Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Rejestrowanie aktywności sieci w obwodach nocyceptywnych rdzenia kręgowego za pomocą układów mikroelektrod

3.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62920

⸱

9 lutego 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Biomedical Sciences and Pharmacy, University of Newcastle, 2School of Electrical Engineering, University of Newcastle

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiono połączone użycie technologii matryc mikroelektrod i stymulacji chemicznej indukowanej 4-aminopirydyną do badania aktywności nocyceptywnej na poziomie sieci w rogu grzbietowym rdzenia kręgowego.

Streszczenie

Role i połączenia określonych typów neuronów w obrębie rogu grzbietowego rdzenia kręgowego (DH) są wyznaczane w szybkim tempie, aby zapewnić coraz bardziej szczegółowy obraz obwodów leżących u podstaw przetwarzania bólu kręgosłupa. Jednak wpływ tych połączeń na szerszą aktywność sieci w DH pozostaje mniej dobrze poznany, ponieważ większość badań koncentruje się na aktywności pojedynczych neuronów i małych mikroukładów. Alternatywnie, zastosowanie układów mikroelektrod (MEA), które mogą monitorować aktywność elektryczną w wielu komórkach, zapewnia wysoką rozdzielczość przestrzenną i czasową aktywności neuronalnej. W tym miejscu opisano zastosowanie MEA z mysimi wycinkami rdzenia kręgowego do badania aktywności DH indukowanej przez chemiczną stymulację obwodów DH za pomocą 4-aminopirydyny (4-AP). Wynikająca z tego aktywność rytmiczna jest ograniczona do powierzchownej DH, stabilnej w czasie, blokowanej przez tetrodotoksynę i może być badana w różnych orientacjach warstw. Preparat ten stanowi platformę do badania aktywności obwodu DH w tkankach pochodzących od zwierząt naiwnych, zwierzęcych modeli przewlekłego bólu oraz myszy z genetycznie zmienioną funkcją nocyceptywną. Co więcej, zapisy MEA w wycinkach rdzenia kręgowego stymulowanych przez 4-AP mogą być wykorzystane jako szybkie narzędzie przesiewowe do oceny zdolności nowych związków antynocyceptywnych do zakłócania aktywności rdzenia kręgowego DH.

Wprowadzenie

Role specyficznych typów hamujących i pobudzających interneuronów w rdzeniu kręgowym DH są odkrywane w szybkim tempie1,2,3,4. Razem interneurony stanowią ponad 95% neuronów w DH i biorą udział w przetwarzaniu sensorycznym, w tym nocycepcji. Co więcej, te obwody interneuronowe są ważne dla określenia, czy sygnały obwodowe wznoszą się przez oś neuroosi, aby dotrzeć do mózgu i przyczyniają się do percepcji bólu5,6,7. Do tej pory większość badań dotyczyła roli neuronów DH na poziomie analizy pojedynczej komórki lub całego organizmu, wykorzystując kombinacje elektrofizjologii wewnątrzkomórkowej in vitro, znakowania neuroanatomicznego i analizy behawioralnej in vivo1,3,8,9,10,11,12,13,14. Podejścia te znacznie poszerzyły wiedzę na temat roli określonych populacji neuronów w przetwarzaniu bólu. Pozostaje jednak luka w zrozumieniu, w jaki sposób określone typy komórek i małe makroobwody wpływają na duże populacje neuronów na poziomie mikroukładów, aby następnie kształtować wynik DH, reakcje behawioralne i doświadczenie bólu.

Jedną z technologii, która może badać makro-obwody lub funkcje na poziomie wielokomórkowym, jest tablica mikroelektrod (MEA)15,16. MEA są używane do badania funkcji układu nerwowego od kilkudziesięciu lat17,18. W mózgu ułatwiły one badanie rozwoju neuronów, plastyczności synaptycznej, badań farmakologicznych i testów toksyczności17,18. Mogą być stosowane zarówno do zastosowań in vitro, jak i in vivo, w zależności od rodzaju MEA. Co więcej, rozwój MEA szybko ewoluował, a obecnie dostępne są różne numery elektrod i konfiguracje19. Kluczową zaletą MEA jest ich zdolność do jednoczesnej oceny aktywności elektrycznej w wielu neuronach z dużą dokładnością przestrzenną i czasową za pomocą wielu elektrod15,16. Zapewnia to szerszy odczyt tego, w jaki sposób neurony oddziałują w obwodach i sieciach, w warunkach kontrolnych i w obecności lokalnie stosowanych związków.

Jednym z wyzwań związanych z przygotowaniami in vitro DH jest to, że ciągły poziom aktywności jest zazwyczaj niski. W tym przypadku wyzwanie to jest rozwiązywane w obwodach DH rdzenia kręgowego przy użyciu bramkowanego napięciem blokera kanału K+, 4-aminopryidyny (4-AP), do chemicznej stymulacji obwodów DH. Lek ten był wcześniej stosowany do ustalenia rytmicznej synchronicznej aktywności elektrycznej w DH ostrych wycinków rdzenia kręgowego oraz w ostrych warunkach in vivo20,21,22,23,24. W eksperymentach tych wykorzystano jednokomórkowy zapis plamowy i zewnątrzkomórkowy lub obrazowanie wapnia w celu scharakteryzowania aktywności indukowanej przez 4-AP20,21,22,23,24,25. Łącznie prace te wykazały zapotrzebowanie na pobudzające i hamujące przekaźnictwo synaptyczne i synapsy elektryczne dla rytmicznej aktywności indukowanej przez 4-AP. W związku z tym odpowiedź 4-AP była postrzegana jako podejście, które demaskuje natywne polisynaptyczne obwody DH o znaczeniu biologicznym, a nie jako epifenomen wywołany przez lek. Co więcej, aktywność indukowana przez 4-AP wykazuje podobny profil odpowiedzi na leki przeciwbólowe i przeciwpadaczkowe jak stany bólu neuropatycznego i została wykorzystana do zaproponowania nowych celów leków przeciwbólowych opartych na rdzeniu, takich jak connexins20,21,22.

Tutaj opisany jest preparat, który łączy MEA i chemiczną aktywację rdzeniowego DH za pomocą 4-AP w celu zbadania tego obwodu nocyceptywnego na poziomie makro-obwodu, czyli na poziomie analizy sieci. Podejście to zapewnia stabilną i powtarzalną platformę do badania obwodów nocyceptywnych w naiwnych i neuropatycznych warunkach "podobnych" do bólu. Preparat ten jest również łatwo stosowany do testowania działania znanych leków przeciwbólowych na poziomie obwodu oraz do badań przesiewowych nowych leków przeciwbólowych w nadpobudliwym rdzeniu kręgowym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Badania przeprowadzono na samcach i samicach myszy c57Bl/6 w wieku od 3 do 12 miesięcy. Wszystkie procedury eksperymentalne zostały wykonane zgodnie z wytycznymi Komitetu ds. Opieki i Etyki nad Zwierzętami Uniwersytetu w Newcastle (protokoły A-2013-312 oraz A-2020-002).

1. Elektrofizjologia in vitro

  1. Przygotowanie roztworów do preparowania skrawków rdzenia kręgowego i rejestracji
    1. Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy
      UWAGA: Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (aCSF) jest stosowany w komorze inkubacyjnej typu interface, w której skrawki są przechowywane do momentu rozpoczęcia rejestracji, a podczas eksperymentów służy zarówno jako perfuzat, jak i rozcieńczalnik leków. Szczegółowy skład przedstawiono w Tabeli 1.
ChemicznyaCSF (mM)aCSF (g/100 ml)Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (aCSF) z substytucją sacharozą (mM)aCSF z substytucją sacharozą (g/100 ml)aCSF o wysokiej zawartości potasu (mM)aCSF z wysoką zawartością potasu (g/100 ml)
Chlorek sodu (NaCl)1180.690--1180.690
Węglan sodu(IV) (NaHCO₃)3)250.210250.210250.210
Glukoza100.180100.180100.180
Chlorek potasu (KCl)2.50.0192.50.0194.50.034
Wodorofosforan sodu (NaH2PO4)10.01210.01210.012
Chlorek magnezu (MgCl2)2)10.0110.0110.01
chlorek wapnia (CaCl2)2.50.0282.50.0282.50.028
Sacharoza--2508.558--

Tabela 1: Składy sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego.Skrót: aCSF = sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy.

  1. Przygotować aCSF zawierający (w mM) 118 NaCl, 25 NaHCO3, 10 glukozy, 2.5 KCl, 1 NaH2PO4, 1 MgCl2 oraz 2.5 CaCl2, dodając wymagane ilości powyższych składników, z wyjątkiem CaCl2, do 2 L wody destylowanej.
  2. Przewietrzyć powyższy roztwór karbogenem (95% O2, 5% CO2) przez 5 min, a następnie dodać CaCl2.
    UWAGA: Krok ten zapobiega wytrącaniu się CaCl2, tzn. roztwór nie powinien stać się mętny. W celu aplikacji leków podczas eksperymentów należy rozcieńczyć roztwory zapasowe leków w aCSF do pożądanych stężeń końcowych.
  1. Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy z substytucją sacharozą
    UWAGA: aCSF z substytucją sacharozą jest stosowany podczas sekcji i krojenia rdzenia kręgowego. Jak wynika z nazwy, NaCl zastąpiono sacharozą, aby zmniejszyć pobudzenie neuronów podczas tych procedur przy jednoczesnym zachowaniu osmolarności. Szczegółowy skład znajduje się w Tabeli 1.
    1. Przygotować aCSF z substytucją sacharozą zawierający (w mM) 250 sacharozy, 25 NaHCO3, 10 glukozy, 2,5 KCl, 1 NaH2PO4, 1 MgCl2 oraz 2,5 CaCl2, dodając wymagane ilości wszystkich powyższych składników, z wyjątkiem CaCl2, do 300 mL wody destylowanej.
    2. Napowietrzać roztwór karbogenem przez 5 min, a następnie dodać CaCl2.
    3. Przechowywać roztwór w zamrażarce w temperaturze -80 °C przez około 40 min lub do momentu, aż roztwór przybierze konsystencję papki. Należy unikać całkowitego zamrożenia i używać roztworu, gdy ma on konsystencję papki.
  1. Przygotowanie macierzy mikroelektrod
    UWAGA: Powierzchnia styku MEA wymaga wstępnej obróbki w celu nadania jej właściwości hydrofilowych.
    1. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy wypełnić studzienkę MEA surowicą z płodu bydlęcego (FBS) lub surowicą konią (HS) na 30 min.
    2. Usunąć FBS lub HS i dokładnie wypłukać MEA, wykonując około pięciu płukań wodą destylowaną, aż woda destylowana przestanie się pienić. Napełnić dołek gotowym do użycia roztworem aCSF.
  2. Przygotowanie ostrych skrawków rdzenia kręgowego
    UWAGA: Przygotowanie skrawków rdzenia kręgowego myszy przebiegało zgodnie z opisem przedstawionym wcześniej przez Smith i współpracowników.2W idealnym przypadku usunięcie zgrubienia lędźwiowo-krzyżowego nie powinno zająć więcej niż 8–10 min (kroki 1.3.2–1.3.11 poniżej).
    1. Głęboko znieczul mysz, podając 100 mg/kg ketaminy (i.p.), a następnie przeprowadź dekapitację za pomocą dużych nożyc chirurgicznych.
    2. Usuń skórę z obszaru brzucha, wykonując niewielkie nacięcie skóry na wysokości bioder. Odciągnij skórę po obu stronach nacięcia w kierunku rostralnym, aż zostanie usunięta cała skóra, tj. od górnej krawędzi klatki piersiowej do górnej krawędzi miednicy (zarówno brzusznie, jak i grzbietowo).
    3. Umieścić ciało na lodzie i zastosować dostęp brzuszny w celu odsłonięcia kolumny kręgowej poprzez usunięcie wszystkich organów wewnętrznych oraz przecięcie żeber bocznie w stosunku do mostka.
    4. Usuń brzuszna część klatki piersiowej, obie łopatki (odciąć mniej więcej na wysokości T2) oraz kończyny dolne i miednicę (odciąć mniej więcej na górnej krawędzi kości krzyżowej).
    5. Przenieś preparat kręgosłupa i żeber do kąpieli sekcyjnej zawierającej schłodzony do temperatury lodowej płyn aCSF z sacharozą. Przypnij wszystkie cztery narożniki preparatu (powierzchnią brzuszna do góry), wbijając piny przez mięśnie dolnej części pleców oraz przylegające górne żebra.
    6. Za pomocą kuretek usuń wszystkie mięśnie i tkankę łączną pokrywającą powierzchnię brzuszną kręgów, a następnie zidentyfikuj odcinek kręgosłupa znajdujący się nad zgrubieniem lędźwiowo-krzyżowym, które położone jest mniej więcej pod ciałami kręgów od T12 do L2.
    7. Usunąć trzon kręgu znajdujący się gudałowo względem obszaru poszerzenia lędźwiowo-krzyżowego, aby uzyskać dostęp do rdzenia kręgowego znajdującego się w kanale kręgowym.
    8. Za pomocą zakrzywionych nożyczek sprężynowych należy przeciąć obustronnie kręgi łukowe, jednocześnie unosząc i odciągając trzon kręgu w kierunku rostralnym, aby rozdzielić brzuszny i grzbietowy aspekt kręgów i odsłonić rdzeń kręgowy.
    9. Po usunięciu ciał kręgów w celu odsłonięcia zgrubienia lędźwiowo-krzyżowego, należy ostrożnie wyciąć nożyczkami sprężynowymi pozostałe korzenie kotwiczące rdzeń kręgowy, aż do momentu, gdy rdzeń będzie swobodnie unosić się w płynie.
    10. Wyizoluj rdzeń kręgowy, wykonując cięcia rostralne i kaudalne odpowiednio powyżej i poniżej zgrubienia lędźwiowo-krzyżowego, tak aby docelowy obszar rdzenia pozostał swobodnie zawieszony.
      UWAGA: Preferowana orientacja przekroju określi sposób późniejszego zamocowania rdzenia w celu wykonania sekcji (Rycina 1).
    11. W przypadku przekrojów poprzecznych należy unieść segment lędźwiowo-krzyżowy za przyczepiony korzeń i umieścić go na wcześniej dociętym bloku polistyrenowym (styropianowym) (1 cm x 1 cm x 1 cm) z wyciętym w centrum płytkim kanałem. Należy użyć kleju cyjanoakrylowego (patrz: Tabela materiałów) aby przymocować blok i sznur do platformy sekcyjnej i umieścić go w kąpieli tnącej zawierającej lodowaty aCSF z sacharozą (zawiesinę).
      UWAGA: Płytki kanał pomaga w unieruchomieniu i zorientowaniu rdzenia kręgowego, tak aby strona grzbietowa była odsłonięta, a odcinek piersiowy rdzenia znajdował się u dołu bloku.
    12. W przypadku przekrojów strzałkowych na platformie sekcyjnej nanieś cienką linię kleju cyjanoakrylowego, unieś powiększenie lędźwowo-krzyżowe za przyczepiony korzeń i umieść rdzeń wzdłuż linii kleju, upewniając się, że jedna powierzchnia boczna znajduje się w kleju, a druga jest skierowana ku górze. Umieść go w kąpieli tnącej zawierającej lodowaty aCSF z sacharozą (zawiesina).
    13. W przypadku przekrojów poziomych na platformę sekcyjną nanieś cienką linię kleju cyjanoakrylowego. Unieś powiększenie lędźwiowo-krzyżowe za przytwierdzony korzeń i ułóż je wzdłuż linii kleju, upewniając się, że powierzchnia brzuszna znajduje się w kleju, a powierzchnia grzbietowa jest skierowana ku górze. Wykorzystaj przytwierdzone korzenie do ustawienia rdzenia. Umieść go w kąpieli tnącej zawierającej lodowaty aCSF z sacharozą (zawiesinę).

Schemat przekrojów rdzenia kręgowego: przekroje poprzeczne, strzałkowe i poziome z zaznaczonym położeniem rogów tylnych.
Rysunek 1: Orientacja przekrojów rdzenia kręgowego, metody montażu i cięcia. (A) Przekroje poprzeczne wymagają styropianowego bloku do cięcia z wyciętym w nim rowkiem stabilizującym. Rdzeń kręgowy opiera się o blok w rowku stabilizującym, tak aby strona grzbietowa była skierowana w stronę przeciwną do bloku. Blok i rdzeń są przyklejane do platformy tnącej za pomocą kleju cyjanoakrylowego. (B) Przekroje strzałkowe przygotowuje się poprzez nałożenie cienkiej linii kleju cyjanoakrylowego na platformę tnącą, a następnie ułożenie rdzenia kręgowego na boku na kleju. (C) Przekroje poziome przygotowuje się poprzez nałożenie cienkiej linii kleju cyjanoakrylowego na platformę tnącą, a następnie ułożenie rdzenia kręgowego stroną brzuszną do dołu na kleju. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Przygotować skrawki o grubości 300 µm (L1-L5, ta sama grubość niezależnie od orientacji), używając wibratomu z następującymi ustawieniami: prędkość 0,06 mm/s, amplituda 2,50 mm, skalibrowanego z dokładnością do ±0,02 odchylenia amplitudy wysokości.
  2. Przenieść skrawki do komory inkubacyjnej z interfejsem powietrznym zawierającej natleniony aCSF.
  3. Przed rozpoczęciem pomiarów pozostawić skrawki do wyrównania przez 1 h w temperaturze pokojowej (20-24 °C).
  1. Rejestracje z macierzy mikroelektrod
    UWAGA: Poniższe kroki szczegółowo opisują sposób rejestrowania danych z eksperymentów opartych na MEA na skrawkach rdzenia kręgowego. W zależności od eksperymentu można zastosować kilka konstrukcji MEA. Szczegóły konstrukcyjne macierzy MEA wykorzystanych w tych eksperymentach przedstawiono w Tabeli 2 oraz na Ryc. 2. Szczegółowe informacje projektowe zostały opublikowane przez Egerta i współpracowników26 oraz Thiebauda i współpracowników27 odpowiednio dla planarnych i trójwymiarowych (3D) MEA. Oba typy MEA składają się z 60 elektrod z azotku tytanu, z izolacyjną warstwą azotku krzemu oraz ścieżkami i polami kontaktowymi z azotku tytanu.
    1. Układ eksperymentalny
      1. Włącz komputer i płytę interfejsu, a następnie uruchom oprogramowanie do rejestracji.
      2. Wczytaj wcześniej przygotowany szablon rejestracji (Ryc. 3A). Nazwij pliki na dany dzień w zakładce rejestratora.
      3. Przez cały czas trwania eksperymentu stale napowietrzaj aCSF karbogenem (5% CO2, 95% O2).
      4. Uruchom system perfuzji sterowany pompą perystaltyczną. Umieść linię wlotową w aCSF, a koniec wylotowy w zlewce z odpadami. Przepłucz linie perfuzyjne roztworem aCSF.
      5. Przygotuj 4-AP oraz inne roztwory leków, rozcieńczając roztwory zapasowe w 50 mL aCSF do wymaganego stężenia końcowego (np. 200 µM dla 4-AP).
      6. Umieść roztwory leków w naczyniach z lekami i napowietrzaj je karbogenem.
    2. Aktywność indukowana 4-AP
      1. Po inkubacji przenieś pojedynczy skrawka z inkubatora, używając pipety Pasteura z szeroką końcówką wypełnionej aCSF.
      2. Umieść skrawka w studience MEA i dodaj dodatkowy aCSF.
      3. Ustaw skrawka nad 60-elektrodową macierzą rejestrującą za pomocą cienkiego pędzla z miękkim włosiem. Unikaj kontaktu pędzla z elektrodami oraz przeciągania tkanki po elektrodach, szczególnie w przypadku stosowania macierzy 3D.
        UWAGA: W zależności od układu MEA, można to wykonać z pomocą mikroskopu lub bez niej, aby zapewnić dokładne pozycjonowanie.
      4. Po ustawieniu skrawka nałóż na tkankę obciążoną siatkę, aby utrzymać ją w miejscu i zapewnić dobry kontakt z elektrodami MEA.
        UWAGA: Po nałożeniu siatki może być konieczne ponowne ustawienie skrawka.
      5. Umieść MEA w głowicy rejestrującej (Ryc. 2A,B).
      6. Sprawdź pozycję tkanki nad elektrodami za pomocą mikroskopu odwróconego (powiększenie 2x), aby potwierdzić, że jak najwięcej elektrod znajduje się pod powierzchownym rogiem grzbietowym (SDH). Upewnij się, że co najmniej 2-6 elektrod nie kontaktuje się ze skrawkiem, ponieważ elektrody te są istotne dla odejmowania szumów i artefaktów rejestracji podczas analizy (Ryc. 2E).
      7. Włącz kamerę, podłącz ją do urządzenia i wykonaj zdjęcie referencyjne skrawka względem MEA do wykorzystania podczas analizy.
      8. Naciśnij Start DAQ w oprogramowaniu do rejestracji i upewnij się, że wszystkie elektrody odbierają wyraźny sygnał.
        UWAGA: Jeśli sygnał jest zaszumiony, odepnij głowicę i oczyść zarówno pola kontaktowe MEA, jak i złote styki sprężynowe 70% etanolem (użyj chusteczki laboratoryjnej, aby upewnić się, że pola i styki są suche po czyszczeniu). Jeśli sygnał nadal jest zaszumiony, wyłącz wadliwe elektrody w oprogramowaniu do rejestracji lub zanotuj to w celu ich późniejszego wykluczenia podczas analizy.
      9. Podłącz linie wlotowe i wylotowe perfuzji do studzienki MEA (wcześniej wypełnionej aCSF) i uruchom system perfuzji. Sprawdź szybkość przepływu, idealnie 4-6 objętości kąpieli na minutę, i upewnij się, że odpływ jest wystarczający, aby zapobiec przelewaniu się superfuzatu.
      10. Pozostaw tkankę do równowagi przez 5 min, a następnie zarejestruj 5 min surowych, niefiltrowanych danych bazowych.
      11. Przenieś linię wlotową perfuzji z aCSF do roztworu 4-AP i odczekaj 12 min, aż rytmiczna aktywność indukowana 4-AP osiągnie stan stacjonarny (2 min na dotarcie leków do kąpieli i 10 min na osiągnięcie szczytu aktywności, a następnie plateau).
      12. Zarejestruj 5 min aktywności indukowanej 4-AP. Bądź przygotowany na kolejne rejestracje w celu przetestowania leków lub sprawdzenia stabilności 4-AP.
Układy macierzy mikroelektrod
Model macierzy mikroelektrod60MEA 200/30iR-Ti60-3DMEA 100/12/40iR-Ti60-3DMEA 200/12/50iR-Ti60MEA 500/30iR-Ti
Planarna czy trójwymiarowa (3D)Planarna3D3DPlanarna
Siatka elektrod8 x 88 x 88 x 86 x 10
Rozstaw elektrod200 µm100 µm200 µm500 µm
Średnica elektrody30 µm12 µm12 µm30 µm
Wysokość elektrody (3D)N/A40 µm50 µmN/A
EksperymentyPrzekrój poprzecznyPrzekrój poprzecznySagitalny + poziomySagitalny + poziomy

Tabela 2: Układy macierzy mikroelektrod.

Układ MEA i schematy; system perfuzyjny i matryce elektrod do analizy sygnałów tkankowych.
Rycina 2: Pozycjonowanie tkanki na matrycy mikroelektrod. (A) Zdjęcie przedstawia otwarty moduł wejściowy MEA z umieszczoną w odpowiedniej pozycji matrycą MEA. (B) To samo co w A, z zamkniętym modułem wejściowym MEA do rejestracji oraz zamontowanym systemem perfuzji tkanek. (C) Zdjęcie przedstawia matrycę MEA w formie dostarczonej przez producenta. Widoczne są piny kontaktowe, które łączą się ze złotymi sprężynami modułu wejściowego, oraz kąpiel tkankowa MEA, w której znajduje się roztwór kąpielowy i skrawka tkanki. Obszar zaznaczony czerwonym kwadratem w centrum to miejsce rozmieszczenia matrycy elektrod. (D) Schematy przedstawiają dwie konfiguracje elektrod MEA zastosowane w tej badaniu, z dalszymi szczegółami zaprezentowanymi w Tabeli 2. Elektroda referencyjna jest oznaczona niebieskim trapezem. Lewy układ elektrod MEA przedstawia kwadratową konfigurację 60 elektrod, najczęściej stosowaną w przedstawionej pracy – modele 60MEA200/30iR-Ti z elektrodami o średnicy 30 μm rozmieszczonymi w odstępach 200 μm, lub trójwymiarowe MEA z odstępami 200 μm i 100 μm (60MEA200/12/50iR-Ti oraz 60MEA100/12/40iR-Ti) z elektrodami o średnicy 12 μm i wysokości odpowiednio 50 μm lub 40 μm. Prawy układ elektrod MEA przedstawia prostokątowy układ 6 x 10 elektrod – 60MEA500/30iR-Ti. (E) Zdjęcie przy dużym powiększeniu kwadratowej matrycy 60MEA100/12/40iR-Ti z pozycjonowanym do rejestracji poprzecznym skrawkiem rdzenia kręgowego. Skrawka spoczywa na rzędach elektrod 3-8. Górny rząd elektrod, które nie mają kontaktu z tkanką, służy jako elektrody referencyjne. Obszar SDH widoczny jest jako półprzezroczysty pas. W tym przypadku SDH pokrywa elektrody w rzędach 4, 5 i 6 oraz kolumnach 2, 3, 4, 5 i 7 matrycy MEA. Pasek skali = 200 µm. Skróty: MEA = matryca mikroelektrod; SDH = powierzchowna róg tylny. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Wymiana skrawków
    1. Po każdej sesji rejestracji wypłucz linie za pomocą aCSF.
    2. Wyjmij MEA z wzmacniacza przedwzmacniaczowego (headstage).
    3. Wyjmij siatkę i tkankę z otworu MEA, dokładnie wypłucz je roztworem aCSF, a następnie powtórz powyższe kroki z nowym skrawkiem.

2. Przetwarzanie i analiza danych

UWAGA: Poniższe kroki szczegółowo opisują sposób korzystania z oprogramowania analitycznego w eksperymentach MEA na skrawkach rdzenia kręgowego. Jedna z 60 elektrod służy jako referencja wewnętrzna (oznaczona trapezem na Rysunku 2 C,D), natomiast od czterech do dwudziestu pięciu pozostałych 59 elektrod jest rozmieszczonych pod SDH w skrawku rdzenia kręgowego dorosłej myszy. Kolejna analiza służy do wykrywania przebiegów potencjału czynnościowego zewnątrzkomórkowego (EAP) oraz lokalnego potencjału polowego (LFP) (przykłady见 Rysunek 3B) z surowego sygnału w tym obszarze.

  1. Przetwarzanie danych surowych
    1. Otwórz oprogramowanie analityczne i załaduj przygotowany wcześniej układ analizy (Rysunek 3B).
    2. Otwórz wybrany plik i odznacz elektrodę odniesienia (elektroda 15 w konfiguracji MEA 8 x 8 lub elektroda E1 w konfiguracji MEA 6 x 10) oraz wszelkie elektrody uznane za nadmiernie zaszumione.
    3. Ustaw okno czasowe analizy (0:00 → 5:00 min).
    4. Przenieść do Filtr międzykanałowy zakładka Wybierz Złożone odniesienie i wybrać Elektrody odniesienia na podstawie wykonanego zdjęcia i notatek sporządzonych podczas eksperymentu (tj. tych elektrod, które nie znajdują się pod tkanką). Aby zastosować i sprawdzić to ustawienie, należy nacisnąć Przeglądaj przed kontynuacją.
    5. Przejdź do filtr EAP zakładka i zastosuj 2nd filtr Butterworth wysokoprzepustowy (częstotliwość odcięcia 200 Hz) w celu usunięcia aktywności LFP.
    6. Przenieś do filtr LFP zakładka i zastosuj 2nd pasmowo-przepustowy filtr Butterwortha o określonym rzędzie (zakres częstotliwości 0,5–4 Hz) w celu usunięcia aktywności EAP.
    7. Przenieś do detektor EAP zakładka i wybór Automatyczny próg. Wzrost populacji kleszczy i Przednia krawędź opadająca pudełka i ustawić Czas martwy do 0,5 ms.
    8. Zestaw Dodatni i Progi negatywne na podstawie danych. Przejrzyj dane, wracając do Analizator danych surowych ekran, przesuwając znacznik czasu, a następnie wracając do detektor EAP zakładka i naciskanie EksplorujPowtarzać czynność do momentu uzyskania pewności, że ustawiony próg detekcji rejestruje potencjały czynnościowe zewnątrzkomórkowe (EAPs), nie rejestrując jednocześnie szumów ani aktywności niefizjologicznej. Do identyfikacji szumów i aktywności niefizjologicznej należy wykorzystać elektrody referencyjne.
      UWAGA: Należy zapewnić, aby w elektrodach referencyjnych, w których nie będzie występować aktywność fizjologiczna, wykryto minimalną liczbę potencjałów czynnościowych zewnątrzkomórkowych (EAP). Niemniej jednak niewielkie odchylenia linii bazowej mogą zostać błędnie zinterpretowane jako EAP. Jednocześnie należy dążyć do maksymalizacji liczby wykrytych rzeczywistych zdarzeń w elektrodach aktywnych.
    9. Przenieś do detektor LFP karta, wybrać Próg manualny, kleszcz Wzrost i Krawędź opadająca pudełka i ustawić Czas martwy do 3 ms.
    10. Powtórz krok 2.1.8 dla jednej elektrody, wybierając elektrodę z aktywnością LFP. Po uzyskaniu satysfakcjonującego rezultatu wybierz Zastosuj do wszystkich ponieważ podczas ręcznego wyznaczania progów będą one stosowane tylko do pojedynczej elektrody.
    11. Podczas analizy danych LFP w Detektor w zakładce zanotuj maksymalną liczbę przekroczeń progu dla pojedynczego przebiegu LFP oraz maksymalny odstęp czasowy między przekroczeniami progu dla pojedynczego przebiegu LFP do wykorzystania w późniejszej analizie.
    12. Naciśnij Rozpocznij analizę.
    13. Po zakończeniu analizy przejdź do analizator EAP przetabuluj i wyeksportuj dane. Postąp w ten sam sposób w przypadku analizator LFP tab.
    14. Powtórz ten proces dla wszystkich pozostałych plików z tego samego przekroju.
    15. Po eksporcie danych przekonwertuj pliki do formatu xlsx, aby mogły zostać odczytane przez użyty skrypt programistyczny. Nazwij pliki zgodnie z poniższą konwencją, aby dostarczony skrypt mógł je odczytać: nazwa eksperymentu (np. sample data) – numer warstwy (np. S1) – numer rejestracji (np. R1) – typ aktywności (np. spikes lub SPs, odpowiadające odpowiednio EAPs lub LFPs).
      UWAGA: Opisana tutaj analiza EAP traktuje impulsowanie z poszczególnych kanałów jako pojedynczą populację, mimo że aktywność ta zazwyczaj wynika z aktywności wielu neuronów znajdujących się w bliskim sąsiedztwie elektrody rejestrującej. Jeśli wymagana jest liczba neuronów przyczyniających się do powstania EAP w danym kanale, można zastosować opisane w innych źródłach techniki sortowania wielopików, aby rozróżnić poszczególne populacje impulsów na podstawie charakterystyki przebiegu sygnału.28.

Przetwarzanie sygnałów neuronalnych w systemie MEA, schemat danych elektrofizjologicznych i analizy impulsów.
Rycina 3: Układy narzędzi do rejestracji i analizy danych oraz przykładowe zapisy z macierzy mikroelektrod przedstawiające kształty potencjałów czynnościowych zewnątrzkomórkowych oraz lokalnych potencjałów polowych. (A) Schemat przedstawia skonfigurowany szablon rejestracji wykorzystywany do pozyskiwania danych MEA. Połączenie MEA2100 z narzędziem rejestrującym (głowicą wzmacniającą/wzmacniaczem) umożliwia nazwanie i zapisanie danych. Cztery przykładowe ślady surowych danych (po prawej, epoki 5-minutowe) zostały zebrane przez jeden kanał MEA, wykazując aktywność w punkcie wyjściowym, 12 min po aplikacji 4-AP, kolejne 15 min po ustabilizowaniu aktywności wywołanej przez 4-AP oraz po kąpieli z zastosowaniem TTX (1 µM). Należy zauważyć, że dodanie 4-AP (drugi ślad) powoduje wyraźny wzrost szumu tła oraz aktywności EAP/LFP. Co istotne, aktywność pozostaje stosunkowo stabilna przez co najmniej 15 min po ustabilizowaniu aktywności indukowanej przez 4-AP (trzeci ślad). Dodanie TTX (1 µM) znosi całą aktywność (dolny ślad). (B) Schemat (po lewej) przedstawia konfigurację oprogramowania analitycznego do analizy danych. Narzędzie eksploratora surowych danych służy do importu zapisów zebranych przez oprogramowanie rejestrujące. Dane te są następnie przetwarzane przez narzędzie filtra międzykanałowego, które odejmuje sygnały z wybranych elektrod referencyjnych od sygnałów z innych elektrod w celu usunięcia szumu tła. Dane przechodzą przez narzędzia filtra EAP i filtra LFP, aby zoptymalizować stosunek sygnału do szumu dla każdego kształtu fali. Po tym kroku dane ze ścieżki EAP trafiają do narzędzia detektora EAP, w którym ustawiane są progi. Potencjały EAP są wykrywane, a następnie przesyłane do narzędzia analizatora EAP, gdzie rejestrowane są latencje każdego zdarzenia i eksportowane do pliku txt. Identyczny przebieg pracy zachodzi dla danych LFP przy użyciu odpowiadającego im zestawu narzędzi LFP. Ślady po prawej stronie przedstawiają dane z pojedynczego kanału MEA zawierające różne zewnątrzkomórkowe kształty fal. Położenie sygnałów EAP i LFP jest wyróżnione na powyższych „rasterach zliczeń”. Dolne ślady to epoki z górnego zapisu (oznaczone czerwonymi paskami), pokazujące kształty fal w powiększonej skali czasowej, w tym różne sygnały LFP (zauważalna różnorodność wyglądu) i pojedyncze zewnątrzkomórkowe EAP (czerwone okręgi). Należy zauważyć, że kształt fali i polaryzacja LFP/EAP różnią się w zależności od liczby neuronów generujących te sygnały, ich bliskości do elektrody rejestrującej oraz ich lokalizacji względem pobliskich elektrod. Skróty: MEA = macierz mikroelektrod; EAP = zewnątrzkomórkowy potencjał czynnościowy; LFP = lokalny potencjał polowy; 4-AP = 4-aminopirydyna; TTX = tetrodotoksyna. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Analiza synchroniczności
    UWAGA: Synchroniczność, czyli liczba zdarzeń „zbieżnych” między dwiema elektrodami, została określona przy użyciu kryterium zbieżności w ramach metody synchronizacji A-SPIKE opisanej przez Satuvuori et al.29. W celu zwiększenia wydajności użyty tutaj skrypt porównuje jedynie elektrody sąsiadujące ze sobą (tj. sąsiadów w poziomie, pionie i po przekątnej); skrypt można jednak przeredagować tak, aby porównywać wszystkie elektrody, jeśli jest to wymagane.
    1. Przeprowadź analizę danych za pomocą niestandardowego skryptu programistycznego, który wyodrębnia znaczniki czasu latencji dla każdej elektrody z plików .xlsx.
      UWAGA: Można to zrobić ręcznie.
    2. W kroku 2.1.11 zapisz maksymalną liczbę przekroczeń progu oraz maksymalną separację czasową przekroczeń progu dla jednego przebiegu LFP. Przed uruchomieniem skryptu zmodyfikuj go, wprowadzając te parametry definiujące LFP dla każdego przekroju.
      UWAGA: Progowanie wykonane wcześniej w oprogramowaniu analitycznym wyraźnie rejestruje EAP jako pojedyncze zdarzenie. Jednak LFP składają się ze zmiennej liczby szczytów, w zależności od kształtu przebiegu i późniejszej liczby przekroczeń progu przez to jedno zdarzenie.
    3. Zmodyfikuj skrypt, aby wprowadzić interesujące elektrody przed rozpoczęciem analizy.
    4. Aby określić synchroniczność (zdefiniowaną w skrypcie za pomocą modyfikowalnych ram czasowych, w których musi wystąpić aktywność synchroniczna), oddziel i przeanalizuj wyodrębnione latencje w celu wykrycia zdarzeń zbieżnych.
      UWAGA: Skrypt umożliwia ustawienie maksymalnego czasu między zdarzeniami zbieżnymi. Wartości te zostały ustawione na 20 ms dla EAP i 200 ms dla LFP.
    5. Uruchom skrypt, aby wyodrębnić znaczniki czasu latencji.
      UWAGA: Plik wyjściowy .xlsx zawiera interpretacje danych latencji, którymi są liczby, częstotliwości oraz liczby zdarzeń zbieżnych dla EAP i LFP w odniesieniu do poszczególnych elektrod i całych przekrojów. Dane te są wykorzystywane do oceny częstotliwości, liczby EAP/LFP, liczby aktywnych elektrod, liczby zdarzeń zbieżnych, liczby powiązanych elektrod oraz średniej siły tych powiązań.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Model aktywności sieci w rogach tylnych rdzenia kręgowego
Aplikacja 4-AP niezawodnie indukuje synchroniczną aktywność rytmiczną w rogach tylnych (DH) rdzenia kręgowego. Aktywność ta przejawia się pod postacią zwiększonej liczby potencjałów czynnościowych zewnątrzkomórkowych (EAPs) oraz potencjałów polowych (LFPs). Ten drugi sygnał jest falą o niskiej częstotliwości, która była wcześniej opisywana w pomiarach MEA.30Zmiany w aktywności EAP i/lub LFP po podaniu leku odzwierciedla...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Pomimo znaczenia rdzenia DH w sygnalizacji nocyceptywnej, przetwarzaniu i wynikających z tego reakcjach behawioralnych i emocjonalnych, które charakteryzują ból, obwody w tym regionie pozostają słabo poznane. Kluczowym wyzwaniem w badaniu tego problemu była różnorodność populacji neuronów, które składają się na te obwody 6,31,32. Ostatnie postępy w technologiach transgenicznych, na czele z optogenetyką i chemogenetyką, zaczynają...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez National Health and Medical Research Council (NHMRC) z Australii (granty 631000, 1043933, 1144638 i 1184974 dla B.A.G. i R.J.C.) oraz Hunter Medical Research Institute (grant dla B.A.G. i R.J.C.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4-aminopirydynaSigma-Aldrich275875-5G
100% etanolThermo FisherAJA214-2.5LPL
CaCl2 1MBanksia Scientific0430/1L
Carbonox (Carbogen - 95% O2, 5% CO2)Coregas219122
Zakrzywione nożyczki sprężynowe z długim uchwytemFine Science Tools15015-11
Wykonana na zamówienie komora
Surowica bydlęca płoduKleszcze10091130
Dumont #5Narzędzia Fine Science11251-30
GlukozaThermo FisherAJA783-500G
Surowica dla koniaThermo Fisher16050130
Mikroskop odwróconyZeissAxiovert10
KClThermo FisherAJA383-500G
KetaminaCevaKETALAB04
Duże nożyczki chirurgiczneFine Science Tools14007-14
Loctite 454 samoprzylepnebłyskawiczne i artykuły przemysłoweL4543G
MATLABMathWorksR2018b
MEAs, 3-wymiarowesystemy wielokanałowe60-3DMEA100/12/40iR-Ti, 60-3DMEA200/12/50iR-Ti60 elektrod z azotku tytanu (TiN) z 1 wewnętrzną elektrodą odniesienia, uporządkowaną w kwadratową siatkę 8x8. Elektrody są 12 i mikro; m średnicy, 40 i mikro; m (100/12/40) lub 50 &mikro; m (200/12/50) o wysokości i równych odstępach 100 &mikro; m (100/12/40) lub 200 &mikro; m (200/12/50) od siebie.
Stacja czołowa MEASystemy wielokanałoweMEA2100-HS60
Płyta interfejsu MEA SystemywielokanałoweMCS-IFB 3.0 Multiboot
MEA netSystemy wielokanałoweALA HSG-MEA-5BD
System perfuzyjny MEASystemy wielokanałowePPS2
MEAs, Planarnesystemy wielokanałowe60MEA200/30iR-Ti, 60MEA500/30iR-Ti60 elektrod z azotku tytanu (TiN) z 1 wewnętrzną elektrodą odniesienia, ułożonych w siatkę kwadratową 8x8 (200/30) lub prostokątną 6x10 (500/30). Elektrody są 30 i mikro; m średnicy i równo rozmieszczone 200 &mikro; m (200/30) lub 500 &mikro; m (500/30) od siebie.
MgCl2Thermo FisherAJA296-500G
Kamera mikroskopowaMoticMoticam X Wi-Fi
Multi Channel Analyser oprogramowanie MultichannelSystemsV 2.17.4
Multi Channel Experimenter oprogramowanieMultichannel SystemsV 2.17.4
NaClThermo FisherAJA465-500G
NaHCO3Thermo FisherAJA475-500G
NaH2PO4Thermo FisherACR207805000
RongeursNarzędzia do nauki16021-14
Małe nożyczki sprężynoweFine Science Tools91500-09
Małe nożyczki chirurgiczneFine Science Tools14060-09
SacharozaThermo FisherAJA530-500G
Superglueklej cyjanoakrylowy
TetrodotoksynaAbcamAB120055
Stół do tłumienia drgańNewportVH3048W-OPT
Mikrotom wibracyjnyLeicaVT1200 S
inkubacyjna z interfejsem powietrzaThermo Fisher

Bibliografia

  1. Smith, K. M., et al. Calretinin positive neurons form an excitatory amplifier network in the spinal cord dorsal horn. eLife. 8, 49190(2019).
  2. Smith, K. M., et al. Functional heterogeneity of calretinin-expressing neurons in the mouse superficial dorsal horn: implications for spinal pain processing. The Journal of physiology. 593 (19), 4319-4339 (2015).
  3. Boyle, K. A., et al. Defining a spinal microcircuit that gates myelinated afferent input: Implications for tactile allodynia. Cell Reports. 28 (2), 526-540 (2019).
  4. Browne, T. J., et al. Transgenic cross-referencing of inhibitory and excitatory interneuron populations to dissect neuronal heterogeneity in the dorsal horn. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 32(2020).
  5. Graham, B. A., Hughes, D. I. Rewards, perils and pitfalls of untangling spinal pain circuits. Current Opinion in Physiology. 11, 35-41 (2019).
  6. Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 823-836 (2010).
  7. Hughes, D. I., Todd, A. J. Central nervous system targets: inhibitory interneurons in the spinal cord. Neurotherapeutics. 17 (3), 874-885 (2020).
  8. Duan, B., et al. Identification of spinal circuits transmitting and gating mechanical pain. Cell. 159 (6), 1417-1432 (2014).
  9. Hachisuka, J., Chiang, M. C., Ross, S. E. Itch and neuropathis itch. Pain. 159 (3), 603(2018).
  10. Foster, E., et al. Targeted ablation, silencing, and activation establish glycinergic dorsal horn neurons as key components of a spinal gate for pain and itch. Neuron. 85 (6), 1289-1304 (2015).
  11. Bourane, S., et al. Identification of a spinal circuit for light touch and fine motor control. Cell. 160 (3), 503-515 (2015).
  12. Cheng, L., et al. Identification of spinal circuits involved in touch-evoked dynamic mechanical pain. Nature neuroscience. 20 (6), 804-814 (2017).
  13. Peirs, C., et al. Mechanical allodynia circuitry in the dorsal horn is defined by the nature of the injury. Neuron. 109 (1), 73-90 (2021).
  14. Huang, J., et al. Circuit dissection of the role of somatostatin in itch and pain. Nature Neuroscience. 21 (5), 707-716 (2018).
  15. Obien, M. E. J., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. Revealing neuronal function through microelectrode array recordings. Frontiers in Neuroscience. 8, 423(2015).
  16. Nam, Y., Wheeler, B. C. In vitro microelectrode array technology and neural recordings. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39 (1), 45-61 (2011).
  17. Johnstone, A. F., et al. Microelectrode arrays: a physiologically based neurotoxicity testing platform for the 21st century. Neurotoxicology. 31 (4), 331-350 (2010).
  18. Stett, A., et al. Biological application of microelectrode arrays in drug discovery and basic research. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 377 (3), 486-495 (2003).
  19. Xu, L., et al. Trends and recent development of the microelectrode arrays (MEAs). Biosensors and Bioelectronics. 175 (1), 112854(2020).
  20. Chapman, R. J., Cilia La Corte, P. F., Asghar, A. U. R., King, A. E. Network-based activity induced by 4-aminopyridine in rat dorsal horn in vitro is mediated by both chemical and electrical synapses. The Journal of Physiology. 587, Pt 11 2499-2510 (2009).
  21. Ruscheweyh, R., Sandkühler, J. Epileptiform activity in rat spinal dorsal horn in vitro has common features with neuropathic pain. Pain. 105 (1-2), 327-338 (2003).
  22. Kay, C. W., Ursu, D., Sher, E., King, A. E. The role of Cx36 and Cx43 in 4-aminopyridine-induced rhythmic activity in the spinal nociceptive dorsal horn: an electrophysiological study in vitro. Physiological Reports. 4 (14), 12852(2016).
  23. Jankowska, E., Lundberg, A., Rudomin, P., Sykova, E. Effects of 4-aminopyridine on synaptic transmission in the cat spinal cord. Brain Research. 240 (1), 117-129 (1982).
  24. Semba, K., Geller, H. M., Egger, M. D. 4-Aminopyridine induces expansion of cutaneous receptive fields of dorsal horn cells. Brain Research. 343 (2), 398-402 (1985).
  25. Ruscheweyh, R., Sandkühler, J. Long-range oscillatory Ca2+ waves in rat spinal dorsal horn. European Journal of Neuroscience. 22 (8), 1967-1976 (2005).
  26. Egert, U., et al. A novel organotypic long-term culture of the rat hippocampus on substrate-integrated multielectrode arrays. Brain Research Protocols. 2 (4), 229-242 (1998).
  27. Thiebaud, P., De Rooij, N., Koudelka-Hep, M., Stoppini, L. Microelectrode arrays for electrophysiological monitoring of hippocampal organotypic slice cultures. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 44 (11), 1159-1163 (1997).
  28. Rey, H. G., Pedreira, C., Quiroga, R. Q. Past, present and future of spike sorting techniques. Brain Research Bulletin. 119, 106-117 (2015).
  29. Satuvuori, E., et al. Measures of spike train synchrony for data with multiple time scales. Journal of Neuroscience Methods. 287, 25-38 (2017).
  30. Mendis, G. D. C., Morrisroe, E., Reid, C. A., Halgamuge, S. K., Petrou, S. Use of local field potentials of dissociated cultures grown on multi-electrode arrays for pharmacological assays. 38th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. , 952-956 (2016).
  31. Hughes, D. I., et al. Morphological, neurochemical and electrophysiological features of parvalbumin-expressing cells: a likely source of axo-axonic inputs in the mouse spinal dorsal horn. The Journal of Physiology. 590 (16), 3927-3951 (2012).
  32. Peirs, C., Seal, R. P. Neural circuits for pain: recent advances and current views. Science. 354 (6312), 578-584 (2016).
  33. Li, J., Baccei, M. L. Developmental regulation of membrane excitability in rat spinal lamina I projection neurons. Journal of Neurophysiology. 107 (10), 2604-2614 (2012).
  34. Li, J., Baccei, M. L. Pacemaker neurons within newborn spinal pain circuits. Journal of Neuroscience. 31 (24), 9010-9022 (2011).
  35. Sandkühler, J., Eblen-Zajjur, A. Identification and characterization of rhythmic nociceptive and non-nociceptive spinal dorsal horn neurons in the rat. Neuroscience. 61 (4), 991-1006 (1994).
  36. Lucas-Romero, J., Rivera-Arconada, I., Roza, C., Lopez-Garcia, J. A. Origin and classification of spontaneous discharges in mouse superficial dorsal horn neurons. Scientific Reports. 8 (1), 9735-9735 (2018).
  37. Antonio, L., et al. L. al. In vitro seizure like events and changes in ionic concentration. Journal of Neuroscience Methods. 260, 33-44 (2016).
  38. Avoli, M., Jefferys, J. G. Models of drug-induced epileptiform synchronization in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 260, 26-32 (2016).
  39. Taccola, G., Nistri, A. Low micromolar concentrations of 4-aminopyridine facilitate fictive locomotion expressed by the rat spinal cord in vitro. Neuroscience. 126 (2), 511-520 (2004).
  40. Mitra, P., Brownstone, R. M. An in vitro spinal cord slice preparation for recording from lumbar motoneurons of the adult mouse. Journal of Neurophysiology. 107 (2), 728-741 (2012).
  41. Egert, U., Heck, D., Aertsen, A. Two-dimensional monitoring of spiking networks in acute brain slices. Experimental Brain Research. 142 (2), 268-274 (2002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Aktywność rogów tylnychskrawki rdzenia kręgowegostymulacja 4-aminopirydynąrejestracja aktywności sieciowejlokalne potencjały polowepozakomórkowe potencjały czynnościowemodele przewlekłego bólunapięciowo zależne kanały sodowe
Rejestrowanie aktywności sieci w obwodach nocyceptywnych rdzenia kręgowego za pomocą układów mikroelektrod
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.