Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Czasowo-rozdzielcze rezonansowe testy transferu energii Förstera do pomiaru endogennych fosforylowanych białek STAT w komórkach ludzkich

3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62915

⸱

9 września 2021

 ,  , 
1BioAuxilium Research

W tym artykule

Podsumowanie

Protokoły testów opartych na komórkach rezonansu rezonansu Förstera z rozdzielczością czasową są opisane dla prostej, specyficznej, czułej i solidnej kwantyfikacji endogennych fosforylowanych białek przetwornika sygnału i aktywatora transkrypcji (STAT) 1/3/4/5/6 w lizatach komórkowych w formacie 384-dołkowym.

Streszczenie

Szlak sygnałowy kinazy janusowej (JAK)/przetwornik sygnału i aktywator transkrypcji (STAT) odgrywa kluczową rolę w pośredniczeniu w odpowiedziach komórkowych na cytokiny i czynniki wzrostu. Białka STAT są aktywowane przez fosforylację tyrozyny, w której pośredniczą głównie JAK. Nieprawidłowa aktywacja szlaków sygnałowych STAT jest związana z wieloma chorobami człowieka, zwłaszcza rakiem i schorzeniami związanymi z odpornością. Dlatego możliwość monitorowania fosforylacji białek STAT w natywnym środowisku sygnalizacji komórkowej jest ważna zarówno dla badań akademickich, jak i badań nad odkrywaniem leków. Tradycyjne formaty testów dostępne do ilościowego oznaczania fosforylowanych białek STAT obejmują western blotting i test immunoenzymatyczny (ELISA). Te niejednorodne metody są pracochłonne, mało przepustowe i często nierzetelne (specyficzne) w przypadku western blottingu. Metody jednorodne (bez mycia) są dostępne, ale pozostają drogie.

Tutaj dostępne są szczegółowe protokoły dla czułych, solidnych i opłacalnych pomiarów w 384-dołkowym formacie endogennych poziomów fosforylowanych STAT1 (Y701), STAT3 (Y705), STAT4 (Y693), STAT5 (Y694/Y699) i STAT6 (Y641) w lizatach komórkowych z komórek przylegających lub zawieszonych przy użyciu nowatorskiej platformy THUNDER time-resolution Förster resonance energy transfer (TR-FRET). Przebieg pracy w teście komórkowym jest prosty, szybki i przeznaczony do wysokoprzepustowych badań przesiewowych (HTS). Protokół testu jest elastyczny, wykorzystuje próbkę o małej objętości (15 μl), wymaga tylko jednego etapu dodawania odczynnika i może być dostosowany do zastosowań o niskiej przepustowości i wysokiej przepustowości. Każdy test immunologiczny typu sandwich fosfo-STAT jest walidowany w zoptymalizowanych warunkach ze znanymi agonistami i inhibitorami i generuje oczekiwane wartości farmakologiczne i czynnika Z. Ponieważ testy TR-FRET są ratiometryczne i nie wymagają etapów mycia, zapewniają znacznie lepszą odtwarzalność niż tradycyjne podejścia. Razem ten zestaw testów zapewnia nowe, opłacalne narzędzia do bardziej kompleksowej analizy specyficznych fosforylowanych białek STAT po leczeniu komórkowym oraz badaniach przesiewowych i charakteryzacji specyficznych i selektywnych modulatorów szlaku sygnałowego JAK/STAT.

Wprowadzenie

Szlak sygnalizacyjny JAK/STAT odgrywa kluczową rolę w pośredniczeniu odpowiedzi komórkowych na różnorodne cytokiny, interferony, czynniki wzrostu i cząsteczki powiązane1,2. Wiązanie tych ligandów do specyficznych receptorów powierzchniowych komórki prowadzi do aktywacji kinaz JAK, które z kolei aktywują białka STAT poprzez fosforylację specyficznych reszt tyrozyny. Fosforylacja STAT skutkuje ich dimeryzacją i translokacją do jądra komórkowego, gdzie wpływają one na transkrypcję regulowanych genów docelowych. Rodzina STAT składa się z siedmiu członków: STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b oraz STAT6. Członkowie ci pełnią złożoną i istotną rolę w regulacji fizjologicznych procesów komórkowych, w tym proliferacji, różnicowania, apoptozy, angiogenezy i regulacji układu odpornościowego. Nieprawidłowa aktywacja szlaków sygnalizacyjnych STAT jest zaangażowana w wiele chorób ludzi, zwłaszcza w nowotwory i schorzenia związane z układem odpornościowym3,4. Dlatego zdolność do oceny fosforylacji białek STAT w naturalnym środowisku sygnalizacji komórkowej jest ważna zarówno dla badań akademickich, jak i dla badań nad odkrywaniem leków.

Do tej pory konwencjonalne metody stosowane do pomiaru wewnątrzkomórkowych poziomów fosforylowanych białek, w tym białek STAT, opierały się na przeciwciałach i obejmowały western blotting, ELISA oraz cytometrię przepływową z detekcją fosforylacji. Te heterogeniczne metody są pracochłonne, czasochłonne, podatne na błędy, charakteryzują się niską przepustowością, a w przypadku western blottingu są często niewiarygodne (np. ze względu na problemy ze swoistością)5. W przeciwieństwie do nich, testy homogeniczne wymagają mniej etapów eksperymentalnych, wykorzystują mniejsze objętości próbek i nadają się do HTS. Dostępnych jest komercyjnie pięć platform homogenicznych testów immunoenzymatycznych opartych na komórkach, które mogą być wykorzystane do ilościowego monitorowania zależnej od JAK fosforylacji białek STAT w lizatach komórkowych: SureFire, HTRF, LANCE, LanthaScreen oraz Lumit. Każda z tych platform posiada swoje zalety i wady.

SureFire opiera się na technologii luminescencyjnego kierowania tlenem (luminescent oxygen channeling technology), która wykorzystuje koraliki donorowe i akceptorowe powlekane w celu specyficznego wychwytywania pary przeciwciał, z których jedno jest biotynilowane. W obecności ufosforylowanego białka dwa przeciwciała zbliżają do siebie koraliki donorowe i akceptorowe, co umożliwia generowanie sygnału chemiluminescencyjnego6. Choć technologia ta jest wszechstronna i czuła, jest ona kosztowna, podatna na obecność biotyny w pożywce hodowlanej, bardzo wrażliwa na temperaturę otoczenia oraz światło, a do detekcji wymaga specjalistycznego czytnika. HTRF i LANCE opierają się na technologii TR-FRET, która wykorzystuje długożyciowe luminescencyjne kompleksy jonów lantanowców (chelaty europu lub terbu, lub kryptat europu) jako cząsteczki donorowe oraz fluorofory dalekiej czerwieni jako cząsteczki akceptorowe7. Gdy dwa przeciwciała specyficzne dla białka, znakowane cząsteczkami donorowymi lub akceptorowymi, zostaną zbliżone do siebie, dochodzi do zjawiska FRET, co powoduje wzrost fluorescencji akceptora i spadek fluorescencji donora. Te długotrwałe sygnały fluorescencyjne mogą być mierzone w sposób czasowo rozdzielczy i ratiometryczny, aby zredukować zakłócenia testu i zwiększyć jakość danych. Innymi zaletami TR-FRET są brak wrażliwości na światło, możliwość wielokrotnych odczytów oraz długa stabilność sygnału. Chociaż TR-FRET jest szeroko stosowany w HTS ze względu na swoją wszechstronność, czułość i wysoką odporność, wszystkie komercyjne platformy testowe oparte na TR-FRET są drogie, co ogranicza ich powszechne zastosowanie w laboratoriach akademickich i małych laboratoriach przemysłowych. Test LanthaScreen również wykorzystuje odczyt oparty na TR-FRET, ale opiera się na zmodyfikowanej linii komórkowej U2OS, która stabilnie wykazuje ekspresję białka fuzyjnego GFP-STAT1 w połączeniu z przeciwciałem anty-fosfo-STAT1 znakowanym terbem8. Oprócz ograniczeń w wyborze białek sygnałowych, metoda ta wymaga zakupu drogich transfektowanych linii komórkowych, co zmniejsza jej przydatność i zwiększa możliwość wystąpienia artefaktów eksperymentalnych. Lumit to generyczna platforma bioluminescencyjnego testu immunoenzymatycznego, która wykorzystuje przeciwciała wtórne (anty-mysie i anty-królicze) znakowane chemicznie małymi i dużymi podjednostkami NanoBit lucyferazy NanoLuc9. Wiązanie dwóch przeciwciał pierwszorzędowych do białka docelowego zbliża przeciwciała wtórne, tworząc aktywny enzym, który generuje sygnał luminescencyjny. Choć luminescencja jest zazwyczaj czułym i odpornym sposobem odczytu, wymóg stosowania przeciwciał pierwszorzędowych otrzymanych u dwóch różnych gatunków ogranicza możliwości projektowania testu. Ponadto stosowanie przeciwciał wtórnych w złożonych matrycach próbek może być podatne na zakłócenia testu.

W związku z tym nadal istnieje potrzeba stworzenia niezawodnej, szybkiej, a jednocześnie przystępnej cenowo platformy testów komórkowych do pomiaru poszczególnych ufosforylowanych i całkowitych białek STAT w sposób kompatybilny z HTS. Aby zaspokoić tę potrzebę, opracowano nową wysokoprzepustową platformę immunoanalizy komórkowej opartą na ulepszonej technologii TR-FRET (THUNDER), zaprojektowaną w celu umożliwienia prostego, czułego, stabilnego i kosztowo efektywnego pomiaru endogennie ekspresjowanych białek wewnątrzkomórkowych (ufosforylowanych lub całkowitych) w lizatach komórkowych. Zalety tej technologii wynikają z połączenia pary donor/akceptor FRET wykazującej wyjątkową kompatybilność spektralną i sygnał TR-FRET, rygorystycznie zwalidowanych przeciwciał oraz zoptymalizowanych buforów do lizy. Testy te są sformatowane jako immunoanalizy kanapkowe i wykorzystują prosty, trzyetapowy schemat postępowania (Rycina 1). Komórki są najpierw poddawane działaniu czynników modulujących fosforylację białek, a następnie lizowane przy użyciu specyficznego buforu do lizy dostarczonego w zestawie. Docelowe ufosforylowane lub całkowite białko STAT w lizacie komórkowym jest wykrywane w jednym kroku dodania odczynnika i inkubacji z parą przeciwciał znakowanych fluoroforami, które rozpoznają odrębne epitopy białka docelowego (Rycina 2). Jedno przeciwciało jest znakowane donorem w postaci chelatu europu (Eu-Ab1), natomiast drugie przeciwciało jest znakowane dalekoczerwonym fluoroforem akceptorem (FR-Ab2). Dwa znakowane przeciwciała wiążą się z białkiem w roztworze, co zbliża do siebie oba znaczniki. Pobudzenie donora w postaci chelatu europu przy 320 lub 340 nm wywołuje efekt FRET do akceptora, który emituje długotrwały sygnał TR-FRET przy 665 nm, proporcjonalny do stężenia białka docelowego (ufosforylowanego lub całkowitego) w lizacie komórkowym.

Schemat procesu analizy komórkowej: traktowanie komórek, liza komórek, detekcja białek; etapy analizy TR-FRET.
Rycina 1: Schemat działania analizy TR-FRET. Procedura składa się z trzech etapów: traktowania komórek, lizy komórek oraz detekcji białek za pomocą TR-FRET. W protokole z użyciem dwóch płytek lizaty są przenoszone na białą płytkę detekcyjną z 384 dołkami, natomiast w protokole z jedną płytką wszystkie etapy są przeprowadzane w tej samej białej płytce detekcyjnej z 384 dołkami (protokół typu all-in-one-well). Niezależnie od zastosowanego protokołu analizy, detekcja białek jest przeprowadzana w tej samej objętości całkowitej (20 µL na dołek). Skrót: TR-FRET = czasowo rozdzielony transfer energii rezonansowej Förstera. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat FRET przedstawiający wzbudzenie przy 320-340 nm i emisję przy 615 nm oraz 665 nm dla TR-FRET.
Rycina 2: Zasada kanapkowego immunoanalizy TR-FRET. jedno przeciwciało jest znakowane donorem w postaci chelatu europu (Eu-Ab1), a drugie akceptorem w postaci dalekoczerwonego małego fluoroforu (FR-Ab2). Dwa znakowane przeciwciała wiążą się specyficznie z odrębnymi epitopami białka docelowego (fosforylowanego lub całkowitego) w lizacie komórkowym, co zbliża dwa fluorofory do siebie. Wzbudzenie donora (chelatu europu) przy 320 lub 340 nm wywołuje FRET z donora na cząsteczki akceptora, które z kolei emitują sygnał przy 665 nm. Sygnał ten jest proporcjonalny do stężenia białka w lizacie komórkowym. W przypadku braku specyficznego białka docelowego, fluorofory donora i akceptora znajdują się zbyt daleko od siebie, aby doszło do zjawiska FRET. Skróty: FRET = Förster resonance energy transfer; TR-FRET = FRET z rozdzielczością czasową; Ab = przeciwciało; FR = daleka czerwień; Eu = chelat europu; P = fosforylacja. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

W niniejszym opracowaniu przedstawiono szczegółowe protokoły pomiaru w formacie 384-dołkowym wewnątrzkomórkowych poziomów fosforylowanych białek STAT1 (Y701), STAT3 (Y705), STAT4 (Y693), STAT5 (Y694/Y699) oraz STAT6 (Y641), wraz z całkowitymi poziomami STAT1, STAT3, STAT5 i STAT6 w lizatach komórek adherentnych lub zawiesinowych przy użyciu platformy THUNDER TR-FRET. Protokoły te określają etapy traktowania komórek, lizy oraz detekcji białek docelowych metodą TR-FRET z wykorzystaniem protokołu przeniesienia między dwiema płytkami lub protokołu typu „wszystko w jednym dołku” na jednej płytce. Opisane testy komórkowe są stosowane do określania profilu farmakologicznego znanych aktywatorów i inhibitorów szlaku JAK/STAT. Wykazano odporność i przydatność wybranych testów do wysokoprzepustowych przesiewów (HTS). Na koniec omówiono kluczowe eksperymenty służące optymalizacji testu wraz z zaleceniami dotyczącymi rozwiązywania problemów analitycznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Hodowla komórek

  1. Komórki należy utrzymywać w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2, hodując je w pożywce DMEM uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) (komórki HeLa i A431) lub RPMI uzupełnionej o 15% FBS (komórki U266B1). Hodowlę prowadzić do momentu osiągnięcia 70-80% konfluencji, a następnie poddać komórki trypsynizacji i przeprowadzić pasażowanie lub wykorzystać je do analiz.
    ​UWAGA: Pożywki hodowlane zawierały czerwoną fenolową. Przed przystąpieniem do analiz żadna z linii komórkowych nie była poddawana głodzeniu surowiczym.

2. Miareczkowanie stymulatora lub inhibitora przy użyciu protokołu testu dwupłytkowego z komórkami adherentnymi

UWAGA: Niniejsza procedura opisuje sposób określania potencji stymulatora lub inhibitora poprzez generowanie krzywej zależności odpowiedź-stężenie z serii rozcieńczeń badanego związku.

  1. Wysiew komórek
    1. Do płytki 96-dołkowej do hodowli tkanek w odpowiednim medium hodowlanym nanieść 50 µL komórek o wcześniej zoptymalizowanej gęstości (40 000 komórek HeLa/dołek dla STAT3 i STAT6; 75 000 komórek A431/dołek dla STAT5). Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C/5% CO2.
      UWAGA: Należy określić optymalną gęstość komórek oraz czas inkubacji hodowli.
  2. Rozcieńczenia związków testowych
    1. Przygotować pośrednie serie rozcieńczeń 2x związku(ów) testowego(ych) poprzez rozcieńczanie szeregowe (w odstępach półlogarytmicznych) w 12 dołkach polipropylenowej płytki 96-dołkowej w medium bezzserowym.
      UWAGA: W celu dokładnej oceny EC50 lub IC50 zaleca się przeprowadzenie 12-punktowej krzywej zależności odpowiedź-stężenie w odstępach półlogarytmicznych, co najmniej w duplikacie.
    2. Alternatywnie, w przypadku hydrofobowych związków testowych rozpuszczalnych w dimetylosulfotlenku (DMSO), przeprowadzić wstępne rozcieńczenia w 100% DMSO, a następnie rozcieńczyć otrzymane serie w medium bezzserowym.
      UWAGA: Przed przeprowadzeniem miareczkowania związku testowego w nośniku DMSO należy ustalić tolerancję testu na DMSO. Ważne jest zachowanie równych stężeń rozpuszczalnika w komórkach traktowanych i nietraktowanych. Ponadto, podczas testowania rozcieńczeń szeregowych związków, stężenia rozpuszczalnika powinny pozostawać stałe w całej serii rozcieńczeń.
  3. Traktowanie komórek
    1. W celu stymulacji komórek dodać 50 µL samego medium bezzserowego (komórki nietraktowane) lub medium zawierającego stymulator (2x).
    2. Inkubować przez wcześniej zoptymalizowany czas w temperaturze pokojowej (RT) lub 37 °C (interferon (IFN) α2b/20 min w RT dla STAT3; czynnik wzrostu naskórka (EGF)/10 min w RT dla STAT5; interleukina (IL)-4/20 min w RT dla STAT6). Następnie przejść do sekcji 2.4.
      UWAGA: Należy określić optymalną temperaturę inkubacji.
    3. W celu inhibicji komórek dodać 25 µL samego medium bezzserowego (komórki nietraktowane) lub medium zawierającego inhibitor (4x).
    4. Inkubować przez wcześniej zoptymalizowany czas w RT lub 37 °C (inhibitor JAK 1/30 min w RT dla STAT3 i STAT6; Erlotinib/15 min w RT dla STAT5).
    5. Dodać 25 µL samego medium bezzserowego (komórki nietraktowane) lub medium zawierającego stymulator (4x) w jego stężeniu EC80.
    6. Inkubować przez wcześniej zoptymalizowany czas w RT lub 37 °C (te same warunki co w kroku 2.3.2).
  4. Liza komórek
    1. Przygotować specyficzny dla zestawu 1x Supplemented Lysis Buffer zgodnie z instrukcją producenta.
      UWAGA: Obowiązkowe jest uzupełnienie 1x Lysis Buffer o 100x Phosphatase Inhibitor Cocktail rozcieńczony do stężenia końcowego 1x. 1x Supplemented Lysis Buffer zawiera 1 mM fluorku sodu, 2 mM ortowanadanu sodu i 2 mM beta-glicerofosforanu. Inne inhibitory fosfataz nie są wymagane i należy ich unikać. Buforów lizujących i inhibitorów fosfataz innych niż zawarte w zestawie nie zaleca się, ponieważ mogą one zawierać składniki zakłócające pomiar.
    2. Ostrożnie usunąć i odrzucić medium hodowlane poprzez aspirację supernatantu.
    3. Natychmiast dodać 50 µL 1x Supplemented Lysis Buffer.
      UWAGA: Objętość Lysis Buffer (25-50 µL) może zostać zoptymalizowana.
    4. Inkubować przez 30 min w RT podczas wytrząsania (orbitalny wytrząsarka do płytek ustawiona na 400 rpm; umiarkowane mieszanie).
      UWAGA: Czas inkubacji lizy (30-60 min) może zostać zoptymalizowany. Lizaty można wykorzystać natychmiast do detekcji białka docelowego lub zamrozić w temperaturze -80 °C.
  5. Detekcja TR-FRET
    1. Przygotować 4x Antibody Detection Mix w 1x Detection Buffer zgodnie z instrukcją producenta.
    2. W tym kroku transferu ostrożnie pipetować 15 µL lizatu komórkowego z 96-dołkowej płytki hodowlanej do dołka białej, niskobjemnościowej mikropłytki 384-dołkowej.
    3. Do oddzielnych dołków testowych dodać 15 µL Positive Control Lysate oraz 15 µL 1x Lysis Buffer (kontrola negatywna).
    4. Do każdego z dołków testowych dodać 5 μL 4x Antibody Detection Mix (Eu-Ab1/FR-Ab2 dla detekcji białka fosforylowanego lub Eu-Ab3/FR-Ab4 dla detekcji białka całkowitego).
    5. Przykryć płytkę uszczelniaczem i inkubować od 1 h do całej nocy w RT, w zależności od testu (patrz odpowiednia karta danych technicznych).
      UWAGA: Optymalny czas odczytu musi zostać zoptymalizowany dla każdego testu i linii komórkowej. Płytkę można odczytywać kilkukrotnie bez negatywnego wpływu na wyniki testu.
    6. Zdjąć klejący uszczelniacz i odczytać płytkę na czytniku mikropłytek kompatybilnym z TR-FRET.
      UWAGA: Zaleca się stosowanie fluorometrów opartych na filtrach, choć można używać niektórych urządzeń z monochromatorem. Należy upewnić się, że zainstalowany jest odpowiedni moduł optyczny (filtry i lustro) dla TR-FRET. Do wzbudzenia chelatu europu użyć długości fali wzbudzenia 320 lub 340 nm. Testy odczytywać przy 615 nm (lub 620 nm) oraz 665 nm, aby odpowiednio wykryć emisję z donora (europu) oraz akceptora (fluoroforu). Ustawienia instrumentu będą zależeć od konkretnego czytnika. Dane przedstawione tutaj uzyskano przy użyciu wzbudzenia lampowego, opóźnieniu 90 µs, czasie integracji 300 µs i 100 błyskach na dołek. Test phospho-STAT4 był jednak odczytywany przy użyciu wzbudzenia laserowego w celu uzyskania wyższych stosunków sygnału do tła (S/B).

3. Miareczkowanie stymulatora lub inhibitora przy użyciu protokołu testu dwupłytkowego z komórkami w zawiesinie

  1. Rozcieńczanie związków testowych
    1. Przygotować pośrednie szeregi rozcieńczeń 2x związku (związków) testowych zgodnie z opisem w krokach 2.2.1 i 2.2.2.
  2. Wysiew i traktowanie komórek
    1. Nanieść 20 µL komórek o zoptymalizowanej wcześniej gęstości (200 000 komórek U266B1/dołek dla STAT1; 400 000 komórek U266B1/dołek dla STAT4) do płytki 96-dołkowej do hodowli tkanek w odpowiednim medium hodowlanym. Przejść bezpośrednio do traktowania komórek lub inkubować przez 2-4 h w temperaturze 37 °C, 5% CO2.
      UWAGA: Krok ten wymaga optymalizacji dla różnych typów komórek.
    2. W przypadku stymulacji komórek dodać 20 µL samego medium bezsurowiczego (komórki nietraktowane) lub medium zawierającego stymulator (2x).
    3. Inkubować przez zoptymalizowany wcześniej czas w temperaturze pokojowej (RT) lub 37 °C (IFNα2b/15 min w RT dla STAT1; IFNα2b/25 min w 37 °C dla STAT4). Następnie przejść do sekcji 3.3.
      UWAGA: Należy określić optymalną temperaturę inkubacji.
    4. W przypadku inhibicji komórek dodać 10 µL samego medium bezsurowiczego (komórki nietraktowane) lub medium zawierającego inhibitor (4x).
    5. Inkubować przez zoptymalizowany wcześniej czas w temperaturze RT lub 37 °C (JAK Inhibitor 1/30 min w RT dla STAT1 i STAT4).
    6. Dodać 10 µL samego medium bezsurowiczego (komórki nietraktowane) lub medium zawierającego stymulator (4x) w stężeniu EC80.
    7. Inkubować przez zoptymalizowany wcześniej czas w temperaturze RT lub 37 °C (według tych samych warunków, co w kroku 3.2.3).
  3. Liza komórek
    1. Przygotować specyficzny dla zestawu 5x Suplementowany Bufor Lizujący zgodnie z instrukcją producenta.
      UWAGA: Obowiązkowe jest suplementowanie 5x Buforu Lizującego koktajlem 100x Phosphatase Inhibitor Cocktail rozcieńczonym do stężenia końcowego 5x. 5x Suplementowany Bufor Lizujący zawiera 5 mM fluorku sodu, 10 mM ortowanadanu sodu i 10 mM beta-glicero-fosforanu. Inne inhibitory fosfataz nie są wymagane i należy ich unikać.
    2. Dodać 10 µL 5x Suplementowanego Buforu Lizującego.
    3. Inkubować przez 30 min w RT z wytrząsaniem (orbitalny wytrząsarka do płytek ustawiona na 400 rpm; umiarkowane mieszanie).
      ​UWAGA: Czas inkubacji lizy (30-60 min) może zostać zoptymalizowany. Lizaty można wykorzystać natychmiast do detekcji białka docelowego lub zamrozić w temperaturze -80 °C.
  4. Detekcja TR-FRET
    1. Po lizie komórek przeprowadzić etap detekcji TR-FRET zgodnie z opisem w sekcji 2.5 dla protokołu analizy z dwiema płytkami dla komórek przylegających.

4. Miareczkowanie stymulatora przy użyciu protokołu testu jednopłytkowego z komórkami adherentnymi lub w zawiesinie

  1. Rozcieńczanie związków testowych
    1. Przygotować serie rozcieńczeń pośrednich związku/związków testowych w stężeniu 3x, wykonując rozcieńczenia szeregowe (w odstępach półlogarytmicznych) w 12 dołkach polipropylenowej płytki 96-dołkowej w medium bezzれたkowym.
  2. Wysiew i traktowanie komórek
    1. Do białej płytki analitycznej 384-dołkowej o niskiej objętości dozować 8 µL komórek o zoptymalizowanej gęstości (160 000 komórek U266B1/dołek dla STAT4; 80 000 komórek HeLa/dołek dla STAT6) w odpowiednim bezzatkanym medium hodowlanym. Przejść bezpośrednio do traktowania komórek lub inkubować przez 2-4 h w temperaturze 37 °C, 5% CO2.
      UWAGA: Konieczność zastosowania okresu inkubacji hodowli komórkowej przed traktowaniem musi zostać określona dla różnych typów komórek.
    2. W celu stymulacji komórek dodać 4 µL samego medium bezzatkanego (komórki nietraktowane) lub medium zawierającego stymulator (3x).
    3. Inkubować przez zoptymalizowany czas w temperaturze pokojowej lub 37 °C (IFNα2b/25 min w 37°C dla STAT4; IL-4/20 min w 37°C dla STAT6). Następnie przejść do sekcji 4.3.
  3. Liza komórek
    1. Przygotować specyficzny dla zestawu 5x Supplemented Lysis Buffer zgodnie z instrukcjami producenta.
      UWAGA: Obowiązkowe jest uzupełnienie 5x Lysis Buffer za pomocą 100x Phosphatase Inhibitor Cocktail rozcieńczonego do końcowego stężenia 5x.
    2. Dodać 3 µL 5x Supplemented Lysis Buffer.
    3. Inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej przy wytrząsaniu (orbitalny wytrząsarka do płytek z prędkością 400 rpm).
      UWAGA: Czas inkubacji lizy (30-60 min) może zostać zoptymalizowany. Lizaty można wykorzystać natychmiast lub zamrozić w temperaturze -80 °C.
  4. Detekcja TR-FRET
    1. Do oddzielnych dołków analitycznych dodać 15 µL lizatu kontroli dodatniej (nierozcieńczonego) oraz 15 µL 1x Supplemented Lysis Buffer (kontrola ujemna).
    2. Do każdego z dołków analitycznych dodać 5 µL 4x Antibody Detection Mix (Eu-Ab1/FR-Ab2 dla białka fosforylowanego lub Eu-Ab3-/FR-Ab4 dla białka całkowitego) przygotowanego w 1x Detection Buffer.
    3. Przykryć płytkę folią uszczelniającą i inkubować w temperaturze pokojowej od 1 h do całej nocy, w zależności od analizy.
      UWAGA: Optymalny czas odczytu musi zostać zoptymalizowany dla każdej analizy i linii komórkowej. Płytkę można odczytywać kilkakrotnie bez negatywnego wpływu na wyniki analizy.
    4. Zdjąć samoprzylepną folię uszczelniającą. Odczytać płytkę na czytniku mikro płytek kompatybilnym z TR-FRET.

5. Analiza danych

  1. Oblicz stosunek TR-FRET dla każdej studzienki, korzystając z następującego wzoru (1):
    Wzór na stosunek: (Sygnał przy 665 nm)/(Sygnał przy 615 nm) x 1,000; analiza danych optycznych. (1)
    UWAGA: Ponieważ sygnał TR-FRET jest odczytywany w trybie czasowo rozdzielczym, odejmowanie tła zazwyczaj nie jest konieczne. Jeśli odejmowanie tła jest przeprowadzane, do tego celu należy wykorzystać studzienki bez komórek zawierające 1x Supplemented Lysis Buffer (kontrola negatywna). Wyznacz średni stosunek TR-FRET ze studni bez komórek, a następnie odejmij tę wartość od stosunku TR-FRET każdej studzienki.
  2. W przypadku krzywych zależności odpowiedzi od stężenia, przeanalizuj dane za pomocą regresji nieliniowej z wykorzystaniem równania logistycznego 4-parametrowego (sigmoidalna krzywa zależności odpowiedzi od dawki ze zmiennym nachyleniem) oraz ważenia danych 1/Y2 w celu wygenerowania wartości EC50 lub IC50.
  3. Dla eksperymentu z wyznaczeniem współczynnika Z', przeanalizuj dane zgodnie z następującym wzorem (2)10
    Wzór na współczynnik Z' dla jakości testu; statystyczna metoda oceny dla przesiewania wysokoprzepustowego. (2)
    Gdzie µ i σ oznaczają odpowiednio wartości średnie i odchylenia standardowe dla kontroli dodatniej (p; komórki stymulowane) oraz kontroli negatywnej (n; komórki nieleczone).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Każdy test THUNDER TR-FRET został zwalidowany farmakologicznie poprzez traktowanie komórek adherentnych (HeLa lub A431) lub zawiesinowych (U266B1) specyficznymi aktywatorami lub inhibitorami szlaku JAK/STAT, a następnie pomiar poziomu specyficznych form fosforylowanych i całkowitych białek STAT, jeśli było to dotyczyło. Testy przeprowadzono w formacie 384-dołkowym, stosując protokół przeniesienia między dwiema płytkami oraz uprzednio zoptymalizowane warunki testowe. Rysunek 3,

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W porównaniu z konwencjonalnymi metodami analizy fosfoprotein, takimi jak western blotting i metody oparte na ELISA, przebieg pracy w teście komórkowym THUNDER TR-FRET jest prosty i szybki, wykorzystuje próbkę o małej objętości (15 μl), jest przeznaczony do HTS w formacie 384-dołkowym i jest wysoce podatny na automatyzację. Protokół testowy jest elastyczny i można go łatwo dostosować zarówno do zastosowań o średniej, jak i wysokiej przepustowości. Testy można przeprowadzać przy użyciu protokołu transferu z dwiema płytkam...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Konkurencyjne interesy: Jaime Padros, Mireille Caron i Geneviève Chatel są pracownikami firmy BioAuxilium Research, która produkuje zestawy testowe THUNDER TR-FRET używane w tym badaniu. Ponadto Jaime Padros i Mireille Caron są udziałowcami BioAuxilium Research. Nie ma to wpływu na przestrzeganie przez autorów wszystkich zasad JoVE dotyczących udostępniania danych i materiałów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
96-dołkowa mikropłytka, przezroczysta, z płaskim dnem, polistyren, poddana działaniu kultur tkankowych, sterylnaCorning3595Jest to płytka do hodowli komórek przy użyciu protokołu testu dwupłytkowego. Inne 96-dołkowe płytki do hodowli komórkowych mogą być używane
384-dołkowe mikropłytki, białe, o małej objętościPerkinElmer6007290Jest to płytka do wykrywania TR-FRET podczas korzystania z protokołów testów dwu- lub jednopłytkowych. Można stosować inne białe płytki 384-dołkowe o małej objętości
Linia komórkowa A431ATCCCRL-1555
Samoprzylepna uszczelka mikropłytkowaPerkinElmer6050185
DMSOFisherD159-4
Dulbecco' s zmodyfikowany Eagle medium (DMEM)Żubr319-005-CL THUNDER TR-FRET jest kompatybilny z pożywką zawierającą czerwień fenolową
Czytnik płytek EnVision Xcite MultilabelPerkinElmer2104-0020ATesty można wykonywać na różnych czytnikach płytek wyposażonych w opcję TR-FRET
Chlorowodorek erlotynibuKolby poddane
FalconFisher13-680-65
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Żubr098-150
Linia komórkowa HeLaATCCCCL-2
JAK Inhibitor 1Cayman Chemical15146
Wytrząsarka orbitalnaDostępnych jest wiele opcjiNie dotyczy
Rekombinowany ludzki EGFPeproTechAF-100-15
Rekombinowany ludzki IFN&alfa; 2bProSpecCYT-460
Rekombinowana ludzka IL-4R& D Systems204-IL
Roswell Park Memorial Institute 1640 pożywka (RPMI)Żubel350-007-CLTHUNDER TR-FRET jest kompatybilny z pożywką hodowlaną zawierającą czerwień fenolową
THUNDER Phospho-STAT1 (Y701) + Total STAT1 TR-FRET Zestaw do oznaczania sygnalizacji komórkowejBioAuxiliumResearch KIT-STAT1PT-500
THUNDER Phospho-STAT3 (Y705) + zestaw do oznaczania całkowitej sygnalizacji komórkowej STAT3 BadaniaBioAuxiliumKIT-STAT3PT-500
THUNDER Phospho-STAT4 (Y693) Zestaw do testowania sygnalizacji komórkowej TR-FRET Zestawbadawczy BioAuxiliumBAt-STAT4P-500
THUNDER Phospho-STAT5 (Y694/Y699) + Zestaw do oznaczania sygnalizacji komórkowej Total STAT5 TR-FRET Zestawbadawczy BioAuxiliumSTAT5PT-500
THUNDER Phospho-STAT6 (Y641) + Zestaw do oznaczania sygnalizacji komórkowej Total STAT6 TR-FRET Zestawbadawczy BioAuxiliumSTAT6PT-500
Trypsyna / EDTA 0,05%Żubr325-542-CL
Linia komórkowa U266B1ATCCTIB-196
Woda ultraczystaNANA Użyjwody klasy Milli-Q (18 MΩ. cm) do rozcieńczania buforu do lizy i buforu detekcyjnego
hodowli tkankowej Sigma CDS022564

Bibliografia

  1. Villarino, A., Kanno, Y., O'Shea, J. Mechanisms and consequences of Jak-STAT signaling in the immune system. Nature Immunology. 18 (4), 374-384 (2017).
  2. Hammarén, H. M., Virtanen, A. T., Raivola, J., Silvennoinen, O. The regulation of JAKs in cytokine signaling and its breakdown in disease. Cytokine. 118, 48-63 (2019).
  3. O'Shea, J. J., et al. The JAK-STAT pathway: impact on human disease and therapeutic intervention. Annual Review of Medicine. 66, 311-328 (2015).
  4. Verhoeven, Y., et al. et al. potential and controversy of targeting STAT family members in cancer. Seminars in Cancer Biology. 60 (2), 41-56 (2020).
  5. Gilda, J. E., et al. et al. blotting inaccuracies with unverified antibodies: need for a Western blotting minimal reporting standard (WBMRS). PLoS One. 10 (8), 0135392(2015).
  6. Binder, C., et al. et al. and utilization of the SureFire phospho-STAT5 assay for a cell-based screening campaign. Assay and Drug Development Technologies. 6 (1), 27-37 (2008).
  7. Ayoub, M. A., et al. Homogeneous time-resolved fluorescence-based assay to monitor extracellular signal-regulated kinase signaling in a high-throughput format. Frontiers in Endocrinology. 5, 94(2014).
  8. Robers, M. B., Machleidt, T., Carlson, C. B., Bi, K. Cellular LanthaScreen and beta-lactamase reporter assays for high-throughput screening of JAK2 inhibitors. Assay and Drug Development Technologies. 6 (4), 519-529 (2008).
  9. Hwang, B., Engel, L., Goueli, S. A., Zegzouti, H. A. Homogeneous bioluminescent immunoassay to probe cellular signaling pathway regulation. Communications Biology. 3 (8), 1-12 (2020).
  10. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high-throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  11. Osmond, R. I. W., Das, S., Crouch, M. F. Development of cell-based assays for cytokine receptor signaling, using an AlphaScreen SureFire assay format. Analytical Biochemistry. 403 (1-2), 94-101 (2010).
  12. Haan, C., et al. Jak1 has a dominant role over Jak3 in signal transduction through γc-containing cytokine receptors. Chemistry & Biology. 18 (3), 314-323 (2011).
  13. Kim, Y., Apetri, M., Luo, B., Settleman, J. E., Anderson, K. S. Differential effects of tyrosine kinase inhibitors on normal and oncogenic EGFR signaling and downstream effectors. Molecular Cancer Research. 13 (4), 765-774 (2015).
  14. Qian, J., et al. Comparison of two homogeneous cell-based kinase assays for JAK2 V617F: SureFire pSTAT5 and GeneBLAzer fluorescence resonance energy transfer assays. ASSAY and Drug Development Technologies. 10 (2), 212-217 (2012).
  15. Iversen, P. W., et al. HTS assay validation. Assay Guidance Manual. Markossian, S., et al. , Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. Bethesda (MD). (2012).
  16. Muelas, M. W., Ortega, F., Breitling, R., Bendtsen, C., Westerhoff, H. V. Rational cell culture optimization enhances experimental reproducibility in cancer cells. Scientific Reports. 8, 3029(2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Testy TR-FRETszlak JAK-STATFRET z rozdzielczością czasowąwysokoprzepustowe przesiewanieimmunoassay z lizatu komórkowegodetekcja fosfo-STATtransdukcja sygnałumieszanina detekcyjna przeciwciałczytnik mikropłytek
Czasowo-rozdzielcze rezonansowe testy transferu energii Förstera do pomiaru endogennych fosforylowanych białek STAT w komórkach ludzkich
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.