Artykuł metodologiczny

Rejestrowanie aktywności sieci w obwodach nocyceptywnych rdzenia kręgowego za pomocą układów mikroelektrod

3.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62920

⸱

9 lutego 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Biomedical Sciences and Pharmacy, University of Newcastle, 2School of Electrical Engineering, University of Newcastle

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiono połączone użycie technologii matryc mikroelektrod i stymulacji chemicznej indukowanej 4-aminopirydyną do badania aktywności nocyceptywnej na poziomie sieci w rogu grzbietowym rdzenia kręgowego.

Streszczenie

Role i połączenia określonych typów neuronów w obrębie rogu grzbietowego rdzenia kręgowego (DH) są wyznaczane w szybkim tempie, aby zapewnić coraz bardziej szczegółowy obraz obwodów leżących u podstaw przetwarzania bólu kręgosłupa. Jednak wpływ tych połączeń na szerszą aktywność sieci w DH pozostaje mniej dobrze poznany, ponieważ większość badań koncentruje się na aktywności pojedynczych neuronów i małych mikroukładów. Alternatywnie, zastosowanie układów mikroelektrod (MEA), które mogą monitorować aktywność elektryczną w wielu komórkach, zapewnia wysoką rozdzielczość przestrzenną i czasową aktywności neuronalnej. W tym miejscu opisano zastosowanie MEA z mysimi wycinkami rdzenia kręgowego do badania aktywności DH indukowanej przez chemiczną stymulację obwodów DH za pomocą 4-aminopirydyny (4-AP). Wynikająca z tego aktywność rytmiczna jest ograniczona do powierzchownej DH, stabilnej w czasie, blokowanej przez tetrodotoksynę i może być badana w różnych orientacjach warstw. Preparat ten stanowi platformę do badania aktywności obwodu DH w tkankach pochodzących od zwierząt naiwnych, zwierzęcych modeli przewlekłego bólu oraz myszy z genetycznie zmienioną funkcją nocyceptywną. Co więcej, zapisy MEA w wycinkach rdzenia kręgowego stymulowanych przez 4-AP mogą być wykorzystane jako szybkie narzędzie przesiewowe do oceny zdolności nowych związków antynocyceptywnych do zakłócania aktywności rdzenia kręgowego DH.

Wprowadzenie

Role specyficznych typów hamujących i pobudzających interneuronów w rdzeniu kręgowym DH są odkrywane w szybkim tempie1,2,3,4. Razem interneurony stanowią ponad 95% neuronów w DH i biorą udział w przetwarzaniu sensorycznym, w tym nocycepcji. Co więcej, te obwody interneuronowe są ważne dla określenia, czy sygnały obwodowe wznoszą się przez oś neuroosi, aby dotrzeć do mózgu i przyczyniają się do percepcji bólu5,6,7. Do tej pory większość badań dotyczyła roli neuronów DH na poziomie analizy pojedynczej komórki lub całego organizmu, wykorzystując kombinacje elektrofizjologii wewnątrzkomórkowej in vitro, znakowania neuroanatomicznego i analizy behawioralnej in vivo1,3,8,9,10,11,12,13,14. Podejścia te znacznie poszerzyły wiedzę na temat roli określonych populacji neuronów w przetwarzaniu bólu. Pozostaje jednak luka w zrozumieniu, w jaki sposób określone typy komórek i małe makroobwody wpływają na duże populacje neuronów na poziomie mikroukładów, aby następnie kształtować wynik DH, reakcje behawioralne i doświadczenie bólu.

Jedną z technologii, która może badać makro-obwody lub funkcje na poziomie wielokomórkowym, jest tablica mikroelektrod (MEA)15,16. MEA są używane do badania funkcji układu nerwowego od kilkudziesięciu lat17,18. W mózgu ułatwiły one badanie rozwoju neuronów, plastyczności synaptycznej, badań farmakologicznych i testów toksyczności17,18. Mogą być stosowane zarówno do zastosowań in vitro, jak i in vivo, w zależności od rodzaju MEA. Co więcej, rozwój MEA szybko ewoluował, a obecnie dostępne są różne numery elektrod i konfiguracje19. Kluczową zaletą MEA jest ich zdolność do jednoczesnej oceny aktywności elektrycznej w wielu neuronach z dużą dokładnością przestrzenną i czasową za pomocą wielu elektrod15,16. Zapewnia to szerszy odczyt tego, w jaki sposób neurony oddziałują w obwodach i sieciach, w warunkach kontrolnych i w obecności lokalnie stosowanych związków.

Jednym z wyzwań związanych z przygotowaniami in vitro DH jest to, że ciągły poziom aktywności jest zazwyczaj niski. W tym przypadku wyzwanie to jest rozwiązywane w obwodach DH rdzenia kręgowego przy użyciu bramkowanego napięciem blokera kanału K+, 4-aminopryidyny (4-AP), do chemicznej stymulacji obwodów DH. Lek ten był wcześniej stosowany do ustalenia rytmicznej synchronicznej aktywności elektrycznej w DH ostrych wycinków rdzenia kręgowego oraz w ostrych warunkach in vivo20,21,22,23,24. W eksperymentach tych wykorzystano jednokomórkowy zapis plamowy i zewnątrzkomórkowy lub obrazowanie wapnia w celu scharakteryzowania aktywności indukowanej przez 4-AP20,21,22,23,24,25. Łącznie prace te wykazały zapotrzebowanie na pobudzające i hamujące przekaźnictwo synaptyczne i synapsy elektryczne dla rytmicznej aktywności indukowanej przez 4-AP. W związku z tym odpowiedź 4-AP była postrzegana jako podejście, które demaskuje natywne polisynaptyczne obwody DH o znaczeniu biologicznym, a nie jako epifenomen wywołany przez lek. Co więcej, aktywność indukowana przez 4-AP wykazuje podobny profil odpowiedzi na leki przeciwbólowe i przeciwpadaczkowe jak stany bólu neuropatycznego i została wykorzystana do zaproponowania nowych celów leków przeciwbólowych opartych na rdzeniu, takich jak connexins20,21,22.

Tutaj opisany jest preparat, który łączy MEA i chemiczną aktywację rdzeniowego DH za pomocą 4-AP w celu zbadania tego obwodu nocyceptywnego na poziomie makro-obwodu, czyli na poziomie analizy sieci. Podejście to zapewnia stabilną i powtarzalną platformę do badania obwodów nocyceptywnych w naiwnych i neuropatycznych warunkach "podobnych" do bólu. Preparat ten jest również łatwo stosowany do testowania działania znanych leków przeciwbólowych na poziomie obwodu oraz do badań przesiewowych nowych leków przeciwbólowych w nadpobudliwym rdzeniu kręgowym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Badania przeprowadzono na samcach i samicach myszy c57Bl/6 w wieku od 3 do 12 miesięcy. Wszystkie procedury eksperymentalne zostały wykonane zgodnie z wytycznymi Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Etyki Uniwersytetu w Newcastle (protokoły A-2013-312 oraz A-2020-02).

1. Elektrofizjologia in vitro

  1. Przygotowanie roztworów do preparacji i rejestracji skrawków rdzenia kręgowego
    1. Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy
      ​UWAGA: Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (aCSF) jest stosowany w komorze inkubacyjnej do inkubacji na styku faz, w której skrawki są przechowywane do momentu rozpoczęcia rejestracji, a podczas eksperymentów służy zarówno jako perfuzat, jak i rozcieńczalnik dla leków. Szczegółowy skład przedstawiono w Tabeli 1.
Odczynnik chemicznyaCSF (mM)aCSF (g/10 mL)aCSF z substytucją sacharozą (mM)aCSF z substytucją sacharozą (g/10 mL)aCSF z wysoką zawartością potasu (mM)aCSF z wysoką zawartością potasu (g/10 mL)
Chlorek sodu (NaCl)180.690--1180.690
Wodorowęglan sodu (NaHCO3)250.210250.210250.210
Glukoza100.180100.180100.180
Chlorek potasu (KCl)2.50.0192.50.0194.50.034
Dwuwodowodoreczfosforan sodu (NaH2PO4)10.01210.01210.012
Chlorek magnezu (MgCl2)10.0110.0110.01
Chlorek wapnia (CaCl2)2.50.0282.50.0282.50.028
Sacharoza--2508.58--

Tabela 1: Składy sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego. Skrót: aCSF = sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy.

  1. Przygotować aCSF zawierający (w mM) 18 NaCl, 25 NaHCO3, 10 glukozy, 2,5 KCl, 1 NaH2PO4, 1 MgCl2 oraz 2,5 CaCl2, dodając wymagane ilości powyższych składników, z wyłączeniem CaCl2, do 2 L wody destylowanej.
  2. Przedmuchać powyższy roztwór karbogenem (95% O2, 5% CO2) przez 5 min, a następnie dodać CaCl2.
    UWAGA: Ten krok zapobiega wytrącaniu się CaCl2, tzn. roztwór nie powinien stać się mętny. W celu aplikacji leków podczas eksperymentów, rozcieńczyć roztwory zapasowe leków w aCSF do pożądanych stężeń końcowych.
  1. Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy z substytucją sacharozy
    UWAGA: aCSF z substytucją sacharozy jest stosowany podczas sekcji i krojenia rdzenia kręgowego. Zgodnie z nazwą, NaCl zastąpiono sacharozą, aby zredukować pobudzenie neuronów podczas tych procedur, zachowując jednocześnie osmolarność. Szczegółowy skład znajduje się w Tabeli 1.
    1. Przygotować aCSF z substytucją sacharozy zawierający (w mM) 250 sacharozy, 25 NaHCO3, 10 glukozy, 2,5 KCl, 1 NaH2PO4, 1 MgCl2 oraz 2,5 CaCl2, dodając wymagane ilości wszystkich powyższych składników, z wyjątkiem CaCl2, do 30 mL wody destylowanej.
    2. Napowietrzać roztwór karbogenem przez 5 min, a następnie dodać CaCl2.
    3. Przechowywać roztwór w zamrażarce w temperaturze -80 °C przez około 40 min lub do momentu, aż roztwór zmieni się w zawiesinę. Należy unikać całkowitego zamrożenia i używać roztworu, gdy ma on konsystencję zawiesiny.
  1. Przygotowanie matrycy mikroelektrod
    UWAGA: Powierzchnia styku MEA wymaga wstępnej obróbki w celu nadania jej właściwości hydrofilowych.
    1. Przed rozpoczęciem eksperymentu wypełnij dołek MEA surowicą bydlęcą z płodu (FBS) lub surowicą końską (HS) na 30 min.
    2. Usuń FBS lub HS i dokładnie wypłucz MEA, wykonując około pięciu płukań wodą destylowaną, aż woda przestanie się pienić. Wypełnij dołek gotowym do użycia roztworem aCSF.
  2. Przygotowanie ostrych skrawków rdzenia kręgowego
    UWAGA: Przygotowanie skrawków rdzenia kręgowego myszy przebiega zgodnie z wcześniejszym opisem Smitha i współpracowników2. Idealnie, usunięcie zgrubienia lędźwiowo-krzyżowego powinno zająć nie więcej niż 8-10 min (kroki 1.3.2-1.3.1 poniżej).
    1. Głęboko znieczul mysz dawką 10 mg/kg ketaminy (i.p.), a następnie uderz ją w głowę (dekapitacja) za pomocą dużych nożyc chirurgicznych.
    2. Usuń skórę z obszaru brzusznego, wykonując niewielkie nacięcie w skórze na poziomie bioder. Odciągnij skórę po obu stronach nacięcia w kierunku rostralnym, aż zostanie usunięta cała skóra, tj. od górnej części klatki piersiowej do górnej części miednicy (zarówno brzusznie, jak i grzbietowo).
    3. Umieść ciało na lodzie i zastosuj dostęp brzuszny, aby odsłonić kręgosłup, usuwając wszystkie wnętrzności i przecinając żebra bocznie od mostka.
    4. Usuń brzuszną część klatki piersiowej, obie łopatki (odcięte mniej więcej na poziomie T2) oraz kończyny dolne i miednicę (odcięte mniej więcej na górnej krawędzi kości krzyżowej).
    5. Przenieś preparat kręgosłupa i klatki piersiowej do kąpieli sekcyjnej zawierającej lodowaty aCSF z sacharozą. Przypnij wszystkie cztery narożniki preparatu (powierzchnią brzuszną do góry), wbijając szpilki przez mięśnie dolnego grzbietu i przymocowane górne żebra.
    6. Usuń kleszczykami kostnymi wszystkie mięśnie i tkankę łączną pokrywającą powierzchnię brzuszną kręgów i zidentyfikuj region kręgowy nad zgrubieniem lędźwiowo-krzyżowym, który znajduje się mniej więcej pod ciałami kręgów od T12 do L2.
    7. Usuń ciało kręgu znajdujące się gudałowo względem obszaru zgrubienia lędźwiowo-krzyżowego, aby uzyskać dostęp do rdzenia kręgowego znajdującego się w kanale kręgowym.
    8. Używając zakrzywionych nożyc sprężynowych, przetnij obustronnie nasady łuków kręgowych, jednocześnie unosząc i odciągając ciało kręgu w kierunku rostralnym, aby oddzielić brzuszne i grzbietowe części kręgu i odsłonić rdzeń kręgowy.
    9. Po usunięciu ciał kręgów i odsłonięciu zgrubienia lędźwiowo-krzyżowego, ostrożnie usuń nożycami sprężynowymi pozostałe korzenie kotwiczące rdzeń kręgowy, aż rdzeń będzie swobodnie unosić się w płynie.
    10. Wyizoluj rdzeń kręgowy, wykonując cięcia rostralne i kaudalne znacznie powyżej i poniżej zgrubienia lędźwiowo-krzyżowego, aby docelowy region rdzenia mógł „swobodnie pływać”.
      UWAGA: Preferowana orientacja skrawka określi sposób późniejszego zamocowania rdzenia do sekcjonowania (Rycina 1).
    11. W przypadku skrawków poprzecznych unieś segment lędźwiowo-krzyżowy za przyczepiony korzeń i umieść go na wcześniej dociętym bloku polistyrenowym (1 cm x 1 cm x 1 cm) z płytkim kanałem wyciętym w centrum. Użyj kleju cyjanoakrylowego (patrz Tabela Materiałów), aby przymocować blok i rdzeń do platformy sekcyjnej i umieść go w kąpieli tnącej zawierającej lodowaty aCSF z sacharozą (zawiesina).
      UWAGA: Płytki kanał pomaga zabezpieczyć i zorientować rdzeń kręgowy, tak aby strona grzbietowa była odsłonięta, a koniec piersiowy rdzenia znajdował się u podstawy bloku.
    12. W przypadku skrawków strzałkowych nałóż cienką linię kleju cyjanoakrylowego na platformę sekcyjną, unieś zgrubienie lędźwiowo-krzyżowe za przyczepiony korzeń i ułóż rdzeń wzdłuż linii kleju, upewniając się, że jedna powierzchnia boczna znajduje się w kleju, a druga jest skierowana do góry. Umieść go w kąpieli tnącej zawierającej lodowaty aCSF z sacharozą (zawiesina).
    13. W przypadku skrawków poziomych nałóż cienką linię kleju cyjanoakrylowego na platformę sekcyjną. Unieś zgrubienie lędźwiowo-krzyżowe za przyczepiony korzeń i ułóż je wzdłuż linii kleju, upewniając się, że powierzchnia brzuszna znajduje się w kleju, a powierzchnia grzbietowa jest skierowana do góry. Użyj przyczepionych korzeni do ustawienia rdzenia. Umieść go w kąpieli tnącej zawierającej lodowaty aCSF z sacharozą (zawiesina).

figure-protocol-1
Rysunek 1: Orientacje przekrojów rdzenia kręgowego, metody montażu i cięcia. (A) Przekroje poprzeczne wymagają styropianowego bloku do cięcia z wyciętym w nim rowkiem wspierającym. Rdzeń kręgowy opiera się o blok w rowku wspierającym, przy czym strona grzbietowa rdzenia jest skierowana w stronę przeciwną do bloku. Blok i rdzeń są przyklejane do stołu tnącego za pomocą kleju cyjanoakrylowego. (B) Przekroje strzałkowe przygotowuje się poprzez nałożenie cienkiej linii kleju cyjanoakrylowego na stole tnącym, a następnie ułożenie rdzenia kręgowego na boku na kleju. (C) Przekroje poziome przygotowuje się poprzez nałożenie cienkiej linii kleju cyjanoakrylowego na stole tnącym, a następnie ułożenie rdzenia kręgowego stroną brzuszną dołu na kleju. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Przygotować skrawki o grubości 300 µm (L1-L5, ta sama grubość niezależnie od orientacji) przy użyciu mikrotomu wibracyjnego z następującymi ustawieniami: prędkość 0,06 mm/s, amplituda 2,50 mm oraz kalibracją odchylenia amplitudy wysokości w zakresie ±0,02.
  2. Przenieść skrawki do komory inkubacyjnej z interfejsem powietrznym zawierającej natleniony aCSF.
  3. Przed rozpoczęciem rejestracji pozostawić skrawki do równoważenia przez 1 h w temperaturze pokojowej (20-24 °C).
  1. Rejestracje z macierzy mikroelektrod
    UWAGA: Poniższe kroki szczegółowo opisują sposób rejestracji danych z eksperymentów opartych na MEA na skrawkach rdzenia kręgowego. W zależności od eksperymentu można zastosować kilka konstrukcji MEA. Szczegóły konstrukcyjne MEA użytych w tych eksperymentach przedstawiono w Tabeli 2 i na Rysunku 2. Szczegółowe informacje projektowe zostały opublikowane przez Egerta et al.26 oraz Thiebaud et al.27 odpowiednio dla płaskich i trójwymiarowych (3D) MEA. Oba typy MEA składają się z 60 elektrod z azotku tytanu, z izolacyjną warstwą azotku krzemu oraz ścieżkami i polami kontaktowymi z azotku tytanu.
    1. Ustawienie eksperymentalne
      1. Włącz komputer i płytę interfejsu, a następnie uruchom oprogramowanie do rejestracji.
      2. Wczytaj wcześniej przygotowany szablon rejestracji (Rysunek 3A). Nazwij pliki na dany dzień w zakładce rejestratora.
      3. Przez cały czas trwania eksperymentu stale napowietrzaj aCSF karbogenem (5% CO2, 95% O2).
      4. Włącz system perfuzyjny, który jest sterowany przez pompę perystaltyczną. Umieść linię doprowadzającą w aCSF, a końcówkę wylotową w naczyniu z odpadami. Przepłucz linie perfuzyjne za pomocą aCSF.
      5. Przygotuj roztwory 4-AP oraz wszelkie inne roztwory leków, rozcieńczykając zapasy w 50 mL aCSF do wymaganego stężenia końcowego (np. 200 µM dla 4-AP).
      6. Umieść roztwory leków w naczyniach na leki i napowietrzaj je karbogenem.
    2. Aktywność wywołana 4-AP
      1. Po inkubacji przenieś pojedynczy skrawek z inkubatora, używając pipety Pasteura z szeroką końcówką wypełnionej aCSF.
      2. Umieść skrawek w studni MEA i dodaj dodatkowy aCSF.
      3. Ustaw skrawek nad 60-elektrodową macierzą rejestrującą za pomocą cienkiego, krótkowłosiego pędzla. Unikaj dotykania elektrod pędzlem lub przeciągania tkanki po elektrodach, zwłaszcza w przypadku stosowania macierzy 3D.
        UWAGA: W zależności od układu MEA można to wykonać z pomocą mikroskopu lub bez niej w celu dokładnego pozycjonowania.
      4. Po ustawieniu skrawka nałóż na tkankę obciążoną siatkę, aby utrzymać ją na miejscu i zapewnić dobry kontakt z elektrodami MEA.
        UWAGA: Po nałożeniu siatki może być konieczne ponowne ustawienie skrawka.
      5. Umieść MEA w głowicy rejestrującej (Rysunek 2A,B).
      6. Sprawdź położenie tkanki nad elektrodami za pomocą mikroskopu odwróconego (powiększenie 2x), aby potwierdzić, że jak najwięcej elektrod znajduje się pod powierzchownym rogiem grzbietowym (SDH). Upewnij się, że co najmniej 2-6 elektrod nie kontaktuje się ze skrawkiem, ponieważ elektrody te są istotne dla odejmowania szumu i artefaktów rejestracji podczas analizy (Rysunek 2E).
      7. Włącz kamerę, podłącz ją do urządzenia i wykonaj zdjęcie referencyjne skrawka względem MEA do wykorzystania podczas analizy.
      8. Naciśnij Start DAQ w oprogramowaniu do rejestracji i potwierdź, że wszystkie elektrody odbierają wyraźny sygnał.
        UWAGA: Jeśli sygnał jest zaszumiony, odepnij głowicę i oczyść zarówno pola kontaktowe MEA, jak i złote styki sprężynowe 70% etanolem (użyj chusteczki laboratoryjnej, aby upewnić się, że pola i styki są suche po czyszczeniu). Jeśli sygnał nadal jest zaszumiony, wyłącz wadliwe elektrody w oprogramowaniu do rejestracji lub odnotuj je w celu wykluczenia podczas późniejszej analizy.
      9. Podłącz linie doprowadzające i odprowadzające perfuzję do studni MEA (wcześniej wypełnionej aCSF) i włącz system perfuzyjny. Sprawdź szybkość przepływu, idealnie 4-6 objętości kąpieli na minutę, i upewnij się, że odpływ jest wystarczający, aby zapobiec przepełnieniu superfuzatu.
      10. Pozwól tkance na equilibrację przez 5 min, a następnie zarejestruj 5 min surowych, nieprzefiltrowanych danych bazowych.
      11. Przenieś linię doprowadzającą perfuzję z aCSF do roztworu 4-AP i odczekaj 12 min, aż rytmiczna aktywność indukowana przez 4-AP osiągnie stan stacjonarny (2 min, aby leki dotarły do kąpieli i 10 min, aby aktywność osiągnęła szczyt, a następnie plateau).
      12. Zarejestruj 5 min aktywności indukowanej przez 4-AP. Przygotuj się do kolejnych rejestracji w celu przetestowania leków lub sprawdzenia stabilności 4-AP.
Układy macierzy mikroelektrod
Model macierzy mikroelektrod60MEA 20/30iR-Ti60-3DMEA 10/12/40iR-Ti60-3DMEA 20/12/50iR-Ti60MEA 50/30iR-Ti
Planarny lub trójwymiarowy (3D)Planarny3D3DPlanarny
Siatka elektrod8 x 88 x 88 x 86 x 10
Rozstaw elektrod200 µm100 µm200 µm500 µm
Średnica elektrody30 µm12 µm12 µm30 µm
Wysokość elektrody (3D)Ponieważ nie dostarczono żadnego tekstu źródłowego do tłumaczenia, proszę o przesłanie treści, którą należy przetłumaczyć na język polski.40 µm50 µmPonieważ nie dostarczono tekstu źródłowego do tłumaczenia, proszę o przesłanie treści, którą należy przełożyć na język polski.
EksperymentyPrzekrój poprzecznyPrzekrój poprzecznySagitalny + PoziomyStrzałkowy + poziomy

Tabela 2: Układy macierzy mikroelektrod.

figure-protocol-2
Rysunek 2: Pozycjonowanie tkanki na macierzy mikroelektrod. (A) Zdjęcie przedstawia otwartą głowicę MEA z umieszczoną w pozycji macierzą MEA. (B) To samo co w A, z zamkniętą głowicą MEA do rejestracji oraz zainstalowanym systemem perfuzji tkanki. (C) Zdjęcie przedstawia macierz MEA w formie dostarczonej przez producenta. Widoczne są piny kontaktowe, które łączą się ze złotymi sprężynami głowicy, oraz kąpiel tkankowa MEA, w której znajduje się roztwór kąpielowy i skrawek tkanki. Obszar zaznaczony czerwonym kwadratem w centrum to miejsce rozmieszczenia macierzy elektrod. (D) Schematy przedstawiają dwie konfiguracje elektrod MEA użyte w niniejszym badaniu, z dalszymi szczegółami zaprezentowanymi w Tabeli 2. Elektroda odniesienia jest oznaczona niebieskim trapezem. Lewy układ elektrod MEA przedstawia kwadratową konfigurację 60 elektrod, najczęściej stosowaną w przedstawionej pracy – modele 60MEA20/30iR-Ti z elektrodami o średnicy 30 μm rozmieszczonymi w odstępach 20 μm, lub trójwymiarowe macierze MEA z odstępami 20 μm i 10 μm (60MEA20/12/50iR-Ti oraz 60MEA10/12/40iR-Ti) z elektrodami o średnicy 12 μm i wysokości odpowiednio 50 μm lub 40 μm. Prawy układ elektrod MEA przedstawia prostokątowy układ 6 x 10 elektrod – 60MEA50/30iR-Ti. (E) Zdjęcie przy dużym powiększeniu kwadratowej macierzy 60MEA10/12/40iR-Ti z poprzecznym skrawkiem rdzenia kręgowego ustawionym do rejestracji. Skrawek spoczywa na rzędach elektrod 3-8. Górny rząd elektrod, które nie mają kontaktu z tkanką, służy jako elektrody odniesienia. Obszar SDH widoczny jest jako półprzezroczysty pas. W tym przypadku SDH pokrywa elektrody w rzędach 4, 5 i 6 oraz w kolumnach 2, 3, 4, 5 i 7 macierzy MEA. Pasek skali = 20 µm. Skróty: MEA = microelectrode array (macierz mikroelektrod); SDH = superficial dorsal horn (powierzchniowy róg tylny). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Wymiana skrawków
    1. Po każdej sesji rejestracji przepłucz linie za pomocą aCSF.
    2. Wyjmij MEA z modułu wzmacniacza (headstage).
    3. Usuń siatkę oraz tkankę z otworu MEA, dokładnie przepłucz je w aCSF i powtórz powyższe kroki z nowym skrawkiem.

2. Przetwarzanie i analiza danych

UWAGA: Poniższe kroki szczegółowo opisują sposób korzystania z oprogramowania analitycznego dla eksperymentów MEA na skrawkach rdzenia kręgowego. Jeden z 60 elektrod służy jako referencja wewnętrzna (oznaczona trapezem na Rysunku 2 C,D), natomiast od czterech do dwudziestu pięciu pozostałych z 59 elektrod jest umieszczonych pod SDH w skrawku rdzenia kręgowego dorosłej myszy. Kolejna analiza wykrywa kształty fal potencjału czynnościowego zewnątrzkomórkowego (EAP) oraz lokalnego potencjału polowego (LFP) (przykłady znajdują się na Rysunku 3B) z surowego sygnału w tym obszarze.

  1. Przetwarzanie danych surowych
    1. Otwórz oprogramowanie analityczne i wczytaj przygotowany wcześniej układ analizy (Rysunek 3B).
    2. Otwórz interesujący plik i odznacz elektrodę odniesienia (elektrodę 15 w konfiguracji MEA 8 x 8 lub elektrodę E1 w konfiguracji MEA 6 x 10) oraz wszelkie elektrody uznane za nadmiernie zaszumione.
    3. Ustaw okno czasowe analizy (0:0 → 5:0 min).
    4. Przenieś do Filtr międzykanałowy zakładka Wybierz Złożona referencja i wybierz Elektrody odniesienia na podstawie wykonanego obrazu oraz notatek sporządzonych podczas eksperymentu (tj. elektrod nie znajdujących się pod tkanką). Aby zastosować i sprawdzić to ustawienie, należy nacisnąć Eksploruj przed kontynuacją.
    5. Przenieś do filtr EAP zakładka i zastosuj 2nd zamów filtru górnoprzepustowego Butterwortha (częstotliwość odcięcia 20 Hz) w celu usunięcia aktywności LFP.
    6. Przenieś do filtr LFP zakładka i zastosuj 2nd filtr pasmowy Butterwortha o określonym rzędzie (częstotliwości odcięcia 0,5–4 Hz) w celu usunięcia aktywności EAP.
    7. Przenieś do detektor EAP przełącz i wybierz Automatyczny próg. Wzrost populacji kleszczy i Krawędź opadająca pudełka i ustawić Czas martwy do 0,5 ms.
    8. Zestaw Dodatni i Progi ujemne na podstawie danych. Sprawdź dane, wracając do Analizator danych surowych ekran, przesuwając znacznik czasu, a następnie wracając do detektor EAP zakładka i naciskanie PrzeglądajPowtarzać czynność do momentu uzyskania pewności, że ustalony próg detekcji rejestruje potencjały czynnościowe zewnątrzkomórkowe (EAP), nie rejestrując jednocześnie szumu ani aktywności niefizjologicznej. W celu zidentyfikowania szumu lub aktywności niefizjologicznej należy wykorzystać elektrody referencyjne.
      UWAGA: Należy zapewnić, aby w elektrodach referencyjnych, w których nie występuje aktywność fizjologiczna, wykryto minimalną liczbę potencjałów czynnościowych zewnątrzkomórkowych (EAP). Niemniej jednak niewielkie odchylenia linii bazowej mogą zostać błędnie zinterpretowane jako EAP. Jednocześnie należy dążyć do zmaksymalizowania liczby wykrytych rzeczywistych zdarzeń w elektrodach aktywnych.
    9. Przenieś do detektor LFP zakładka, wybierz Ręczne ustawianie progu, kleszcz Wzrost i Krawędź opadająca pudełka, a następnie ustaw Czas martwy do 3 ms.
    10. Powtórz krok 2.1.8 dla jednej elektrody, wybierając elektrodę z aktywnością LFP. Po uzyskaniu satysfakcjonującego wyniku wybierz Zastosuj do wszystkich ponieważ podczas ręcznego wyznaczania progów zostaną one zastosowane tylko do jednej elektrody.
    11. Podczas analizy danych LFP w Detektor zakładka, odnotuj maksymalną liczbę przekroczeń progu dla jednego przebiegu LFP oraz maksymalną separację czasową przekroczeń progu dla jednego przebiegu LFP do wykorzystania w późniejszej analizie.
    12. Docisnąć Rozpocznij analizę.
    13. Po zakończeniu analizy przejdź do analizator EAP zakładkę i wyeksportuj dane. Przeprowadź tę samą czynność w obrębie analizator LFP tab.
    14. Powtórz ten proces dla wszystkich pozostałych plików z tego samego przekroju.
    15. Po eksporcie danych należy przekonwertować pliki do formatu xlsx, aby mogły zostać odczytane przez użyty skrypt programistyczny. Pliki należy nazwać zgodnie z poniższą konwencją, aby skrypt mógł je prawidłowo odczytać: nazwa eksperymentu (np. sample data) - numer przekroju (np. S1) - numer rejestracji (np. R1) - typ aktywności (np. spikes lub SPs, odpowiednio dla EAPs lub LFPs).
      ​UWAGA: Opisana tutaj analiza EAP traktuje impulsowanie z poszczególnych kanałów jako jedną populację, mimo że aktywność ta zazwyczaj pochodzi z wielu neuronów znajdujących się w bliskim sąsiedztwie elektrody rejestrującej. Jeśli wymagana jest liczba neuronów przyczyniających się do EAP w danym kanale, można zastosować opisane w innych źródłach techniki sortowania wielopulsowego (multispike sorting), aby odróżnić poszczególne populacje impulsów na podstawie charakterystyki kształtu fali.28.

figure-protocol-3
Rysunek 3: Układy narzędzi do zapisu i analizy danych oraz przykładowe zapisy z macierzy mikroelektrod pokazujące kształty fal potencjału czynnościowego zewnątrzkomórkowego i lokalnego potencjału polowego. (A) Schemat przedstawia skonfigurowany szablon zapisu stosowany do akwizycji danych MEA. Połączenie MEA210 z narzędziem do zapisu (przedwzmacniacz/wzmacniacz) umożliwia nazwanie i zapisanie danych. Przedstawiono cztery przykładowe ślady surowych danych (po prawej, epoki 5-minutowe) zebrane przez jeden kanał MEA, pokazujące aktywność w stanie spoczynkowym, 12 min po aplikacji 4-AP, kolejne 15 min po ustabilizowaniu się aktywności wywołanej przez 4-AP oraz po aplikacji TTX (1 µM) do kąpieli. Należy zauważyć, że dodanie 4-AP (drugi ślad) powoduje wyraźny wzrost szumu tła oraz aktywności EAP/LFP. Co istotne, aktywność pozostaje względnie stabilna przez co najmniej 15 min po ustanowieniu aktywności indukowanej przez 4-AP (trzeci ślad). Dodatek TTX (1 µM) znosi całą aktywność (dolny ślad). (B) Schemat (po lewej) przedstawia konfigurację oprogramowania analizatora do analizy danych. Narzędzie eksploratora surowych danych służy do importowania zapisów zebranych przez oprogramowanie do rejestracji. Następnie dane te są przepuszczane przez narzędzie filtra międzykanałowego, które odejmuje sygnały z wybranych elektrod referencyjnych od sygnałów z innych elektrod w celu usunięcia szumu tła. Dane przechodzą przez narzędzia filtru EAP i filtru LFP, aby zoptymalizować stosunek sygnału do szumu dla każdego kształtu fali. Po tym kroku dane ze ścieżki EAP trafiają do narzędzia detektora EAP, gdzie ustawiane są progi. Potencjały EAP są wykrywane, a następnie przesyłane do narzędzia analizatora EAP, gdzie rejestrowane są opóźnienia każdego zdarzenia i eksportowane do pliku txt. Identyczny schemat pracy zachodzi dla danych LFP przy użyciu odpowiadającego im zestawu narzędzi LFP. Ślady po prawej pokazują dane z pojedynczego kanału MEA zawierające różne kształty fal zewnątrzkomórkowych. Położenie sygnałów EAP i LFP zostało wyróżnione na powyższych rasterach zliczeń („count rasters”). Dolne ślady to epoki z górnego zapisu (oznaczone czerwonymi paskami) pokazujące kształty fal w powiększonej skali czasowej, w tym różne sygnały LFP (zwrócić uwagę na różnorodność ich wyglądu) oraz pojedyncze zewnątrzkomórkowe EAP (czerwone okręgi). Należy zauważyć, że kształt fali i polaryzacja LFP/EAP różnią się w zależności od liczby neuronów generujących te sygnały, ich bliskości do elektrody zapisującej oraz ich położenia względem pobliskich elektrod. Skróty: MEA = macierz mikroelektrod; EAP = potencjał czynnościowy zewnątrzkomórkowy; LFP = lokalny potencjał polowy; 4-AP = 4-aminopirydyna; TTX = tetrodotoksyna. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Analiza synchroniczności
    UWAGA: Synchroniczność, czyli liczba zdarzeń „zbieżnych” pomiędzy dwiema elektrodami, została określona przy użyciu kryterium zbieżności w ramach metody synchronizacji A-SPIKE opisanej przez Satuvuori et al.29. Wykorzystany tutaj skrypt w celu zwiększenia wydajności porównuje jedynie elektrody sąsiadujące ze sobą (tj. sąsiadów w poziomie, pionie i po przekątnej); skrypt ten można jednak zmodyfikować tak, aby porównywał wszystkie elektrody, jeśli jest to wymagane.
    1. Przeprowadź analizę danych za pomocą niestandardowego skryptu programistycznego, który wyodrębnia znaczniki czasu opóźnienia (latency timestamps) dla każdej elektrody z plików .xlsx.
      UWAGA: Można to zrobić ręcznie.
    2. W kroku 2.1.1 zapisz maksymalną liczbę przekroczeń progu oraz maksymalny odstęp czasu między przekroczeniami progu dla jednego przebiegu LFP. Przed uruchomieniem skryptu zmodyfikuj go, wprowadzając te parametry definiujące LFP dla każdego przekroju.
      UWAGA: Progowanie wykonane wcześniej w oprogramowaniu analitycznym wyraźnie rejestruje EAP jako pojedyncze zdarzenie. Jednak LFPs składają się ze zmiennej liczby pików, w zależności od kształtu przebiegu i wynikającej z tego liczby przekroczeń progu przez to jedno zdarzenie.
    3. Przed analizą zmodyfikuj skrypt, aby wprowadzić interesujące elektrody.
    4. Aby określić synchroniczność (zdefiniowaną w skrypcie przez modyfikowalne ramy czasowe, w których musi wystąpić aktywność synchroniczna), rozdziel i przeanalizuj wyodrębnione opóźnienia w celu wykrycia zdarzeń zbieżnych.
      UWAGA: Skrypt pozwala na ustawienie maksymalnego czasu pomiędzy zdarzeniami zbieżnymi. Wartości te zostały ustawione na 20 ms dla EAPs i 20 ms dla LFPs.
    5. Uruchom skrypt, aby wyodrębnić znaczniki czasu opóźnienia.
      UWAGA: Wyjściowy plik .xlsx zawiera interpretacje danych o opóźnieniach, którymi są liczby EAP i LFP, częstotliwości oraz liczby zdarzeń zbieżnych dla poszczególnych elektrod i całych przekrojów. Dane te są wykorzystywane do oceny częstotliwości, liczby EAP/LFP, liczby aktywnych elektrod, liczby zdarzeń zbieżnych, liczby połączonych elektrod oraz średniej siły tych powiązań.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Model aktywności sieci w tylnym rogu rdzenia kręgowego
Zastosowanie 4-AP wiarygodnie indukuje synchroniczną aktywność rytmiczną w tylnych rogach (DH) rdzenia kręgowego. Aktywność ta objawia się zwiększeniem potencjałów czynnościowych zewnątrzkomórkowych (EAP) oraz potencjałów polowych (LFP). Ten drugi sygnał jest falą o niskiej częstotliwości, która była wcześniej opisana w rejestracjach MEA.30Zmiany w aktywności EAP i/lub LFP po podaniu leku odzwierciedlają zmienioną aktywn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Pomimo znaczenia rdzenia DH w sygnalizacji nocyceptywnej, przetwarzaniu i wynikających z tego reakcjach behawioralnych i emocjonalnych, które charakteryzują ból, obwody w tym regionie pozostają słabo poznane. Kluczowym wyzwaniem w badaniu tego problemu była różnorodność populacji neuronów, które składają się na te obwody 6,31,32. Ostatnie postępy w technologiach transgenicznych, na czele z optogenetyką i chemogenetyką, zaczynają...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez National Health and Medical Research Council (NHMRC) z Australii (granty 631000, 1043933, 1144638 i 1184974 dla B.A.G. i R.J.C.) oraz Hunter Medical Research Institute (grant dla B.A.G. i R.J.C.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4-aminopirydynaSigma-Aldrich275875-5G
100% etanolThermo FisherAJA214-2.5LPL
CaCl2 1MBanksia Scientific0430/1L
Carbonox (Carbogen - 95% O2, 5% CO2)Coregas219122
Zakrzywione nożyczki sprężynowe z długim uchwytemFine Science Tools15015-11
Wykonana na zamówienie komora
Surowica bydlęca płoduKleszcze10091130
Dumont #5Narzędzia Fine Science11251-30
GlukozaThermo FisherAJA783-500G
Surowica dla koniaThermo Fisher16050130
Mikroskop odwróconyZeissAxiovert10
KClThermo FisherAJA383-500G
KetaminaCevaKETALAB04
Duże nożyczki chirurgiczneFine Science Tools14007-14
Loctite 454 samoprzylepnebłyskawiczne i artykuły przemysłoweL4543G
MATLABMathWorksR2018b
MEAs, 3-wymiarowesystemy wielokanałowe60-3DMEA100/12/40iR-Ti, 60-3DMEA200/12/50iR-Ti60 elektrod z azotku tytanu (TiN) z 1 wewnętrzną elektrodą odniesienia, uporządkowaną w kwadratową siatkę 8x8. Elektrody są 12 i mikro; m średnicy, 40 i mikro; m (100/12/40) lub 50 &mikro; m (200/12/50) o wysokości i równych odstępach 100 &mikro; m (100/12/40) lub 200 &mikro; m (200/12/50) od siebie.
Stacja czołowa MEASystemy wielokanałoweMEA2100-HS60
Płyta interfejsu MEA SystemywielokanałoweMCS-IFB 3.0 Multiboot
MEA netSystemy wielokanałoweALA HSG-MEA-5BD
System perfuzyjny MEASystemy wielokanałowePPS2
MEAs, Planarnesystemy wielokanałowe60MEA200/30iR-Ti, 60MEA500/30iR-Ti60 elektrod z azotku tytanu (TiN) z 1 wewnętrzną elektrodą odniesienia, ułożonych w siatkę kwadratową 8x8 (200/30) lub prostokątną 6x10 (500/30). Elektrody są 30 i mikro; m średnicy i równo rozmieszczone 200 &mikro; m (200/30) lub 500 &mikro; m (500/30) od siebie.
MgCl2Thermo FisherAJA296-500G
Kamera mikroskopowaMoticMoticam X Wi-Fi
Multi Channel Analyser oprogramowanie MultichannelSystemsV 2.17.4
Multi Channel Experimenter oprogramowanieMultichannel SystemsV 2.17.4
NaClThermo FisherAJA465-500G
NaHCO3Thermo FisherAJA475-500G
NaH2PO4Thermo FisherACR207805000
RongeursNarzędzia do nauki16021-14
Małe nożyczki sprężynoweFine Science Tools91500-09
Małe nożyczki chirurgiczneFine Science Tools14060-09
SacharozaThermo FisherAJA530-500G
Superglueklej cyjanoakrylowy
TetrodotoksynaAbcamAB120055
Stół do tłumienia drgańNewportVH3048W-OPT
Mikrotom wibracyjnyLeicaVT1200 S
inkubacyjna z interfejsem powietrzaThermo Fisher

Bibliografia

  1. Smith, K. M., et al. Calretinin positive neurons form an excitatory amplifier network in the spinal cord dorsal horn. eLife. 8, 49190(2019).
  2. Smith, K. M., et al. Functional heterogeneity of calretinin-expressing neurons in the mouse superficial dorsal horn: implications for spinal pain processing. The Journal of physiology. 593 (19), 4319-4339 (2015).
  3. Boyle, K. A., et al. Defining a spinal microcircuit that gates myelinated afferent input: Implications for tactile allodynia. Cell Reports. 28 (2), 526-540 (2019).
  4. Browne, T. J., et al. Transgenic cross-referencing of inhibitory and excitatory interneuron populations to dissect neuronal heterogeneity in the dorsal horn. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 32(2020).
  5. Graham, B. A., Hughes, D. I. Rewards, perils and pitfalls of untangling spinal pain circuits. Current Opinion in Physiology. 11, 35-41 (2019).
  6. Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 823-836 (2010).
  7. Hughes, D. I., Todd, A. J. Central nervous system targets: inhibitory interneurons in the spinal cord. Neurotherapeutics. 17 (3), 874-885 (2020).
  8. Duan, B., et al. Identification of spinal circuits transmitting and gating mechanical pain. Cell. 159 (6), 1417-1432 (2014).
  9. Hachisuka, J., Chiang, M. C., Ross, S. E. Itch and neuropathis itch. Pain. 159 (3), 603(2018).
  10. Foster, E., et al. Targeted ablation, silencing, and activation establish glycinergic dorsal horn neurons as key components of a spinal gate for pain and itch. Neuron. 85 (6), 1289-1304 (2015).
  11. Bourane, S., et al. Identification of a spinal circuit for light touch and fine motor control. Cell. 160 (3), 503-515 (2015).
  12. Cheng, L., et al. Identification of spinal circuits involved in touch-evoked dynamic mechanical pain. Nature neuroscience. 20 (6), 804-814 (2017).
  13. Peirs, C., et al. Mechanical allodynia circuitry in the dorsal horn is defined by the nature of the injury. Neuron. 109 (1), 73-90 (2021).
  14. Huang, J., et al. Circuit dissection of the role of somatostatin in itch and pain. Nature Neuroscience. 21 (5), 707-716 (2018).
  15. Obien, M. E. J., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. Revealing neuronal function through microelectrode array recordings. Frontiers in Neuroscience. 8, 423(2015).
  16. Nam, Y., Wheeler, B. C. In vitro microelectrode array technology and neural recordings. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39 (1), 45-61 (2011).
  17. Johnstone, A. F., et al. Microelectrode arrays: a physiologically based neurotoxicity testing platform for the 21st century. Neurotoxicology. 31 (4), 331-350 (2010).
  18. Stett, A., et al. Biological application of microelectrode arrays in drug discovery and basic research. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 377 (3), 486-495 (2003).
  19. Xu, L., et al. Trends and recent development of the microelectrode arrays (MEAs). Biosensors and Bioelectronics. 175 (1), 112854(2020).
  20. Chapman, R. J., Cilia La Corte, P. F., Asghar, A. U. R., King, A. E. Network-based activity induced by 4-aminopyridine in rat dorsal horn in vitro is mediated by both chemical and electrical synapses. The Journal of Physiology. 587, Pt 11 2499-2510 (2009).
  21. Ruscheweyh, R., Sandkühler, J. Epileptiform activity in rat spinal dorsal horn in vitro has common features with neuropathic pain. Pain. 105 (1-2), 327-338 (2003).
  22. Kay, C. W., Ursu, D., Sher, E., King, A. E. The role of Cx36 and Cx43 in 4-aminopyridine-induced rhythmic activity in the spinal nociceptive dorsal horn: an electrophysiological study in vitro. Physiological Reports. 4 (14), 12852(2016).
  23. Jankowska, E., Lundberg, A., Rudomin, P., Sykova, E. Effects of 4-aminopyridine on synaptic transmission in the cat spinal cord. Brain Research. 240 (1), 117-129 (1982).
  24. Semba, K., Geller, H. M., Egger, M. D. 4-Aminopyridine induces expansion of cutaneous receptive fields of dorsal horn cells. Brain Research. 343 (2), 398-402 (1985).
  25. Ruscheweyh, R., Sandkühler, J. Long-range oscillatory Ca2+ waves in rat spinal dorsal horn. European Journal of Neuroscience. 22 (8), 1967-1976 (2005).
  26. Egert, U., et al. A novel organotypic long-term culture of the rat hippocampus on substrate-integrated multielectrode arrays. Brain Research Protocols. 2 (4), 229-242 (1998).
  27. Thiebaud, P., De Rooij, N., Koudelka-Hep, M., Stoppini, L. Microelectrode arrays for electrophysiological monitoring of hippocampal organotypic slice cultures. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 44 (11), 1159-1163 (1997).
  28. Rey, H. G., Pedreira, C., Quiroga, R. Q. Past, present and future of spike sorting techniques. Brain Research Bulletin. 119, 106-117 (2015).
  29. Satuvuori, E., et al. Measures of spike train synchrony for data with multiple time scales. Journal of Neuroscience Methods. 287, 25-38 (2017).
  30. Mendis, G. D. C., Morrisroe, E., Reid, C. A., Halgamuge, S. K., Petrou, S. Use of local field potentials of dissociated cultures grown on multi-electrode arrays for pharmacological assays. 38th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. , 952-956 (2016).
  31. Hughes, D. I., et al. Morphological, neurochemical and electrophysiological features of parvalbumin-expressing cells: a likely source of axo-axonic inputs in the mouse spinal dorsal horn. The Journal of Physiology. 590 (16), 3927-3951 (2012).
  32. Peirs, C., Seal, R. P. Neural circuits for pain: recent advances and current views. Science. 354 (6312), 578-584 (2016).
  33. Li, J., Baccei, M. L. Developmental regulation of membrane excitability in rat spinal lamina I projection neurons. Journal of Neurophysiology. 107 (10), 2604-2614 (2012).
  34. Li, J., Baccei, M. L. Pacemaker neurons within newborn spinal pain circuits. Journal of Neuroscience. 31 (24), 9010-9022 (2011).
  35. Sandkühler, J., Eblen-Zajjur, A. Identification and characterization of rhythmic nociceptive and non-nociceptive spinal dorsal horn neurons in the rat. Neuroscience. 61 (4), 991-1006 (1994).
  36. Lucas-Romero, J., Rivera-Arconada, I., Roza, C., Lopez-Garcia, J. A. Origin and classification of spontaneous discharges in mouse superficial dorsal horn neurons. Scientific Reports. 8 (1), 9735-9735 (2018).
  37. Antonio, L., et al. L. al. In vitro seizure like events and changes in ionic concentration. Journal of Neuroscience Methods. 260, 33-44 (2016).
  38. Avoli, M., Jefferys, J. G. Models of drug-induced epileptiform synchronization in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 260, 26-32 (2016).
  39. Taccola, G., Nistri, A. Low micromolar concentrations of 4-aminopyridine facilitate fictive locomotion expressed by the rat spinal cord in vitro. Neuroscience. 126 (2), 511-520 (2004).
  40. Mitra, P., Brownstone, R. M. An in vitro spinal cord slice preparation for recording from lumbar motoneurons of the adult mouse. Journal of Neurophysiology. 107 (2), 728-741 (2012).
  41. Egert, U., Heck, D., Aertsen, A. Two-dimensional monitoring of spiking networks in acute brain slices. Experimental Brain Research. 142 (2), 268-274 (2002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Aktywno rog w tylnychskrawki rdzenia kr gowegostymulacja 4 aminopirydynrejestracja aktywno ci sieciowejlokalne potencja y polowepozakom rkowe potencja y czynno ciowemodele przewlek ego b lunapi ciowo zale ne kana y sodowe

Powiązane artykuły