Produkcja humanizowanej myszy poprzez przeszczepienie torebki grasicy nerkowej, wstrzyknięcie komórek CD34 + i dostarczenie cytokin

Podsumowanie

Humanizowane modele myszy zapewniają dokładniejsze odwzorowanie ludzkiego mikrośrodowiska immunologicznego. Ten manuskrypt opisuje proces, w którym te modele są tworzone poprzez przeszczep nerkowy ludzkiej grasicy, wstrzyknięcie ludzkich komórek CD34 ⁺ oraz ukierunkowane dostarczanie ludzkich transgenów cytokin w celu promowania proliferacji i różnicowania komórek CD34 ⁺.

Streszczenie

Modele zwierzęce dostarczają istotnego przekładu między badaniami biomedycznymi in vitro i in vivo. Humanizowane modele myszy stanowią pomost w reprezentacji ludzkich systemów, umożliwiając w ten sposób dokładniejsze badanie patogenezy, biomarkerów i wielu innych zapytań naukowych. W opisanej tej metodzie myszom z niedoborem odporności NOD-scid IL2Rγnull (NSG) wszczepia się autologiczną grasicę, wstrzykuje się komórki CD34 ⁺ pochodzące z wątroby, a następnie wykonuje się serię wstrzykiwanych cytokin. W przeciwieństwie do innych modeli o podobnym charakterze, opisany tutaj model promuje lepszą rekonstytucję komórek odpornościowych poprzez dostarczanie cytokin i czynników wzrostu za pośrednictwem transgenów kodowanych w wektorach opartych na DNA AAV8 lub pMV101. Co więcej, zapewnia długoterminową stabilność u myszy po rekonstytucji, których średnia długość życia wynosi 30 tygodni po wstrzyknięciu CD34 ⁺. Mamy nadzieję, że dzięki temu modelowi uda nam się zapewnić stabilną i skuteczną metodę badania immunoterapii i chorób u ludzi w modelu mysim, wykazując w ten sposób zapotrzebowanie na predykcyjne modele przedkliniczne.

Wprowadzenie

Podczas gdy modele zwierzęce pozwoliły na głębsze zrozumienie systemów komórkowych i molekularnych, wyzwaniem pozostaje wyjaśnienie zawiłości systemów specyficznych dla gatunku, takich jak odporność, fizjologia i inne obszary patologii. Zwierzęta naczelne inne niż ludzie (NHP), takie jak szympansy, były historycznie wykorzystywane do kompensowania braków w badaniach modelowych; jednak model NHP może być dość kosztowny i niedostępny, zwłaszcza że jego stosowanie zostało zakazane w Europie¹.

Po udanym zabiegu szczepienia, mysi system replikuje ludzki układ odpornościowy, czego dowodem jest ponowne zasiedlenie narządów limfatycznych. Rozwój myszy z funkcjonalnym ludzkim układem odpornościowym daje możliwość prowadzenia badań translacyjnych nad ludzką odpornością w różnych kontekstach. Myszy z niedoborem odporności wszczepione ludzkimi komórkami i tkankami, które mogą z powodzeniem replikować działający ludzki układ odpornościowy, ułatwiają badanie hematopoezy, odporności, terapii genowej², chorób zakaźnych³, cancer⁴, oraz medycyny regeneracyjnej⁵. Nasza grupa i niektórzy z naszych współpracowników opublikowali wyniki przy użyciu tego modelu, który demonstruje przedkliniczne modele czerniaka skóry⁶. Model ten jest na tyle wszechstronny, że można go zastosować w niezliczonych dziedzinach poza kontekstem badań nad czerniakiem i immunoterapią.

Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMCs) są powszechnie używane do humanizacji, ponieważ powodują solidną rekonstytucję limfocytów T, które mają ugruntowaną rolę w tolerancji immunologicznej; jednakże, ze względu na ich niski wskaźnik samoodnawiania się i wysoki wskaźnik dojrzałych komórek zaangażowanych w linię, PBMC są często zastępowane produktami opartymi na ludzkich komórkach macierzystych (HSC), które mogą pochodzić z wątroby płodu⁷. W połączeniu z tymi pochodnymi produktami HSC, dodanie implantacji ludzkiej grasicy pod kapsułkami nerkowymi myszy NSG tworzy system zdolny do wspierania rozwoju ludzkich limfocytów T. Ten model, znany jako szpik kostny-wątroba-grasica (BLT), jest bardzo korzystny, ponieważ pozwala na wieloliniową hematopoezę, edukację komórek T w autologicznej grasicy i ograniczenie HLA⁸.

Model proponowany w tym manuskrypcie to zmodyfikowany model BLT z dodatkowym dostarczaniem cytokin. Wykazano, że cytokiny prozapalne wzmacniają zdolności efektorowych komórek odpornościowych, w szczególności poprzez immunoterapie oparte na IL-15⁹. Limfocyty CD45 ⁺ obserwuje się we krwi obwodowej humanizowanych myszy (myszy Hu) około 8-12 tygodni po wstrzyknięciu ludzkich komórek CD34 ⁺, wykazując wyraźny wzrost rekonstytucji w porównaniu z krążącą krwią zwykłych myszy NSG. Wykorzystując wektor związany z adenowirusem do dostarczania ludzkich IL-3, IL-7 i GM-CSF, poziomy ludzkich komórek CD45 ⁺ wzrosły w krążeniu w porównaniu z myszami, które nie otrzymują cytokin. Dodanie cytokin DNA Combo II (SCF, FLT3, CKIT i THPO) poprawia różnicowanie limfocytów T i komórek szpikowych¹⁰. Dodanie dostarczania cytokin odróżnia tę metodę od innych modeli Hu-mysi, co potwierdzają opublikowane dane¹⁰.

Rozwój tego modelu z wrodzoną i adaptacyjną ludzką odpowiedzią immunologiczną pozwolił na opublikowanie danych dotyczących oporności na terapię i mikrośrodowiska guza¹⁰. Dostarczone laboratoria mogą uzyskać dostęp do próbek tkanek w celu zastosowania tej metody; ten model Hu-myszy ma ogromny potencjał dla innych laboratoriów do badania podobnych dziedzin, a także rozszerzania się na inne obszary immunoterapii i badań przedklinicznych.

Protokół

Wszystkie protokoły związane z wykorzystaniem zwierząt są ściśle monitorowane przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowników Instytutu Wistar (IACUC). Laboratorium przestrzega wytycznych ustalonych przez ten komitet i lekarza weterynarii prowadzącego w celu zapewnienia zdrowia, bezpieczeństwa i dobrostanu zaangażowanych zwierząt. Przed zastosowaniem tego protokołu wymagana jest zgoda lekarza weterynarii i IACUC, a poszczególne osoby mogą mieć różnice w konkretnych technikach chirurgicznych i obchodzeniu się ze zwierzętami w porównaniu z protokołem, zgodnie z zaleceniami wyżej wymienionych stron zaangażowanych w dobrostan zwierząt.

UWAGA: Próbki tkanek mogą być zamrożone do momentu, gdy będą gotowe do użycia. Dodatkowo izolację CD34⁺ można wykonać tego samego dnia lub następnego dnia, co operacja przeszczepu nerki. Informacja ta poinformuje o tym, kiedy Busulfan zostanie wstrzyknięty: jeśli zamierza się przeprowadzić zabieg chirurgiczny w tym samym dniu co izolacja, Busulfan powinien zostać wstrzyknięty prewencyjnie w celu przygotowania tkanki biorczej. Potraktuj trzydzieści samic 5-7 tygodniowych myszy NSG 30 mg/kg (100 μL, PBS 1x) świeżo przygotowanego leku zubożającego mielo; Busulfan wstrzykiwany IP 24 godziny przed zabiegiem.

1. Izolacja komórek CD34⁺

1. Przygotować roztwór wytrawiający, rozpuszczając 100 mg kolagenazy/dypazy w 50 ml RPMI1640. Użyj filtra próżniowego 0,22 μm, aby wysterylizować roztwór wytrawiający.
2. Wątroba płodu (w wieku >20 tygodni) jest dostarczana w 50 ml pożywki RPMI1640. Odessać i wyrzucić pożywkę, pozostawiając 10 ml wewnątrz probówki zawierającej wątrobę.
3. Przemyć tkankę 45 ml RPMI1640 + 100 μg/ml antybiotyku Primocin dwa razy w stożkowej probówce o pojemności 50 ml, odsysając pożywkę między każdym myciem. Upewnij się, że chusteczka osiada na dnie probówki przed odkurzeniem pożywki.
4. Umieścić sterylne sito tkankowe w sterylnej zlewce o pojemności 200 ml.
5. Przelej wątrobę płodu przez sito i użyj końcówki sterylnej plastikowej strzykawki o pojemności 10 ml do zmielenia tkanki.
6. Opłucz komórki wątroby pozostałe na sicie za pomocą 50 ml RPMI1640 + 100 μg/ml antybiotyku Primocin, a następnie 50 ml RPMI1640 pożywki kolagenazy/dyspazy (2 mg/ml). Zlewka o pojemności 200 ml zawiera teraz RPMI1640 z Primocin, RPMI1640 kolagenazą/dypazą i homogenizowaną wątrobą.
7. Podzielić mieszaninę na cztery stożkowe probówki o pojemności 50 ml i inkubować je w łaźni wodnej (37 °C) przez 1 godzinę. Wstrząsać stożkowymi probówkami co 15 minut.
8. Dodaj 15 ml Ficollu do czterech stożkowych probówek o pojemności 50 ml.
9. Ostrożnie ułóż homogenizowany roztwór wątroby na wierzchu, rozprowadzając około 35 ml między każdą probówką. Nie zakłócaj interfejsu.
10. Umieścić probówki w wirówce i wirować z prędkością 800 x g przez 1 godzinę z minimalnym przyspieszeniem/hamulcem.
11. Wyjmij probówki z wirówki i zbierz komórki z granicy faz (10-15 ml) do dwóch stożkowych probówek o pojemności 50 ml.
12. Dodać PBS 1x do 50 ml, aby przepłukać osad i odwirować przy 300 x g przez 5 minut. Wyrzucić supernatant.
13. Zawiesić osad w 10 ml buforu do lizy ACK (chlorek amonu-potasu) i inkubować przez 5-10 minut. Napełnij probówkę 1x PBS.
14. Ręcznie policz komórki pod mikroskopem za pomocą błękitu trypanowego i hemocytometru. Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 min.
    UWAGA: Komórki jednojądrzaste wątroby można wstrzykiwać bezpośrednio stąd, jeśli jest to pożądane, na przykład, jeśli liczba komórek jest mniejsza niż 50 milionów komórek.
15. Odkurzyć PBS i ponownie zawiesić osad komórek w 300 μl buforu separacyjnego (2 mM EDTA, 5 μg/ml BSA w 1x PBS) dla 100 x 10⁶ komórek lub mniej. W przypadku komórek o wymiarach więcej niż 100 x 10⁶ należy użyć stosunku opartego na powyższej liczbie komórek, aby określić ilość bufora (tj. podwój komórki, podwój bufor
).
16. Dodać 100 μl odczynnika blokującego FcR i inkubować 2-5 min.
17. Dodać 100 μl przeciwciał mikrokulek CD34, dobrze wymieszać i inkubować na lodzie przez 30 min; po 15 minutach wstrząsnąć mechanicznie ręcznie.
18. Dodać 7-10 ml buforu separacyjnego i przefiltrować przez sitka do komórek 100 μm, 70 μm i 40 μm w tej kolejności.
19. Umieść kolumnowy separator komórek w separatorze magnetycznym. Umieść stożkową rurkę o pojemności 15 ml pod separatorem, aby zebrać przepływ i bufor.
20. Napełnić kolumnę 500 μl buforu rozdzielającego.
21. Przelać zawiesinę komórek przez kolumnę.
22. Napełnić kolumnę przepływem i buforem, który został zebrany w stożkowej rurce.
23. Przemyć kolumnę 3 razy 500 μl buforu rozdzielającego.
24. Wyrzuć przepływowy i zastąp probówkę rurką z polistyrenu o pojemności 15 ml.
25. Napełnij kolumnę 1 ml buforu separacyjnego, wyjmij kolumnę z magnesu i przepłucz tłok jednym naciśnięciem.
26. Policz komórki i ponownie zawieś w 1x PBS do wstrzykiwań. Ułóż na lodzie do czasu użycia.

2. Przetwarzanie grasicy

1. Umyj autologiczną grasicę (>20 tygodnia życia), dodając 5-8 ml RPMI1640, pozwól tkance się uspokoić. Ostrożnie usunąć pożywkę za pomocą podciśnienia, unikając kontaktu z grasicą. Powtórz to jeszcze raz.
2. Zawiesić w 10 ml RPMI1640 o temperaturze pokojowej z Primocin (100 μg/ml).
3. Przenieś grasicę na szalkę Petriego poddaną działaniu tkanek. Upewnij się, że grasica jest całkowicie pokryta pożywką Primocin.
4. Inkubować przez 30-45 minut w temperaturze pokojowej.
5. Odkurzyć pożywkę Primocin. Umyj grasicę 5-8 ml RPMI1640, usuń podłoże próżniowo i powtórz to jeszcze raz.
6. Zawiesić grasicę w 5-8 ml RPMI1640.
7. Przygotować inkubowaną grasicę do szczepienia, krojąc segmenty o wymiarach 1 mm x 2 mm za pomocą dwóch skalpeli.
   UWAGA: Zostanie to wszczepione myszom; dlatego należy upewnić się, że plastry grasicy mogą być odkurzane zarówno do strzykawki, jak i z dołączonej igły Hamiltona 22 G ze względną łatwością.

3. Przeszczepienie torebki podnerkowej i wstrzyknięcie komórek CD34

1. Zbadaj myszy pod kątem ich ogólnego stanu zdrowia przed operacją. Ogol myszy, aby odsłonić obszar (około 3 "x 2") po lewej stronie ciała.
2. Znieczulenie myszy za pomocą izofluranu (indukcja 5%, utrzymanie 2%-3%) w komorze, a następnie przeniesienie pojedynczych myszy z komory do etapu chirurgicznego za pomocą stożka nosowego.
3. Zdezynfekuj ogolony obszar za pomocą chloroheksydyny i wacików nasączonych alkoholem. Zapewnić indywidualne znieczulenie za pomocą testu szczypania.
4. Wykonaj duże nacięcie (5-7 mm) z tyłu, z boku kręgosłupa myszy i odchyl skórę.
5. Upewnij się, że w tym momencie śledziona jest widoczna pod powięzią. Wykonaj mniejsze nacięcie ~2 mm w powięzi. Upewnij się, że nacięcie jest jak najmniejsze, pozwalając jednocześnie na pełne odsłonięcie nerki.
6. Określ miejsce tego nacięcia, wizualnie identyfikując śledzionę i używając jej jako markera nerki, która nie jest widoczna.
   UWAGA: Mysia nerka znajduje się za grupą tłuszczu w północno-wschodnim kwadrancie do śledziony.
7. Stąd umieść rękę (chirurga) pod bokiem myszy naprzeciwko nacięcia i popchnij, aby odsłonić nerkę. Zmień położenie tłuszczu, aby w pełni odsłonić nerki.
8. Użyj palców tej samej ręki, aby ustabilizować odsłoniętą nerkę. W razie potrzeby użyj sterylnego 1x PBS do nasmarowania odsłoniętej nerki.
   UWAGA: Ważne jest, aby pamiętać, że chirurg musi używać innych palców niż te, które obsługiwały bok myszy, aby utrzymać nerkę, aby zachować sterylność. Skonsultuj się z lekarzem weterynarii instytutu w sprawie prawidłowego utrzymania sterylności.
9. Jednocześnie pozwól asystentowi przygotować strzykawkę z tkanką grasicy płodu. Delikatnie zassać 2-3 średniej wielkości kawałki grasicy (1 mm x 2 mm) z minimalną ilością pożywki do końcówki igły, a następnie przekazać ją chirurgowi w celu wykonania zabiegu.
   UWAGA: Liczba kawałków grasicy zależy od wielkości tkanki, zwykle wystarczą 2 kawałki, aby uzyskać humanizowane myszy.
10. Pozwól chirurgowi wprowadzić igłę przez ogonowy koniec torebki nerkowej, aż do osiągnięcia dystalnego końca (~ 2 mm), do punktu, w którym igła jest widoczna, ale nie przebija się przez czaszkową stronę torebki nerkowej. Pozwól asystentowi zanurzyć strzykawkę.
11. Umieść nerkę wraz z odsłoniętym tłuszczem z powrotem w otrzewnej. Umieść jeden wchłanialny szew (rozmiar 4) i zamknij powierzchowne nacięcie klejem vet bond.
12. Po operacji należy podać dawkę leku przeciwbólowego, 25 μl buprenorfiny o przedłużonym uwalnianiu (1 mg/ml) we wstrzyknięciu podskórnym (1 mg/kg).
13. Sprawdź, czy myszy zaczynają wracać do zdrowia w ciągu 5 minut po operacji.
14. Pomiędzy klatkami zmień rękawiczki i wysterylizuj narzędzia w sterylizatorze ze szklanymi kulkami.
15. Od 1-3 godzin po zabiegu wstrzyknąć 100 μl ludzkich komórek CD34⁺ (około 100 000 komórek) myszowi we wstrzyknięciu dożylnym (IV).
16. Przeprowadź ogólną kontrolę stanu zdrowia myszy po zakończeniu operacji (zwykle 2 godziny po pierwszej klatce), a następnie 24 godziny i 48 godzin po niej.
17. Jeśli występują jakiekolwiek nieprawidłowości w dyspozycji lub parametrach życiowych, należy dalej monitorować myszy. Po usunięciu tych punktów kontrolnych monitoruj myszy mniej rygorystycznie (2x-3x w tygodniu).
18. Tydzień po zabiegu wstrzyknij (IV) myszom 100 μl ludzkiej cytokiny AAV8 (IL-3, IL-7 i GM-CSF; 2 x 10⁹ kopii genomu / ml).
19. Dwa tygodnie po zabiegu należy wykonać iniekcje domięśniowe plazmidu DNA Combo II.
    1. Użyj maszyny do elektroporacji, aby wykonać iniekcję domięśniową plazmidowego DNA Combo II: SCF, FLT3, CKIT i THPO. Dla każdej myszy połącz 25 μl SCF (2 mg/ml), 25 μl THPO (2 mg/ml), 25 μl FLT3 (2 mg/ml) i 25 μl CKIT (10 mg/ml).
    2. Wykonać jedno wstrzyknięcie na tylną nogę, tj. w sumie dwa, po 50 μl na nogę, a następnie elektroporację w każdym miejscu wstrzyknięcia.

Wyniki

Po udanym zabiegu chirurgicznym i odpowiednich zastrzykach pooperacyjnych, różnicowanie komórek CD34⁺ można potwierdzić za pomocą cytometrii przepływowej. Około 8 tygodni po operacji pobiera się krew od myszy w celu przygotowania do analizy FACS, co powtarza się co 2 tygodnie, aż do osiągnięcia określonego progu ludzkich komórek odpornościowych, zgodnie z wcześniejszym opisem¹⁰. W skrócie, 100 mL krwi zebrano do probówek do pobierania krwi powlekanych litem i heparyną. Po lizie erytrocy...

Dyskusja

W tym manuskrypcie opisano tutaj generowanie humanizowanych myszy za pomocą ludzkiej grasicy płodowej przeszczepionej pod torebką nerkową, a następnie wstrzyknięcie CD34 ⁺ w celu odtworzenia ludzkiego układu odpornościowego.

Chociaż protokół działa w celu stworzenia najlepszego możliwego modelu, pewne kroki są niezbędne do zapewnienia rentowności. Na przykład podczas izolacji CD34⁺ ważne jest, aby osoba patrząca przez mikroskop mogła zidentyfikować komórki CD34⁺

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bufor do lizy ACK	Life Technologies Corporation
BD Mikropojemnik	BD		probówki do pobierania krwi
Busulfan	Sigma	B2635-25g	Lek napromieniujący; światłoczułe
mikrogranulki CD34	Miltenyi Biotec	130-046-702	; przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C
CKIT	Aldevron	cytokine niestandardowa	; przechowywana w temperaturze -20 ° C
Diagnostyka kolagenazy/dypazy	Roche	11097113001	przechowywana w temperaturze 4 & stopni; Odczynnik
blokujący C FcR	Miltenyi Biotec	130-046-702	; przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C
Tkanka płodowa (wątroba i grasica)	Zaawansowane zasoby		Dostarczane tego samego dnia lub z dnia na dzień
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-03	Przechowywane w temperaturze pokojowej
FLT3	Aldevron	125964	cytokiny; przechowywane w temperaturze -20 ° C
Kleszcze	Różne	Różne Igła
do strzykawki Hamilton	Różne	Różne 22	G; 3 punkty; 2 "długości
Hemostatyki	Różne	Różne Kolumny
MS	Miltenyi Biotec	130-042-201	separator magnetyczny
PBS	Gibco	14190-136	Przechowywany w temperaturze pokojowej
Primocin	Invivogen	amt-pm1	antybiotyk przechowywany w temperaturze 4 & st; C
RPMI	Corning	10-040-CM	przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C
SCF	Aldevron	125962	cytokina; przechowywana w temperaturze -20 & deg; C
Nożyczki chirurgiczne	Różne	Różne
THPO	Aldevron	125963	cytokiny; przechowywane w temperaturze -20 &; C
Szalka Petriego poddana obróbce tkankowej	Corning	430167
Klej VetBond	3M	1469SB	klej
Szew Visorb	Stoelting Co	5046	, rozmiar 4, cięcie 19 mm

Zestaw kulek przeciwciał Zestaw kulek przeciwciał biologiczne Szew wchłanialny