Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

In Situ Hybrydyzacja u larw danio pręgowanego i osobników młodocianych podczas rozwoju Mesonephros

2.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62930

⸱

13 sierpnia 2021

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Indiana University of Pennsylvania

W tym artykule

Podsumowanie

Danio pręgowany jest ważnym modelem do zrozumienia rozwoju nerek. W tym przypadku protokół hybrydyzacji in situ jest zoptymalizowany pod kątem wykrywania ekspresji genów u larw danio pręgowanego i osobników młodocianych podczas rozwoju mesonephros.

Streszczenie

Danio pręgowany tworzy dwie struktury nerkowe w ciągu swojego życia. Nercze (nerka zarodkowa) tworzy się podczas rozwoju embrionalnego i zaczyna funkcjonować po 2 dniach od zapłodnienia. Składa się tylko z dwóch nefronów, przednercze służy jako jedyna nerka podczas życia larwalnego, dopóki nie będzie wymagana większa funkcja nerek ze względu na rosnącą masę ciała. Aby poradzić sobie z tym wyższym zapotrzebowaniem, mesonephros (dorosła nerka) zaczyna tworzyć się podczas metamorfozy. Nowe nefrony pierwotne łączą się z przednerczymi i tworzą połączone światła. Następnie nefrony wtórne łączą się z pierwotnymi (i tak dalej), tworząc rozgałęziającą się sieć w mezonach. Zdecydowana większość badań koncentruje się na przednerczach ze względu na łatwość wykorzystania zarodków. W związku z tym istnieje potrzeba opracowania technik badania starszych i większych larw oraz młodych ryb, aby lepiej zrozumieć rozwój mesonephros. W tym przypadku protokół hybrydyzacji in situ do analizy ekspresji genów jest zoptymalizowany pod kątem penetracji sondy, mycia sond i przeciwciał oraz wybielania pigmentów w celu lepszej wizualizacji śródnercza. Linia transgeniczna Tg (lhx1a-EGFP) służy do znakowania komórek progenitorowych i dystalnych kanalików powstających nefronów. Protokół ten wypełnia lukę w badaniach nad mesonephros. Jest to kluczowy model pozwalający zrozumieć, w jaki sposób powstają nowe tkanki nerkowe i integruje się z istniejącymi nefronami, a także dostarcza informacji na temat terapii regeneracyjnych.

Wprowadzenie

Zarodek danio pręgowanego jest ważnym modelem do badania rozwoju tkanek ze względu na jego mały rozmiar, przezroczystość, dostępne narzędzia i możliwość przetrwania bez karmienia przez okres do pięciu dni1,2. Znacząco przyczynił się do zrozumienia rozwoju nerek i ochrony między danio pręgowanym a ssakami3,4,5. Nerki odgrywają istotną rolę w utrzymaniu homeostazy płynów, filtrowaniu krwi i wydalaniu odpadów6. Nefron, jednostka funkcjonalna nerki, składa się z filtra krwi połączonego z długim kanalikiem. U danio pręgowanego przez całe życie tworzą się dwie struktury nerkowe. Przednercze (tymczasowa nerka embrionalna) tworzy się jako pierwsze we wczesnym okresie rozwoju. Składa się z dwóch nefronów biegnących wzdłuż osi przednio-tylnej i staje się funkcjonalny po około 2 dniach od zapłodnienia (dpf). Użyteczność przednercza polega na jego prostocie, ma tylko dwa nefrony, które są w większości liniowe i łatwe do wizualizacji (chociaż bliższy kanalik kręty zaczyna się zwijać przy trzech dpf)3. Ułatwiło to nie tylko badania nad jego wczesnym rozwojem od mezodermy pośredniej, ale także nad wzorcem segmentacji i naprawą kanalików7,8.

Użyteczność zebry staje się ograniczona po pięciu dpf, kiedy żółtko jest zmniejszone, a larwy polegają na żerowaniu w systemie wodnym9. W wieku około 2 tygodni larwy przechodzą metamorfozę w młode, gdzie tworzą się nowe tkanki, a stare tkanki są tracone i/lub reorganizowane9. Jest to również moment, w którym tworzy się mesonephros (stała dorosła nerka) class<="xref">10,11,12. Pierwszy dorosły nefron tworzy się w pobliżu szóstego somitu i łączy się z dystalnym wczesnym kanalikiem przednercza. Dodatkowe nefrony są początkowo dodawane z tyłu tej pozycji, ale później także w kierunku przedniej. Pierwotne nefrony w tej pierwszej fali łączą się z kanalikami przednerczy i dzielą wspólne światło, aby zdeponować swoje odpady. Nefrony wtórne tworzą się w następnej fali i łączą się z nefronami pierwotnymi. Ten powtarzający się proces tworzy mesonephros, który jest rozgałęziony, nieco podobny do nerki ssaków. Przypuszczalnie przednercze ostatecznie traci swoją tożsamość kanalików i staje się dwoma głównymi kanałami zbiorczymi, w których wszystkie nefrony odprowadzają swoje odpady13.

Przed powstaniem pierwszego dorosłego nefronu, pojedyncze komórki progenitorowe zaczynają pojawiać się w larwach ~4 mm (całkowitej długości) (~10 dpf). Komórki te, które są oznaczone w linii transgenicznej Tg(lhx1a-EGFP), przylegają do przednerczy i wydają się migrować do przyszłych miejsc nefrogenezy. Pojedyncze komórki łączą się w klastry, które różnicują się w nowe nefrony12. Nie jest jasne, gdzie znajdują się te komórki ani jakie geny wyrażają przed rozpoczęciem mezonfrogenezy.

Zrozumienie rozwoju mesonephros dostarcza wglądu w nerki ssaków w sposób, w jaki nie mogą tego zrobić przednercze. Obejmują one tworzenie agregatów nefrogennych z pojedynczych komórek progenitorowych, funkcjonalną integrację nowych nefronów z istniejącymi oraz rozgałęziającą się morfogenezę. Istnieją jednak ograniczenia w badaniu rozwoju postembrionalnego. Larwy są mniej przezroczyste ze względu na większy rozmiar i pigmentację. Oś czasu rozwoju nie jest synchroniczna między poszczególnymi zwierzętami i jest silnie zależna od czynników środowiskowych, takich jak karmienie i zatłoczenie9,14. Chociaż istnieją odczynniki knockdown, są one mniej skuteczne u larw w porównaniu do embryos15. W tym protokole opisano metodę hybrydyzacji in situ w celu określenia ekspresji genów podczas rozwoju mesonephros danio pręgowanego. Zoptymalizowano kilka kroków w celu zwiększenia wizualizacji śródnercza oraz penetracji i mycia sondy i przeciwciała. Linia transgeniczna Tg (lhx1a-EGFP) jest używana wraz z sondą do EGFP do znakowania pojedynczych komórek progenitorowych, agregatów nefrogennych i dystalnych kanalików powstających nefronów. Metoda ta zapewni głębsze zrozumienie rozwoju śródnerki i wgląd w terapie regeneracyjne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wykorzystanie larw danio pręgowanego i osobników młodocianych jest zatwierdzone przez IUP IACUC (protokół #02-1920, #08-1920). Szczegółowe informacje na temat zawartości rozwiązania znajdują się w Tabeli materiałów.

1. Hodowla larw

UWAGA: Potrzeba do 21 dni lub więcej, aby doprowadzić larwy i młode osobniki do etapu zainteresowania.

  1. Przygotuj dorosłe ryby, aby kojarzyły się, dodając 1 samca i 1 samicę do zbiornika godowego późnym popołudniem po ostatnim posiłku.
    UWAGA: Nie wszystkie pary ryb będą się kojarzyć. Zacznij od ustawienia 20 par, aby określić częstotliwość krycia i odpowiednio dostosować w przyszłych eksperymentach.
  2. Następnego dnia po zakończeniu krycia ryb (około godziny 13) należy zebrać zarodki z pożywką E3 na płytkach Petriego.
    1. Upewnij się, że na jednej płytce nie ma więcej niż 30 zarodków.
    2. Usuń zanieczyszczenia (takie jak kał) z płytek Petriego i dodaj 20 ml pożywki E3.
    3. Inkubować w temperaturze 28,5 °C przez 1 dzień.
  3. Umieść dorosłego danio pręgowanego z powrotem w systemie wodnym.
  4. Przy 1 dpf zastąp podłoże E3 świeżym E3.
    1. Inkubować w temperaturze 28,5 °C jeszcze przez 4 dni, aż do osiągnięcia 5 dpf.
  5. Umieść sitko o pojemności 400 μm w zbiorniku o pojemności 2,8 l i napełnij je 2 cm wodą systemową.
    1. Dodać 5 larw dpf z 1 płytki (do 30 larw ogółem).
    2. Umieść zbiornik w systemie wodnym, ale nie uruchamiaj przepływu wody.
  6. Podawaj larwom 4 ml sproszkowanego pokarmu dwa razy dziennie do 14 dpf.
  7. Przy 6 dpf rozpocznij przepływ wody z prędkością 1 kropli na sekundę.
    UWAGA: Codziennie sprawdzaj przepływ wody i odpowiednio dostosuj.
  8. Przy 8 dpf zwiększ przepływ wody do powolnego, stałego strumienia.
  9. W temperaturze 14 dpf oprócz karmy w proszku podawaj żywe krewetki solankowe.

2. Dzień 1 - 2: Naprawianie larw

  1. Usuń zbiornik larw w żądanym punkcie czasowym.
  2. Napełnij płytkę Petriego 20 ml wody systemowej.
  3. Użyj siatki o drobnych oczkach, aby delikatnie zgarnąć larwy i wynieść je na powierzchnię wody.
    1. Odciąć końcówkę pipety transferowej, aby uzyskać szerszy otwór i przenieść larwy na płytkę Petriego. Większy otwór pipety pozwala na przenoszenie kilku małych larw lub kilku większych jednocześnie.
  4. Dodaj 2 ml tricainy (2%, bulion o pH 7), aby unieruchomić larwy.
    1. Gdy larwy przestaną się poruszać, usuń większość wody i dodaj 10 ml tricainy. Odczekaj 15 minut, aż larwy zostaną poddane eutanazji.
    2. Opcjonalnie: W przypadku osobników młodocianych dłuższych niż 8 mm odciąć głowy i ogony żyletką (po eutanazji) pod mikroskopem preparacyjnym, aby poprawić penetrację roztworu utrwalającego. Upewnij się, że zapisałeś całkowitą długość każdego zwierzęcia przed odcięciem głowy i ogona i wyizoluj każde z nich na osobnej płytce Petriego. Zapoznaj się z krokiem 3, aby dowiedzieć się, jak mierzyć zwierzęta.
  5. Zastąp tricainę 20 ml roztworu utrwalającego (4% paraformaldehydu, 1% DMSO). Umieść pokrywkę z powrotem na szalce Petriego i powoli kołysz się w dygestorium.
    UWAGA: Ważne jest, aby korzystać z platformy bujanej. Potrząsająca platforma o ruchu okrężnym spowoduje wygięcie osi zwierzęcia. Używaj tylko świeżego (nie wstępnie zamrożonego) roztworu utrwalającego.
    UWAGA: Roztwór utrwalający zawiera paraformaldehyd, który jest prawdopodobnym czynnikiem rakotwórczym. Do odmierzenia proszku należy użyć dygestorium (lub maski) i rękawiczek.
  6. Po 30 minutach zastąp roztwór utrwalający świeżym roztworem utrwalającym.
    1. Zużyty roztwór utrwalający należy zebrać w osobnym pojemniku na odpady w celu prawidłowej utylizacji.
    2. Przenieść larwy do probówki o pojemności 50 ml zawierającej 25 ml świeżego roztworu utrwalającego.
    3. Upewnij się, że nakrętka jest szczelna i powoli kołysz się w temperaturze 4 °C przez 2 dni. Dla wygody możliwa jest dłuższa inkubacja.

3. Dzień 3: Pomiar larw

  1. W dygestorium zastąp roztwór utrwalający 20 ml PBST.
  2. Przenieś larwy na szalkę Petriego.
  3. Umieść płaską linijkę na mikroskopie preparacyjnym i połóż płytkę Petriego na linijce.
  4. Użyj manipulatora rzęs, aby przesunąć każdą larwę na linijkę, aby zmierzyć jej całkowitą długość (od pyska do czubka płetwy ogonowej) (Rysunek 1).
  5. Połączyć kilka larw o podobnej długości (np. 5,0 mm i 5,1 mm) w jednej szklanej fiolce o pojemności 5,5 ml, do 10 larw w każdej fiolce.

4. Dzień 3 - 4: Odwodnienie

  1. Zastąp PBST 4 ml 100% metanolu. Kołysz fiolką przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Zastąp metanol świeżym metanolem i kołysz się przez 5 minut. Powtórz jeszcze raz.
  3. Przechowywać fiolkę w temperaturze -20 °C przez 2 dni. Dla wygody możliwa jest dłuższa inkubacja.

5. Dzień 5: Nawodnienie

  1. Podgrzać fiolkę do temperatury pokojowej.
  2. Zastąp metanol 4 ml 75% metanolu/25% PBST. Kołysz przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Zastąp roztwór w kroku 5.2 4 ml 50% metanolu/50% PBST i kołysz przez 5 minut.
  4. Zastąp roztwór w kroku 5.3 4 ml 25% metanolu/75% PBST i kołysz przez 5 minut.
  5. Zastąp roztwór opisany w kroku 5.4 4 ml PBST i kołysz przez 10 minut.
  6. Zastąp PBST 4 ml świeżego PBST i kołysz przez 10 minut. Powtórz jeszcze raz.

6. Dzień 5: Trawienie proteinazy K

  1. Zastąp PBST 2 ml roztworu proteinazy K (20 μg/ml, 1% DMSO końcowe stężenie w PBST) i miażdż w temperaturze pokojowej przez 30 min.
    UWAGA: Larwy dłuższe niż 6 mm będą potrzebowały dłuższego czasu inkubacji i/lub wyższego stężenia proteinazy K. Dokładny czas i stężenie będą musiały zostać określone empirycznie. Rozpocząć od wydłużenia czasu inkubacji o 10 minut na każde 0,5 mm dłuższe niż 6 mm.
  2. Zastąp roztwór proteinazy K 4 ml PBST i kołysz się przez 10 minut.
  3. Zastąp PBST 4 ml świeżego PBST i kołysz przez 10 minut. Powtórz jeszcze raz.
  4. Zastąp PBST 4 ml świeżego roztworu utrwalającego i kołysz przez 1 godzinę. Dla wygody możliwa jest dłuższa inkubacja w temperaturze 4 °C.

7. Dzień 5: Wybielanie

  1. Zastąp roztwór utrwalający 4 ml PBST i miażdż w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
  2. Zastąp PBST 4 ml świeżego PBST i kołysz przez 10 minut. Powtórz jeszcze raz.
  3. Przenieś larwy na płytkę 6-dołkową (do 10 larw na studzienkę).
  4. Zastąp PBST 3 ml świeżego roztworu wybielającego.
  5. Kołysz w temperaturze pokojowej i monitoruj pigmentację pod mikroskopem preparacyjnym co 5 minut. Szukaj zaniku pigmentacji wzdłuż śródnercza (grzbietowo do pęcherza pławnego i jelita).
    UWAGA: W przypadku larw o długości do 6 mm wybielenie pigmentacji otaczającej śródnerce zajmie do 20 minut. Nie wybielać dłużej niż jest to konieczne, aby zachować integralność larw.
  6. Przenieść larwy z powrotem do szklanej fiolki.
  7. Zastąp roztwór wybielający 4 ml PBST. Kołysz się przez 10 minut.
  8. Zastąp PBST 4 ml świeżego PBST i kołysz przez 10 minut. Powtórz jeszcze raz.
  9. Zastąp PBST 4 ml świeżego roztworu utrwalającego i kołysz przez 1 godzinę. Dla wygody możliwa jest dłuższa inkubacja w temperaturze 4 °C.

8. Dzień 5: Prehybrydyzacja

UWAGA: W przypadku czynności wykonywanych w temperaturze 70 °C, ważne jest, aby pracować szybko, aby zminimalizować wychładzanie się fiolki.

  1. Zastąp roztwór utrwalający 4 ml PBST i miażdż w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
  2. Zastąp PBST 4 ml świeżego PBST i kołysz przez 10 minut. Powtórz jeszcze raz.
  3. Zastąp PBST 4 ml roztworu Hyb- i kołysz w temperaturze pokojowej przez 10 min.
    UWAGA: Roztwory Hyb-, Hyb+ i probówki zawierają formamid, który może podrażniać skórę. Do obsługi tych roztworów należy używać rękawiczek.
  4. Zastąp Hyb- 4 ml świeżego Hyb- i kołysz przez 10 minut. Powtórz jeszcze raz.
    1. Zużyte roztwory Hyb-, Hyb+ i sondy należy zebrać do oddzielnego pojemnika na odpady w celu prawidłowej utylizacji.
  5. Zastąp Hyb- 4 ml roztworu Hyb+.
  6. Inkubować fiolkę w temperaturze 70 °C przez noc.
  7. Rozcieńczyć sondę EGFP-fluoresceiny w stosunku 1:100 w 500 μl Hyb+ i inkubować ją O/N w temperaturze 70 °C.
    UWAGA: Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi syntezy sondy.

9. Dzień 6: Hybrydyzacja sondy

  1. Zastąpić roztwór Hyb+ w fiolce podgrzaną sondą i inkubować w temperaturze 70 °C przez noc.
    UWAGA: Larwy dłuższe niż 6 mm potrzebują 2 dni inkubacji.
  2. Podgrzej bufor do mycia, roztwory 2x SSCT i 0,2x SSCT w temperaturze 70 °C na noc.

10. Dzień 7: Mycie sondy

  1. Zastąpić sondę 4 ml podgrzanego buforu do przemywania i inkubować w temperaturze 70 °C przez 30 minut.
    1. Zużytą sondę należy zebrać w osobnym pojemniku na odpady w celu prawidłowej utylizacji.
  2. Zastąpić bufor do przemywania 4 ml świeżego buforu do płukania i inkubować w temperaturze 70 °C przez 30 minut.
  3. Zastąpić bufor do przemywania 4 ml podgrzanego roztworu 2x SSCT i inkubować w temperaturze 70 °C przez 15 minut.
  4. Dodaj 50 ml podgrzanego 0,2x SSCT do probówki o pojemności 50 ml.
    1. Włóż sitko do komórek (100 μm) do górnej części probówki. Upewnij się, że sitko do komórek jest wciśnięte do końca, aż się zatrzyma.
    2. Przenieść larwy ze szklanej fiolki do sitka do komórek. Upewnić się, że larwy są zanurzone w buforze i inkubować w temperaturze 70 °C przez 2 godziny.
  5. Przygotować nową probówkę zawierającą 50 ml podgrzanego 0,2x SSCT.
    1. Przenieść sitko komórkowe z kroku 10.4.2 do nowej probówki 0,2x SSCT i inkubować w temperaturze 70 °C przez 2 godziny.
    2. Powtórz krok 10.5 jeszcze raz.

11. Dzień 7: Blokowanie

  1. Przenieść larwy do nowej szklanej fiolki i schłodzić do temperatury pokojowej.
  2. Zastąp 0,2x SSCT 4 ml 67% 0,2x SSCT/33% MABT i kołysz w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
  3. Zastąp roztwór w kroku 11.2 4 ml 33% 0,2x SSCT/67% MABT i kołysz przez 10 minut.
  4. Zastąp roztwór w kroku 11.3 4 ml MABT i kołysz przez 10 minut.
  5. Zastąp MABT 4 ml świeżego MABT i rock przez 10 minut. Powtórz jeszcze raz.
  6. Zastąpić MABT 4 ml roztworu blokującego i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc. Dla wygody możliwa jest dłuższa inkubacja.

12. Dzień 8 - 9: Inkubacja przeciwciał

  1. Rozcieńczyć przeciwciało antyfluoresceinowe w stosunku 1:5 000 w 500 μl roztworu blokującego.
  2. Zastąpić roztwór blokujący roztworem przeciwciała i inkubować w temperaturze 4 °C przez 2 dni. Dla wygody możliwa jest dłuższa inkubacja.
    1. Obracać fiolkę dwa razy dziennie w celu poruszenia larw.
      UWAGA: Larwy dłuższe niż 6 mm potrzebują jeszcze 1-2 dni inkubacji.

13. Dzień 10 - 11: Mycie przeciwciał

  1. Zastąp roztwór przeciwciała 4 ml PBST i kołysz w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
  2. Zastąp PBST 4 ml świeżego PBST i kołysz przez 10 minut. Powtórz jeszcze raz.
  3. Przenieś larwy do probówki o pojemności 50 ml.
  4. Dodać 40 ml PBST2. Połóż probówkę na boku i kołysz się w temperaturze 4 °C przez noc.
  5. Zastąp PBST2 40 ml świeżego PBST2 i kołysz w temperaturze 4 °C przez noc. Dla wygody możliwa jest dłuższa inkubacja.
    UWAGA: Larwy dłuższe niż 6 mm potrzebują jeszcze 1-2 dni mycia.

14. Dzień 12: Barwienie

  1. Przenieś larwy na płytkę 6-dołkową.
  2. Zastąp PBST2 3 ml buforu barwiącego i rozbujaj w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
  3. Zastąp bufor barwiący 3 ml świeżego buforu barwiącego i rozbujaj przez 5 minut. Powtórz jeszcze raz.
  4. Zastąp bufor barwiący 3 ml roztworu barwiącego. Przykryj folią aluminiową i monitoruj plamy przez kilka następnych godzin.
    1. W przypadku sond o słabym sygnale, inkubować w temperaturze 4 °C przez noc i raz w międzyczasie zastąpić roztwór barwiący świeżym roztworem barwiącym.
  5. Po osiągnięciu pożądanej intensywności barwienia zastąp roztwór barwiący 3 ml roztworu zatrzymującego i kołysz przez 30 minut.
  6. Zastąp roztwór zatrzymujący 3 ml świeżego roztworu zatrzymującego i kołysz przez 30 minut. Powtórz jeszcze raz.
  7. Przenieść larwy do nowej szklanej fiolki i zastąpić roztwór zatrzymujący 4 ml świeżego roztworu utrwalającego i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Dla wygody możliwa jest dłuższa inkubacja w temperaturze 4 °C.
  8. Larwy należy przechowywać w roztworze utrwalającym w ciemności w temperaturze 4 °C przez okres do roku.

15. Dzień 12: Obrazowanie

  1. Zastąp roztwór utrwalający 4 ml PBST i miażdż w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
  2. Przenieś larwy na płytkę 6-dołkową.
  3. Zastąp PBST 4 ml świeżego PBST i kołysz przez 10 minut. Powtórz jeszcze raz.
  4. Zastąp PBST 3 ml 50% glicerolu (w PBST) i kołysz się przez 10 minut.
  5. Zastąp roztwór w kroku 15.4 3 ml 100% glicerolu bez kołysania przez 10 minut.
  6. Użyj mikroskopu preparacyjnego, aby zobrazować larwy bezpośrednio w 6-dołkowej płytce lub przenieś larwy do szkiełka wgłębieniowego, aby zobrazować pod mikroskopem złożonym. Użyj manipulatora rzęs, aby zorientować larwy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wykorzystując linię transgeniczną Tg(lhx1a-EGFP) wykazano, że niniejszy protokół hybrydyzacji in situ jest skuteczny w znakowaniu komórek progenitorowych nerek oraz różnych struktur nefronu podczas rozwoju mezonephros. Zgodnie z oczekiwaniami, w tej linii transgenicznej znakowany jest również ośrodkowy układ nerwowy (niepokażano). Pierwszy nefron mezonephros tworzy się przy długości około 5,2 mm, grzbietowo względem pronephros (Rycina 2A), a cewka dystalna tego nefronu jest...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisana tutaj metoda hybrydyzacji in situ ma na celu badanie rozwoju mesonephros. Można go jednak zastosować do badania rozwoju innych tkanek i narządów podczas metamorfozy, takich jak jelita, układ nerwowy, łuski i pigmentacja14. Można generować sondy dla genów endogennych lub markerów fluorescencyjnych w liniach transgenicznych.

Bardzo ważne jest, aby larwy pozostały nienaruszone, aby można było obserwować narządy i tkanki w ich naturalnym kontekście. Aby zac...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

Finansowanie zostało zapewnione przez Pennsylvania Academy of Science, Commonwealth of Pennsylvania Biologists oraz Indiana University of Pennsylvania (School of Graduate Studies and Research, Department of Biology oraz Cynthia Sushak Undergraduate Biology Fund for Excellence). Linia transgeniczna Tg(lhx1a-EGFP) została dostarczona przez dr Neila Hukriede (University of Pittsburgh).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przeciwciało antyfluoresceinoweRoche/Sigma-Aldrich11426338910
Roztwór0,8% KOH, 0,9% H2O2 w PBST
Odczynnik blokującyRoche/Sigma-Aldrich11096176001Stosować do roztworu blokującego, przygotować zgodnie z instrukcją producenta
Sitko do komórekFisher Scientific  22-363-549100 μ m
E3 medium5 mM NaCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4, 0,17 mM KCl, 0,0001% błękit metylenowy
Manipulator rzęsFisher ScientificNC1083208Służy do manipulowania larwami
Roztwór4% paraformaldehydu, 1% DMSO w PBS; ciepło w 65° C wstrząsając, aż proszek się rozpuści, a następnie dodać DMSO po ostygnięciu
Synteza sondy fluoresceinowejChe/Sigma-Aldrich11685619910
Fiolka szklanaFisher Scientific03-338B
Kapsułka HatchfryArgent
Hyb- roztwór50% formamidu, 5X SSC, 0,1% roztwór
Tween-20 Hyb+HYB-, 5 mg/ml torula RNA, 50 ug/ml heparyny
MAB (10X)1 M kwas maleinowy, 1,5 M NaCl, pH 7,5
MABT1X MAB, 0,1% Tween-20
Kwas maleinowySigma-AldrichM0375
ParaformaldehydSigma Aldrich158127
PBS (10X)8% NaCl, 0,2% KCl, 1,44% Na2HPO4, 0,24% KH2PO4
PBST1X PBS, 0,1% Tween-20
PBST21X PBS, 0,2% Tween-20
ŻywnośćWymieszaj po 2 g spiruliny i enkapsulonu hatchfry w 50 ml wody z systemu rybnego i dobrze wstrząśnij
Proteinaza KSigma-AldrichP5568Służy do przepuszczalności larw
Roztwórproteinazy K20  μ g / mL, 1% DMSO końcowe stężenie w PBST
Spirulina mikrodrobny proszekArgent
SSC (20X)3 M NaCl, 0,3 M octan sodu bezwodny, pH 7, autoklaw
SSCT (0,2X)Rozcieńczony od 20X SSC, 0,1% Tween-20
SSCT (2X)Rozcieńczony od 20X SSC, 0,1% Tween-20
Buforbarwiący100 mM Tris pH 9,5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0,1% Tween-20
barwiący200 μ g/ml chlorek jodonitrotetrazolu, 200 μ g/ml soli disodowej fosforanu 5-bromo-4-chloro-3-indolilofosforanu, w buforze barwiącym
Roztwór1 mM EDTA, pH 5,5, w PBST
Torula (drożdże) RNASigma-AldrichR6625
TrikainaSigma AldrichE105212%, pH 7
Bufor50% formamidu, 2X SSC, 0,1% Tween-20
wybielający utrwalający w proszku Roztwór zatrzymujący płuczący

Bibliografia

  1. Kinth, P., Mahesh, G., Panwar, Y. Mapping of zebrafish research: a global outlook. Zebrafish. 10 (4), 510-517 (2013).
  2. Grunwald, D. J., Eisen, J. S. Headwaters of the zebrafish - emergence of a new model vertebrate. Nature Reviews. Genetics. 3 (9), 717-724 (2002).
  3. Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney International. 73 (10), 1120-1127 (2008).
  4. Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 16 (2), 299-304 (2005).
  5. Swanhart, L. M., et al. Zebrafish kidney development: basic science to translational research. Birth defects research. Part C, Embryo Today: Reviews. 93 (2), 141-156 (2011).
  6. Dressler, G. Advances in early kidney specification, development and patterning. Development. 136 (23), 3863-3874 (2009).
  7. Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e2845(2011).
  8. Marra, A. N., et al. Visualizing gene expression during zebrafish pronephros development and regeneration. Methods in Cell Biology. 154, 183-215 (2019).
  9. McMenamin, S. K., Chandless, M. N., Parichy, D. M. Working with zebrafish at postembryonic stages. Methods in Cell Biology. 134, 587-607 (2016).
  10. Diep, C. Q., et al. Development of the zebrafish mesonephros. Genesis. 53 (3-4), 257-269 (2015).
  11. Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 299 (5), 1040-1047 (2010).
  12. Diep, C. Q., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470 (7332), 95-100 (2011).
  13. Diep, C. Q., Mikeasky, N., Davidson, A. J., et al. The Zebrafish in Biomedical Research: Biology, Husbandry, Diseases, and Research Applications. Cartner, S. C., et al. , Elsevier. 145-150 (2020).
  14. Parichy, D., Elizondo, M., Mills, M., Gordon, T., Engeszer, R. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Developmental dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 238 (12), 2975-3015 (2009).
  15. Guo, R., et al. LIM Homeobox 4 (lhx4) regulates retinal neural differentiation and visual function in zebrafish. Science Reports. 11 (1), 1977(2021).
  16. Vauti, F., Stegemann, L. A., Vogele, V., Koster, R. W. All-age whole mount in situ hybridization to reveal larval and juvenile expression patterns in zebrafish. PloS One. 15 (8), 0237167(2020).
  17. Parichy, D. M., Turner, J. M., Parker, N. B. Essential role for puma in development of postembryonic neural crest-derived cell lineages in zebrafish. Developmental Biology. 256 (2), 221-241 (2003).
  18. Yang, H., Wanner, I. B., Roper, S. D., Chaudhari, N. An optimized method for in situ hybridization with signal amplification that allows the detection of rare mRNAs. The Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 47 (4), 431-445 (1999).
  19. McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. Analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51644(2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza ekspresji genówkomórki progenitorowe nerekformowaniepronefrosuprotokół hybrydyzacjitrawienie proteinazą Kbarwienie przeciwciałamimikroskop stereoskopowy
In Situ Hybrydyzacja u larw danio pręgowanego i osobników młodocianych podczas rozwoju Mesonephros
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.