temperaturze -20 °C |
| M199 | |||
| M199 | 1 woreczek | Dodać wodę do objętości 900 ml i dostosować pH do wartości 7,2–7,4. Doprowadzić do objętości końcowej 1 l i wysterylizować przez filtrację. Przechowywać w 4 °C | |
| NaHCO33 | 2,2 g | 26 mM | |
| 1 M HEPES (klasy do hodowli komórkowych) | 25 ml | 25 mM | |
| Dodatkowa glukoza (tylko dla myszy karmionych) | 1 g | 11 mM | |
| roztwór BSA | |||
| BSA wolna od kwasów tłuszczowych | 400 mg | 20% (m/v) | Rozpuścić w 2 ml wody. Podzielić na alykwoaty i przechowywać w temperaturze -20 °C |
| Nieradioaktywny roztwór kwasu palmitynowego | |||
| Kwas palmitynowy | 103 mg | 200 mM | Rozpuścić w 2 ml etanolu, przechowywać w temperaturze -20 °C |
| 1 M kwas nadchlorowy | |||
| 70% kwas nadchlorowy | 3,5 ml | 1 M | Dopełnić wodą do objętości 40 mL. Przechowywać w temperaturze pokojowej. |
Tabela 1: Bufory, pożywki i inne roztwory wymagane do izolacji hepatocytów oraz testu β-oksydacji kwasów tłuszczowych
| Numer reakcji | M199 ± inhibitory | zawiesina hepatocytów (µL) | Mieszanina podłoży (µL) | ||||
| Objętość (µL) | Etomoksyr | ||||||
| 1 | 750 | - | Podgrzać wstępnie do 37 °C | 750 | Preinkubować w temperaturze 37 °C przez 15 min | 500 | Inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 min |
| 2 | |||||||
| 3 | |||||||
| 4 | + | ||||||
| 5 | |||||||
| 6 | |||||||
| 7 | + | Przerwij natychmiast | |||||
| 8 | |||||||
| 9 | |||||||
Tabela 2: Przykład układu eksperymentalnego dla zawiesiny hepatocytów analizowanej w trzech powtórzeniach w obecności i w nieobecności etomoksiru.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Opisana tutaj perfuzja wątroby zazwyczaj pozwala na uzyskanie 30-40 milionów komórek/wątrobę przy średniej żywotności na poziomie 80%, oszacowanej metodą wykluczania błękitu trypanu (Rysunek 2). Typowe stężenie glukozy w buforze Krebsa-Henseleit (KHB), stosowanym do przygotowania buforów perfuzyjnych 1 i 2, wynosi 11 mM. Podczas pomiaru β-oksydacji kwasów tłuszczowych w hepatocytach izolowanych z myszy na czczo, stężenie glukozy w KHB można obniżyć, aby lepiej odwzorować stan głodzenia. Jak ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Podczas perfuzji wątroby bardzo ważne jest, aby unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza, ponieważ blokują one mikronaczynia włosowate w wątrobie, uniemożliwiając lub ograniczając krążenie buforowe i ogólnie zmniejszając wydajność i żywotność hepatocytów20,21. Środki ostrożności, takie jak dokładne sprawdzenie przewodu wlotowego wypełnionego buforem przed kaniulacją IVC i unikanie podnoszenia przewodu wlotowego z rurki zawierającej bufor 1 w celu przełączenia na...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez grant National Institutes of Health R35GM119528 dla Roberty Leonardi.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| (R)-(+)-Sól sodowa Etomoxir | Tocris Bioscience | 4539/10 | |
| [1-14C]-Kwas palmitynowy, 50– 60 mCi/mmol, 0,5 mCi/ml | Amerykańskie chemikalia znakowane radioaktywnie | ARC 0172A | |
| 1 M HEPES, sterylne | Corning | 25060CI | |
| 10 µ L jednorazowe kapilary/tłoki do pipety wyporowej | Mettler Toledo | 17008604 | |
| 1000 µ L, 200 i mikro; L oraz 10 i mikro; Pipety i końcówki | |||
| Pipety | |||
| 50 ml sterylne probówki wirówkowe | CellTreat | 229421 | |
| 70% Kwas nadchlorowy | Fisher Scientific | A2296-1LB | |
| BSA, bez kwasów tłuszczowych | Fisher Scientific | BP9704100 | |
| CaCl2 dwuwodny | MilliporeSigma | 223506 | |
| D-(+)-glukoza | MiliporeSigma | G7021 | |
| EGTA | Gold Biotechnology | E-217 | |
| Etanol | Pharmco | 11000200CSPP | |
| System filtrów, 0,22 μ m Filtr PES, 500 mL, Sterile | CellTreat | 229707 | |
| Siarczan gentamycyny | Gold Biotechnology | G-400-25 | |
| HDPE, 6,5 ml fiolki scyntylacyjne | Fisher Scientific | 03-342-3 | |
| Hemocytometr | |||
| Igły podskórne 22 G, 1,5 cala | BD Biosciences | 305156 | |
| Isoflurane | VetOne | ||
| KCl | Fisher Scientific | BP366-1 | |
| KH2PO4 | MilliporeSigma | P5655 | |
| Liberase TM Research Grade | MilliporeSigma | 5401119001 | Zdefiniowana mieszanka oczyszczonej kolagenazy I i II ze średnim stężeniem termolizyny |
| M199 podłoże | MiliporeSigma | M5017 | |
| MgSO4 siedmiowodny | MilliporeSigma | M1880 | |
| Mikrowirówka | Fisher Scientific | accuSpin Micro 17 | |
| Nożyczki do mikropreparacji | Roboz Surgical Instrument Co | RS-5980 | |
| NaCl | Chem-Impex International | 30070 | |
| NaHCO3 | Acros Organics | ||
| Kwas palmitynowy | MilliporeSigma | P0500 | |
| Penicylina/streptomycyna (100x) | Gibco | 15140122 | |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS) | Cytiva Life Sciences | SH30256.01 | |
| Pipeta wyporowa MR-10, 10 i mikro; L | Mettler Toledo | 17008575 | |
| Wirówka z chłodzeniem z wkładkami do probówek stożkowych 50 ml | Eppendorf | 5810 R | |
| Probówki do hodowli polipropylenu z okrągłym dnem, 14 ml | Fisher Scientific | 14-956-9A | |
| Licznik scyntylacyjny | Perkin Elmer | TriCarb 4810 TR | |
| Koktajl ScintiVerse BD | Fisher Scientific | SX18-4 | |
| Kąpiel wodna z wytrząsaniem, pojemność 30 L, | New Brunswick Scientific | Model G76 | |
| Sterylne sitka komórkowe, 100 i mikro; | m Fisher Scientific 22363549 | ||
| Kleszcze opatrunkowe do kciuka | Roboz Surgical Instrument Co | RS-8120 | |
| Trypan Blue | Corning | 25900CI | |
| Pompa perystaltyczna o zmiennym przepływie | Fisher Scientific | 138762 | |
| Kąpiele wodne, 2– Pojemność |
Bibliografia
- Alves-Bezerra, M., Cohen, D. E. Triglyceride Metabolism in the Liver. Comprehensive Physiology. 8 (1), 1-8 (2017).
- Lopaschuk, G. D., Ussher, J. R., Folmes, C. D., Jaswal, J. S., Stanley, W. C. Myocardial fatty acid metabolism in health and disease. Physiological Reviews. 90 (1), 207-258 (2010).
- Mannaerts, G. P., van Veldhoven, P. P. Functions and organization of peroxisomal beta-oxidation. Annals of the New York Academy of Sciences. 804, 99-115 (1996).
- Kerner, J., Hoppel, C. Fatty acid import into mitochondria. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1486 (1), 1-17 (2000).
- Baker, A., et al. Peroxisomal ABC transporters: functions and mechanism. Biochemical Society Transactions. 43 (5), 959-965 (2015).
- Leonardi, R., Rehg, J. E., Rock, C. O., Jackowski, S. Pantothenate kinase 1 is required to support the metabolic transition from the fed to the fasted state. PloS One. 5 (6), 11107(2010).
- Shumar, S. A., Kerr, E. W., Fagone, P., Infante, A. M., Leonardi, R. Overexpression of Nudt7 decreases bile acid levels and peroxisomal fatty acid oxidation in the liver. Journal of Lipid Research. 60 (5), 1005-1019 (2019).
- Richert, L., et al. Gene expression in human hepatocytes in suspension after isolation is similar to the liver of origin, is not affected by hepatocyte cold storage and cryopreservation, but is strongly changed after hepatocyte plating. Drug Metabolism and Disposition: The Biological Fate of Chemicals. 34 (5), 870-879 (2006).
- Colbert, R. A., Amatruda, J. M., Young, D. A. Changes in the expression of hepatocyte protein gene-products associated with adaptation of cells to primary culture. Clinical Chemistry. 30 (12), Pt 1 2053-2058 (1984).
- Spurway, T. D., Sherratt, H. A., Pogson, C. I., Agius, L. The flux control coefficient of carnitine palmitoyltransferase I on palmitate beta-oxidation in rat hepatocyte cultures. Biochemical Journal. 323, Pt 1 119-122 (1997).
- Consitt, L. A., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator-1alpha overexpression increases lipid oxidation in myocytes from extremely obese individuals. Diabetes. 59 (6), 1407-1415 (2010).
- Lee, S. M., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. Isolation of human hepatocytes by a two-step collagenase perfusion procedure. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50615(2013).
- Lilly, K., Chung, C., Kerner, J., VanRenterghem, R., Bieber, L. L. Effect of etomoxiryl-CoA on different carnitine acyltransferases. Biochemical Pharmacology. 43 (2), 353-361 (1992).
- Yu, X. X., Drackley, J. K., Odle, J. Rates of mitochondrial and peroxisomal beta-oxidation of palmitate change during postnatal development and food deprivation in liver, kidney and heart of pigs. Journal of Nutrition. 127 (9), 1814-1821 (1997).
- Yu, X. X., Drackley, J. K., Odle, J., Lin, X. Response of hepatic mitochondrial and peroxisomal beta-oxidation to increasing palmitate concentrations in piglets. Biology of the Neonate. 72 (5), 284-292 (1997).
- Veerkamp, J. H., van Moerkerk, H. T. Peroxisomal fatty acid oxidation in rat and human tissues. Effect of nutritional state, clofibrate treatment and postnatal development in the rat. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 875 (2), 301-310 (1986).
- Hakvoort, T. B., et al. Interorgan coordination of the murine adaptive response to fasting. Journal of Biological Chemistry. 286 (18), 16332-16343 (2011).
- Sokolovic, M., et al. The transcriptomic signature of fasting murine liver. BMC Genomics. 9, 528(2008).
- Kersten, S., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor alpha mediates the adaptive response to fasting. Journal of Clinical Investigation. 103 (11), 1489-1498 (1999).
- Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. Isolation and culture of adult mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).
- Ng, I. C., et al. Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (170), e62289(2021).
- Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3917(2012).
- Fulgencio, J. P., Kohl, C., Girard, J., Pegorier, J. P. Effect of metformin on fatty acid and glucose metabolism in freshly isolated hepatocytes and on specific gene expression in cultured hepatocytes. Biochemical Pharmacology. 62 (4), 439-446 (2001).
- Leonardi, R., Rock, C. O., Jackowski, S. Pank1 deletion in leptin-deficient mice reduces hyperglycaemia and hyperinsulinaemia and modifies global metabolism without affecting insulin resistance. Diabetologia. 57 (7), 1466-1475 (2014).
- Bougarne, N., et al. PPARalpha blocks glucocorticoid receptor alpha-mediated transactivation but cooperates with the activated glucocorticoid receptor alpha for transrepression on NF-kappaB. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (18), 7397-7402 (2009).
- Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60507(2019).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
