Danio pręgowany jest ważnym modelem do zrozumienia rozwoju nerek. W tym przypadku protokół hybrydyzacji in situ jest zoptymalizowany pod kątem wykrywania ekspresji genów u larw danio pręgowanego i osobników młodocianych podczas rozwoju mesonephros.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
In Situ Hybrydyzacja u larw danio pręgowanego i osobników młodocianych podczas rozwoju Mesonephros
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Danio pręgowany tworzy dwie struktury nerkowe w ciągu swojego życia. Nercze (nerka zarodkowa) tworzy się podczas rozwoju embrionalnego i zaczyna funkcjonować po 2 dniach od zapłodnienia. Składa się tylko z dwóch nefronów, przednercze służy jako jedyna nerka podczas życia larwalnego, dopóki nie będzie wymagana większa funkcja nerek ze względu na rosnącą masę ciała. Aby poradzić sobie z tym wyższym zapotrzebowaniem, mesonephros (dorosła nerka) zaczyna tworzyć się podczas metamorfozy. Nowe nefrony pierwotne łączą się z przednerczymi i tworzą połączone światła. Następnie nefrony wtórne łączą się z pierwotnymi (i tak dalej), tworząc rozgałęziającą się sieć w mezonach. Zdecydowana większość badań koncentruje się na przednerczach ze względu na łatwość wykorzystania zarodków. W związku z tym istnieje potrzeba opracowania technik badania starszych i większych larw oraz młodych ryb, aby lepiej zrozumieć rozwój mesonephros. W tym przypadku protokół hybrydyzacji in situ do analizy ekspresji genów jest zoptymalizowany pod kątem penetracji sondy, mycia sond i przeciwciał oraz wybielania pigmentów w celu lepszej wizualizacji śródnercza. Linia transgeniczna Tg (lhx1a-EGFP) służy do znakowania komórek progenitorowych i dystalnych kanalików powstających nefronów. Protokół ten wypełnia lukę w badaniach nad mesonephros. Jest to kluczowy model pozwalający zrozumieć, w jaki sposób powstają nowe tkanki nerkowe i integruje się z istniejącymi nefronami, a także dostarcza informacji na temat terapii regeneracyjnych.
Wprowadzenie
Zarodek danio pręgowanego jest ważnym modelem do badania rozwoju tkanek ze względu na jego mały rozmiar, przezroczystość, dostępne narzędzia i możliwość przetrwania bez karmienia przez okres do pięciu dni1,2. Znacząco przyczynił się do zrozumienia rozwoju nerek i ochrony między danio pręgowanym a ssakami3,4,5. Nerki odgrywają istotną rolę w utrzymaniu homeostazy płynów, filtrowaniu krwi i wydalaniu odpadów6. Nefron, jednostka funkcjonalna nerki, składa się z filtra krwi połączonego z długim kan....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wykorzystanie larw danio pręgowanego i osobników młodocianych jest zatwierdzone przez IUP IACUC (protokół #02-1920, #08-1920). Szczegółowe informacje na temat zawartości rozwiązania znajdują się w Tabeli materiałów.
1. Hodowla larw
UWAGA: Potrzeba do 21 dni lub więcej, aby doprowadzić larwy i młode osobniki do etapu zainteresowania.
- Przygotuj dorosłe ryby, aby kojarzyły się, dodając 1 samca i 1 samicę do zbiornika godowego późnym popołudniem po ostatnim posiłku.
UWAGA: Nie wszystkie pary ryb będą się kojarzyć. Zacznij od ustawienia 20 par, aby określić częstotliwość krycia i od....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wykorzystując linię transgeniczną Tg(lhx1a-EGFP) wykazano, że niniejszy protokół hybrydyzacji in situ jest skuteczny w znakowaniu komórek progenitorowych nerek oraz różnych struktur nefronu podczas rozwoju mezonephros. Zgodnie z oczekiwaniami, w tej linii transgenicznej znakowany jest również ośrodkowy układ nerwowy (niepokażano). Pierwszy nefron mezonephros tworzy się przy długości około 5,2 mm, grzbietowo względem pronephros (Rycina 2A), a cewka dystalna tego nefronu jest.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisana tutaj metoda hybrydyzacji in situ ma na celu badanie rozwoju mesonephros. Można go jednak zastosować do badania rozwoju innych tkanek i narządów podczas metamorfozy, takich jak jelita, układ nerwowy, łuski i pigmentacja14. Można generować sondy dla genów endogennych lub markerów fluorescencyjnych w liniach transgenicznych.
Bardzo ważne jest, aby larwy pozostały nienaruszone, aby można było obserwować narządy i tkanki w ich naturalnym kontekście. Aby zac.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.
Podziękowania
Finansowanie zostało zapewnione przez Pennsylvania Academy of Science, Commonwealth of Pennsylvania Biologists oraz Indiana University of Pennsylvania (School of Graduate Studies and Research, Department of Biology oraz Cynthia Sushak Undergraduate Biology Fund for Excellence). Linia transgeniczna Tg(lhx1a-EGFP) została dostarczona przez dr Neila Hukriede (University of Pittsburgh).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Przeciwciało antyfluoresceinowe | Roche/Sigma-Aldrich | 11426338910 | |
| Roztwór | 0,8% KOH, 0,9% H2O2 w PBST | ||
| Odczynnik blokujący | Roche/Sigma-Aldrich | 11096176001 | Stosować do roztworu blokującego, przygotować zgodnie z instrukcją producenta |
| Sitko do komórek | Fisher Scientific | 22-363-549 | 100 μ m |
| E3 medium | 5 mM NaCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4, 0,17 mM KCl, 0,0001% błękit metylenowy | ||
| Manipulator rzęs | Fisher Scientific | NC1083208 | Służy do manipulowania larwami |
| Roztwór | 4% paraformaldehydu, 1% DMSO w PBS; ciepło w 65° C wstrząsając, aż proszek się rozpuści, a następnie dodać DMSO po ostygnięciu | ||
| Synteza sondy fluoresceinowej | Che/Sigma-Aldrich | 11685619910 | |
| Fiolka szklana | Fisher Scientific | 03-338B | |
| Kapsułka Hatchfry | Argent | ||
| Hyb- roztwór | 50% formamidu, 5X SSC, 0,1% roztwór | ||
| Tween-20 Hyb+ | HYB-, 5 mg/ml torula RNA, 50 ug/ml heparyny | ||
| MAB (10X) | 1 M kwas maleinowy, 1,5 M NaCl, pH 7,5 | ||
| MABT | 1X MAB, 0,1% Tween-20 | ||
| Kwas maleinowy | Sigma-Aldrich | M0375 | |
| Paraformaldehyd | Sigma Aldrich | 158127 | |
| PBS (10X) | 8% NaCl, 0,2% KCl, 1,44% Na2HPO4, 0,24% KH2PO4 | ||
| PBST | 1X PBS, 0,1% Tween-20 | ||
| PBST2 | 1X PBS, 0,2% Tween-20 | ||
| Żywność | Wymieszaj po 2 g spiruliny i enkapsulonu hatchfry w 50 ml wody z systemu rybnego i dobrze wstrząśnij | ||
| Proteinaza K | Sigma-Aldrich | P5568 | Służy do przepuszczalności larw |
| Roztwór | proteinazy K20 μ g / mL, 1% DMSO końcowe stężenie w PBST | ||
| Spirulina mikrodrobny proszek | Argent | ||
| SSC (20X) | 3 M NaCl, 0,3 M octan sodu bezwodny, pH 7, autoklaw | ||
| SSCT (0,2X) | Rozcieńczony od 20X SSC, 0,1% Tween-20 | ||
| SSCT (2X) | Rozcieńczony od 20X SSC, 0,1% Tween-20 | ||
| Bufor | barwiący100 mM Tris pH 9,5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0,1% Tween-20 | ||
| barwiący | 200 μ g/ml chlorek jodonitrotetrazolu, 200 μ g/ml soli disodowej fosforanu 5-bromo-4-chloro-3-indolilofosforanu, w buforze barwiącym | ||
| Roztwór | 1 mM EDTA, pH 5,5, w PBST | ||
| Torula (drożdże) RNA | Sigma-Aldrich | R6625 | |
| Trikaina | Sigma Aldrich | E10521 | 2%, pH 7 |
| Bufor | 50% formamidu, 2X SSC, 0,1% Tween-20 |
Bibliografia
- Kinth, P., Mahesh, G., Panwar, Y. Mapping of zebrafish research: a global outlook. Zebrafish. 10 (4), 510-517 (2013).
- Grunwald, D. J., Eisen, J. S. Headwaters of the zebrafish - emergence of a new model vertebrate. Nature Reviews. Genetics. 3 (9), 717-724 (2002).<....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
