Method Article

Rejestrowanie aktywności sieci w obwodach nocyceptywnych rdzenia kręgowego za pomocą układów mikroelektrod

DOI:

10.3791/62920

⸱

February 9th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Biomedical Sciences and Pharmacy, University of Newcastle, 2School of Electrical Engineering, University of Newcastle

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono połączone użycie technologii matryc mikroelektrod i stymulacji chemicznej indukowanej 4-aminopirydyną do badania aktywności nocyceptywnej na poziomie sieci w rogu grzbietowym rdzenia kręgowego.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Role i połączenia określonych typów neuronów w obrębie rogu grzbietowego rdzenia kręgowego (DH) są wyznaczane w szybkim tempie, aby zapewnić coraz bardziej szczegółowy obraz obwodów leżących u podstaw przetwarzania bólu kręgosłupa. Jednak wpływ tych połączeń na szerszą aktywność sieci w DH pozostaje mniej dobrze poznany, ponieważ większość badań koncentruje się na aktywności pojedynczych neuronów i małych mikroukładów. Alternatywnie, zastosowanie układów mikroelektrod (MEA), które mogą monitorować aktywność elektryczną w wielu komórkach, zapewnia wysoką rozdzielczość przestrzenną i czasową aktywności neuronalnej. W tym miejscu opisano zastosowanie MEA z mysimi wycinkami rdzenia kręgowego do badania aktywności DH indukowanej przez chemiczną stymulację obwodów DH za pomocą 4-aminopirydyny (4-AP). Wynikająca z tego aktywność rytmiczna jest ograniczona do powierzchownej DH, stabilnej w czasie, blokowanej przez tetrodotoksynę i może być badana w różnych orientacjach warstw. Preparat ten stanowi platformę do badania aktywności obwodu DH w tkankach pochodzących od zwierząt naiwnych, zwierzęcych modeli przewlekłego bólu oraz myszy z genetycznie zmienioną funkcją nocyceptywną. Co więcej, zapisy MEA w wycinkach rdzenia kręgowego stymulowanych przez 4-AP mogą być wykorzystane jako szybkie narzędzie przesiewowe do oceny zdolności nowych związków antynocyceptywnych do zakłócania aktywności rdzenia kręgowego DH.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Role specyficznych typów hamujących i pobudzających interneuronów w rdzeniu kręgowym DH są odkrywane w szybkim tempie1,2,3,4. Razem interneurony stanowią ponad 95% neuronów w DH i biorą udział w przetwarzaniu sensorycznym, w tym nocycepcji. Co więcej, te obwody interneuronowe są ważne dla określenia, czy sygnały obwodowe wznoszą się przez oś neuroosi, aby dotrzeć do mózgu i przyczyniają się do percepcji bólu5,6,7. Do tej pory większość badań dotyczyła roli neuronów DH na poziomie analizy pojedynczej komórki lub całego organizmu, wykorzystując kombinacje elektrofizjologii wewnątrzkomórkowej in vitro, znakowania neuroanatomicznego i analizy behawioralnej in vivo1,3,8,9,10,11,12,13,14. Podejścia te znacznie poszerzyły wiedzę na temat roli określonych populacji neuronów w przetwarzaniu bólu. Pozostaje jednak luka w zrozumieniu, w jaki sposób określone typy komórek i małe makroobwody wpływają na duże populacje neuronów na poziomie mikroukładów, aby następnie kształtować wynik DH, reakcje behawioralne i doświadczenie bólu.

Jedną z technologii, która może badać makro-obwody lub funkcje na poziomie wielokomórkowym, jest tablica mikroelektrod (MEA)15,16. MEA są używane do badania funkcji układu nerwowego od kilkudziesięciu lat17,18. W mózgu ułatwiły one badanie rozwoju neuronów, plastyczności synaptycznej, badań farmakologicznych i testów toksyczności17,18. Mogą być stosowane zarówno do zastosowań in vitro, jak i in vivo, w zależności od rodzaju MEA. Co więcej, rozwój MEA szybko ewoluował, a obecnie dostępne są różne numery elektrod i konfiguracje19. Kluczową zaletą MEA jest ich zdolność do jednoczesnej oceny aktywności elektrycznej w wielu neuronach z dużą dokładnością przestrzenną i czasową za pomocą wielu elektrod15,16. Zapewnia to szerszy odczyt tego, w jaki sposób neurony oddziałują w obwodach i sieciach, w warunkach kontrolnych i w obecności lokalnie stosowanych związków.

Jednym z wyzwań związanych z przygotowaniami in vitro DH jest to, że ciągły poziom aktywności jest zazwyczaj niski. W tym przypadku wyzwanie to jest rozwiązywane w obwodach DH rdzenia kręgowego przy użyciu bramkowanego napięciem blokera kanału K+, 4-aminopryidyny (4-AP), do chemicznej stymulacji obwodów DH. Lek ten był wcześniej stosowany do ustalenia rytmicznej synchronicznej aktywności elektrycznej w DH ostrych wycinków rdzenia kręgowego oraz w ostrych warunkach in vivo20,21,22,23,24. W eksperymentach tych wykorzystano jednokomórkowy zapis plamowy i zewnątrzkomórkowy lub obrazowanie wapnia w celu scharakteryzowania aktywności indukowanej przez 4-AP20,21,22,23,24,25. Łącznie prace te wykazały zapotrzebowanie na pobudzające i hamujące przekaźnictwo synaptyczne i synapsy elektryczne dla rytmicznej aktywności indukowanej przez 4-AP. W związku z tym odpowiedź 4-AP była postrzegana jako podejście, które demaskuje natywne polisynaptyczne obwody DH o znaczeniu biologicznym, a nie jako epifenomen wywołany przez lek. Co więcej, aktywność indukowana przez 4-AP wykazuje podobny profil odpowiedzi na leki przeciwbólowe i przeciwpadaczkowe jak stany bólu neuropatycznego i została wykorzystana do zaproponowania nowych celów leków przeciwbólowych opartych na rdzeniu, takich jak connexins20,21,22.

Tutaj opisany jest preparat, który łączy MEA i chemiczną aktywację rdzeniowego DH za pomocą 4-AP w celu zbadania tego obwodu nocyceptywnego na poziomie makro-obwodu, czyli na poziomie analizy sieci. Podejście to zapewnia stabilną i powtarzalną platformę do badania obwodów nocyceptywnych w naiwnych i neuropatycznych warunkach "podobnych" do bólu. Preparat ten jest również łatwo stosowany do testowania działania znanych leków przeciwbólowych na poziomie obwodu oraz do badań przesiewowych nowych leków przeciwbólowych w nadpobudliwym rdzeniu kręgowym.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania przeprowadzono na samcach i samicach myszy c57Bl/6 w wieku 3-12 miesięcy. Wszystkie procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone zgodnie z Komitetem ds. Opieki nad Zwierzętami i Etyki Uniwersytetu w Newcastle (protokoły A-2013-312 i A-2020-002).

1. Elektrofizjologia in vitro

  1. Przygotowanie roztworów do przygotowania i rejestracji wycinków rdzenia kręgowego
    1. Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy
      UWAGA: Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (aCSF) jest używany w komorze inkubacyjnej interfejsu, w której plastry są przechowywane do momentu rozpoczęcia nagrywania oraz podczas eksperymentów zarówno jako perfuzator, jak i rozcieńczalnik do leków. Szczegółowy skład znajduje się w tabeli 1.
pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. szt. pkt.
chemicznyaCSF (mM)aCSF (g/100 ml)Podstawiony sacharozą aCSF (mM)Sacharoza podstawiona aCSF (g/100 ml)Wysoka zawartość potasu aCSF (mM)Wysoka zawartość potasu aCSF (g/100 ml)
Chlorek sodu (NaCl)Rozdział 1180,690--Rozdział 1180,690
Wodorowęglan sodu (NaHCO3)250,210250,210250,210
glukoza100,180100,180100,180
Chlorek potasu (KCl)Rozdział 2.50,019Rozdział 2.50,019Rozdział 4.50,034
Diwodorofosforan sodu (NaH2PO4)10,01210,01210,012
Kloryd magnezu (MgCl2)10,0110,0110,01
Chlorek wapnia (CaCl2)Rozdział 2.50,028Rozdział 2.50,028Rozdział 2.50,028
sacharoza--Z kolei 2508,558--

Tabela 1: Sztuczne kompozycje płynu mózgowo-rdzeniowego. Skrót: aCSF = sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy.

  1. Przygotować płyn CSF zawierający (w mM) 118 NaCl, 25 NaHCO3, 10 glukozy, 2,5 KCl, 1 NaH2PO4, 1 MgCl2 i 2,5 CaCl2 poprzez dodanie wymaganych ilości powyższego, z wyłączeniem CaCl2, do 2 l wody destylowanej.
  2. Pęcherzykować powyższy roztwór karbogenem (95%O2, 5% CO2) przez 5 minut i dodać CaCl2.
    UWAGA: Ten krok zapobiega wytrącaniu się CaCl2, tj. roztwór nie powinien stać się mętny. W celu stosowania leku podczas eksperymentów, należy rozcieńczyć roztwory podstawowe leku w aCSF do pożądanych stężeń końcowych.
  1. Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy podstawiony sacharozą
    UWAGA: ACSF podstawiony sacharozą jest stosowany podczas preparowania i przecinania rdzenia kręgowego. Jak wskazuje nazwa, sacharoza jest zastępowana NaCl w celu zmniejszenia pobudzenia neuronów podczas tych procedur przy jednoczesnym zachowaniu osmolarności. Szczegółowy skład znajduje się w tabeli 1.
    1. Przygotować podstawiony sacharozą aCSF zawierający (w mM) 250 sacharozy, 25 NaHCO3, 10 glukozy, 2,5 KCl, 1 NaH2PO4, 1 MgCl2 i 2,5 CaCl2 poprzez dodanie wymaganych ilości wszystkich powyższych, z wyłączeniem CaCl2, do 300 ml wody destylowanej.
    2. Bulgotać roztwór z karbogenem przez 5 minut, a następnie dodać CaCl2.
    3. Przechowywać roztwór w zamrażarce o temperaturze -80 °C przez około 40 minut lub do momentu, gdy roztwór utworzy zawiesinę. Unikaj zamrażania ciał stałych i używaj w konsystencji zawiesiny.
  1. Przygotowanie matrycy mikroelektrod
    UWAGA: Powierzchnia styku MEA wymaga obróbki wstępnej, aby nadać jej hydrofilowość.
    1. Przed eksperymentem należy dobrze napełnić MEA płodową surowicą bydlęcą (FBS) lub surowicą końską (HS) przez 30 minut.
    2. Wyjmij FBS lub HS i dokładnie spłucz MEA około pięcioma płukaniami wody destylowanej, aż woda destylowana przestanie się pienić. Napełnij studnię CSF, gotowy do użycia.
  2. Przygotowanie ostrego plastra rdzenia kręgowego
    UWAGA: Przygotowanie wycinka rdzenia kręgowego myszy jest zgodne z wcześniejszym opisem Smitha i wsp.2. Idealnie, usunięcie powiększenia odcinka lędźwiowo-krzyżowego nie powinno zająć więcej niż 8-10 minut (kroki 1.3.2-1.3.11 poniżej).
    1. Głęboko znieczulij mysz 100 mg/kg ketaminy (i.p.), a następnie odetnij jej głowę za pomocą dużych nożyczek chirurgicznych.
    2. Usuń skórę nad okolicą brzucha, wykonując małe nacięcie w skórze na poziomie bioder. Pociągnij skórę po obu stronach nacięcia rostralnie, aż cała skóra zostanie usunięta, tj. od górnej części klatki piersiowej do górnej części miednicy (zarówno brzusznie, jak i grzbietowo).
    3. Umieść ciało na lodzie i użyj podejścia brzusznego, aby odsłonić kręgosłup, usuwając wszystkie wnętrzności i przecinając żebra po bocznej stronie mostka.
    4. Usuń brzuszną klatkę piersiową, obie łopatki (odcięte w przybliżeniu T2) oraz kończyny dolne i miednicę (odcięte mniej więcej w górnej części kości krzyżowej).
    5. Przenieść kręgosłup i preparat żebrowy do kąpieli rozwarstwiającej zawierającej lodowatą sacharozę aCSF. Przypiąć wszystkie cztery rogi preparatu (powierzchnia brzuszna do góry), umieszczając szpilki przez mięśnie dolnej części pleców i przyczepione górne żebra.
    6. Usuń wszystkie mięśnie i tkankę łączną pokrywającą brzuszną powierzchnię kręgów za pomocą rongeurs i zidentyfikuj obszar kręgowy nad powiększeniem lędźwiowo-krzyżowym, który leży w przybliżeniu poniżej trzonów kręgów od T12 do L2.
    7. Usuń trzon kręgu, który jest doogonowy do obszaru powiększenia lędźwiowo-krzyżowego, aby zapewnić dostęp do rdzenia kręgowego, gdy znajduje się w kanale kręgowym.
    8. Za pomocą zakrzywionych nożyczek sprężynowych przetnij obustronnie szypułki kręgów, jednocześnie podnosząc i ciągnąc trzon kręgu rostralnie, aby oddzielić brzuszne i grzbietowe aspekty kręgów i odsłonić rdzeń kręgowy.
    9. Po usunięciu trzonów kręgów w celu odsłonięcia powiększenia odcinka lędźwiowo-krzyżowego, ostrożnie usuń pozostałe korzenie, które zakotwiczają rdzeń kręgowy, za pomocą nożyczek sprężynowych, aż rdzeń będzie swobodnie unosił się.
    10. Odizoluj rdzeń kręgowy za pomocą nacięć rostralnych i ogonowych znacznie powyżej i poniżej powiększenia odcinka lędźwiowo-krzyżowego, pozwalając docelowemu obszarowi rdzenia "swobodnie unosić się".
      UWAGA: Preferowana orientacja przekroju określi, w jaki sposób przewód zostanie następnie zamontowany w celu przekroju ( Rysunek 1).
    11. W przypadku plastrów poprzecznych podnieś odcinek lędźwiowo-krzyżowy za dołączony korzeń i umieść go na wstępnie przyciętym bloku styropianowym (styropianowym) (1 cm x 1 cm x 1 cm) z płytkim kanałem wyciętym pośrodku. Za pomocą kleju cyjanoakrylowego (patrz Tabela materiałów) przymocuj blok i sznurek do platformy sekcyjnej i umieść je w kąpieli tnącej zawierającej lodowatą sacharozę aCSF (zawiesinę).
      UWAGA: Płytki kanał pomaga zabezpieczyć i zorientować rdzeń kręgowy, z odsłoniętą stroną grzbietową i piersiowym końcem rdzenia na dole bloku.
    12. W przypadku plastrów strzałkowych połóż cienką linię kleju cyjanoakrylowego na platformie sekcyjnej, podnieś powiększenie odcinka lędźwiowo-krzyżowego za pomocą dołączonego korzenia i umieść sznurek wzdłuż linii kleju, upewniając się, że jedna powierzchnia boczna znajduje się w kleju, a druga jest skierowana do góry. Umieścić go w kąpieli rozbioru zawierającej lodowatą sacharozę aCSF (zawiesinę).
    13. W przypadku plastrów poziomych połóż cienką linię kleju cyjanoakrylowego na platformie do cięcia. Podnieś powiększenie lędźwiowo-krzyżowe za pomocą dołączonego korzenia i umieść powiększenie lędźwiowo-krzyżowe wzdłuż linii kleju, upewniając się, że powierzchnia brzuszna znajduje się w kleju, a powierzchnia grzbietowa jest skierowana do góry. Użyj dołączonych korzeni, aby ustawić sznurek. Umieścić go w kąpieli rozbioru zawierającej lodowatą sacharozę aCSF (zawiesinę).

figure-protocol-1
Rysunek 1: Orientacja przekroju rdzenia kręgowego, metody montażu i cięcia. (A) Plastry poprzeczne wymagają styropianowego bloku tnącego z wyciętym w nim rowkiem nośnym. Rdzeń kręgowy opiera się o blok w rowku nośnym, grzbietowa strona rdzenia jest skierowana od bloku. Blok i sznurek są przyklejane do stolika do cięcia za pomocą kleju cyjanoakrylowego. (B) Plastry strzałkowe przygotowuje się, umieszczając cienką linię kleju cyjanoakrylowego na etapie cięcia, a następnie umieszczając rdzeń kręgowy na boku na kleju. (C) Poziome plastry przygotowuje się poprzez umieszczenie cienkiej linii kleju cyjanoakrylowego na etapie cięcia, a następnie umieszczenie rdzenia kręgowego brzuszną stroną do dołu na kleju. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Uzyskać plastry o grubości 300 μm (L1-L5, ta sama grubość niezależnie od orientacji) za pomocą mikrotomu wibracyjnego o następujących ustawieniach: prędkość 0,06 mm/s, amplituda 2,50 mm i skalibrowane z dokładnością do ±0,02 odchylenia wysokości.
  2. Przenieść plastry do komory inkubacyjnej na granicy powietrza zawierającej natleniony aCSF.
  3. Przed zarejestrowaniem należy pozostawić plastry do zrównoważenia przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (20–24 °C).
  1. Zapisy matrycy mikroelektrod
    UWAGA: Poniższe kroki szczegółowo opisują, jak używać danych rekordowych z eksperymentów opartych na MEA na wycinkach rdzenia kręgowego. W zależności od eksperymentu można zastosować kilka projektów MEA. Szczegóły projektu MEA użytych w tych eksperymentach są pokazane w Tabeli 2 i Rysunek 2. Szczegółowe informacje projektowe zostały opublikowane przez Egert et al.26 oraz Thiebaud et al.27 odpowiednio dla płaskich i trójwymiarowych (3D) MEA. Oba typy MEA składają się z 60 elektrod z azotku tytanu, z warstwą izolacyjną z azotku krzemu oraz ścieżkami z azotku tytanu i podkładkami kontaktowymi.
    1. Konfiguracja eksperymentalna
      1. Włącz komputer i kartę interfejsu, a następnie uruchom oprogramowanie do nagrywania.
      2. Załaduj wstępnie zmontowany szablon nagrania (Rysunek 3A). Nazwij pliki na dany dzień na karcie rejestratora.
      3. Ciągłe bąbelkowanie aCSF karbogenem (5% CO2, 95% O2) przez czas trwania eksperymentu.
      4. Włącz system perfuzyjny, który jest kontrolowany przez pompę perystaltyczną. Umieść przewód dolotowy w CSF, a koniec wlotowy w zlewce na odpady. Zagruntować linie perfuzyjne za pomocą płynu mózgowo-rdzeniowego.
      5. Przygotować 4-AP i wszelkie inne roztwory leków, rozcieńczając zapasy w 50 ml aCSF do wymaganego stężenia końcowego (np. 200 μM dla 4-AP).
      6. Umieść roztwory leków w pojemnikach na leki i bąbelkuj je karbogenem.
    2. Aktywność 4-AP
      1. Po inkubacji przenieść pojedynczą cząstkę z inkubatora za pomocą pipety Pasteura z dużą końcówką wypełnionej płynem CSF.
      2. Umieść plasterek w dołku MEA i dodaj dodatkowy aCSF.
      3. Umieść plasterek nad 60-elektrodową matrycą zapisu za pomocą cienkiego pędzla z krótkim włosiem. Unikaj dotykania elektrod pędzlem lub przeciągania chusteczki po elektrodach, zwłaszcza jeśli używasz tablic 3D.
        UWAGA: W zależności od układu MEA, można to zrobić z pomocą mikroskopu lub bez niego w celu dokładnego pozycjonowania.
      4. Po umieszczeniu plastra umieść obciążoną siatkę na tkance, aby utrzymać ją na miejscu i zapewnić dobry kontakt z elektrodami MEA.
        UWAGA: Plasterek może wymagać zmiany położenia po umieszczeniu siatki.
      5. Umieść MEA w czołówce nagrania (Rysunek 2A,B).
      6. Sprawdź położenie tkanki nad elektrodami za pomocą mikroskopu odwróconego (2-krotne powiększenie), aby potwierdzić, że jak najwięcej elektrod znajduje się pod powierzchniową DH (SDH). Upewnij się, że co najmniej 2-6 elektrod nie styka się z plasterkiem, ponieważ te elektrody są ważne dla odejmowania szumów i rejestrowania artefaktów podczas analizy (Rysunek 2E).
      7. Włącz kamerę, podłącz ją do urządzenia i zrób zdjęcie referencyjne przekroju względem MEA do wykorzystania podczas analizy.
      8. Naciśnij Start DAQ w oprogramowaniu do nagrywania i upewnij się, że wszystkie elektrody odbierają wyraźny sygnał.
        UWAGA: Jeśli sygnał jest głośny, odepnij scenę czołową i wyczyść zarówno podkładki stykowe MEA, jak i złote styki sprężynowe 70% etanolem (użyj chusteczki laboratoryjnej, aby upewnić się, że podkładki i styki są suche po czyszczeniu). Jeśli sygnał jest nadal zaszumiony, wyłącz nieprawidłowo działające elektrody w oprogramowaniu do nagrywania lub zanotuj w celu wykluczenia później podczas analizy.
      9. Podłącz przewody wlotowe i wylotowe perfuzji do studzienki MEA (uprzednio wypełnionej CSF) i włącz system perfuzyjny. Sprawdź natężenie przepływu, najlepiej 4-6 objętości kąpieli na minutę, i upewnij się, że odpływ jest wystarczający, aby zapobiec przepełnieniu się superbezpiecznika.
      10. Pozwól tkance zrównoważyć się przez 5 minut, a następnie zapisz 5 minut surowych, niefiltrowanych danych wyjściowych.
      11. Przenieś linię wlotową perfuzji z aCSF do roztworu 4-AP i odczekaj 12 minut, aż aktywność rytmiczna wywołana przez 4-AP osiągnie stan ustalony (2 minuty, aby leki dotarły do kąpieli i 10 minut, aby aktywność osiągnęła szczyt, a następnie ustabilizowała się).
      12. Nagraj 5 minut aktywności wywołanej przez 4-AP. Należy przygotować się na kolejne nagrania w celu przetestowania leków lub sprawdzenia stabilności 4-AP.
Układy układów mikroelektrod
Model matrycy mikroelektrod60MEA 200/30iR-Ti60-3DMEA 100/12/40iR-Ti60-3DMEA 200/12/50iR-Ti60MEA 500/30iR-Ti
Planarne lub trójwymiarowe (3D)Planar3d3dPlanar
Siatka elektrod8 x 88 x 88 x 8Wymiary: 6 x 10
Odstępy między elektrodami200 μm100 μm200 μm500 μm
Średnica elektrody30 μm12 μm12 μm30 μm
Wysokość elektrody (3D)N/a40 μm50 μmN/a
EksperymentyPrzekrój poprzecznyPrzekrój poprzecznyStrzałkowy + PoziomyStrzałkowy + Poziomy

Tabela 2: Układy układów mikroelektrod.

figure-protocol-2
Rysunek 2: Umiejscowienie tkanki na matrycy mikroelektrod. (A) Obraz przedstawia otwartą scenę MEA z umieszczonym MEA. (B) Taki sam jak A z zamkniętą sceną główną MEA na czas nagrań i systemem perfuzji tkanek. (C) Ilustracja przedstawia MEA w postaci, w jakiej został dostarczony przez producenta. Pokazane są podkładki kontaktowe, które łączą się ze złotymi sprężynami sceny głównej, oraz kąpiel tkankowa MEA, w której znajduje się roztwór do kąpieli tkanek i plasterek tkanki. Obszar podświetlony czerwonym kwadratem pośrodku to lokalizacja układu elektrod. (D) Schematy przedstawiają dwie konfiguracje elektrod MEA użyte w tym badaniu, z dalszymi szczegółami przedstawionymi w tabeli 2. Elektroda referencyjna jest oznaczona niebieskim trapezem. Lewy układ elektrod MEA przedstawia konfigurację kwadratową 60 elektrod, najczęściej używaną w prezentowanych modelach roboczych 60MEA200/30iR-Ti z elektrodami o średnicy 30 μm oddalonymi od siebie o 200 μm lub 200 μm i 100 μm rozstawionymi trójwymiarowymi MEA (60MEA200/12/50iR-Ti i 60MEA100/12/40iR-Ti) z elektrodami o średnicy 12 μm i wysokości 50 μm lub 40 μm, odpowiednio. Lewy układ elektrod MEA przedstawia prostokątny układ elektrod 6 x 10-60MEA500/30iR-Ti. (E) Obraz w dużym powiększeniu kwadratowego MEA 60MEA100/12/40iR-Ti z poprzecznym przekrojem rdzenia kręgowego ustawionym do nagrywania. Plaster znajduje się w rzędach elektrod 3-8. Górny rząd elektrod, które nie stykają się z żadną tkanką, służy jako elektrody odniesienia. Obszar SDH jest wyświetlany jako półprzezroczyste pasmo. W tym przypadku SDH nakłada się na elektrody w rzędach 4, 5 i 6 oraz kolumnach 2, 3, 4, 5 i 7 MEA. Podziałka = 200 μm. Skróty: MEA = układ mikroelektrod; SDH = powierzchowny róg grzbietowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Zmienianie plasterków
    1. Po każdej sesji nagraniowej przepłucz linie za pomocą CSF.
    2. Usuń MEA ze sceny głównej.
    3. Wyjmij siatkę i tkankę z MEA, dobrze spłucz je płynem CSF i powtórz powyższe kroki z nowym plasterkiem.

2. Przetwarzanie i analiza danych

UWAGA: Poniższe kroki szczegółowo opisują, jak korzystać z oprogramowania analitycznego do eksperymentów MEA na wycinkach rdzenia kręgowego. Jedna z 60 elektrod służy jako wewnętrzne odniesienie (oznaczone trapezem w Rysunek 2 C,D), podczas gdy od czterech do dwudziestu pięciu z pozostałych 59 jest umieszczonych pod SDH w przekroju rdzenia kręgowego dorosłej myszy. Późniejsza analiza wykrywa przebiegi zewnątrzkomórkowego potencjału czynnościowego (EAP) i potencjału pola lokalnego (LFP) (patrz Rysunek 3B dla przykładów) z surowego sygnału w tym regionie.

  1. Przetwarzanie danych surowych
    1. Otwórz oprogramowanie analityczne i załaduj gotowy układ analizy (Rysunek 3B).
    2. Otwórz interesujący Cię plik i odznacz elektrodę odniesienia (elektroda 15 w konfiguracji 8 x 8 MEA lub elektroda E1 w konfiguracji 6 x 10 MEA) oraz wszelkie elektrody uznane za nadmiernie hałaśliwe.
    3. Ustaw okno czasowe dla analizy (0:00 → 5:00 min).
    4. Przejdź do zakładki Filtr międzykanałowy. Wybierz Złożone odniesienie i wybierz Elektrody referencyjne na podstawie wykonanego obrazu i notatek wykonanych podczas eksperymentu (tj. tych elektrod, które nie znajdują się pod tkanką). Aby zastosować i sprawdzić to, naciśnij Eksploruj przed kontynuowaniem.
    5. Przejdź do zakładki Filtr EAP i zastosuj filtr górnoprzepustowy Butterwortha 2. rzędu (odcięcie 200 Hz), aby usunąć aktywność LFP.
    6. Przejdź do zakładki Filtr LFP i zastosuj filtr Butterwortha pasmowo-przepustowy 2. rzędu (częstotliwości delta 0,5-4 Hz), aby usunąć aktywność EAP.
    7. Przejdź do karty Detektor EAP i wybierz opcję Próg automatyczny. Zaznacz pola Krawędź narastająca i opadająca i ustaw czas martwy na 0,5 ms.
    8. Ustaw progi dodatnie i ujemne na podstawie danych. Sprawdź dane, wracając do ekranu Analizator danych pierwotnych, przesuwając znacznik czasu, a następnie wracając do karty Detektor EAP i naciskając przycisk Eksploruj. Powtarzaj, aż upewnisz się, że ustawiony próg wykrywania wychwytuje EAP bez wychwytywania hałasu/aktywności niefizjologicznej. Użyj elektrod referencyjnych, aby zidentyfikować hałas/aktywność niefizjologiczną.
      UWAGA: Konieczne jest upewnienie się, że minimalna liczba EAP jest wykrywana w elektrodach referencyjnych, w których nie będzie występować aktywność fizjologiczna. Jednak raczej niewielkie odchylenia w linii bazowej mogą zostać błędnie wykryte jako EAP. Ma to na celu maksymalizację liczby rzeczywistych zdarzeń wykrywanych w aktywnych elektrodach.
    9. Przejdź do zakładki detektor LFP, wybierz próg ręczny, zaznacz pola Krawędź narastająca i opadająca, a następnie ustaw czas martwy na 3 ms.
    10. Powtórz krok 2.1.8 dla jednej elektrody, wybierając elektrodę o aktywności LFP. Po spełnieniu oczekiwań wybierz opcję Zastosuj do wszystkich, ponieważ progi zostaną zastosowane tylko do jednej elektrody podczas ręcznego określania progów.
    11. Analizując dane LFP w zakładce Detektor, należy zwrócić uwagę na maksymalną liczbę przekroczeń progów dla jednego kształtu fali LFP oraz maksymalną separację czasową przejść progowych dla jednego przebiegu LFP do wykorzystania w późniejszej analizie.
    12. Naciśnij przycisk Rozpocznij analizę.
    13. Po zakończeniu analizy przejdź do karty Analizator EAP i wyeksportuj dane. Zrób to samo na karcie Analizator LFP.
    14. Powtórz ten proces dla wszystkich innych plików z tego samego wycinka.
    15. Po wyeksportowaniu danych przekonwertuj pliki do formatu xlsx, aby mogły być odczytane przez użyty skrypt programistyczny. Nazwij pliki zgodnie z następującą konwencją dla dostarczonego skryptu, aby je odczytać: nazwa eksperymentu (np. przykładowe dane) - numer wycinka (np. S1) - numer nagrania (np. R1) - typ aktywności (np. skoki lub SP, odpowiadające odpowiednio EAP lub LFP).
      UWAGA: Opisana tutaj analiza EAP traktuje impulsy z poszczególnych kanałów jako pojedynczą populację, mimo że aktywność ta zwykle wynika z wielu neuronów znajdujących się w bliskiej odległości od elektrody rejestrującej. Jeśli pożądana jest liczba neuronów przyczyniających się do EAP w kanale, techniki sortowania wielokolcowego opisane w innym miejscu mogą być zastosowane do rozróżnienia odrębnych populacji impulsów na podstawie charakterystyki fali28.

figure-protocol-3
Rysunek 3: Układy narzędzi do rejestracji i analizy danych oraz przykładowe zapisy matryc mikroelektrod pokazujące przebiegi potencjału czynnościowego zewnątrzkomórkowego i potencjału pola lokalnego. (A) Schemat pokazuje wstępnie skonfigurowany szablon zapisu używany do pozyskiwania danych MEA. Połączenie MEA2100 z narzędziem do nagrywania (scena czołowa/wzmacniacz) umożliwia nazwanie i zapisanie danych. Cztery przykładowe ślady surowych danych (po prawej, 5-minutowe epoki) zostały zebrane przez jeden kanał MEA wykazujący aktywność na początku badania, 12 minut po zastosowaniu 4-AP, kolejne 15 minut po ustalonej aktywności 4-AP i po zastosowaniu kąpieli TTX (1 μM). Należy zauważyć, że dodanie 4-AP (druga ścieżka) powoduje wyraźny wzrost szumu tła i aktywności EAP/LFP. Co ważne, aktywność pozostaje względnie stabilna przez co najmniej 15 minut po ustaleniu aktywności indukowanej przez 4-AP (trzeci ślad). Dodanie TTX (1 μM) znosi wszelką aktywność (ślad dolny). (B) Schemat (po lewej) przedstawia konfigurację oprogramowania analizatora do analizy danych. Narzędzie do eksploratora danych surowych służy do importowania nagrań zebranych przez oprogramowanie do nagrywania. Dane te są następnie przepuszczane przez wielokanałowe narzędzie filtrujące, które odejmuje wybrane sygnały elektrod odniesienia od innych elektrod w celu usunięcia szumów tła. Dane przechodzą przez filtr EAP i narzędzia filtra LFP w celu optymalizacji relacji sygnał-szum dla każdego przebiegu. Po wykonaniu tego kroku dane ścieżki EAP są wprowadzane do narzędzia do wykrywania protokołu EAP, w którym ustawiane są progi. Protokoły EAP są wykrywane, a następnie wysyłane do narzędzia analizatora EAP, gdzie opóźnienia każdego zdarzenia są rejestrowane i eksportowane jako plik txt. plik. Identyczny przepływ pracy odbywa się w przypadku danych LFP przy użyciu odpowiedniego zestawu narzędzi LFP. Prawe ścieżki pokazują dane z pojedynczego kanału MEA zawierającego różne przebiegi zewnątrzkomórkowe. Lokalizacja sygnałów EAP i LFP jest wyróżniona w powyższych "rastrach zliczających". Dolne ślady to epoki od górnego nagrania (oznaczone czerwonymi paskami) pokazujące przebiegi w rozszerzonej skali czasowej, w tym różne sygnały LFP (zwróć uwagę na różnorodność występów) i indywidualne zewnątrzkomórkowe EAP (czerwone kółka). Należy zauważyć, że kształt fali i polaryzacja LFP/EAP różnią się w zależności od liczby neuronów wytwarzających te sygnały, ich odległości od elektrody rejestrującej i ich położenia w stosunku do pobliskich elektrod. Skróty: MEA = układ mikroelektrod; EAP = zewnątrzkomórkowy potencjał czynnościowy; LFP = lokalny potencjał pola; 4-AP = 4-aminopirydyna; TTX = tetrodotoksyna. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Analiza synchroniczności
    UWAGA: Synchroniczność, czyli liczba "zbieżnych" zdarzeń między dwiema elektrodami, została określona przy użyciu kryterium koincydencji w ramach metody synchronizacji A-SPIKE, opisanej przez Satuvuori i wsp.29. Skrypt używany tutaj porównuje tylko elektrody sąsiadujące ze sobą pod kątem wydajności (tj. sąsiadów poziomych, pionowych i ukośnych); Jednak skrypt można przepisać, aby w razie potrzeby porównać wszystkie elektrody.
    1. Przeprowadź analizę danych za pomocą niestandardowego skryptu programowania, który wyodrębnia znaczniki czasu opóźnienia dla każdej elektrody z plików .xlsx.
      UWAGA: Można to zrobić ręcznie.
    2. W kroku 2.1.11 zapisz maksymalną liczbę przekroczeń progów i maksymalną separację czasową przekroczeń progów dla jednego przebiegu LFP. Zmodyfikuj skrypt do wprowadzania tych parametrów definiujących LFP dla każdego wycinka przed uruchomieniem skryptu.
      UWAGA: Progowanie wykonywane wcześniej w oprogramowaniu analitycznym wyraźnie rejestruje EAP jako pojedyncze zdarzenie. Jednak LFP składają się ze zmiennej liczby pików w zależności od kształtu fali i późniejszej liczby przekroczeń progu przez jedno zdarzenie.
    3. Zmodyfikuj skrypt, aby wprowadzić interesujące elektrody przed analizą.
    4. Aby określić synchronizację (zdefiniowaną w skrypcie przez modyfikowalne ramy czasowe, w których ma zachodzić aktywność synchroniczna), oddziel i przeanalizuj wyodrębnione opóźnienia w celu wykrycia zbieżnych zdarzeń.
      UWAGA: Skrypt pozwala na ustawienie maksymalnego czasu między zbieżnymi zdarzeniami. Są one ustawione na 20 ms dla EAP i 200 ms dla LFP.
    5. Uruchom skrypt, aby wyodrębnić znaczniki czasu opóźnienia.
      UWAGA: Plik wyjściowy .xlsx zawiera interpretacje danych dotyczących opóźnień, którymi są liczby EAP i LFP, częstotliwości i liczby zdarzeń zbieżnych dla poszczególnych elektrod i całych warstw. Dane te są wykorzystywane do oceny częstotliwości, liczby EAP/LFP, liczby aktywnych elektrod, liczby zdarzeń zbieżnych, liczby połączonych elektrod oraz średniej siły tych wiązań.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Model aktywności sieci w rogu grzbietowym rdzenia kręgowego
Zastosowanie 4-AP niezawodnie indukuje synchroniczną aktywność rytmiczną w rdzeniu kręgowym DH. Taka działalność przejawia się jako zwiększenie EAP i LFP. Drugi sygnał to przebieg o niskiej częstotliwości, który został wcześniej opisany w nagraniach MEA30. Zmiany w aktywności EAP i/lub LFP po zastosowaniu leku odzwierciedlają zmienioną aktywność neuronalną. Przykłady EAP i LFP są pokazane na Rysun...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomimo znaczenia rdzenia DH w sygnalizacji nocyceptywnej, przetwarzaniu i wynikających z tego reakcjach behawioralnych i emocjonalnych, które charakteryzują ból, obwody w tym regionie pozostają słabo poznane. Kluczowym wyzwaniem w badaniu tego problemu była różnorodność populacji neuronów, które składają się na te obwody 6,31,32. Ostatnie postępy w technologiach transgenicznych, na czele z optogenetyką i chemogenetyką, zaczynają...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana przez National Health and Medical Research Council (NHMRC) z Australii (granty 631000, 1043933, 1144638 i 1184974 dla B.A.G. i R.J.C.) oraz Hunter Medical Research Institute (grant dla B.A.G. i R.J.C.).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4-aminopirydynaSigma-Aldrich275875-5G
100% etanolThermo FisherAJA214-2.5LPL
CaCl2 1MBanksia Scientific0430/1L
Carbonox (Carbogen - 95% O2, 5% CO2)Coregas219122
Zakrzywione nożyczki sprężynowe z długim uchwytemFine Science Tools15015-11
Wykonana na zamówienie komora
Surowica bydlęca płoduKleszcze10091130
Dumont #5Narzędzia Fine Science11251-30
GlukozaThermo FisherAJA783-500G
Surowica dla koniaThermo Fisher16050130
Mikroskop odwróconyZeissAxiovert10
KClThermo FisherAJA383-500G
KetaminaCevaKETALAB04
Duże nożyczki chirurgiczneFine Science Tools14007-14
Loctite 454 samoprzylepnebłyskawiczne i artykuły przemysłoweL4543G
MATLABMathWorksR2018b
MEAs, 3-wymiarowesystemy wielokanałowe60-3DMEA100/12/40iR-Ti, 60-3DMEA200/12/50iR-Ti60 elektrod z azotku tytanu (TiN) z 1 wewnętrzną elektrodą odniesienia, uporządkowaną w kwadratową siatkę 8x8. Elektrody są 12 i mikro; m średnicy, 40 i mikro; m (100/12/40) lub 50 &mikro; m (200/12/50) o wysokości i równych odstępach 100 &mikro; m (100/12/40) lub 200 &mikro; m (200/12/50) od siebie.
Stacja czołowa MEASystemy wielokanałoweMEA2100-HS60
Płyta interfejsu MEA SystemywielokanałoweMCS-IFB 3.0 Multiboot
MEA netSystemy wielokanałoweALA HSG-MEA-5BD
System perfuzyjny MEASystemy wielokanałowePPS2
MEAs, Planarnesystemy wielokanałowe60MEA200/30iR-Ti, 60MEA500/30iR-Ti60 elektrod z azotku tytanu (TiN) z 1 wewnętrzną elektrodą odniesienia, ułożonych w siatkę kwadratową 8x8 (200/30) lub prostokątną 6x10 (500/30). Elektrody są 30 i mikro; m średnicy i równo rozmieszczone 200 &mikro; m (200/30) lub 500 &mikro; m (500/30) od siebie.
MgCl2Thermo FisherAJA296-500G
Kamera mikroskopowaMoticMoticam X Wi-Fi
Multi Channel Analyser oprogramowanie MultichannelSystemsV 2.17.4
Multi Channel Experimenter oprogramowanieMultichannel SystemsV 2.17.4
NaClThermo FisherAJA465-500G
NaHCO3Thermo FisherAJA475-500G
NaH2PO4Thermo FisherACR207805000
RongeursNarzędzia do nauki16021-14
Małe nożyczki sprężynoweFine Science Tools91500-09
Małe nożyczki chirurgiczneFine Science Tools14060-09
SacharozaThermo FisherAJA530-500G
Superglueklej cyjanoakrylowy
TetrodotoksynaAbcamAB120055
Stół do tłumienia drgańNewportVH3048W-OPT
Mikrotom wibracyjnyLeicaVT1200 S
inkubacyjna z interfejsem powietrzaThermo Fisher

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Smith, K. M., et al. Calretinin positive neurons form an excitatory amplifier network in the spinal cord dorsal horn. eLife. 8, 49190(2019).
  2. Smith, K. M., et al. Functional heterogeneity of calretinin-expressing neurons in the mouse superficial dorsal horn: implications for spinal pain processing. The Journal of physiology. 593 (19), 4319-4339 (2015).
  3. Boyle, K. A., et al. Defining a spinal microcircuit that gates myelinated afferent input: Implications for tactile allodynia. Cell Reports. 28 (2), 526-540 (2019).
  4. Browne, T. J., et al. Transgenic cross-referencing of inhibitory and excitatory interneuron populations to dissect neuronal heterogeneity in the dorsal horn. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 32(2020).
  5. Graham, B. A., Hughes, D. I. Rewards, perils and pitfalls of untangling spinal pain circuits. Current Opinion in Physiology. 11, 35-41 (2019).
  6. Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 823-836 (2010).
  7. Hughes, D. I., Todd, A. J. Central nervous system targets: inhibitory interneurons in the spinal cord. Neurotherapeutics. 17 (3), 874-885 (2020).
  8. Duan, B., et al. Identification of spinal circuits transmitting and gating mechanical pain. Cell. 159 (6), 1417-1432 (2014).
  9. Hachisuka, J., Chiang, M. C., Ross, S. E. Itch and neuropathis itch. Pain. 159 (3), 603(2018).
  10. Foster, E., et al. Targeted ablation, silencing, and activation establish glycinergic dorsal horn neurons as key components of a spinal gate for pain and itch. Neuron. 85 (6), 1289-1304 (2015).
  11. Bourane, S., et al. Identification of a spinal circuit for light touch and fine motor control. Cell. 160 (3), 503-515 (2015).
  12. Cheng, L., et al. Identification of spinal circuits involved in touch-evoked dynamic mechanical pain. Nature neuroscience. 20 (6), 804-814 (2017).
  13. Peirs, C., et al. Mechanical allodynia circuitry in the dorsal horn is defined by the nature of the injury. Neuron. 109 (1), 73-90 (2021).
  14. Huang, J., et al. Circuit dissection of the role of somatostatin in itch and pain. Nature Neuroscience. 21 (5), 707-716 (2018).
  15. Obien, M. E. J., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. Revealing neuronal function through microelectrode array recordings. Frontiers in Neuroscience. 8, 423(2015).
  16. Nam, Y., Wheeler, B. C. In vitro microelectrode array technology and neural recordings. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39 (1), 45-61 (2011).
  17. Johnstone, A. F., et al. Microelectrode arrays: a physiologically based neurotoxicity testing platform for the 21st century. Neurotoxicology. 31 (4), 331-350 (2010).
  18. Stett, A., et al. Biological application of microelectrode arrays in drug discovery and basic research. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 377 (3), 486-495 (2003).
  19. Xu, L., et al. Trends and recent development of the microelectrode arrays (MEAs). Biosensors and Bioelectronics. 175 (1), 112854(2020).
  20. Chapman, R. J., Cilia La Corte, P. F., Asghar, A. U. R., King, A. E. Network-based activity induced by 4-aminopyridine in rat dorsal horn in vitro is mediated by both chemical and electrical synapses. The Journal of Physiology. 587, Pt 11 2499-2510 (2009).
  21. Ruscheweyh, R., Sandkühler, J. Epileptiform activity in rat spinal dorsal horn in vitro has common features with neuropathic pain. Pain. 105 (1-2), 327-338 (2003).
  22. Kay, C. W., Ursu, D., Sher, E., King, A. E. The role of Cx36 and Cx43 in 4-aminopyridine-induced rhythmic activity in the spinal nociceptive dorsal horn: an electrophysiological study in vitro. Physiological Reports. 4 (14), 12852(2016).
  23. Jankowska, E., Lundberg, A., Rudomin, P., Sykova, E. Effects of 4-aminopyridine on synaptic transmission in the cat spinal cord. Brain Research. 240 (1), 117-129 (1982).
  24. Semba, K., Geller, H. M., Egger, M. D. 4-Aminopyridine induces expansion of cutaneous receptive fields of dorsal horn cells. Brain Research. 343 (2), 398-402 (1985).
  25. Ruscheweyh, R., Sandkühler, J. Long-range oscillatory Ca2+ waves in rat spinal dorsal horn. European Journal of Neuroscience. 22 (8), 1967-1976 (2005).
  26. Egert, U., et al. A novel organotypic long-term culture of the rat hippocampus on substrate-integrated multielectrode arrays. Brain Research Protocols. 2 (4), 229-242 (1998).
  27. Thiebaud, P., De Rooij, N., Koudelka-Hep, M., Stoppini, L. Microelectrode arrays for electrophysiological monitoring of hippocampal organotypic slice cultures. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 44 (11), 1159-1163 (1997).
  28. Rey, H. G., Pedreira, C., Quiroga, R. Q. Past, present and future of spike sorting techniques. Brain Research Bulletin. 119, 106-117 (2015).
  29. Satuvuori, E., et al. Measures of spike train synchrony for data with multiple time scales. Journal of Neuroscience Methods. 287, 25-38 (2017).
  30. Mendis, G. D. C., Morrisroe, E., Reid, C. A., Halgamuge, S. K., Petrou, S. Use of local field potentials of dissociated cultures grown on multi-electrode arrays for pharmacological assays. 38th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. , 952-956 (2016).
  31. Hughes, D. I., et al. Morphological, neurochemical and electrophysiological features of parvalbumin-expressing cells: a likely source of axo-axonic inputs in the mouse spinal dorsal horn. The Journal of Physiology. 590 (16), 3927-3951 (2012).
  32. Peirs, C., Seal, R. P. Neural circuits for pain: recent advances and current views. Science. 354 (6312), 578-584 (2016).
  33. Li, J., Baccei, M. L. Developmental regulation of membrane excitability in rat spinal lamina I projection neurons. Journal of Neurophysiology. 107 (10), 2604-2614 (2012).
  34. Li, J., Baccei, M. L. Pacemaker neurons within newborn spinal pain circuits. Journal of Neuroscience. 31 (24), 9010-9022 (2011).
  35. Sandkühler, J., Eblen-Zajjur, A. Identification and characterization of rhythmic nociceptive and non-nociceptive spinal dorsal horn neurons in the rat. Neuroscience. 61 (4), 991-1006 (1994).
  36. Lucas-Romero, J., Rivera-Arconada, I., Roza, C., Lopez-Garcia, J. A. Origin and classification of spontaneous discharges in mouse superficial dorsal horn neurons. Scientific Reports. 8 (1), 9735-9735 (2018).
  37. Antonio, L., et al. L. al. In vitro seizure like events and changes in ionic concentration. Journal of Neuroscience Methods. 260, 33-44 (2016).
  38. Avoli, M., Jefferys, J. G. Models of drug-induced epileptiform synchronization in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 260, 26-32 (2016).
  39. Taccola, G., Nistri, A. Low micromolar concentrations of 4-aminopyridine facilitate fictive locomotion expressed by the rat spinal cord in vitro. Neuroscience. 126 (2), 511-520 (2004).
  40. Mitra, P., Brownstone, R. M. An in vitro spinal cord slice preparation for recording from lumbar motoneurons of the adult mouse. Journal of Neurophysiology. 107 (2), 728-741 (2012).
  41. Egert, U., Heck, D., Aertsen, A. Two-dimensional monitoring of spiking networks in acute brain slices. Experimental Brain Research. 142 (2), 268-274 (2002).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Spinal Nociceptive CircuitsMicroelectrode ArraysDorsal Horn ActivitySpinal Cord Slices4 Aminopyridine StimulationNetwork Activity RecordingLocal Field PotentialsExtracellular Action PotentialsChronic Pain ModelsVoltage Gated Sodium Channels

Related Articles