Artykuł metodologiczny

Przygotowanie mykobakteryjnego zapalenia błony naczyniowej oka (PMU) jako model poinfekcyjnego zapalenia błony naczyniowej oka

4.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62925

⸱

17 grudnia 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, University of Washington, 2Academic Unit of Ophthalmology, Translational Health Sciences, University of Bristol

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje kroki do wywołania Primed Mycobacterial Uveitis (PMU) u myszy. Ta metoda przedstawia kroki, które pomogą w wytworzeniu niezawodnego i solidnego zapalenia oka w systemie modelu mysiego. Korzystając z tego protokołu, wygenerowaliśmy oczy błony naczyniowej oka i nieobjęte stanem zapalnym inne oczy od pojedynczych zwierząt w celu dalszej oceny za pomocą testów immunologicznych, transkryptomicznych i proteomicznych.

Streszczenie

Termin 'zapalenie błony naczyniowej oka' opisuje niejednorodny zestaw stanów, z których wszystkie charakteryzują się zapaleniem wewnątrzgałkowym. Ogólnie rzecz biorąc, zapalenie błony naczyniowej oka definiuje się na podstawie etiologii: infekcji lub autoimmunizacji. Zakaźne zapalenie błony naczyniowej oka wymaga leczenia odpowiednimi środkami przeciwdrobnoustrojowymi, podczas gdy autoimmunologiczne zapalenie błony naczyniowej oka wymaga leczenia kortykosteroidami lub innymi środkami immunosupresyjnymi. Poinfekcyjne zapalenie błony naczyniowej oka jest formą przewlekłego zapalenia błony naczyniowej oka, która wymaga kortykosteroidów w celu kontrolowania następstw immunologicznych po początkowej infekcji. Zapalenie błony naczyniowej oka związane z zakażeniem Mycobacterium tuberculosis (Mtb) jest dobrze rozpoznaną formą poinfekcyjnego zapalenia błony naczyniowej oka, ale mechanizmy choroby nie są w pełni poznane. Aby zrozumieć rolę, jaką antygeny mykobakteryjne i wrodzone ligandy odgrywają w stymulowaniu przewlekłego zapalenia oczu po zakażeniu gruźlicą mTB, opracowano model Primed Mycobacterial Uveitis (PMU) do stosowania u myszy. W artykule przedstawiono metody generowania PMU i monitorowania klinicznego przebiegu stanu zapalnego za pomocą obrazowania dna oka i optycznej koherentnej tomografii (OCT). PMU jest indukowany przez immunizację ekstraktem z prątków zabitych termicznie, a następnie wstrzyknięcie tego samego ekstraktu do ciała szklistego do jednego oka siedem dni później. Zapalenie oka jest monitorowane podłużnie za pomocą obrazowania in vivo, a następnie pobiera się próbki do szerokiego zakresu testów, w tym histologii, cytometrii przepływowej, analizy cytokin, qPCR lub sekwencjonowania mRNA. Mysi model PMU jest użytecznym nowym narzędziem do badania odpowiedzi oczu na gruźlicę, mechanizmu przewlekłego zapalenia błony naczyniowej oka, oraz do przedklinicznych testów skuteczności nowych terapii przeciwzapalnych.

Wprowadzenie

Termin 'zapalenie błony naczyniowej oka' opisuje niejednorodny zestaw stanów, z których wszystkie charakteryzują się zapaleniem wewnątrzgałkowym1. Zwierzęce modele zapalenia błony naczyniowej oka są ważne dla zrozumienia mechanizmów choroby i badań przedklinicznych nowych terapii. Stworzono wiele zwierzęcych modeli zapalenia błony naczyniowej oka2. Dwa, które zostały najszerzej zbadane, to eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie błony naczyniowej oka (lub zapalenie błony naczyniowej oka; EAU) i zapalenie błony naczyniowej oka wywołane endotoksynami (EIU). EAU jest zwykle generowany przez immunizację antygenami oka lub może wystąpić spontanicznie, gdy centralna tolerancja jest zakłócona przy braku genu AIRE 3,4. Od tego czasu opracowano inne warianty modelu5,6,7, aby uwzględnić różne peptydy uveitogenne; Zostały one szczegółowo sprawdzone8,9,10. EAU jest podstawowym modelem dla form autoimmunologicznego zapalenia błony naczyniowej oka zależnego od limfocytów T, takich jak choroba Vogta-Koyanagi-Harada i zapalenie błony śluzowej u ludzi. EIU jest generowany przez ogólnoustrojowe lub miejscowe wstrzyknięcie bakteryjnego lipopolisacharydu (LPS)10,11. EIU został wykorzystany jako model ostrego zapalenia błony naczyniowej oka generowanego przez aktywację wrodzonych immunologicznych szlaków sygnałowych12. Oba modele odegrały zasadniczą rolę w obecnym zrozumieniu immunologii oka, ale żaden z nich nie jest skutecznym modelem dla poinfekcyjnego przewlekłego zapalenia błony naczyniowej oka. Niedawno opracowany u myszy, model Primed Mycobacterial Uveitis (PMU) zapewnia teraz podejście do badania i oceny klinicznych i komórkowych aspektów tej postaci zapalenia błony naczyniowej oka13.

Na całym świecie występuje wysoka częstość występowania infekcji prątkami, z ponad 10 milionami nowych przypadków i ponad 1,4 miliona zgonów zgłoszonych przez Światową Organizację Zdrowia w 2019 roku14. Pozapłucna manifestacja czynnej gruźlicy (TB) obejmuje zapalenie błony naczyniowej oka i jest dobrze znaną przyczyną zakaźnego zapalenia błony naczyniowej oka15,16. Objawy zapalenia błony naczyniowej oka związanego z gruźlicą są proteuszowe, co prawdopodobnie odzwierciedla wiele odrębnych mechanizmów choroby, w tym bezpośrednią infekcję oka, a także mniej dobrze poznane zapalenie o podłożu immunologicznym17,18,19. Proponowane mechanizmy tych następstw poinfekcyjnych obejmują przewlekłą reakcję zapalną stymulowaną przez utrzymywanie się infekcji pauc-bakillary w nabłonku barwnikowym siatkówki (RPE), przewlekłą reakcję zapalną stymulowaną przez obecność szczątkowych wzorców molekularnych związanych z patogenem (PAMP) z pomyślnie usuniętej infekcji oka oraz niewłaściwą aktywację adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej przeciwko antygenom ocznym poprzez proces mimikry molekularnej lub antygenu rozprzestrzenianie się spowodowane ogólnoustrojowym zakażeniem gruźlicą20,21,22,23.

W celu lepszego zrozumienia przewlekłego poinfekcyjnego zapalenia błony naczyniowej oka i zbadania roli antygenów mykobakteryjnych w inicjacji choroby, opracowano model PMU do użytku u myszy13,24. W związku z tym, aby wywołać stan zapalny, mysz najpierw otrzymuje podskórne wstrzyknięcie antygenu z zabitego termicznie szczepu Mycobacterium tuberculosis H37Ra w celu naśladowania infekcji ogólnoustrojowej, a następnie siedem dni później wstrzyknięcie doszklistkowe tego samego antygenu podawanego do lewego lub prawego oka w celu naśladowania miejscowej infekcji oka. Intensywność i czas trwania wynikającego z tego zapalenia błony naczyniowej oka są monitorowane za pomocą podłużnej optycznej koherentnej tomografii in vivo (OCT) i obrazowania dna oka25. PMU charakteryzuje się ostrym, zdominowanym przez szpik zapaleniem błony naczyniowej oka, które przekształca się w przewlekłe zapalenie tylnego błony naczyniowej oka z dominacją limfocytów T z zapaleniem ciała żywotnego, okołonaczyniowym zapaleniem siatkówki i ogniskowymi obszarami zewnętrznego uszkodzenia siatkówki26. Obecność ziarniniakowego zapalenia w tylnym segmencie oka sugeruje, że model PMU może być wykorzystany do badania niektórych form przedniego (ziarniniakowego i nieziarniniakowego) i pośredniego zapalenia błony naczyniowej oka, obserwowanego u pacjentów z immunologicznymi dowodami przebytego zakażenia Mtb27. Dodatkowo, zasugerowano, że składniki zabijanego termicznie Mtb stosowane w modelu PMU wyzwalają odpowiedzi immunologiczne leżące u podstaw aspektów nawracającego zapalenia błony naczyniowej oka u pacjentów z gruźlicą oka, którzy reagują na terapię przeciwgruźliczą (ATT)28. Ze względu na różnice w inicjacji choroby i przebiegu stanu zapalnego w porównaniu z EAU i EIU, PMU stanowi nowy zwierzęcy model zapalenia błony naczyniowej oka, który nie jest zależny od immunizacji antygenami oka i może pomóc w wyjaśnieniu mechanizmów choroby u pacjentów z przewlekłym zapaleniem błony naczyniowej oka. Protokół ten określa metody generowania PMU, monitorowania klinicznego przebiegu stanu zapalnego oraz pobierania próbek z oka do analizy pośmiertnej za pomocą cytometrii przepływowej.

Protokół

Wszystkie przeprowadzone procedury zostały zatwierdzone lokalnie przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania na Uniwersytecie Waszyngtońskim (protokół badania na zwierzętach # 4481-02) lub zgodnie z licencją brytyjskiego Ministerstwa Spraw Wewnętrznych (PPL 30/3281) i Grupą Oceny Etycznej Uniwersytetu w Bristolu. Eksperymenty przeprowadzone w obu instytucjach były zgodne z oświadczeniem Stowarzyszenia Badań nad Wzrokiem i Okulistyką (ARVO) dotyczącym wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wizualnych. PMU wygenerowano u 6-10-tygodniowych myszy C57BL / 6J; wszystkie myszy ważyły co najmniej 18 g w momencie indukcji zapalenia błony naczyniowej oka i potwierdzono ujemny wynik mutacji rd8 genu Crb129. Myszy utrzymywano za pomocą standardowej karmy i wody leczniczej (paracetamol 200-300 mg / kg / dzień) ad libitum w określonych warunkach wolnych od patogenów. Eutanazja zwierząt została przeprowadzona przy użyciu standardowej metody inhalacji dwutlenkiem węgla30.

1. Preparat antygenowy do wstrzyknięcia podskórnego

  1. Wszystkie procedury opisane w tej sekcji należy wykonać wewnątrz dygestorium chemicznego, aby zapobiec wdychaniu lub kontaktowi skóry z proszkiem Mtb H37Ra. Postępuj zgodnie z zasadami swojej instytucji dla kompletnego adiuwanta Freunda (zwykle BSL-1). Obejmuje to stosowanie rękawic odpornych na chemikalia, okularów ochronnych i ochronnej odzieży roboczej (fartuch laboratoryjny).
  2. Stosuj dobrą sterylną technikę, aby zapobiec zanieczyszczeniu odczynników, które zostaną wprowadzone do zwierząt doświadczalnych.
  3. Sporządzić zawiesinę Mtb w PBS, mieszając 5 mg liofilizowanego, zabitego termicznie proszku M. tuberculosis H37Ra z 2,5 ml zimnego PBS w probówce do mikrowirówek o pojemności 5 ml. Wiruj raz przez 30 sekund, a następnie umieść na lodzie.
  4. Aby wytworzyć drobną zawiesinę H37Ra w PBS, należy sonikować zawiesinę na lodzie przez 5 minut.
    1. Zwolnij korpus konwertera i wyczyść sondę wacikiem nasączonym alkoholem o stężeniu 70% (v/v).
    2. Włącz sonikator, ustaw moc na 4, obracając pokrętło regulacji mocy i zanurz końcówkę sondy w proszku mykobakteryjnym zawierającym PBS. Upewnij się, że końcówka sondy jest zanurzona do co najmniej połowy głębokości próbki i że końcówka sondy nie dotyka ścianki probówki mikrowirówkowej.
  5. Sonikować mieszaninę na lodzie przez 30 s, zrobić przerwę na 30 s i powtarzać łącznie przez 5 minut, aby w pełni rozproszyć proszek do równomiernej zawiesiny bez podgrzewania cieczy.
  6. Dodać 2,5 ml niekompletnego adiuwantu Freunda do mieszaniny i powtarzać proces sonikacji na lodzie, aż emulsja utworzy konsystencję przypominającą pastę do zębów.
  7. Ustaw moc na 0 za pomocą pokrętła sterującego i wyłącz urządzenie, aby zakończyć sonikację. Zdejmij końcówkę z zawieszenia i przetrzyj sondę wacikiem nasączonym alkoholem.
  8. Emulsję antygenową należy przechowywać w temperaturze 4 °C. Wytwarzanie partii emulsji pomoże zapewnić spójność między eksperymentami. Emulsję można przechowywać w temperaturze 4 °C do 3 miesięcy.

2. Wstrzyknięcie podskórne

  1. Wykonać wstrzyknięcie podskórne na tydzień przed wstrzyknięciem do ciała szklistego (oznaczone jako dzień -7).
  2. Załadować strzykawkę o pojemności 1 ml (bez dołączonej igły) z emulsją prątkową. Ze względu na lepkość i nieprzezroczystość emulsji, strzykawkę mogą wypełnić trudne do zauważenia pęcherzyki powietrza.
    1. Aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza w strzykawce, po załadowaniu 0,2-0,3 ml emulsji, odwróć strzykawkę (końcówką skierowaną do góry) i delikatnie postukaj strzykawką kilkakrotnie w krawędź blatu, aby pęcherzyki wypłynęły na powierzchnię.
  3. Usunąć powietrze ze strzykawki i kontynuować napełnianie strzykawki. Odwróć i co jakiś czas stukaj, aż zostanie napełniony.
  4. Umieścić igłę 25 G na strzykawce i przesunąć emulsję, aby napełnić igłę. Przechowywać strzykawkę na lodzie do czasu jej użycia.
  5. Aby bezpiecznie wykonać wstrzyknięcie podskórne, należy znieczulić mysz lub zastosować humanitarne metody krępowania, które umożliwiają łatwy dostęp do zadu zwierzęcia 31.
  6. Aby znieczulić zwierzę do wstrzyknięcia podskórnego, należy umieścić zwierzę w komorze indukcyjnej izofluranu (3%-4% w przypadku indukcji i 1%-3% w przypadku podtrzymania). Po znieczuleniu upewnij się, że mysz ma powolną częstość oddechów i nie wykazuje żadnych oznak niewydolności oddechowej.
  7. Wstrzyknięcia podskórne należy umieścić na grzbietowej powierzchni bioder lub na brzusznej powierzchni nóg proksymalnie do okolicy pachwinowych węzłów chłonnych.
    1. Ostrożnie wprowadzić igłę, aby zapobiec wstrzyknięciu do mięśnia. Wstrzyknąć 0,05 ml emulsji Mtb w przestrzeń podskórną. Nie należy natychmiast wyjmować igły, aby umożliwić pełne wstrzyknięcie gęstej emulsji.
    2. Powtórzyć wstrzyknięcie po lewej i prawej stronie, w sumie 0,1 ml na zwierzę.
  8. W przypadku znieczulenia umieść mysz na ciepłej poduszce grzewczej do całkowitego wyzdrowienia. Nie pozostawiaj myszy bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka.
  9. Po całkowitym wyzdrowieniu należy umieścić mysz z powrotem w klatce i oznaczyć kartę klatki datą wstrzyknięcia podskórnego.
  10. Przeciwbólowe należy stosować doustnie paracetamol (200 mg/kg/dobę), ale nie NLPZ, ponieważ środki przeciwzapalne mogą wpływać na indukcję zapalenia błony naczyniowej oka.

3. Preparat antygenu do iniekcji doszklistkowej

  1. Wszystkie procedury opisane w tej sekcji należy wykonać w odpowiednich sterylnych warunkach, aby zapobiec zanieczyszczeniu zawiesiny MTB do ciała szklistego.
  2. Wykonać zawiesiny doszklistkowe.
    1. W celu indukcji łagodnego do umiarkowanego zapalenia błony naczyniowej oka, należy przygotować zawiesinę doszklistkową o stężeniu 5 mg/ml, dodając 5 mg ekstraktu z prątków do 1 ml 1x PBS.
    2. W celu indukcji umiarkowanego do ciężkiego zapalenia błony naczyniowej oka, należy przygotować zawiesinę doszklistkową o stężeniu 10 mg/ml, dodając 10 mg ekstraktu z prątków do 1 ml 1x PBS.
  3. Wiruj raz przez 30 sekund, a następnie umieść na lodzie.
  4. Aby wytworzyć drobną zawiesinę H37Ra w PBS, należy sonikować zawiesinę na lodzie przez 10 minut, jak opisano w kroku 1.4. Roztwór podstawowy rozmieścić w objętości 100 μl i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  5. Przed użyciem rozmrozić w temperaturze pokojowej i wirować na wysokich obrotach przez 1 minutę. Porcje należy przechowywać na lodzie podczas transportu do obiektu dla zwierząt.

4. Zabieg iniekcji do ciała szklistego w dniu 0

  1. Przygotowanie zwierząt
    1. Załóż dopasowane rękawiczki do badań, umieść mysz na wadze, aby uzyskać jej wagę w gramach.
    2. Wykonać dootrzewnowe wstrzyknięcie 0,02 ml/g masy ciała roztworu zawierającego 100 mg/ml ketaminy i 20 mg/ml ksylazyny zmieszanej ze sterylną wodą w celu znieczulenia zwierzęcia. Alternatywne podejście obejmuje indukcję przy użyciu ~1,5% izofluranu (wziewnego).
    3. Odczekaj około 2 minut, aż mysz zaśnie, a następnie umieść mysz w podgrzewanym pudełku i przykryj pokrywę. Wykonaj testy odruchów bólowych, takie jak szczypanie ucha, palców u nóg i ogona, aby ocenić głębokość znieczulenia do zabiegu32.
    4. Po zaśnięciu znieczulij rogówkę 1 kroplą 0,5% (v/v) tetrakainy. Unikaj dostania się tetrakainy w pobliżu nosa lub ust myszy. Po 10 s zetrzyj nadmiar płynu.
      UWAGA: Zaobserwowano, że rozszerzenie tęczówki i wizualizacja komory przedniej (AC) ulegają poprawie po podaniu znieczulenia miejscowego, prawdopodobnie z powodu lepszego tłumienia odruchów rogówkowych za pomocą połączonego znieczulenia ogólnoustrojowego i miejscowego. Jednak w razie potrzeby ten krok można pominąć.
    5. Rozszerz źrenicę za pomocą 1 kropli 2,5% (v/v) fenylefryny. Zachowaj ostrożność, aby uniknąć nadmiaru kropelek, które mogą dostać się do nosa lub ust. Po 2-3 minutach zetrzyj nadmiar płynu.
    6. Aby zmniejszyć ryzyko zapalenia wnętrza gałki ocznej, dodaj 1 kroplę 5% betadyny na powierzchnię oka i otaczające włosy. Pozostawić na oku na 2-3 min.
      UWAGA: Wszystkie procedury opisane w tej sekcji należy wykonywać w odpowiednich sterylnych warunkach, aby zapobiec zapaleniu wnętrza gałki ocznej.
    7. Usuń betadynę i przykryj oko hypromelozą (0,3%) lub karbomerowym żelem pod oczy 0,2% w/w), aby zapobiec wysuszeniu pod narkozą. Pomoże to również zapobiec powstawaniu zaćmy.
  2. Konfiguracja systemu mikroiniekcji
    1. Wykonaj wstrzyknięcie do ciała szklistego za pomocą mikropompy podłączonej do sterownika pompy mikrostrzykawkowej i strzykawki do wstrzykiwań (Rysunek 1A-C). Alternatywnie należy wykonać wstrzyknięcie za pomocą igły 33 G dołączonej do strzykawki Hamiltona, jak opisano w podpunkcie 4.4.
    2. Podłączyć igłę 34 G do uchwytu do wstrzykiwań, aby zmontować wtryskiwacz. Poluzować srebrną nakrętkę z przodu uchwytu do wstrzykiwań i wsunąć igłę w korpus uchwytu mniej więcej do połowy. Dokręć palcami srebrną nakrętkę.
    3. Podłączyć rurkę do uchwytu wtrysku, jak opisano w krokach 4.2.4-4.2.5.
    4. Aby włożyć rurkę do uchwytu wtryskowego, poluzuj plastikową z tyłu uchwytu, wsuń rurkę przez uszczelkę wewnątrz i dokręć.
    5. Należy zachować niewielką przerwę z końcem rurki, aby zapobiec uszkodzeniu rurki podczas wstrzykiwania. Patrz Rysunek 1C.
    6. Rozmrozić 100 μl podwielokrotności zawiesiny wyjściowej prątków.
    7. Dodać 3 μl 1% roztworu fluoresceiny sodowej (AK-Fluor) i dobrze odwirować.
    8. Załadować strzykawkę o pojemności 10 μl mieszanką antygenu i fluoresceiny, nie dodając żadnych pęcherzyków powietrza.
    9. Wyjąć igłę ładującą ze strzykawki i wsunąć rurkę przez srebrną uszczelkę nakrętki, aż końcówka osiągnie znak zera w korpusie strzykawki.
    10. Gdy końcówka rurki zostanie prawidłowo wyrównana w żądanej pozycji, dokręć palcami nakrętkę.
    11. Przepłukać roztwór w strzykawce przez rurkę do wstrzykiwań, aby w pełni naładować system. Następnie powtórzyć kroki 4.2.8-4.2.11, aby ponownie załadować strzykawkę do wstrzykiwań.
    12. Aby zainstalować załadowaną strzykawkę na mikropompie, naciśnij przycisk zwalniający zacisk na końcu mikropompy, aby otworzyć zaciski strzykawki.
    13. Umieścić nasadkę tłoka w uchwycie nasadki tłoka na tylnym końcu mikropompy.
    14. Następnie wsunąć kołnierz strzykawki na ogranicznik kołnierza, a korpus strzykawki do zacisku strzykawki.
    15. Zwolnij clamp przycisk i dokręcić mocującą tłok. Patrz Rysunek 1D.
    16. Wsunąć uchwyt do wstrzykiwań i igłę przez zacisk o kształcie litery O w stereotaktycznym aparacie do wstrzykiwań. Jest to platforma niestandardowa; Alternatywnie strzykawkę można trzymać i ustawiać ręcznie.
    17. Ustawić objętość infuzji i szybkość infuzji na sterowniku pompy mikrostrzykawkowej tak, aby wstrzykiwała odpowiednio 500 nl na cykl z szybkością 40 nL/s.
      UWAGA: Można stosować szybsze tempo wstrzykiwań, jednak przed osiągnięciem repozycji igły może wystąpić większy refluks
      18. .
    18. Przetestuj system, aby zapewnić prawidłowe działanie przed wykonaniem iniekcji do ciała szklistego.
      UWAGA: Gdy system iniekcyjny działa prawidłowo, aktywacja cyklu wstrzykiwania za pomocą pedału nożnego lub panelu sterującego spowoduje widoczny ruch uchwytu nasadki tłoka, a na końcu igły pojawi się niewielka kropla zielonkawego płynu. W przypadku, gdy płyn nie jest wytwarzany, należy aktywować dodatkowe cykle lub przepłukać i ponownie załadować strzykawkę.
    19. Przed wstrzyknięciem do oka należy delikatnie przetrzeć igłę płatkiem z 95% etanolu.
  3. Zabieg iniekcji do ciała szklistego
    1. Mysz umieszcza się na aparacie stereotaktycznym w celu wykonania procedury iniekcji.
    2. Utrzymuj scenę/platformę, na której spoczywa mysz, mocując 2-3 ręczniki papierowe na jej powierzchni.
    3. Umieść mysz w pozycji leżącej na platformie. Użyj prawego i lewego paska na ucho, aby delikatnie przymocować głowę zwierzęcia. Zapoznaj się z Rysunek 1E.
    4. Ustaw mysz i zorientuj się pod lunetą tak, aby widoczny był górny nosowy aspekt prawego oka.
    5. Za pomocą igły 30 G przesunąć rzęsy i odsłonić twardówkę. Wizualizuj rąbek i promieniowe naczynie krwionośne.
    6. Za pomocą sterylnej igły 30 G wykonaj otwór prowadzący w twardówce 1-2 mm za rąbkiem.
    7. Wprowadzić igłę 34 G przymocowaną do uchwytu do wstrzykiwań do oka przez otwór prowadzący pod kątem, który pozwoli uniknąć soczewki, ale umieścić końcówkę igły w jamie ciała szklistego.
    8. Za pomocą sterownika pompy mikrostrzykawkowej ostrożnie wstrzyknąć 1 μl ekstraktu Mtb do jamy ciała szklistego. W przypadku stałego refluksu należy zwiększyć objętość wstrzyknięcia do 1,5 μl, aby zapewnić odpowiednie podanie dawki.
      UWAGA: W przypadku kontroli pozorowanej należy wstrzyknąć 1 μl PBS w oko zwierzęcia.
    9. Sprawdź umieszczenie w ciele szklistym, wizualizując zielonkawy odruch w oku. Patrz Rysunek 1F.
    10. Po 10 sekundach wyjąć igłę z oka. Zwróć uwagę na refluks.
    11. Zdejmij mysz z platformy, umieść 0,3% hypromelozy lub 0,2% w/w maści karbomerowej do oczu na obu oczach w celu ochrony rogówki i przejdź do pudełka do podgrzewania regeneracji.
    12. Nie pozostawiaj myszy bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka. Nie wracaj do towarzystwa innych zwierząt, dopóki w pełni nie wyzdrowieją.
    13. Gdy mysz jest w pełni przytomna, wróć do klatki i dodaj butelkę z paracetamolem (200-300 mg/kg/dzień). Oznacz kartę klatki datą wstrzyknięcia IVT.
    14. Iniekcje doszklistkowe są na ogół dobrze tolerowane. Objawy kliniczne, które mogą wskazywać na ból i konieczność usunięcia z badania, obejmują łysienie okołogałkowe (wskazujące na samouraz), owrzodzenie rogówki, utratę masy ciała i zgarbioną postawę.
  4. Alternatywna metoda iniekcji doszklistkowej
    UWAGA: Ta procedura jest wykonywana przy użyciu mikroskopu operacyjnego i igły 33 G na mikrostrzykawce.
    1. Podeprzeć oko i przytrzymaj je w odpowiedniej pozycji za pomocą kleszczy.
    2. Następnie nałóż karbomerowy żel pod oczy 0,2% w/w lub 0,3% hypromelozowy żel pod oczy i umieść okrągłe szkiełko nakrywkowe (o średnicy 7 mm) na oko.
    3. Zamontuj igłę podskórną o wadze 33 g na strzykawce Hamiltona o pojemności 5 μl i wprowadź ją na około 2 mm obwodowo do rąbka rogówki pod kątem ~45°.
    4. Wprowadzić fazę igły do ciała szklistego, zatrzymując się między soczewką a tarczą nerwu wzrokowego (z względnego punktu widzenia chirurga jest to powyżej/zakrywając tarczę nerwu wzrokowego - około 1,5 mm od miejsca wprowadzenia) i powoli wstrzyknąć 2 μl Mtb (przy 2,5 ug/μL w PBS).
    5. Przytrzymać igłę na miejscu przez krótki czas (w celu zmniejszenia refluksu wstrzykiwanego płynu), a następnie ją wyjąć.
    6. Po wstrzyknięciu należy ponownie umieścić kulę ziemską, zwalniając kleszcze. W tym czasie można podać do oka kroplę 1% w/w maści chloramfenikolowej, aby zapewnić dodatkową ochronę przed zapaleniem wnętrza gałki ocznej po wstrzyknięciu.
    7. Po wstrzyknięciu przenieść się do rozgrzewającego pojemnika regeneracyjnego, jak wspomniano w krokach 4.3.11-4.3.13.

5. Obrazowanie OCT do wykrywania i ilościowego określania zapalenia błony naczyniowej oka

  1. Przygotowanie zwierząt
    1. Znieczulij mysz zgodnie z opisem w krokach 4.1.2-4.1.4
    2. Rozszerz źrenicę za pomocą 1 kropli 2,5% fenylefryny. Zachowaj ostrożność, aby uniknąć nadmiaru kropelek, które mogą dostać się do nosa lub ust. Po 2-3 minutach zetrzyj nadmiar płynu.
    3. Umieść 0,3% hypromelozy lub 0,2% w/w żelu karbomerowym na oku, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia. Pomoże to również zapobiec powstawaniu zaćmy.
    4. Owiń mysz warstwą gazy chirurgicznej, aby utrzymać ciepło ciała i umieść ją na kasecie ze zwierzęciem. Ustaw głowę z prętem zgryzowym.
  2. Zdobądź obrazy OCT komory przedniej i tylnej.
    UWAGA: W przypadku uzyskiwania obrazów przedniej i tylnej komory, najpierw uzyskaj obrazy tylnej komory (PC), aby zapobiec degradacji obrazu po powstaniu zaćmy. Powstawaniu zaćmy można zapobiec poprzez częste smarowanie i stosowanie 0,3% hypromelozy lub 0,2% w/w karbomerowego żelu pod oczy. W przypadku dłuższego obrazowania (>10 min) pomocne jest również utrzymywanie myszy w cieple (za pomocą podkładki grzewczej).
    1. Po włączeniu systemu obrazowania OCT zabezpiecz odpowiednią soczewkę obrazową i w razie potrzeby dostosuj pozycję ramienia referencyjnego.
    2. Otwórz oprogramowanie do obrazowania, utwórz unikalny identyfikator myszy i rozpocznij obrazowanie zgodnie z protokołem producenta OCT.
    3. Korzystając z opcji Free Run z protokołem szybkiego skanowania, ustaw oko tak, aby nerw wzrokowy był wyśrodkowany na obrazach komory tylnej lub wierzchołek rogówki na obrazach komory przedniej.
      UWAGA: Tabela 1 zawiera parametry protokołu obrazowania dla dwóch dostępnych na rynku systemów obrazowania małych zwierząt. Zapoznaj się z tabelą materiałów, aby zapoznać się ze specyfikacją produktu.
    4. W przypadku obrazowania tylnej komory należy zbliżyć OCT do powierzchni oka. Należy zachować ostrożność, aby nie dopuścić do kontaktu powierzchni soczewki z okiem.
    5. Po prawidłowym ustawieniu oka zatrzymaj szybkie skanowanie i wybierz protokół skanowania woluminu, a następnie aktywuj skanowanie za pomocą opcji Celowanie.
    6. W przypadku obrazów segmentu tylnego należy wyregulować, aż nerw wzrokowy zostanie wyśrodkowany na obrazie wyrównania poziomego B-Scan, a siatkówka zostanie wyrównana z osią wyrównania pionowego
    7. W przypadku obrazów segmentu przedniego dostosuj położenie, aby wyśrodkować wierzchołek rogówki zarówno na obrazie wyrównania B-Scan w poziomie, jak i na obrazie wyrównania B-Scan w pionie. Obecność artefaktu odbicia na obu obrazach potwierdzi prawidłowe wyrównanie. Następnie przesuń obraz w poziomie na tyle, aby usunąć artefakt odbicia. Zapoznaj się z Rysunek 2.
    8. Kliknij Migawka, aby przechwycić obraz skanowania woluminu, a następnie kliknij Zapisz.
    9. Następnie uzyskaj uśredniony skan linii centralnej. Otwórz protokół skanowania i kliknij Celowanie, a następnie Migawka. Kliknij prawym przyciskiem myszy ten sam panel, a następnie kliknij Średnia.
    10. Powtórz kroki 5.2.1-5.2.9 dla każdego oka z obiema soczewkami.
    11. Po zebraniu wszystkich obrazów wyjmij mysz z kasety i zapewnij ochronę rogówki podczas odzyskiwania, jak podano w krokach 4.3.11-4.3.13.

6. Ocenianie stanu zapalnego za pomocą OCT

  1. Oceń obrazy OCT z pomocą oceniających, którzy są zamaskowani do warunków leczenia.
    UWAGA: W przypadku PMU w modelu mysim zalecany jest system punktacji podany w Tabeli 2.
  2. Jeśli uzyskano zarówno obrazy komory przedniej (AC), jak i komory tylnej (PC), należy połączyć te wyniki, aby uzyskać ostateczny wynik dla każdego oka.
    UWAGA: Zapalenie komory przedniej ustępuje przed zapaleniem komory tylnej.

7. Ocena stanu zapalnego za pomocą histologii pośmiertnej

  1. Pod koniec eksperymentu zbierz pojedyncze oczy przez enukleację, utrwal 4% formaldehydu przez noc i przystąp do zatapiania parafiny, sekcji i barwienia H&E33.
    UWAGA: Zalecane są wielokrotne odcinki 4-8 μm wzdłuż osi nerwu źrenicowo-wzrokowego.
    UWAGA: Trzy sekcje na oko są oceniane przez zamaskowanego oceniającego przy użyciu systemu punktacji podanego w Tabeli 3, a średni wynik trzech sekcji jest podawany jako ostateczny wynik histologicznego zapalenia.

Wyniki

Niniejszy protokół przedstawia indukcję zapalenia błony naczyniowej oka u myszy z wykorzystaniem modelu zapalenia błony naczyniowej indukowanego przymiotowaniem mycobacteriami (PMU). Zapewnienie powtarzalności iniekcji podskórnej oraz precyzji iniekcji doplastycznej są kluczowymi etapami w opracowywaniu modelu zapalenia błony naczyniowej indukowanego przymiotowaniem mycobacteriami (PMU). Rysunek 1 przedstawia procedurę iniekcji doplastycznej u myszy z użyciem aparatu stereotaksycznego. Pręty uszne pomagają delikatnie ustawić głowę w tej samej pozycji pod mikroskopem (Rysunek 1E). Stabilizują one również głowę podczas procedury iniekcji doplastycznej, co zmniejsza ryzyko urazu podczas wkłucia. Po prawidłowym wykonaniu iniekcji fluoresceina zawarta w roztworze wstrzykiwanym wytwarza zielonkawy odblask wewnątrz oka, który jest widoczny pod mikroskopem lub z widoku bocznego, jak pokazano na Rysunku 1F.

Wykonanie protokołu zgodnie z opisem pozwala na wywołanie silnego ostrego zapalenia błony naczyniowej oka, które można wykryć za pomocą OCT i obrazowania dna oka już 10 h po wstrzyknięciu do ciała szklistego. Rysunek 2 przedstawia prawidłowe ustawienie oka do obrazowania OCT. W Tabeli 1A wymieniono parametry zastosowane w protokole OCT. Systematyczne podejście do pozyskiwania obrazów zapewni uzyskanie wysokiej jakości materiału, który można porównywać w czasie. Obrazy przedniej komory są centrowane na wierzchołku rogówki z wykorzystaniem obrazu SLO en face (Rysunek 2A), przy czym tęczówka jest ustawiona równolegle do płaszczyzny poziomej i pionowej (Rysunek 2B,C). Skanowanie objętościowe i liniowe jest wykonywane w orientacji pionowej, tak aby dolne i górne regiony można było obserwować jednocześnie. Obrazy odcinka tylnego są centrowane na nerwie wzrokowym z wykorzystaniem obrazu SLO en face (Rysunek 2D), a jasny pas nabłonka pigmentowego siatkówki (RPE) służy do ustawienia siatkówki równolegle do płaszczyzny poziomej i pionowej (Rysunek 2E,F).

Rycina 3 przedstawia typowe zmiany w zapaleniu oka wywołanym przez PMU w obrazowaniu OCT. Dwadzieścia cztery godziny po wstrzyknięciu do ciała szklistego w komorze przedniej oraz w ciele szklistym widoczne są komórki zapalne (Rysunek 3B). W przypadku stanu zapalnego o nasileniu umiarkowanym lub ciężkim w dolnym kącie komory przedniej (KP) widoczny będzie hipopion. Stopień stanu zapalnego oka można ocenić na tych obrazach OCT, korzystając z kryteriów wymienionych w Tabela 2Reprezentatywne przykłady obrazów wykazujące cechy stanu zapalnego typowe dla każdego stopnia oceny przedstawiono w Rycina 4Wyniki dla komory AC i PC można zsumować w celu uzyskania łącznego wyniku OCT. Wyniki łączone >0, ale ≤2,5 oznacza łagodny stan zapalny. Umiarkowany stan zapalny określa się na podstawie wyników >2,5 lecz ≤4,5. Wyniki >4.5 identyfikacja silnego stanu zapalnego. Stan zapalny zazwyczaj osiąga szczyt 48 h po wstrzyknięciu domacicznym, przy czym wyniki oceny OCT w komorze przedniej (AC) i tylnej (PC) mieszczą się w przedziale od 1 do 3 (łączna suma wyników od 2 do 6). Wyniki 0,5 lub 4 w AC i PC występują rzadziej. W przypadku częstego występowania wyników poza typowym zakresem może być konieczne przeprowadzenie analizy problemów w celu zidentyfikowania czynników przyczyniających się do wyników odstających (patrz sekcja dyskusja). Wyniki stanu zapalnego w komorze przedniej mają tendencję do powrotu do zera w ciągu jednego tygodnia po wstrzyknięciu domacicznym. W przeciwieństwie do tego, wyniki dla części tylnej nie wracają do zera; zamiast tego utrzymuje się niskopoziomowy przewlekły stan zapalny w postaci zapalenia ciała szklistego, a limfocyty okołonaczyniowe naciekają siatkówkę przez 1–2 miesiące po wstrzyknięciu domacznym.

Wskaźnik stanu zapalnego w PMU można również określić za pomocą badania histologicznego. Rycina 5 przedstawia reprezentatywne przekroje barwione H&E, wykorzystywane do oceny stopnia nasilenia PMU w badaniu histologicznym. Liczbę komórek zapalnych w komorze przedniej oraz w ciele szklistym przelicza się i wykorzystuje do określenia stopnia nasilenia stanu zapalnego zgodnie z kryteriami punktacji wymienionymi w Tabeli 3. Infiltracja komórek zapalnych w ciele rzęskowym jest powszechnie widoczna po jednej stronie przekroju histologicznego (zmiany jednostronne) przy łagodnym lub umiarkowanym zapaleniu. W przypadku ciężkiego zapalenia przejawia się to obecnością nacieku komórek zapalnych w ciele rzęskowym po obu stronach soczewki (określane jako zmiany obustronne). W późniejszych punktach czasowych po iniekcji domięśniowej można również zidentyfikować objawy zapalenia przewlekłego, w tym obecność leukocytów okołonaczyniowych i wewnątrzsiatkówkowych oraz fałdy zewnętrznej warstwy siatkówki. Histologia może być również pomocna w identyfikacji oczu dotkniętych błędami techniki iniekcji. Uraz soczewki podczas iniekcji domięśniowej można rozpoznać po obecności amorficznych, barwionych eozyną (na różowo) białek soczewki poza torebką soczewki, w sąsiedztwie miejsca urazu. Refluks mTB z ciała szklistego do przestrzeni podspojówkowej wywoła stan zapalny poza gałką oczną, który można zidentyfikować poprzez dokładną analizę struktur okołogałkowych widocznych na przekrojach. Ze względu na brak zatrzymania ekstraktu mTB wewnątrz oczu, oczy te będą zazwyczaj wykazywać niskie wskaźniki stanu zapalnego w badaniu OCT.

Obrazowanie dna oka w polu jasnym może być również wykorzystywane do identyfikacji klinicznie istotnych aspektów PMU, w tym rozwoju hipopionu, zapalenia ciała szklistego oraz nacieku komórek zapalnych w siatkówce lub okołonaczyniowo. Rysunek 6 przedstawia dwa przykłady, w których na zdjęciach dna oka widoczne jest zapalenie siatkówki i obszarów okołonaczyniowych. Te dwa oczy ukazują również zakres stanu zapalnego powszechnego w modelu PMU. Tabela 1B zawiera parametry zastosowane w systemie obrazowania dna oka/OCT siatkówki. Należy zwrócić uwagę na wpływ silnego stanu zapalnego na jakość obrazu (Rysunek 6, dzień 2, obrazy OCT i dna oka w górnym rzędzie) oraz na stopień zaawansowania choroby w 21. dniu. Obrzęk rogówki może również obniżać jakość obrazu podczas ostrego stanu zapalnego; jednak ciężki obrzęk rogówki wynikający z samego stanu zapalnego występuje rzadko. Częściej jakość obrazu ulega pogorszeniu wskutek uszkodzeń nabłonka spowodowanych niewystarczającą ochroną powierzchni oka podczas obrazowania i znieczulenia.

Model PMU może być wykorzystany do indukcji zapalenia błony naczyniowej oka u dowolnej rasy lub genotypu myszy. W oczach albinosów OCT nadal może służyć do oceny stopnia stanu zapalnego, jednak brak pigmentu w dnie oka utrudnia wizualizację zapalenia za pomocą obrazowania w świetle przechodzącym13,34. Badania pośmiertne mogą być prowadzone na tkankach oka, regionalnych węzłach chłonnych lub śledzionie. Przykłady obejmują testy na obecność komórek odpornościowych, takie jak cytometria przepływowa i immunohistochemia, oraz pomiary cytokin zapalnych. We wszystkich badanych punktach czasowych po zainicjowaniu stanu zapalnego za pomocą PMU (od 1. do 56. dnia), w poszczególnych oczach występuje wystarczająca liczba zapalnych komórek CD45+, aby wykryć wiele głównych populacji leukocytów w oku za pomocą wieloparametrowej analizy przepływowej12,35. Z zapalnych oczu można pobrać ciecz wodnistą (2-5 µL) oraz ciało szkliste (5-10 µL) w celu oznaczenia stężenia białek, badań proteomicznych lub oznaczenia stężenia cytokin36.

Układ pompy mikrosyrigowej Micro4, system iniekcyjny, eksperyment na zwierzętach, proces podawania leku.
Rysunek 1: Układ do iniekcji witreoretycznej u myszy. Iniekcję witreoretyczną w oku myszy przeprowadza się przy użyciu (A) sterownika pompy mikrosyrigowej połączonego z (B) mikropompą oraz (C) strzykawką iniekcyjną. Strzykawka jest napełniona i zamontowana na (D) mikropompie. Głowa myszy jest pozycjonowana za pomocą (E) uchwytów usznych, aby zapewnić stabilność i powtarzalność podczas procedury iniekcji witreoretycznej. (F) Fluoresceina w roztworze iniekcyjnym daje zielonkawy odblask z wnętrza oka po pomyślnym przeprowadzeniu procedury. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Obrazy optycznej koherentnej tomografii (OCT) przedstawiające przekroje siatkówki i rogówki do analizy.
Rysunek 2: Prawidłowe ustawienie oka do obrazowania OCT. (A) Wykorzystując obraz z en-face skanującego laserowego oftalmoskopu (SLO), oko zostaje wycentrowane do obrazowania przedniej komory. Zielona linia wskazuje położenie poziomego skanu liniowego przedstawionego na panelu (B). Należy zwrócić uwagę, że omijono centralną część rogówki, aby zmniejszyć artefakty odblaskowe. (C) Pionowy B-skan przez paracentralną część przedniej komory. Skan ten jest uzyskiwany pod kątem 90° względem skanu poziomego. Zauważmy, że fragmenty tęczówki po obu stronach soczewki są wyrównane w skanie poziomym (panel B) i ułożone jeden nad drugim w skanie pionowym (panel C). (D) Korzystając z obrazu SLO, obraz tylnej komory zostaje wycentrowany na nerwie wzrokowym. (E) Ustawienie poziomego B-skanu, (F) Ustawienie pionowego B-skanu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Postęp obrazowania siatkówki OCT; schemat; analiza komory przedniej/tylnej; badania wzroku.
Rysunek 3: Indukcja PMU wywołuje panuveitis, który można monitorować za pomocą podłużnego obrazowania OCT. Górny rząd przedstawia komorę przednią (AC); dolny rząd przedstawia obrazy OCT komory tylnej (PC), aby wyróżnić zmiany patologiczne w przebiegu choroby. (A) Bazowe obrazy OCT komory przedniej (góra) i tylnej (dół) przed indukcją zapalenia błony naczyniowej, oba z wynikiem 0. (B) Dzień 1 po wstrzyknięciu do ciała szklistego, wykazujący obecność obrzęku rogówki (czarna strzałka), hipopionu (*) licznych wolno pływających komórek zapalnych w komorze przedniej (białe strzałki) oraz zapalenia ciała szklistego (białe groty strzałek) w komorze tylnej. (C) Dzień 7 po wstrzyknięciu do ciała szklistego z nielicznymi komórkami w komorze przedniej na przedniej torebce soczewki (biała strzałka) i zmniejszonym zapaleniem ciała szklistego (biały grot strzałki). (D) Dzień 28 po wstrzyknięciu do ciała szklistego, komora przednia z ustąpionym zapaleniem AC i łagodnym zapaleniem ciała szklistego. Skróty: C – rogówka, L – soczewka, I – tęczówka, Aq – ciecz wodnista, V – ciało szkliste, RGC – komórki zwojowe siatkówki, PR – fotoreceptory, Ch – błona naczyniówkowa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Gradacja w optycznej koherentnej tomografii; schemat; ciężkość 0-4; ocena od prawidłowej do bardzo ciężkiej.
Rycina 4: Przykłady punktacji OCT. Każdemu obrazowi AC i PC przypisuje się punktację OCT od 0 do 4, korzystając z systemu kategorycznego przedstawionego w Tabeli 2. Wyniki AC i PC są sumowane w celu uzyskania końcowej punktacji OCT dla oka. (A,D) Przykłady punktacji zero. (B,E) Przykłady punktacji 0,5. (C,F) Przykłady punktacji 1. (G,J) Przykłady punktacji 2. (H,K) Przykłady punktacji 3. (I,L) Przykłady punktacji 4 przedstawiono na panelach I i L. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Schemat histologii oka; komora przednia, komórkowość ciała rzęsowego, ocena stanu zapalnego komórek ciała szklistego.
Rysunek 5: Przykłady oceny histologicznej. Ocena histologiczna jest określana na podstawie pięciu cech widocznych w przekrojach barwionych H&E: gęstości białek w komorze przedniej, liczby komórek w komorze przedniej, infiltracji komórek odpornościowych w ciele rzęsowym, gęstości komórek w ciele szklistym, zapalenia naczyń siatkówki oraz strukturalnych zmian siatkówki. Dla każdej cechy przypisuje się wynik od 0 do 2. Opis każdego wyniku znajduje się w Tabeli 3. Na tym rysunku przedstawiono reprezentatywne przykłady wyników 0-2 dla każdej cechy. Lewa kolumna obrazuje wynik zero. Środkowa kolumna pokazuje przykłady wyniku 1. Prawa kolumna pokazuje przykłady wyniku 2. Wynik 2 dla ciała rzęsowego przypisuje się, jeśli ciało rzęsowe po którejkolwiek stronie soczewki w tym samym przekroju wykazuje zapalenie komórkowe. Końcowy wynik histologiczny jest sumą punktów za każde z pięciu kryteriów (maksymalny wynik 10). Strzałka na dolnym prawym panelu wskazuje leukocyty okołonaczyniowe związane z powierzchownym naczyniem siatkówki. Czarny pasek skali oznacza 500 µm. Paski skali przy ciele rzęsowym oznaczają 100 µm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Porównanie ciężkiego i umiarkowanego stanu zapalnego za pomocą obrazowania dna oka i OCT; monitorowanie postępu stanu zapalnego.
Rycina 6: Podłużne obrazowanie dna oka w PMU pozwoliło zidentyfikować różny stopień nasilenia choroby. (A) W oczach z ciężkim stanem zapalnym w 2. dniu obserwuje się liczne białe nacieki w siatkówce oraz krętość naczyń w kolorowym obrazowaniu dna oka (górny rząd), a także gęste zapalenie ciała szklistego i obrzęk siatkówki w OCT (dolny rząd). Z czasem widoczny jest postęp w liczbie zmian siatkówkowych, podczas gdy stan zapalenia ciała szklistego ulega poprawie. Zielona linia wskazuje pozycję obrazu OCT. (B) W oczach z łagodnym stanem zapalnym stwierdzono mniej liczniejsze i bardziej odrębne zmiany liniowe w dnie oka oraz pewną liczbę komórek naciekowych w przestrzeni ciała szklistego. Pasek skali = 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

A
Przednia komora oka myszySkan szybki (Fast Scan)Skan objętościowy (Volume Scan)Skan liniowy (Linear Scan)
Długość x szerokość4.0 mm x 4.0 mm3.6 mm x 3.6 mm3.6 mm
Kąt09090
A-scan/B-Scan80010001000
Liczba B-skanów504001
Klatki/B-skan1320
Tylna komora oka myszySkan szybki (Fast Scan)Skan objętościowy (Volume Scan)Skan liniowy (Linear Scan)
Długość x szerokość1.6 mm x 1.6 mm1.6 mm x 1.6 mm1.6 mm
Kąt000
A-scan/B-Scan80010001000
Liczba B-skanów502001
Klatki/B-skan1320
B
Tylna komora oka myszySkan objętościowy (Volume Scan)Skan liniowy (Linear Scan)
Długość x szerokość0.9 mm x 0.9 mm1.8 mm
Kąt0Dowolny (zazwyczaj 0 lub 90)
A-scan/B-Scan10241024
Liczba B-skanów5121
Klatki/B-skan130

Tabela 1: Parametry skanowania. (A) Parametry skanowania OCT. (B) Parametry skanowania OCT dna oka/siatkówki

Opisy wyników OCT
WynikPrzednia komoraTylna komora
NABrak obrazowania poza przednią częścią rogówkiBrak obrazowania odcinka tylnego
0Brak stanu zapalnegoBrak stanu zapalnego
0,51–5 komórek w cieczy wodistejNieliczne komórki zajmujące mniej niż 10% obszaru ciała szklistego
LUB obrzęk rogówkiBrak nacieków podsiatkówkowych lub wewnątrzsiatkówkowych oraz brak zaburzeń architektury siatkówki
16–20 komórek w cieczy wodistejKomórki rozproszone (bez gęstych skupisk) zajmujące od 10 do 50% obszaru ciała szklistego.
LUB pojedyncza warstwa komórek na przedniej torebce soczewkiBrak nacieków podsiatkówkowych lub wewnątrzsiatkówkowych oraz brak zaburzeń architektury siatkówki
220–100 komórek w cieczy wodistejKomórki rozproszone (bez gęstych skupisk) zajmujące > 50% obszaru ciała szklistego
LUB mniej niż 20 komórek przy obecności hipopionuBrak nacieków podsiatkówkowych lub wewnątrzsiatkówkowych oraz brak zaburzeń architektury siatkówki
320–100 komórek w cieczy wodistejKomórki rozproszone odpowiadające stopniowi 2 i 1
ORAZ hipopion LUB błona źrenicznaORAZ co najmniej jedna gęsta zmętnia ciała szklistego zajmująca 10%–20% obszaru ciała szklistego LUB obecność komórek w ciele szklistym odpowiadająca stopniowi 2 i rzadkie (≤ 2) zmętnienia podsiatkówkowe lub wewnątrzsiatkówkowe
4Dowolna liczba komórek w cieczy wodistejGęsta zmętnia ciała szklistego zajmująca > 20% obszaru ciała szklistego.
ORAZ duży hipopion i błona źreniczna LUB utrata struktur przednich z powodu ciężkiego stanu zapalnegoLUB rozproszone komórki w ciele szklistym z dużymi zmętnieniami podsiatkówkowymi lub wewnątrzsiatkówkowymi

Tabela 2: Kryteria oceny OCT w PMU: Obrazy OCT są oceniane zgodnie z kryteriami wymienionymi w tabeli. Wyniki dla AC i PC są sumowane w celu uzyskania końcowej oceny oka. W przypadkach, gdy nie uzyskano wyraźnego obrazu oka, obrazom przypisano wynik NA i zostały one wykluczone z badania.

Opis oceny histologicznej
Charakterystyka012
Białko komory przedniej (AC)Nieliczne cząsteczki acelularne barwiące się eozyną w ACUmiarkowane, lecz niezlewne, pozakomórkowe barwienie eozyną w dowolnym miejscu w obrębie ACKonfluentne lub niemal konfluentne pozakomórkowe barwienie eozyną w obrębie AC
Komórki w przedniej komorze (AC)Brak komórek1–100 komórek, lecz bez gęstych agregatów komórkowych>100 komórek lub gęste agregaty komórek
Zapalenie ciała rzęsistegoBrak nacieku leukocytów w ciele rzęskowym lub w otaczającym ciele szklistymJednostronna obecność leukocytów infiltrujących ciało rzęsiste i/lub otaczające ciało rzęsiste ciało szkliste.Obustronna obecność leukocytów infiltrujących ciało rzęskowe i/lub otaczające ciało szkliste.
Zapalenie naczyń siatkówkiBrak naczyń siatkówkowych z leukocytami okołonaczyniowymiJedno naczynie na przekrój z leukocytami okołonaczyniowymi>1 naczynie na przekrój z leukocytami okołynaczyniowymi
Fałd lub uszkodzenie siatkówkiBrak uszkodzeń siatkówki1–3 fałdy siatkówki na przekrój>3 fałdy siatkówki na przekrój lub jakiekolwiek inne zniszczenie warstw siatkówki bądź krwotok wewnątrzsiatkówkowy

Tabela 3: Kryteria oceny histologicznej PMU: Przekroje oka barwione H&E oceniano na podstawie kryteriów wymienionych w tabeli. Oceniono trzy przekroje z tego samego oka i wyciągnięto z nich średnią, aby uzyskać końcowy wynik oceny histologicznej oka.

Dyskusja

Modele zwierzęce zapalenia błony naczyniowej oka odegrały zasadniczą rolę w zrozumieniu mechanizmów zapalenia i homeostazy oka, a także umożliwiły przedkliniczną ocenę terapii medycznych i chirurgicznych u pacjentów z zapaleniem błony naczyniowej oka37. Zarówno królicze, jak i szczurze warianty modelu PMU wykazały swoją wartość w terapii przedklinicznej poprzez badania potwierdzające słuszność koncepcji 38,39,40. Ze względu na dostępność różnorodnej gamy szczepów transgenicznych u myszy, ustanowienie mysiego systemu modelowego PMU pozwala teraz na bardziej szczegółowe badania mechanistyczne w celu zidentyfikowania określonych typów komórek, szlaków i genów, które przyczyniają się do patologii tej choroby.

Modele zwierzęce zapalenia błony naczyniowej oka mogą wykazywać zmienność między zwierzętami w zakresie występowania i intensywności stanu zapalnego41. W mysim szczepie C57BL/6 PMU jest niezawodnie generowany przy użyciu opisanego tutaj protokołu. Specyficzne dla szczepu różnice w przebiegu i nasileniu zapalenia błony naczyniowej oka odnotowano zarówno dla EAU, jak i EIU42,43. Chociaż wpływ specyficzny dla szczepu na nasilenie i przebieg PMU nie został zmierzony eksperymentalnie, model ten został wykorzystany u C57BL / 6J typu dzikiego, a także u myszy albinosów (B6 (Cg) -Tyrc-2J / J) i wywołał podobne reakcje zapalne. Podczas generowania modelu PMU, kontrolowanie poniższych zagadnień może pomóc nowym badaczom ograniczyć zmienność i uzyskać najbardziej spójne i powtarzalne zapalenie błony naczyniowej oka.

Zapewnić spójność wstrzyknięć podskórnych:
Aby zapewnić równomierne wstrzyknięcie podskórne, należy upewnić się, że wszystkie pęcherzyki powietrza zostały usunięte z emulsji. Należy wziąć pod uwagę krótką wirówkę (30 s przy 400 x g) gotowej emulsji przed załadowaniem strzykawki. Spowoduje to usunięcie powietrza uwięzionego w emulsji. Również podczas ładowania strzykawki należy okresowo odwracać (przechylać do góry) i postukać w strzykawkę, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza. Podczas wstrzykiwania nie należy umieszczać strzykawki zbyt głęboko, aby uniknąć wstrzyknięcia domięśniowego. I odwrotnie, płytkie (śródskórne) wstrzyknięcie może spowodować erozję emulsji przez skórę. Należy pamiętać o krótkiej przerwie przed wyjęciem strzykawki z miejsca wstrzyknięcia, aby zapewnić całkowite wstrzyknięcie gęstej, lepkiej emulsji i zapobiec refluksowi ze skóry.

Siedem dni po wstrzyknięciu podskórnym należy potwierdzić obecność wyczuwalnych guzków po obu stronach tylnych nóg. Jeśli nie można zidentyfikować żadnych guzków, możliwe, że wstrzyknięto powietrze, a nie emulsję. W takim przypadku ostry stan zapalny może nie być tak silny, a przewlekły stan zapalny może się nie rozwinąć.

Zapobiegaj rozwojowi zakaźnego zapalenia wnętrza gałki ocznej:
Bakteryjne lub grzybicze zapalenie wnętrza gałki ocznej wygeneruje zmienną zakłócającą, jeśli nie zostanie zapobieżone44. Aby zapobiec bakteryjnemu zapaleniu wnętrza gałki ocznej, zawsze stosuj dobrą technikę aseptyczną podczas sporządzania zawiesiny doszklistkowej, obsługi i czyszczenia wszystkich narzędzi wielokrotnego użytku, które będą miały kontakt z okiem. Ważne jest używanie sterylnych przedmiotów jednorazowego użytku, autoklawowanie lub czyszczenie myjkami lub chusteczkami nasączonymi 95% alkoholem. Odpowiednie stosowanie betadyny nakładanej na powierzchnię oka, powieki i sierść wokół oka pomoże również zapobiec zapaleniu wnętrza gałki ocznej45. Łatwo jest rozpoznać oko z infekcją, ponieważ struktury oka zostaną zniszczone przez ekstremalny stan zapalny podczas kursu po wstrzyknięciu. Nie jest to typowe dla PMU. Obecność krwawienia wewnątrzgałkowego może również sugerować zapalenie wnętrza gałki ocznej lub uraz spowodowany wstrzyknięciem. W takich przypadkach należy wykluczyć te zwierzęta z badania.

Zapewnić spójność iniekcji do ciała szklistego:
Iniekcja doszklistkowa jest kluczowym krokiem w indukcji wiarygodnego i powtarzalnego stanu zapalnego w PMU. Zapewnienie stałej ilości zawiesiny Mtb przy każdym wstrzyknięciu, unikanie urazów i zapobieganie refluksowi zawiesiny to czynniki, które należy wziąć pod uwagę podczas wykonywania zastrzyków. Aby zapewnić stałą zawiesinę, po rozmrożeniu i przed załadowaniem do strzykawki należy dokładnie wymieszać zawiesinę zapasów. Ponieważ ten zastosowany ekstrakt Mtb nie tworzy roztworu, zawiesina może z czasem ulegać sedymentacji. Aby zapewnić równomierne stężenie ekstraktu Mtb w każdym wstrzyknięciu, należy użyć lub usunąć i ponownie załadować strzykawkę w ciągu 15 minut od jej włożenia. Fenylefryna jest stosowana do rozszerzania w celu zapewnienia większego pola widzenia do tylnego oka i zmniejszenia ryzyka urazu oka podczas wstrzyknięcia. Kropla ta powoduje naturalne cofnięcie powieki i lekką wytrzeszcz gałki ziemskiej, co pozwala na dobrą wizualizację obszaru 1-2 mm za rąbkiem bez konieczności chwytania oka kleszczami. Używanie kleszczy do krępowania oka może spowodować potencjalny uraz i przejściowo zwiększyć ciśnienie wewnątrzgałkowe oraz ryzyko refluksu zawiesiny Mtb. Uraz może być również spowodowany próbą wstrzyknięcia zbyt dużej objętości do oka. Objętość wstrzyknięcia jest ograniczona do 2 μl, aby zapobiec znacznemu i długotrwałemu wzrostowi ciśnienia wewnątrzgałkowego i urazowi oka. Dodatkowo młodsze zwierzęta będą miały oczy mniejsze niż dorosłe myszy. Zazwyczaj myszy w wieku 6-8 tygodni (20-25 g) zapewniają jednolity rozmiar oczu i zapewniają większą spójność stanu zapalnego po wstrzyknięciu Mtb. Większą częstość refluksu zawiesiny prątków po wstrzyknięciu zaobserwowano u mniejszych myszy. To z kolei prowadzi do mniej niż oczekiwano ostrego stanu zapalnego. Rozcieńczony roztwór fluoresceiny służy do zapewnienia początkującemu wstrzykiwaczowi wizualnej informacji zwrotnej na temat powodzenia jego techniki wstrzykiwania. Dylatacja w momencie iniekcji pozwoli na bezpośrednią wizualizację wstrzykniętego materiału w jamie ciała szklistego i możliwość odnotowania wszelkich dowodów uszkodzenia soczewki. W przypadku urazu soczewki może to spowodować zmianę jasności soczewki, która spowoduje zaćmę, którą można uwidocznić na OCT. W przypadku urazu oka oczy muszą zostać wykluczone z badania ze względu na możliwość zapalenia błony naczyniowej oka46 wywołanego soczewką. Zalecamy przerwę na 10 sekund przed wyjęciem strzykawki z oka, aby umożliwić rozproszenie zawiesiny Mtb w oku i zmniejszyć refluks.

Model PMU można zmodyfikować w celu zmiany intensywności ostrego stanu zapalnego poprzez zmianę stężenia Mtb w iniekcji doszklistkowej. Różne dawki w zakresie od 2,5 μg/μL do 15 μg/μL zostały wcześniej przetestowane w naszym laboratorium. Stwierdzono jednak, że dawki wyższe niż 10 μg/μl powodują poważne uszkodzenie oczu, w tym spontaniczne pęknięcie soczewki, ciężki obrzęk i bliznowacenie rogówki oraz strzępkę. Ten stopień nasilenia nie jest typowy dla pacjentów z poinfekcyjnym zapaleniem błony naczyniowej oka, dlatego te stężenia nie są zalecane. Stwierdzono, że dawka 5 μg/μl niezawodnie wywołuje łagodne do umiarkowanego ostre zapalenie i łagodne przewlekłe zapalenie błony naczyniowej oka; Dawka 10 μg/μl powoduje niezawodnie umiarkowaną do ciężkiej ostrą chorobę i bardziej zauważalną chorobę przewlekłą. W związku z tym zmiana stężenia w ciele szklistym może zapewnić alternatywne nasilenie choroby do zastosowania w razie potrzeby w oparciu o pytanie eksperymentalne. Należy tak dobrać grupy kontrolne, aby upewnić się, że wyniki wynikają z odpowiedzi na mTB, a nie z urazu związanego z wstrzyknięciami podskórnymi lub doszklistkowymi. W kontrolach pozorowanych wstrzyknięć PBS może być stosowany zamiast ekstraktu mTB. W przypadku porównań ze zwierzętami nienarażonymi na działanie promieni słonecznych należy wziąć pod uwagę prawdziwe naiwne próbki, ponieważ inne oczy nie zawsze są równoważne.

Ze względu na mały rozmiar oka myszy, OCT może być bardziej czułym testem do wykrywania stanu zapalnego w komorze przedniej niż bezpośrednia wizualizacja lub mikroskopowa fotografia w jasnym polu. Wcześniejsze prace z PMU u szczurów25 wykazały, że więcej komórek można wykryć za pomocą histologii niż za pomocą OCT, ale istnieje dobra korelacja między tymi dwiema modalnościami. OCT ma tę dodatkową zaletę, że może być stosowany do wzdłużnego monitorowania stanu zapalnego u tego samego zwierzęcia. Inne główne mysie modele zapalenia błony naczyniowej oka, takie jak EAU i EIU, również wykorzystały OCT do analizy ilościowej 12,47,48. W modelu PMU myszy komórki przedniej komory są widoczne tylko w OCT i nie można ich zobaczyć w badaniach klinicznych, chyba że występuje duża hipopiona. Zapalenie ciała szklistego (zapalenie ciała szklistego) można zaobserwować za pomocą obrazowania dna oka koloru, ale wykrycie zmiany ilościowej jest możliwe tylko za pomocą obrazowania OCT. Inne aspekty modelu, takie jak zapalenie naczyń krwionośnych siatkówki i uszkodzenie siatkówki, można łatwo zidentyfikować za pomocą OCT i mikroskopowej fotografii dna oka w jasnym polu.

Podczas korzystania z OCT ważne jest, aby rozważyć, w jaki sposób na obrazowanie miejscowe mogą wpływać regionalne różnice w stopniu zapalenia. Wcześniejsze doniesienia zidentyfikowały nierównomierne rozmieszczenie komórek w przedniej komorze człowieka, przy czym więcej komórek znajduje się niżejniż 49. U myszy podobna predyspozycja jest powszechna. W związku z tym skanowanie pionowe lub promieniowe przez AC pomoże zapewnić obrazy, które uchwycą zakres stanu zapalnego. Dodatkowo, wykonanie obrazowania w tym samym miejscu zapewni również spójność obrazów zebranych w tym samym oku wzdłużnie. Aby uzyskać obrazy w tej samej części oka, użyj stabilnych punktów orientacyjnych i systematycznego podejścia. W przypadku obrazów komory przedniej obraz jest wyśrodkowany bezpośrednio przylegający do wierzchołka rogówki i zorientowany pionowo, tak aby można było wykryć obecność hipopionu pod kątem dolnym. W przypadku obrazów tylnego odcinka obraz jest wyśrodkowany na nerwie wzrokowym. Zaleca się rozważenie użycia co najmniej 3 skanów liniowych do oceniania, aby zapewnić uchwycenie zmienności regionalnej. W przypadkach, gdy stan zapalny jest ograniczony do lokalizacji peryferyjnych, pomocne może być uzyskanie skanów woluminów. Zbieranie skanów woluminów może również pomóc w uchwyceniu różnic regionalnych, ale zwiększy wymagania dotyczące przechowywania danych.

Inne testy in vivo, które można wykorzystać do scharakteryzowania stanu zapalnego w mysim modelu PMU, obejmują obrazowanie bioluminescencyjne13,35. Testy pośmiertne, takie jak wieloparametrowa analiza cytometrii przepływowej, można przeprowadzić w celu identyfikacji i ilościowego określenia naciekających populacji komórek odpornościowych w komorze wodnej i tylnej oka12,26. W modelu PMU ostry stan zapalny charakteryzuje się wrodzoną odpowiedzią z dominującym naciekiem neutrofili, po której następuje przewlekła i trwała odpowiedź z dominacją adaptacyjną limfocytów T, która utrzymuje się przez ponad miesiąc35. Inne testy funkcji immunologicznej, które można wykonać na tkankach pośmiertnych, obejmują analizę cytokin płynu ocznego. Ponadto inne dalsze testy, takie jak sekwencjonowanie mRNA i obrazowanie immunofluorescencyjne, mogą być stosowane do oceny wzorców ekspresji genów i białek w populacjach komórek odpornościowych siatkówki w zapaleniu błony naczyniowej oka50,51.

Model PMU można powielić w innych systemach gryzoni przy użyciu adaptacji odpowiednich dla różnych gatunków. Model PMU był wcześniej stosowany u szczurów i królików 38,39,40. U szczurów ostre zapalenie błony naczyniowej rozwija się po wstrzyknięciu do ciała szklistego, które ustępuje samoistnie w ciągu 14 dni bez wystąpienia objawów przewlekłego stanu zapalnego w badaniu histologicznym24. U królików indukcja zapalenia błony naczyniowej oka wykorzystuje dwie rundy wstrzyknięcia podskórnego przed wstrzyknięciem do ciała szklistego, ale generuje również silne zapalenie błony naczyniowej oka. Jedną z zalet korzystania z modelu mysiego jest łatwa dostępność licznych szczepów transgenicznych i nokautujących, które mogą pomóc w zrozumieniu podstawowego mechanizmu zapalenia błony naczyniowej oka52. Wszystkie modele gryzoni mogą być wykorzystywane do badań przedklinicznych terapii, jeśli środek jest podawany ogólnoustrojowo lub w postaci kropli miejscowej. Jednak ze względu na ich większe rozmiary, oczy szczurów i królików są lepszymi modelami do wykorzystania w badaniach przedklinicznych nad wszczepialnymi lub miejscowymi iniekcjami w przypadku zapalenia błony naczyniowej oka.

Podsumowując, protokół ten zapewnia naukowcom zainteresowanym badaniem mechanizmów przewlekłego zapalenia oczu nowe narzędzie, które nie jest zależne od wcześniejszej immunizacji antygenami oka.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów finansowych.

Podziękowania

Ta praca jest wspierana przez fundusze z National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, Stany Zjednoczone (KP) K08EY0123998, (KP) R01EY030431, (KP) R21 EY02939, UW vision research core grant (NEI P30EY01730), dary od Mark Daily, MD Research Fund oraz Christopher and Alida Latham Research Fund, nieograniczony grant wydziałowy od Research to Prevent Blindness, oraz nagrodę za rozwój kariery od Research to Prevent Blindness (KP). Prace przeprowadzone w Bristolu były wspierane przez dodatkowe fundusze z Sight Research UK i The Underwood Trust.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AK-FLUORAkorn Pharmaceuticals, IL, USA10% Fluoresceina sodowa 100 mg/ml w fiolce 5 ml
AnaSedAkorn Animal Health, IL, USANDC 59399-110-20Ksylazyna 20 mg/ml
Betadine 5% sterylny roztwór do przygotowania okulistycznegoAlcon, TX, USA8007-1
BD Precyzyjne igły ślizgowe -25 gBecton, Dickinson and Company, NJ, USA305122
Igła B-D Precision Glide -30-GBecton, Dickinson and Company, NJ, StanyZjednoczone 305106
Bond MAX, Bond RxLeica Biosystems, IL, USAZautomatyzowany system barwienia IHC
Maść chloramfenikolowaMartindale Pharma, Romford, Wielka Brytania1% w/w Chloramfenikolu
EG1150HLeica Biosystems, IL, USAOsadzanie tkanek
Envisu R2300Bioptigen/LeicaOCT Machine
Niekompletny adiuwant FreundaBD Difco, NJ, USA263910
GenTeal lubrykantowa maść do oczuAlcon, TX, USA
GenTeal lubrykant żel pod oczyAlcon, TX, USA
H37Ra liofilizowany ekstrakt z prątkówBD Difco, NJ, USA231141
Igła Hamilton RN ( 33/12/2)SHamilton, Reno, NV7803-05(33/12/2)33 G
Strzykawka HamiltonHamilton, Reno, NVCAL7633-015 µ L
Igła do insulinyExel International, USA260291 ml
Isoflurane
KetasetZoetis, USA377341Ketamina HCL 100 mg / ml
Pompa strzykawkowa do mikroiniekcji i Micro4ControllerWorld Precision Instruments, FL, USAUMP3
Micron IVPhoenix Research Laboratories, Pleasanton, CAAlternatywna maszyna do obrazowania/OCT
Nanofil 10 i micro; L strzykawkaWorld Precision Instruments, FL, USANANOFIL
Nanofil Zestaw do wstrzykiwań wewnątrzgałkowychWorld Precision Instruments, FL, USAIO-KIT
Olympus SZX10OlympusLuneta do dysparacji
PBSGibco14190
Chlorowodorek fenylefryny Roztwór okulistyczny USP 2,5% sterylny 15 mlAkorn Pharmaceuticals, IL, USA
RM2255Leica Biosystems, IL, USA
Strzykawka do cięcia tkanek gruźlicyBecton, Dickinson and Company, NJ, USA3096021 ml
tetrakainy 0,5%Alcon, TX, USA1041544
Tissue Tek VIP seriaSakura Finetek USA, Inc., CA.Histologia Przetwarzanie tkanek
Tropikamid 1%Chauvin Pharmaceuticals, Romford, Wielka BrytaniaMinims
TylenolJohnson & Johnson Consumer Inc, PA, USANDC 50580-614-01Paracetamol
ViscotearsNovartis Pharmaceuticals, Camberley, Wielka BrytaniaŻel pod oczy Carbomer 0,2% w/w
------17478020115

Bibliografia

  1. American Academy of Ophthalmology. Aao 2019-2020 Basic and Clinical Science Course, Section 09: Uveitis and Ocular Inflammation. American Academy of Ophthalmology. , (2019).
  2. Caspi, R. R. Animal models of autoimmune and immune-mediated uveitis. Drug Discovery today. Disease Models. 3 (1), 3-9 (2006).
  3. DeVoss, J., et al. Spontaneous autoimmunity prevented by thymic expression of a single self-antigen. The Journal of Experimental Medicine. 203 (12), 2727-2735 (2006).
  4. Caspi, R. R., et al. A new model of autoimmune disease. Experimental autoimmune uveoretinitis induced in mice with two different retinal antigens. Journal of Immunology. 140 (5), 1490-1495 (1988).
  5. Tang, J., Zhu, W., Silver, P. B., Su, S. -B., Chan, C. -C., Caspi, R. R. Autoimmune uveitis elicited with antigen-pulsed dendritic cells has a distinct clinical signature and is driven by unique effector mechanisms: Initial encounter with autoantigen defines disease phenotype. The Journal of Immunology. 178 (9), 5578-5587 (2007).
  6. Broekhuyse, R. M., Kuhlmann, E. D., Winkens, H. J. Experimental melanin-protein induced uveitis (EMIU) is the sole type of uveitis evoked by a diversity of ocular melanin preparations and melanin-derived soluble polypeptides. Japanese Journal of Ophthalmology. 40 (4), 459-468 (1996).
  7. Pennesi, G., et al. A humanized model of experimental autoimmune uveitis in HLA class II transgenic mice. The Journal of Clinical Investigation. 111 (8), 1171-1180 (2003).
  8. Caspi, R. R. Understanding autoimmune uveitis through animal models. The Friedenwald lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (3), 1872-1879 (2011).
  9. Bansal, S., Barathi, V. A., Iwata, D., Agrawal, R. Experimental autoimmune uveitis and other animal models of uveitis: An update. Indian Journal of Ophthalmology. 63 (3), 211-218 (2015).
  10. Smith, J. R., Hart, P. H., Williams, K. A. Basic pathogenic mechanisms operating in experimental models of acute anterior uveitis. Immunology and Cell Biology. 76 (6), 497-512 (1998).
  11. Rosenbaum, J. T., McDevitt, H. O., Guss, R. B., Egbert, P. R. Endotoxin-induced uveitis in rats as a model for human disease. Nature. 286 (5773), 611-613 (1980).
  12. Chu, C. J., et al. Multimodal analysis of ocular inflammation using the endotoxin-induced uveitis mouse model. Disease Models & Mechanisms. 9 (4), 473-481 (2016).
  13. Gutowski, M. B., Wilson, L., Van Gelder, R. N., Pepple, K. L. In vivo bioluminescence imaging for longitudinal monitoring of inflammation in animal models of uveitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (3), 1521-1528 (2017).
  14. World Health Organization. Global tuberculosis report 2019. World Health Organization. , (2019).
  15. Biswas, J., Badrinath, S. S. Ocular morbidity in patients with active systemic tuberculosis. International Ophthalmology. 19 (5), 293-298 (1995).
  16. Donahue, H. C. Ophthalmologic experience in a tuberculosis sanatorium. American Journal of Ophthalmology. 64 (4), 742-748 (1967).
  17. El-Asrar, M. A., Abouammoh, M., Al-Mezaine, H. S. Tuberculous uveitis. Middle East African Journal of Ophthalmology. 16 (4), 188-201 (2009).
  18. Bodaghi, B., et al. Chronic severe uveitis: etiology and visual outcome in 927 patients from a single center. Medicine. 80 (4), 263-270 (2001).
  19. Cunningham, E. T., Forrester, J. V., Rao, N. A., Zierhut, M. Post-infectious uveitis. Ocular Immunology and Inflammation. 24 (6), 603-606 (2016).
  20. Wroblewski, K. J., Hidayat, A. A., Neafie, R. C., Rao, N. A., Zapor, M. Ocular tuberculosis: a clinicopathologic and molecular study. Ophthalmology. 118 (4), 772-777 (2011).
  21. Yeh, S., Sen, H. N., Colyer, M., Zapor, M., Wroblewski, K. Update on ocular tuberculosis. Current Opinion in Ophthalmology. 23 (6), 551-556 (2012).
  22. Tagirasa, R., Parmar, S., Barik, M. R., Devadas, S., Basu, S. Autoreactive T cells in immunopathogenesis of TB-associated uveitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (13), 5682-5691 (2017).
  23. Agrawal, R., et al. Insights into the molecular pathogenesis of ocular tuberculosis. Tuberculosis. 126, 102018(2021).
  24. Pepple, K. L., et al. Primed mycobacterial uveitis (PMU): Histologic and cytokine characterization of a model of uveitis in rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (13), 8438-8448 (2015).
  25. Pepple, K. L., Choi, W. J., Wilson, L., Van Gelder, R. N., Wang, R. K. Quantitative assessment of anterior segment inflammation in a rat model of uveitis using spectral-domain optical coherence tomography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (8), 3567-3575 (2016).
  26. Pepple, K. L., Wilson, L., Van Gelder, R. N. Comparison of aqueous and vitreous Lymphocyte populations from two rat models of experimental uveitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (6), 2504-2511 (2018).
  27. Basu, S., Elkington, P., Rao, N. A. Pathogenesis of ocular tuberculosis: New observations and future directions. Tuberculosis. 124, 101961(2020).
  28. Basu, S., Rao, N., Elkington, P. Animal models of ocular tuberculosis: Implications for diagnosis and treatment. Ocular Immunology and Inflammation. , 1-7 (2020).
  29. Mattapallil, M. J., et al. The Rd8 mutation of the Crb1 gene is present in vendor lines of C57BL/6N mice and embryonic stem cells, and confounds ocular induced mutant phenotypes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2921-2927 (2012).
  30. Underwood, W., Anthony, R. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2020 edition. 2013 (30), 2020-2021 (2020).
  31. Donovan, J., Brown, P., et al. Handling and restraint. Current protocols in immunology. Coligan, J. E., et al. , John Wiley & Sons, Inc. Chapter 1, Unit 1.3 (2006).
  32. Tremoleda, J. L., Kerton, A., Gsell, W. Anaesthesia and physiological monitoring during in vivo imaging of laboratory rodents: considerations on experimental outcomes and animal welfare. EJNMMI Research. 2 (1), 44(2012).
  33. Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harbor protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).
  34. Paques, M., et al. Panretinal, high-resolution color photography of the mouse fundus. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (6), 2769-2774 (2007).
  35. John, S., Rolnick, K., Wilson, L., Wong, S., Van Gelder, R. N., Pepple, K. L. Bioluminescence for in vivo detection of cell-type-specific inflammation in a mouse model of uveitis. Scientific Reports. 10 (1), 11377(2020).
  36. Fortmann, S. D., Lorenc, V. E., Hackett, S., Campochiaro, P. A. Murine Vitreous Tap (MurViTap): a novel technique to extract uncontaminated mouse vitreous humor, quantify retinal vascular permeability, and compare proteins secreted by diseased and normal retina. Investigative ophthalmology & visual science. 58 (8), 5978(2017).
  37. Caspi, R. R. Understanding autoimmunity in the eye: from animal models to novel therapies. Discovery Medicine. 17 (93), 155-162 (2014).
  38. Mruthyunjaya, P., et al. Efficacy of low-release-rate fluocinolone acetonide intravitreal implants to treat experimental uveitis. Archives of Ophthalmology. 124 (7), 1012-1018 (2006).
  39. Jaffe, G. J., Yang, C. S., Wang, X. C., Cousins, S. W., Gallemore, R. P., Ashton, P. Intravitreal sustained-release cyclosporine in the treatment of experimental uveitis. Ophthalmology. 105 (1), 46-56 (1998).
  40. Pepple, K. L., et al. Uveitis therapy with shark variable novel antigen receptor domains targeting tumor necrosis factor alpha or inducible t-cell costimulatory ligand. Translational Vision Science & Technology. 8 (5), 11(2019).
  41. Mattapallil, M. J., et al. Characterization of a New epitope of IRBP that induces moderate to severe uveoretinitis in mice with H-2b haplotype. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (9), 5439-5449 (2015).
  42. Silver, P. B., Chan, C. C., Wiggert, B., Caspi, R. R. The requirement for pertussis to induce EAU is strain-dependent: B10.RIII, but not B10.A mice, develop EAU and Th1 responses to IRBP without pertussis treatment. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (12), 2898-2905 (1999).
  43. Li, Q., Peng, B., Whitcup, S. M., Jang, S. U., Chan, C. C. Endotoxin induced uveitis in the mouse: susceptibility and genetic control. Experimental Eye Research. 61 (5), 629-632 (1995).
  44. Astley, R. A., Coburn, P. S., Parkunan, S. M., Callegan, M. C. Modeling intraocular bacterial infections. Progress in Retinal and Eye Research. 54, 30-48 (2016).
  45. Lau, P. E., Jenkins, K. S., Layton, C. J. Current evidence for the prevention of endophthalmitis in anti-VEGF intravitreal injections. Journal of Ophthalmology. 2018, 8567912(2018).
  46. Nche, E. N., Amer, R. Lens-induced uveitis: an update. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 258 (7), 1359-1365 (2020).
  47. Chu, C. J., et al. Assessment and in vivo scoring of murine experimental autoimmune uveoretinitis using optical coherence tomography. PLoS ONE. 8 (5), 63002(2013).
  48. Harimoto, K., Ito, M., Karasawa, Y., Sakurai, Y., Takeuchi, M. Evaluation of mouse experimental autoimmune uveoretinitis by spectral domain optical coherence tomography. The British Journal of Ophthalmology. 98 (6), 808-812 (2014).
  49. Li, Y., Lowder, C., Zhang, X., Huang, D. Anterior chamber cell grading by optical coherence tomography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (1), 258-265 (2013).
  50. Bell, O. H., et al. Single eye mRNA-seq reveals normalisation of the retinal microglial transcriptome following acute inflammation. Frontiers in Immunology. 10, 3033(2019).
  51. Lipski, D. A., et al. Retinal endothelial cell phenotypic modifications during experimental autoimmune uveitis: a transcriptomic approach. BMC Ophthalmology. 20 (1), 106(2020).
  52. Agarwal, R. K., Silver, P. B., Caspi, R. R. Rodent Models of Experimental Autoimmune Uveitis. Autoimmunity. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Perl, A. , Humana Press. Totowa, NJ. 443-469 (2012).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Zapalenie okaantygeny mykobakteryjnewstrzyknięcie do ciała szklistegooptyczna koherentna tomografiaobrazowanie dna okacytometria przepływowaanaliza cytokinsekwencjonowanie mRNA
Przygotowanie mykobakteryjnego zapalenia błony naczyniowej oka (PMU) jako model poinfekcyjnego zapalenia błony naczyniowej oka
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.