Humanizowane modele myszy zapewniają dokładniejsze odwzorowanie ludzkiego mikrośrodowiska immunologicznego. Ten manuskrypt opisuje proces, w którym te modele są tworzone poprzez przeszczep nerkowy ludzkiej grasicy, wstrzyknięcie ludzkich komórek CD34 + oraz ukierunkowane dostarczanie ludzkich transgenów cytokin w celu promowania proliferacji i różnicowania komórek CD34 +.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Produkcja humanizowanej myszy poprzez przeszczepienie torebki grasicy nerkowej, wstrzyknięcie komórek CD34 + i dostarczenie cytokin
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Modele zwierzęce dostarczają istotnego przekładu między badaniami biomedycznymi in vitro i in vivo. Humanizowane modele myszy stanowią pomost w reprezentacji ludzkich systemów, umożliwiając w ten sposób dokładniejsze badanie patogenezy, biomarkerów i wielu innych zapytań naukowych. W opisanej tej metodzie myszom z niedoborem odporności NOD-scid IL2Rγnull (NSG) wszczepia się autologiczną grasicę, wstrzykuje się komórki CD34 + pochodzące z wątroby, a następnie wykonuje się serię wstrzykiwanych cytokin. W przeciwieństwie do innych modeli o podobnym charakterze, opisany tutaj model promuje lepszą rekonstytucję komórek odpornościowych poprzez dostarczanie cytokin i czynników wzrostu za pośrednictwem transgenów kodowanych w wektorach opartych na DNA AAV8 lub pMV101. Co więcej, zapewnia długoterminową stabilność u myszy po rekonstytucji, których średnia długość życia wynosi 30 tygodni po wstrzyknięciu CD34 +. Mamy nadzieję, że dzięki temu modelowi uda nam się zapewnić stabilną i skuteczną metodę badania immunoterapii i chorób u ludzi w modelu mysim, wykazując w ten sposób zapotrzebowanie na predykcyjne modele przedkliniczne.
Wprowadzenie
Podczas gdy modele zwierzęce pozwoliły na głębsze zrozumienie systemów komórkowych i molekularnych, wyzwaniem pozostaje wyjaśnienie zawiłości systemów specyficznych dla gatunku, takich jak odporność, fizjologia i inne obszary patologii. Zwierzęta naczelne inne niż ludzie (NHP), takie jak szympansy, były historycznie wykorzystywane do kompensowania braków w badaniach modelowych; jednak model NHP może być dość kosztowny i niedostępny, zwłaszcza że jego stosowanie zostało zakazane w Europie1.
Po udanym zabiegu szczepienia, mysi system replikuje ludzki układ odpornościowy, czego dowodem jest ponowne zasiedlenie narządów ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie protokoły związane z wykorzystaniem zwierząt są ściśle monitorowane przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowników Instytutu Wistar (IACUC). Laboratorium przestrzega wytycznych ustalonych przez ten komitet i lekarza weterynarii prowadzącego w celu zapewnienia zdrowia, bezpieczeństwa i dobrostanu zaangażowanych zwierząt. Przed zastosowaniem tego protokołu wymagana jest zgoda lekarza weterynarii i IACUC, a poszczególne osoby mogą mieć różnice w konkretnych technikach chirurgicznych i obchodzeniu się ze zwierzętami w porównaniu z protokołem, zgodnie z zaleceniami wyżej wymienionych stron zaangażowanych w dobrostan zwierząt.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Po udanym zabiegu chirurgicznym i odpowiednich zastrzykach pooperacyjnych, różnicowanie komórek CD34+ można potwierdzić za pomocą cytometrii przepływowej. Około 8 tygodni po operacji pobiera się krew od myszy w celu przygotowania do analizy FACS, co powtarza się co 2 tygodnie, aż do osiągnięcia określonego progu ludzkich komórek odpornościowych, zgodnie z wcześniejszym opisem10. W skrócie, 100 mL krwi zebrano do probówek do pobierania krwi powlekanych litem i heparyną. Po lizie erytrocy.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym manuskrypcie opisano tutaj generowanie humanizowanych myszy za pomocą ludzkiej grasicy płodowej przeszczepionej pod torebką nerkową, a następnie wstrzyknięcie CD34 + w celu odtworzenia ludzkiego układu odpornościowego.
Chociaż protokół działa w celu stworzenia najlepszego możliwego modelu, pewne kroki są niezbędne do zapewnienia rentowności. Na przykład podczas izolacji CD34+ ważne jest, aby osoba patrząca przez mikroskop mogła zidentyfikować komórki CD34+
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują, że nie mają sprzecznych interesów z tym manuskryptem.
Podziękowania
Dziękuję Wistar Flow-Cytometry, Molecular Screening, Vector Core i Animal Facility za ich wsparcie. Praca ta była możliwa dzięki wsparciu Fundacji Badań Medycznych dr Miriam i Sheldona G. Adelsonów.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Bufor do lizy ACK | Life Technologies Corporation | ||
| BD Mikropojemnik | BD | probówki do pobierania krwi | |
| Busulfan | Sigma | B2635-25g | Lek napromieniujący; światłoczułe |
| mikrogranulki CD34 | Miltenyi Biotec | 130-046-702 | ; przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C |
| CKIT | Aldevron | cytokine niestandardowa | ; przechowywana w temperaturze -20 ° C |
| Diagnostyka kolagenazy/dypazy | Roche | 11097113001 | przechowywana w temperaturze 4 & stopni; Odczynnik |
| blokujący C FcR | Miltenyi Biotec | 130-046-702 | ; przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C |
| Tkanka płodowa (wątroba i grasica) | Zaawansowane zasoby | Dostarczane tego samego dnia lub z dnia na dzień | |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-03 | Przechowywane w temperaturze pokojowej |
| FLT3 | Aldevron | 125964 | cytokiny; przechowywane w temperaturze -20 ° C |
| Kleszcze | Różne | Różne Igła | |
| do strzykawki Hamilton | Różne | Różne 22 | G; 3 punkty; 2 "długości |
| Hemostatyki | Różne | Różne Kolumny | |
| MS | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | separator magnetyczny |
| PBS | Gibco | 14190-136 | Przechowywany w temperaturze pokojowej |
| Primocin | Invivogen | amt-pm1 | antybiotyk przechowywany w temperaturze 4 & st; C |
| RPMI | Corning | 10-040-CM | przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C |
| SCF | Aldevron | 125962 | cytokina; przechowywana w temperaturze -20 & deg; C |
| Nożyczki chirurgiczne | Różne | Różne | |
| THPO | Aldevron | 125963 | cytokiny; przechowywane w temperaturze -20 &; C |
| Szalka Petriego poddana obróbce tkankowej | Corning | 430167 | |
| Klej VetBond | 3M | 1469SB | klej |
| Szew Visorb | Stoelting Co | 5046 | , rozmiar 4, cięcie 19 mm |
Bibliografia
- Fujiwara, S. Humanized mice: A brief overview on their diverse applications in biomedical research. Journal of Cellular Physiology. 233 (4), 2889-2901 (2017).
- Singh, K. S., et al. IspH inhibitors kill Gram-negative bacteria and mobilize....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
