Artykuł metodologiczny

Rekonstrukcja aktywności ekstrakcji Msp1 z w pełni oczyszczonymi składnikami

DOI:

10.3791/62928

⸱

10 sierpnia 2021

 , 
1Department of Chemistry & Biochemistry, University of Toledo

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół rekonstytucji aktywności ekstrakcji Msp1 z w pełni oczyszczonymi składnikami w zdefiniowanych proteoliposomach.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jako centrum fosforylacji oksydacyjnej i regulacji apoptozy, mitochondria odgrywają istotną rolę w zdrowiu człowieka. Prawidłowe funkcjonowanie mitochondriów zależy od solidnego systemu kontroli jakości w celu utrzymania homeostazy białek (proteostazy). Spadek proteostazy mitochondriów wiąże się z rakiem, starzeniem się, neurodegeneracją i wieloma innymi chorobami. Msp1 to ATPaza AAA + zakotwiczona w zewnętrznej błonie mitochondrialnej, która utrzymuje proteostazę poprzez usuwanie nieprawidłowo zlokalizowanych białek zakotwiczonych w ogonie. Używając oczyszczonych składników odtworzonych do proteoliposomów, wykazaliśmy, że Msp1 jest niezbędny i wystarczający do ekstrakcji modelowego białka zakotwiczonego w ogonie z dwuwarstwy lipidowej. Nasz uproszczony, odtworzony system pokonuje kilka barier technicznych, które utrudniały szczegółowe badania nad ekstrakcją białek błonowych. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe metody generowania liposomów, rekonstytucji białek błonowych i testu ekstrakcji Msp1.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prawidłowe funkcjonowanie komórki zależy od procesu zwanego proteostazą, który zapewnia, że funkcjonalne białka mają prawidłowe stężenie i lokalizację komórkową1. Zaburzenia proteostazy prowadzą do upośledzenia funkcji organelli i są związane z wieloma chorobami neurodegeneracyjnymi2,3,4. Białka błonowe stanowią wyjątkowe wyzwanie dla sieci proteostazy, ponieważ muszą być ukierunkowane na właściwą błonę, unikając agregacji z hydrofobowych domen transbłonowych (TMDs)5. W związku z tym wyewoluowały wyspecjalizowane maszyny, które chronią hydrofobowy TMD przed cytozolem i ułatwiają celowanie i wprowadzanie do właściwej błony komórkowej6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.

Mitochondria są centrum metabolicznym komórki i biorą udział w wielu istotnych procesach komórkowych, takich jak: fosforylacja oksydacyjna, tworzenie klastrów żelazowo-siarkowych i regulacja apoptozy16,17. Te endosymbiotyczne organelle zawierają dwie błony, określane jako wewnętrzna błona mitochondrialna (IMM) i zewnętrzna błona mitochondrialna (OMM). Ponad 99% z 1500 ludzkich białek mitochondrialnych jest zakodowanych w genomie jądrowym i musi zostać przemieszczonych przez jedną lub dwie różne błony18,19. Prawidłowa funkcja mitochondriów zależy zatem od solidnej sieci proteostazy, która koryguje wszelkie błędy w celowaniu lub translokacji białek.

Nasze laboratorium skupia się na podzbiorze białek błony mitochondrialnej zwanych białkami zakotwiczonymi w ogonie (TA), które mają pojedynczą domenę transbłonową na samym C-końcu20,21,22,23,24. Białka TA biorą udział w wielu istotnych procesach, takich jak apoptoza, transport pęcherzyków i translokacja białek25. Unikalna topologia białek TA wymaga insercji potranslacyjnej, która zachodzi w retikulum endoplazmatycznym (ER) poprzez kierowane wejście szlaków EMC (Tail-anchored of tail-anchored (GET) lub Endoplasmic reticulum Membrane Complex (EMC) lub do OMM przez słabo scharakteryzowaną ścieżkę20,26,27,28. Właściwości biofizyczne TMD są niezbędne i wystarczające, aby skierować białka TA do właściwej błony29. Rozpoznawanie cech biofizycznych, a nie zdefiniowanego motywu sekwencji, ogranicza wierność szlaków docelowych5. Tak więc błędna lokalizacja białek TA jest częstym stresem dla sieci proteostazy. Stres komórkowy, taki jak hamowanie szlaku GET, powoduje wzrost błędnej lokalizacji białek do OMM i dysfunkcję mitochondriów, chyba że białka te zostaną natychmiast usunięte30,31.

Częstym tematem w proteostazie błony jest użycie białek AAA+ (ATPazy Azwiązanej z komórkowymi aktywnościami A) do usuwania starych, uszkodzonych lub błędnie zlokalizowanych białek z dwuwarstwy lipidowej1,32,33,34,35,36,37,38. Białka AAA+ to silniki molekularne, które tworzą pierścienie heksameryczne i podlegają ruchom zależnym od ATP w celu przebudowy substratu, często przez translokację przez wąski por osiowy39,40. Chociaż wiele wysiłku włożono w badanie ekstrakcji białek błonowych przez ATPazy AAA+, rekonstytucje są złożone lub obejmują mieszaninę lipidów i detergentów41,42, co ogranicza moc eksperymentalną do zbadania mechanizmu ekstrakcji substratu z dwuwarstwy lipidowej.

Msp1 to wysoce konserwatywna ATPaza AAA+ zakotwiczona w OMM i peroksysomach, która odgrywa kluczową rolę w proteostazie błony poprzez usuwanie błędnie zlokalizowanych białek TA43,44,45,46,47. Niedawno wykazano również, że Msp1 łagodzi stres związany z importem białek mitochondrialnych poprzez usuwanie białek błonowych, które zatrzymują się podczas translokacji w klasie OMM48. Utrata Msp1 lub ludzkiego homologu ATAD1 powoduje fragmentację mitochondriów, niepowodzenia w fosforylacji oksydacyjnej, drgawki, zwiększone obrażenia po udarze i przedwczesną śmierć31,49,50,51,52,53,54,55,56.

Pokazaliśmy, że możliwe jest współodtwarzanie białek TA z Msp1 i wykrywanie ekstrakcji z dwuwarstwy lipidowej57. Ten uproszczony system wykorzystuje w pełni oczyszczone białka odtworzone w zdefiniowanych liposomach, które naśladują OMM (Rysunek 1)58,59. Ten poziom kontroli eksperymentalnej może rozwiązać szczegółowe problemy mechanistyczne ekstrakcji substratu, które są eksperymentalnie trudne do rozwiązania przy bardziej złożonych rekonstytucjach z udziałem innych białek AAA+. W tym miejscu przedstawiamy protokoły eksperymentalne szczegółowo opisujące nasze metody przygotowania liposomów, rekonstytucji białek błonowych i testu ekstrakcji. Mamy nadzieję, że te szczegóły eksperymentalne ułatwią dalsze badania nad istotnym, ale słabo poznanym procesem proteostazy błonowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie liposomów

  1. Połącz zapasy chloroformu lipidów w odpowiednich proporcjach, aby naśladować zewnętrzną błonę mitochondrialną.
    1. Przygotować 25 mg mieszaniny lipidów. Używamy wcześniej ustalonej mieszaniny lipidów, które naśladują błony mitochondrialne, składającej się ze stosunku molowego 48:28:10:10:4 fosfatydylocholiny jaja kurzego (PC), fosfatydyloetanoloaminy jaja kurzego (PE), fosfatydyloinozytolu wątroby bydlęcej (PI), syntetycznej 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfo-L-seryny (DOPS) i syntetycznego 1',3'-bis[1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfo]-glicerolu (TOCL)58,59. Przykładowe obliczenia przedstawiono w tabeli 1.
    2. Przed otwarciem doprowadź wszystkie zapasy lipidów do temperatury pokojowej, ponieważ ograniczy to kondensację. Ponieważ większość laboratoriów nie ma precyzyjnego sposobu pomiaru stężenia lipidów, każda woda wchłonięta przez materiał chloroformowy zmieni stężenie lipidów, a tym samym stosunek lipidów użytych w teście.
    3. Ponieważ zapasy lipidów są dostępne w szklanych ampułkach, należy przenieść wymaganą ilość lipidów do szklanej fiolki za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml. Dodać 2 mg ditiotreitolu (DTT) do fiolki, aby zapobiec utlenianiu lipidów. Pracuj szybko, ponieważ odparowanie chloroformu zmieni stężenie lipidów.
    4. Przenieść pozostały lipid do oddzielnej szklanej fiolki i dopasować do przegrody PFTE. Dodać 2 mg naziemnej telewizji cyfrowej do fiolki, owinąć parafilmem i przechowywać w temperaturze -20 °C, aby zapobiec utlenianiu lipidów. Spróbuj zużyć lipidy w ciągu 3 miesięcy od przeniesienia do fiolek. Aby zapobiec potencjalnemu zanieczyszczeniu zapasów chloroformu przez spływ markera, należy przenieść naklejki z oryginalnych ampułek do szklanych fiolek, a nie etykietować je markerem.
  2. Odparować chloroform pod bardzo delikatnym strumieniem azotu, jednocześnie obracając szklaną fiolkę w sposób ciągły ręcznie w dygestorio, zasadniczo działając jak ręczny rotovap. Obracać fiolkę ręcznie ze stałą prędkością (20-40 obr./min), aby utrzymać ruch lipidów. Celem jest odparowanie całego chloroformu i uzyskanie równomiernej powłoki lipidów na całej szklanej fiolce.
    UWAGA: Chloroform jest neurotoksyczny i ten krok należy wykonać w dygestorium.
    1. Podłącz świeżą pipetę Pasteura do rurki z azotem. Nie dopuścić do wydostania się lipidów z fiolki lub na pipetę Pasteura. Skieruj końcówkę na dno fiolki tak, aby powietrze odbijało się od dna i wypychało lipidy w górę w kierunku środka fiolki. Uzyskać równomierną powłokę na całej fiolce, unikając gromadzenia się w rogach lub przy nasadce. Cały proces trwa około 5 minut.
    2. Gdy mieszanina zgęstnieje w "kulkę" lipidów, wprowadź ją do środka fiolki, zmieniając kąt nachylenia fiolki. Gdy kulka zacznie się zmniejszać, lekko zwiększ strumień azotu, aby rozproszyć kulkę, upewniając się, że żaden z lipidów nie wydmuchuje się z fiolki.
  3. Usuń pozostały chloroform w próżni.
    1. Umieść szklaną fiolkę na domowej pompie próżniowej lub membranowej pompie próżniowej na 1 godzinę, aby usunąć większość pozostałości chloroformu. Próżnie te na ogół nie są wystarczająco silne, aby usunąć cały chloroform, ale lepiej tolerują niewielkie ilości rozpuszczalnika niż próżnie obrotowe.
    2. Umieścić fiolkę w silnym podciśnieniu (<1 mTorr) na 12-16 godzin, aby usunąć wszystkie pozostałości chloroformu. Należy pamiętać, aby uniknąć uderzenia fiolką podczas tego procesu.
  4. Ponownie zawiesić lipidy w 1,25 ml buforu liposomowego (50 mM HEPES KOH pH 7,5, 15% glicerolu, 1 mM DTT). Ponieważ zaczęliśmy od 25 mg lipidów, daje to stężenie 20 mg/ml. Całkowicie zawiesić lipidy bez widocznych kawałków. Jeśli lipidy zgromadzą się w rogu fiolki, może to być długotrwały proces.
    1. Energicznie obracać fiolkę, aż próbka stanie się mlecznie gładka. Okazuje się, że jeśli odparowanie chloroformu zostało przeprowadzone prawidłowo poprzedniej nocy, proces ten trwa około 5-10 minut.
    2. Aby zapewnić całkowite ponowne zawieszenie lipidów, obracaj się na kole w temperaturze pokojowej przez 3 godziny z prędkością ~80 obr./min. Wyjmować fiolkę z koła raz na godzinę na 1 minutę wirowania, aby zapewnić równomierne mieszanie.
  5. Ostrożnie przenieś lipidy do czystej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Wykonaj 5 cykli zamrażania i rozmrażania przy użyciu ciekłego azotu do zamrożenia i bloku grzewczego o temperaturze 30 °C do rozmrożenia. Ten krok pomaga przekształcić pęcherzyki wieloblaszkowe w pęcherzyki jednowarstwowe.
  6. Wytłacz lipidy.
    1. Podczas cykli zamrażania i rozmrażania przygotuj mini-ekstruder. Zmontuj mini-ekstruder z 10 mm wspornikami filtrów i membraną poliwęglanową o pożądanej wielkości porów (używamy 200 nm). Rozmiar filtra będzie miał wpływ na rozmiar liposomu, co z kolei wpłynie na stężenie białek wymaganych do rekonstytucji (krok 2.3).
    2. Umieść mini-ekstruder na płycie grzejnej i podnieś temperaturę ekstrudera do 60 °C.
    3. Pobrać lipidy do gazoszczelnej szklanej strzykawki o pojemności 1 ml i ostrożnie umieścić na jednym końcu mini-ekstrudera. Umieść pustą gazoszczelną strzykawkę po drugiej stronie mini-ekstrudera. Pozwól, aby lipidy zrównoważyły się z temperaturą stojaka wytłaczarki przez 5-10 minut.
    4. Przenieść lipidy do alternatywnej strzykawki, delikatnie naciskając tłok napełnionej strzykawki. Wcisnąć roztwór z alternatywnej strzykawki do oryginalnej strzykawki. Powtórz ten proces w przód iw tył 15 razy, tak aby przy 15przejściu lipidy kończyły się w naprzemiennej strzykawce. Monitoruj głośność w każdym przejściu, aby upewnić się, że nie ma wycieków.
  7. Przygotować jednorazowe porcje lipidów, błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C. Liposomy są stabilne w temperaturze -80 °C przez kilka miesięcy. Rekonstytucje wymagają jednorazowo 10 μl liposomów (krok 2.3.4), dlatego wygodnie jest przygotować 10 μl lub 20 μl podwielokrotności.

2 Rekonstytucja białka Msp1 i Model TA

  1. Przygotować bufor do rozpuszczenia: 50 mM HEPES pH 7,5, 200 mM octan potasu, 7 mM octan magnezu, 2 mM DTT, 10% sacharoza, 0,01% azydek sodu, 0,2-0,8% Deoxy Big Chaps (DBC).
    1. Zoptymalizuj warunki rekonstytucji dla nowej partii liposomów. Stężenie DBC i biokulek wymagane do optymalnej rekonstytucji różni się w zależności od partii użytych liposomów. Aby ograniczyć zmienność przygotowania do przygotowania, użyj tej samej partii DBC dla wszystkich eksperymentów. Zmieniając wiele DBC, powtórz proces optymalizacji.
    2. Wykonaj serię rekonstytucji z różnymi stężeniami DBC (0,2% - 0,8%) i biogranulek (25 mg - 100 mg) za każdym razem, gdy przygotowywana jest nowa partia liposomów. Ważne jest, aby nie obniżać DBC poniżej krytycznego stężenia miceli (CMC) wynoszącego ~0,12%. Po zoptymalizowaniu warunków zalecamy zebranie wszystkich danych przy użyciu tych samych warunków przygotowania i rekonstytucji liposomów.
    3. Oznaczyć skuteczność różnych warunków rekonstytucji przy użyciu testu ekstrakcji opisanego w kroku 3.
  2. Przygotuj biokulki w końcowym stężeniu 250 mg/ml.
    1. Odważyć 2,7 g suszonych biokulek i ponownie zawiesić w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml ze 100% metanolem (około 45 ml) w celu zwilżenia kulek. Początkowo zwilż biokulki w metanolu, aby zapobiec uwięzieniu powietrza w porach kulek. Po zanurzeniu w metanolu utrzymuj biokulki mokre, ponieważ powietrze uwięzione przez biokulki zmieni ich zdolność do wchłaniania detergentu.
    2. Usuń metanol, myjąc kulki 8 razy około 45 ml ultraczystej wody (18,2 mΩ), zwanej dalej ddH2O. Kulki granulek przez wirowanie z prędkością 3,200 x g przez 1 minutę. Zdekantować ciecz i ponownie zawiesić w ddH2O.
    3. Po umyciu zawiesić w 10 mlddH2O z 0,02% azydkiem sodu i przechowywać w temperaturze 4 °C. Biokulki można przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy. Ten zapas wynosi 250 mg/ml, ponieważ zakłada się, że ~0,2 g jest tracone podczas etapów prania.
  3. Oblicz wielkość liposomu i pożądaną liczbę cząsteczek białka TA i Msp1 na liposom. W ten sposób określone zostanie stężenie białka Msp1 i TA wymagane do rekonstytucji.
    1. Najpierw oblicz liczbę cząsteczek lipidów na liposom jednowarstwowym (N całkowita) za pomocą równania figure-protocol-1 gdzie d to średnica liposomu, h to grubość dwuwarstwy, a a to obszar grupy głównej lipidów.
      1. Zmierz średnicę liposomu za pomocą DLS. W naszym przykładzie uzyskano wartość 70 nm dla średnicy liposomu (d).
      2. Należy przyjąć wartość 5 nm dla h i 0,71 nm2 dla a, która jest wielkością grupy głównej dla fosfatydylocholiny. W tej konkretnej sytuacji suma N wynosi 37 610.
    2. Następnie oblicz stężenie molowe lipidu M Lipid, używając średniej masy cząsteczkowej lipidów w mieszaninie. W tym przykładzie stężenie lipidów wynosi 20 mg/ml (krok 1.4), a średnia masa cząsteczkowa lipidów wynosi 810 g/mol (tabela 1). Daje to wartość 0,0247 M dla M Lipid.
    3. Następnie oblicz stężenie molowe liposomów, liposom M, używając równania figure-protocol-2 gdzie M Lipid to stężenie molowe lipidu z kroku 2.3.2, a N całkowite to całkowita liczba lipidów na liposom obliczona w kroku 2.3.1. W tym przykładzie podstawowe stężenie liposomów 20 mg/ml wynosi około 660 nM.
    4. Obliczyć ilość białka Msp1 i TA potrzebną do reakcji rozpuszczenia 100 μl.
      UWAGA: Końcowe stężenie lipidów w rozpuszczonej wodzie wynosi 2 mg/ml, co odpowiada 10-krotnemu rozcieńczeniu liposomu. Daje to końcowe stężenie liposomów 66 nM. Końcowe stężenie Msp1 wynosi 792 nM, co daje średnio 12 całkowitych kopii (2 funkcjonalne heksamery) na liposom. Końcowe stężenie białka TA wynosi 660 nM, co daje średnio 10 kopii na liposom.
  4. W probówce do PCR wymieszaj oczyszczone Msp1, białko TA i liposomy w buforze do rekonstytucji. Kolejność dodawania to bufor, białka i liposomy na końcu. Całkowita objętość wynosi 100 μl. Pozostaw mieszaninę na lodzie na 10 minut. Oczyść białko Msp1 i TA zgodnie z wcześniejszym opisem57.
    1. Użyj dobrze scharakteryzowanego modelowego białka TA His-Flag-Sumo-Sec22 jako substratu kontroli pozytywnej podczas pierwszego ustalania testu. Ten konstrukt ma znacznik His do łatwego oczyszczania, znacznik 3x-Flag do wykrywania przez western blot, domenę Sumo dla zwiększenia rozpuszczalności oraz TMD białka ER-TA Sec22 do rekonstytucji i rozpoznawania przez Msp1.
    2. Upewnić się, że roztwory podstawowe zarówno białka Msp1, jak i białka TA mają około 100 μM, aby zminimalizować wpływ N-dodecylu β-D-maltozydu (DDM) z oczyszczania białka na rozpuszczenie. Oczyszczony Msp1 to 20 mM HEPES pH 7,5, 100 mM chlorek sodu, 0,1 mM chlorowodorek tris(2-karboksetylo)fosfiny (TCEP), 0,05% DDM, podczas gdy oczyszczone białko TA to 50 mM Tris pH 7,4, 150 mM chlorek sodu, 10 mM chlorek magnezu, 5 mM β-merkaptoetanol, 10% glicerol, 0,1% DDM. Roztwory podstawowe zawierające około 100 μM białka TA i monomeru Msp1 zapewniają, że składniki te będą stanowić < 5% końcowej objętości rozpuszczonej, co spowoduje rozcieńczenie DDM poniżej CMC.
  5. Dodaj żądaną ilość biokulek do próbki, aby usunąć detergent.
    1. Przytnij końcówkę końcówki pipety p200 do średnicy około 1/8 cala, aby koraliki zmieściły się w końcówce. Dokładnie wymieszaj rurkę z biokulkami, aby uzyskać jednolitą mieszaninę, a następnie szybko zdejmij pokrywkę i odpipetuj objętość, zanim biokulki osiądą. Przenieś biokulki do pustej probówki PCR.
    2. Po zakończeniu 10-minutowej inkubacji na lodzie należy użyć nieodciętej końcówki pipety, aby usunąć cały płyn z biokulek. Następnie przenieś rozpuszczoną zawartość 100 μl do probówki z biokulkami. Należy to zrobić szybko, aby biokulki nie zatrzymywały powietrza, co spowoduje unoszenie się kulek na wodzie.
  6. Pozostawić rozpuszczony materiał do obracania się na kole z prędkością ~80 obr./min przez 16 godzin w temperaturze 4 °C.
  7. Usuń odtworzony materiał z biokulek. Wykonaj szybkie obracanie w pikofudze, aby granulować biokulki, a następnie użyj nieodciętej końcówki pipety, aby przenieść odtworzony materiał do czystej probówki do PCR. Powtórz ten proces 1-2 razy, aż w próbce nie pozostaną żadne biokulki. Rozpuszczać na lodzie.
  8. Wstępnie oczyścić odtworzony materiał w celu usunięcia wszelkich białek, które nie zdołały się rozpuścić w liposomach.
    1. Przygotuj bufor ekstrakcyjny: 50 mM HEPES pH 7,5, 200 mM octan potasu, 7 mM octan magnezu, 2 mM DTT, 100 nM chlorek wapnia.
    2. Zrównoważyć kolumny wirowe glutationu z buforem ekstrakcyjnym zgodnie ze wskazówkami producenta. Zazwyczaj obejmuje to 3 rundy mycia 400 μl buforu, a następnie odwirowywanie przy 700 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej w celu usunięcia buforu.
    3. Dodać 5 μM każdego białka opiekuńczego (GST-SGTA i GST-kalmoduliny) do odtworzonego materiału. Te białka opiekuńcze będą wiązać się z TMD wszelkich białek, które nie zdołały się rozpuścić w liposomach. Oczyszczanie białek opiekuńczych zostało opisane wcześniej6,57.
      UWAGA: Te białka opiekuńcze są dostępne na rynku, ale wolimy oczyszczać je we własnym zakresie, aby kontrolować koszty i jakość. Oba białka mają 20 mM Tris pH 7,5, 100 mM chlorku sodu i 0,1 mM TCEP i mają stężenie wyjściowe około 160 μM. SGTA rozpoznaje substraty o wysoce hydrofobowym TMD, podczas gdy kalmodulina wiąże TMD o umiarkowanej hydrofobowości6,29. Razem ten koktajl opiekuńczy może rozpoznać szeroką gamę substratów.
    4. Dodać 100 μl buforu ekstrakcyjnego do odtworzonego materiału, zwiększając objętość do 200 μl. Dodać to do zrównoważonych kolumn wirowych glutationu. Należy pamiętać, że kolumny wirowe glutationu zapewniają najwyższy odzysk próbki, gdy objętość wstępnego oczyszczania wynosi 200 – 400 μL.
    5. Zatkaj kolumny wirujące i obracaj z prędkością ~80 obr./min w 4 °C przez 30 minut, aby umożliwić chaperony związanie się z żywicą.
    6. Obracać kolumny w temperaturze 700 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Przepływ to wstępnie oczyszczony materiał, który jest pozbawiony zagregowanych białek. Utrzymuj materiał na lodzie i przystąp bezpośrednio do testu ekstrakcji.

3. Test ekstrakcji

  1. Przygotuj probówki do analizy SDS PAGE. Każda reakcja będzie miała 4 probówki: INPUT (I), FLOW THROUGH (FT), WASH (W) i ELUTE (E).
    1. Dodać 45 μL próbki ddH2O do probówki WEJŚCIOWEJ, 40 μL ddH2O do probówki FLOW THROUGH i 0 μL do probówek WASH i ELUTE.
      UWAGA: Najlepszy stosunek sygnału do szumu w tym teście uzyskuje się, gdy próbki WASH i ELUTE są 5x skoncentrowane w stosunku do próbek WEJŚCIOWYCH i PRZEPŁYWOWYCH. Ze względu na rozcieńczenia podczas testu, wymaga to pobrania 5 μl próbki dla próbki WEJŚCIOWEJ, 10 μl próbki dla próbki FLOW THROUGH i 50 μL próbki dla próbek WASH i ELUTE.
    2. Dodaj 16,6 μl 4x bufor ładujący SDS PAGE do każdej probówki. Całkowita objętość każdej próbki wynosi 50 μL przed buforem ładującym SDS PAGE. Ostateczna objętość wynosi 66,6 μL (50 μL próbki + 16,6 μL 4x SDS PAGE Loading Buffer).
  2. Zmontuj test ekstrakcji.
    1. Przygotować reakcję ekstrakcji zawierającą 60 μL wstępnie oczyszczonych proteoliposomów, 5 μM GST-SGTA, 5 μM GST-Kalmoduliny i 2 mM ATP. Połącz wszystkie odczynniki z wyjątkiem ATP, który jest używany do zainicjowania reakcji. Doprowadzić do końcowej objętości 200 μl za pomocą buforu ekstrakcyjnego.
      UWAGA: Ponieważ do każdego testu ekstrakcji używa się 60 μl próbki, do trzech różnych testów ekstrakcji można użyć jednej rekonstytucji. Przeprowadzić kontrole dodatnie i ujemne (+ATP i -ATP) na materiale z tej samej rekonstytucji.
    2. Test ekstrakcji wstępnej na ciepło w bloku grzewczym o temperaturze 30 °C przez 2 minuty.
  3. Rozpocząć test ekstrakcji, dodając ATP do końcowego stężenia 2 mM i uruchomić timer.
    1. Wykonaj 5-sekundowy obrót w pikofuge, aby wymieszać ATP z reakcją. Inkubować reakcję w temperaturze 30 °C przez 30 minut.
    2. Podczas inkubacji pobrać 5 μl reakcji i dodać do probówki INPUT. Czas realizacji tego jest elastyczny.
    3. Podczas tego okresu inkubacji należy zrównoważyć jedną kolumnę spinową glutationu dla każdej próbki w teście ekstrakcji.
  4. Wykonaj ściąganie na białkach opiekuńczych, aby wyizolować wydobyty materiał.
    1. Po zakończeniu 30-minutowej inkubacji dodać 200 μl buforu ekstrakcyjnego do probówki, aby uzyskać całkowitą objętość do 400 μl. Dodać do zrównoważonej żywicy glutationowej i pozostawić do związania na kole w temperaturze 4°C przez 30 minut.
    2. Obracać kolumny o gramaturze 700 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, aby zebrać przepływ. Weź 10 μl na probówkę FLOW THROUGH. Próbka ta zawiera substraty, które są nadal zintegrowane z dwuwarstwą lipidową.
    3. Przemyć żywicę dwukrotnie 400 μl buforu ekstrakcyjnego, odrzucając przepływ. Przy trzecim praniu utrzymuj przepływ i pobierz 50 μl na probówkę WASH.
    4. Przygotować 5 ml buforu elucyjnego, dodając zredukowany glutation do końcowego stężenia 5 mM w buforze ekstrakcyjnym. Za każdym razem przygotuj ten bufor na świeżo.
    5. Dodać 200 μl buforu elucyjnego do kolumny wirowej. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Wirować w 700 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej do elucji. Utrzymuj przepływ. Powtórzyć proces po raz drugi, tak aby całkowita objętość elucji wynosiła 400 μl.
    6. Pobrać 50 μl próbki z próbki wymywania i dodać ją do probówki ELUTE.
  5. Analizuj aktywność ekstrakcji za pomocą SDS-PAGE i western blot.
    UWAGA: Ponieważ western blot jest dość standardową procedurą, dostępny jest podstawowy protokół, który podkreśla kilka szczegółów unikalnych dla tego testu.
    1. Załaduj próbki do nieplamiącego żelu poliakrylamidowego (4% układanie w stosy, 15% oddzielanie) i pracuj pod napięciem 200 V przez 50 minut w buforze tris-glicyny. Jeśli pozwala na to miejsce, użyj zarówno niezabarwionej, jak i poplamionej drabiny, aby umożliwić wizualizację na bezplamistym obrazie żelowym i odpowiednio przenieść na membranę PVDF. Bezbarwny żel umożliwia ilościową wizualizację białek zawierających tryptofan po aktywacji światłem ultrafioletowym, jednocześnie umożliwiając stosowanie żelu do western blot.
    2. Zobrazuj żel bez plam, aby potwierdzić, że obciążenie jest równe we wszystkich próbkach. Jest to niezbędna kontrola, która zapewnia, że wszelkie zmiany w sygnale wykrytym przez western blot nie są wynikiem zmiennego obciążenia białkami. W próbkach INPUT i ELUTION powinny być widoczne tylko pasma dla białek opiekuńczych (GST-kalmodulina i GST-SGTA). Przypomnijmy, że próbka ELUTE będzie bardziej skoncentrowana niż próbka INPUT.
    3. Zamontuj kasetę western blot za pomocą membrany PVDF 45 μm. Przesył prądem stałym 300 mA przez 60 minut.
    4. Po zablokowaniu błony związać się z przeciwciałem pierwszorzędowym przez 16 godzin w temperaturze 4 °C z delikatnym potrząsaniem ~15 obr./min. Osuszyć podłoże preparatem Anti-FLAG dla królika w rozcieńczeniu 1:1 000.
      UWAGA: Stosowane przeciwciała pierwszorzędowe i drugorzędowe będą specyficzne dla substratu, a stężenie do użycia może wymagać optymalizacji.
    5. Przemyć błonę i inkubować z przeciwciałem drugorzędowym, kozim anty-króliczym w rozcieńczeniu 1:10 000, delikatnie wstrząsając przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    6. Umyj membranę i obraz do analizy przy użyciu środka do wykrywania western blotting.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby poprawnie zinterpretować wyniki, żel bez plam i western blot muszą być oglądane razem. Bezplamny żel zapewnia równomierne obciążenie wszystkich próbek. Podczas przeglądania żelu bez plam, białka opiekuńcze (GST-kalmodulina i GST-SGTA) będą widoczne na pasach INPUT (I) i ELUTE (E). Dokładnie sprawdź, czy intensywność tych pasm jest jednolita we wszystkich próbkach wejściowych. Podobnie, należy upewnić się, że intensywność jest jednolita we wszystkich próbkach ELUTE. ELUTE jest 5x bardziej skoncentrowany niż INPUT i ta...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prawidłowe funkcjonowanie mitochondriów zależy od solidnego systemu kontroli jakości białek. Ze względu na nieodłączne ograniczenia w wierności szlaków docelowych białka TA, błędnie zlokalizowane białka TA są stałym źródłem stresu dla mitochondriów. Kluczowym elementem sieci proteostazy mitochondrialnej jest Msp1, która jest ATPazą AAA + zakotwiczoną w błonie, która usuwa nieprawidłowo zlokalizowane białka TA z OMM. W tym miejscu opisaliśmy, jak przygotować proteoliposomy, odtworzyć Msp1 i modelowe białko TA oraz przepro...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MLW opracował część tego protokołu podczas swoich studiów podoktoranckich u dr Roberta Keenana na Uniwersytecie w Chicago.

Ta praca jest finansowana z grantu NIH 1R35GM137904-01 dla MLW.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BiokulkiBio-Rad1523920
Wątroba bydlęca fosfatydyloinozytolAvanti840042CPI
Jajo kurze fosfatydylocholinaAvanti840051CPC
Jajo kurze fosfatydyloetanoloaminaAvanti840021CPE
ECL Select western blotting detection reagentGERPN2235
Wsporniki filtrówAvanti610014
Fiolka szklanaVWR60910L-1
Kolumna wirowa z glutationemThermo FisherPI16103
Koza anty-królikThermo FisherNC1050917
Mini-ekstruderAvanti610020
Membrana poliwęglanowaAvanti610006200 nM
Membrana PVDFThermo Fisher8851845 µ M
Rabbit anti-FLAGSigma-AldrichF7245
Syntetyczna 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfo-L-serynaAvanti840035CDOPS
Syntetyczna 1',3'-bis[1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfo]-glicerolAvanti710335CTOCL
Strzykawka, 1 mlNorm-Ject53548-001
Strzykawka, 1 mL, gazoszczelnaAvanti610017

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Song, J., Herrmann, J. M., Becker, T. Quality control of the mitochondrial proteome. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22, 54-70 (2021).
  2. Phillips, B. P., Miller, E. A. Membrane protein folding and quality control. Current Opinion in Structural Biology. 69, 50-54 (2021).
  3. Jiang, H. Quality control pathways of tail-anchored proteins. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1868, 118922(2020).
  4. McKenna, M. J., et al. The endoplasmic reticulum P5A-ATPase is a transmembrane helix dislocase. Science. 369, New York, N.Y. (2020).
  5. Hegde, R. S., Zavodszky, E. Recognition and Degradation of Mislocalized Proteins in Health and Disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11, 033902(2019).
  6. Shao, S., Hegde, R. S. A calmodulin-dependent translocation pathway for small secretory proteins. Cell. 147, 1576-1588 (2011).
  7. Samuelson, J. C., et al. YidC mediates membrane protein insertion in bacteria. Nature. 406, 637-641 (2000).
  8. Anghel, S. A., McGilvray, P. T., Hegde, R. S., Keenan, R. J. Identification of Oxa1 Homologs Operating in the Eukaryotic Endoplasmic Reticulum. Cell Reports. 21, 3708-3716 (2017).
  9. Aviram, N., et al. The SND proteins constitute an alternative targeting route to the endoplasmic reticulum. Nature. 540, 134-138 (2016).
  10. Voorhees, R. M., Hegde, R. S. Structure of the Sec61 channel opened by a signal sequence. Science. 351, New York, NY. 88-91 (2016).
  11. Cichocki, B. A., Krumpe, K., Vitali, D. G., Rapaport, D. Pex19 is involved in importing dually targeted tail-anchored proteins to both mitochondria and peroxisomes. Traffic. 19, Copenhagen, Denmark. 770-785 (2018).
  12. Mateja, A., et al. Protein targeting. Structure of the Get3 targeting factor in complex with its membrane protein cargo. Science. 347, New York, NY. 1152-1155 (2015).
  13. Chacinska, A., Koehler, C. M., Milenkovic, D., Lithgow, T., Pfanner, N. Importing mitochondrial proteins: machineries and mechanisms. Cell. 138, 628-644 (2009).
  14. Chitwood, P. J., Hegde, R. S. An intramembrane chaperone complex facilitates membrane protein biogenesis. Nature. , (2020).
  15. Chitwood, P. J., Juszkiewicz, S., Guna, A., Shao, S., Hegde, R. S. EMC Is Required to Initiate Accurate Membrane Protein Topogenesis. Cell. 175, 1-30 (2018).
  16. Bock, F. J., Tait, S. W. G. Mitochondria as multifaceted regulators of cell death. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21, 85-100 (2020).
  17. Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial proteins: from biogenesis to functional networks. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, (2019).
  18. Bykov, Y. S., Rapaport, D., Herrmann, J. M., Schuldiner, M. Cytosolic Events in the Biogenesis of Mitochondrial Proteins. Trends in Biochemical Sciences. 45, 650-667 (2020).
  19. Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial proteins: from biogenesis to functional networks. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 427, 1135(2019).
  20. Borgese, N., Coy-Vergara, J., Colombo, S. F., Schwappach, B. The Ways of Tails: the GET Pathway and more. The Protein Journal. , 1-17 (2019).
  21. Mateja, A., Keenan, R. J. A structural perspective on tail-anchored protein biogenesis by the GET pathway. Current Opinion in Structural Biology. 51, 195-202 (2018).
  22. Chio, U. S., Cho, H., Shan, S. Mechanisms of Tail-Anchored Membrane Protein Targeting and Insertion. Annual review of cell and developmental biology. 33, 417-438 (2017).
  23. Denic, V. A portrait of the GET pathway as a surprisingly complicated young man. Trends in biochemical sciences. , (2012).
  24. Hegde, R. S., Keenan, R. J. Tail-anchored membrane protein insertion into the endoplasmic reticulum. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12, 787-798 (2011).
  25. Kalbfleisch, T., Cambon, A., Wattenberg, B. W. A bioinformatics approach to identifying tail-anchored proteins in the human genome. Traffic. 8, Copenhagen, Denmark. 1687-1694 (2007).
  26. Doan, K. N., et al. The Mitochondrial Import Complex MIM Functions as Main Translocase for α-Helical Outer Membrane Proteins. Cell Reports. 31, (2020).
  27. McDowell, M. A., et al. Structural Basis of Tail-Anchored Membrane Protein Biogenesis by the GET Insertase Complex. Molecular Cell. 80, (2020).
  28. Guna, A., Volkmar, N., Christianson, J. C., Hegde, R. S. The ER membrane protein complex is a transmembrane domain insertase. Science. 591, New York, NY. 3099(2017).
  29. Rao, M., et al. Multiple selection filters ensure accurate tail-anchored membrane protein targeting. eLife. 5, 21301(2016).
  30. Schuldiner, M., et al. The GET complex mediates insertion of tail-anchored proteins into the ER membrane. Cell. 134, 634-645 (2008).
  31. Chen, Y. -C., et al. Msp1/ATAD1 maintains mitochondrial function by facilitating the degradation of mislocalized tail-anchored proteins. The EMBO journal. 33, 1548-1564 (2014).
  32. Wu, X., Rapoport, T. A. Translocation of Proteins through a Distorted Lipid Bilayer. Trends in Cell Biology. , (2021).
  33. Phillips, B. P., Gomez-Navarro, N., Miller, E. A. Protein quality control in the endoplasmic reticulum. Current Opinion in Cell Biology. 65, 96-102 (2020).
  34. van de Weijer, M. L., et al. Quality Control of ER Membrane Proteins by the RNF185/Membralin Ubiquitin Ligase Complex. Molecular Cell. 79, (2020).
  35. Weir, N. R., Kamber, R. A., Martenson, J. S., Denic, V. The AAA protein Msp1 mediates clearance of excess tail-anchored proteins from the peroxisomal membrane. eLife. 6, 28507(2017).
  36. Gardner, B. M., et al. The peroxisomal AAA-ATPase Pex1/Pex6 unfolds substrates by processive threading. Nature communications. 9, 135(2018).
  37. Puchades, C., et al. Unique Structural Features of the Mitochondrial AAA+ Protease AFG3L2 Reveal the Molecular Basis for Activity in Health and Disease. Molecular Cell. , (2019).
  38. Castanzo, D. T., LaFrance, B., Martin, A. The AAA+ ATPase Msp1 is a processive protein translocase with robust unfoldase activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117, 14970-14977 (2020).
  39. Wang, L., Myasnikov, A., Pan, X., Walter, P. Structure of the AAA protein Msp1 reveals mechanism of mislocalized membrane protein extraction. eLife. 9, (2020).
  40. Puchades, C., Sandate, C. R., Lander, G. C. The molecular principles governing the activity and functional diversity of AAA+ proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , 1-16 (2019).
  41. Yang, Y., et al. Folding-Degradation Relationship of a Membrane Protein Mediated by the Universally Conserved ATP-Dependent Protease FtsH. Journal of the American Chemical Society. , 10(2018).
  42. Baldridge, R. D., Rapoport, T. A. Autoubiquitination of the Hrd1 Ligase Triggers Protein Retrotranslocation in ERAD. Cell. 166, 394-407 (2016).
  43. Fresenius, H. L., Wohlever, M. L. Sorting out how Msp1 maintains mitochondrial membrane proteostasis. Mitochondrion. 49, 128-134 (2019).
  44. Wang, L., Walter, P. Msp1/ATAD1 in Protein Quality Control and Regulation of Synaptic Activities. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 36, 1-24 (2020).
  45. Dederer, V., et al. Cooperation of mitochondrial and ER factors in quality control of tail-anchored proteins. eLife. 8, 1126(2019).
  46. Matsumoto, S., et al. Msp1 Clears Mistargeted Proteins by Facilitating Their Transfer from Mitochondria to the ER. Molecular Cell. , (2019).
  47. Li, L., Zheng, J., Wu, X., Jiang, H. Mitochondrial AAA-ATPase Msp1 detects mislocalized tail-anchored proteins through a dual-recognition mechanism. EMBO Reports. 20, (2019).
  48. Weidberg, H., Amon, A. MitoCPR - a surveillance pathway that protects mitochondria in response to protein import stress. Science. 360, New York, NY. (2018).
  49. Okreglak, V., Walter, P. The conserved AAA-ATPase Msp1 confers organelle specificity to tail-anchored proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, (2014).
  50. Piard, J., et al. A homozygous ATAD1 mutation impairs postsynaptic AMPA receptor trafficking and causes a lethal encephalopathy. Brain. , (2018).
  51. Zhang, J., et al. The AAA+ ATPase Thorase regulates AMPA receptor-dependent synaptic plasticity and behavior. Cell. 145, 284-299 (2011).
  52. Prendergast, J., et al. Ganglioside regulation of AMPA receptor trafficking. The Journal of Neuroscience. 34, 13246-13258 (2014).
  53. Umanah, G. K. E., et al. Thorase variants are associated with defects in glutamatergic neurotransmission that can be rescued by Perampanel. Science Translational Medicine. 9, 4985(2017).
  54. Pignatelli, M., et al. Synaptic Plasticity onto Dopamine Neurons Shapes Fear Learning. Neuron. 93, 425-440 (2017).
  55. Zhang, J., et al. The AAA Thorase is neuroprotective against ischemic injury. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , 271678(2018).
  56. Umanah, G. K. E., et al. AMPA Receptor Surface Expression Is Regulated by S-Nitrosylation of Thorase and Transnitrosylation of NSF. Cell Reports. 33, 108329(2020).
  57. Wohlever, M. L., Mateja, A., McGilvray, P. T., Day, K. J., Keenan, R. J. Msp1 Is a Membrane Protein Dislocase for Tail-Anchored Proteins. Molecular Cell. 67, 194-202 (2017).
  58. Lovell, J. F., et al. Membrane binding by tBid initiates an ordered series of events culminating in membrane permeabilization by Bax. Cell. 135, 1074-1084 (2008).
  59. Leshchiner, E. S., Braun, C. R., Bird, G. H., Walensky, L. D. Direct activation of full-length proapoptotic BAK. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 986-995 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Protein ReconstitutionAAA ATPaseMitochondrial ProteostasisLiposome GenerationMembrane Protein ExtractionTail Anchored ProteinsGlutathione Spin ColumnsSDS PAGE AnalysisWestern Blot

Powiązane artykuły