Artykuł metodologiczny

W pełni optyczne badanie mechanobiologiczne białka związanego z Tak w ludzkim raku i normalnych komórkach przy użyciu wielofunkcyjnego systemu

5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62934

⸱

20 grudnia 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Electrical and Computer Engineering, Herbert Wertheim College of Engineering, University of Florida, 2Department of Mechanical and Aerospace Engineering, Herbert Wertheim College of Engineering, University of Florida, 3Department of Electrical and Computer Engineering, University of California, 4Department of Radiation Oncology, College of Medicine, University of Florida, 5UF Health Cancer Center, University of Florida, 6Department of Physics, College of Liberal Arts and Sciences, University of Florida, 7Department of Anatomy and Cell Biology, College of Medicine, University of Florida

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł przedstawia szczegółowy protokół krokowy, jak wykorzystać zintegrowany wielofunkcyjny i programowalny przez użytkownika system, który umożliwia automatyczne obrazowanie wielokanałowe i analizę mechanobiologiczną w celu wyjaśnienia mechano-wrażliwości białka związanego z Tak (YAP).

Streszczenie

Długoterminowe wielofunkcyjne obrazowanie i analiza żywych komórek wymagają usprawnionej, funkcjonalnej koordynacji różnych platform sprzętowych i programowych. Jednak ręczne sterowanie różnymi urządzeniami produkowanymi przez różnych producentów jest pracochłonne i czasochłonne, co potencjalnie zmniejsza dokładność, odtwarzalność i jakość pozyskiwanych danych. Dlatego kompleksowy i programowalny przez użytkownika system, który umożliwia automatyczną, wielofunkcyjną i długoterminową akwizycję obrazu oraz jest kompatybilny z większością platform mikroskopii fluorescencyjnej, może przynieść korzyści społeczności naukowej. W niniejszym artykule przedstawiono kompletne protokoły operacyjne wykorzystania nowatorskiego zintegrowanego systemu oprogramowania, który składa się z (1) domowego oprogramowania o nazwie "Automatic Multi-functional Integration Program (AMFIP)", który umożliwia automatyczną wielokanałową akwizycję obrazowania, oraz (2) pakietu ilościowej analizy obrazowania i pakietów obliczeniowych trakcji komórek.

Ten zintegrowany system jest stosowany do ujawnienia wcześniej nieznanego związku między przestrzenno-czasowym rozkładem mechano-wrażliwego białka związanego z Tak (YAP) a mechaniką komórki, w tym rozprzestrzenianiem się komórek i trakcją, w normalnych komórkach ludzkich (B2B) i komórkach raka płuc (PC9) zaprojektowanych przez CRISPR/Cas9. Wykorzystując zdolność tego systemu do wielokanałowej kontroli i odczytu, wynik pokazuje: (1) normalne komórki B2B i komórki rakowe PC9 wykazują wyraźny związek między ekspresją, trakcją i dynamiką komórki YAP podczas procesów rozprzestrzeniania się komórek i migracji; oraz (2) komórki rakowe PC9 wywierają zauważalne siły okołojądrowe na substraty. Podsumowując, w artykule przedstawiono szczegółowy, krokowy protokół wykorzystania zintegrowanego systemu programowalnego przez użytkownika, który umożliwia automatyczne wielofunkcyjne obrazowanie i analizę w celu wyjaśnienia wrażliwości mechanicznej YAP. Narzędzia te otwierają możliwość szczegółowej eksploracji wieloaspektowej dynamiki sygnalizacji w kontekście fizjologii i patologii komórki.

Wprowadzenie

Ogólnym celem tej metody jest umożliwienie w pełni optycznego, wielofunkcyjnego obrazowania i analizy żywych komórek. Kompleksowy program do obrazowania, który umożliwia automatyczną koordynację wielofunkcyjnych urządzeń optoelektronicznych, zmniejszy pracochłonne i podatne na błędy operacje ręczne i jest niezbędny dla badaczy do prowadzenia długoterminowego obrazowania żywych komórek1,2,3,4. Jednak większość istniejących programów publicznych w społeczności badań biomedycznych albo dotyczy tylko ograniczonych urządzeń optoelektronicznych, albo wymaga dodatkowego sprzętu do koordynacji różnych urządzeń5,6,7,8,9. Niedawno opracowano program oparty na oprogramowaniu typu open source o nazwie "Automatic Multi-functional Integration Program (AMFIP)", umożliwiający obrazowanie wielokanałowe i poklatkowe. Oparty na języku Java i interfejsie programowania aplikacji (API) μManager11,12, AMFIP został opracowany jako wtyczka w μManager, która wykonuje niestandardowe skrypty Java w celu realizacji opartej na oprogramowaniu komunikacji wielu platform sprzętu i oprogramowania optoelektronicznego, w tym między innymi tych firmy Nikon. Ustanowienie AMFIP otwiera możliwość programowalnego i wielofunkcyjnego badania zachowań komórek. W artykule opracowano zintegrowany system eksperymentalny i obliczeniowy, który łączy AMFIP z cyfrową analizą obrazowania i mikroskopią sił trakcyjnych komórek. System umożliwia wyjaśnienie odrębnej mechanobiologii YAP w ludzkich normalnych liniach komórkowych B2B (Rysunek 1) i linii komórkowych raka płuc PC9 (Rysunek 2) za pomocą CRISPR/Cas9. System zapewnia społeczności naukowej kompleksowe rozwiązanie, które pozwala uniknąć konieczności zakupu dodatkowych urządzeń kontrolnych, które mogą nie być dostępne i/lub kompatybilne z każdym systemem obrazowania.

Protokoły przedstawione w tym artykule wprowadzają, jak (1) zastosować AMFIP do przeprowadzenia automatycznego długoterminowego obrazowania dla obu linii komórkowych zaprojektowanych przez CRISPR/Cas9, które wyrażają YAP oznaczone mNEonGreen2; oraz (2) połączyć Fiji ImageJ, MATLAB i Origin do ilościowej analizy stosunku jądra/cytoplazmy YAP (N/C) na podstawie ich intensywności fluorescencji (Rysunek 3 i Rysunek 4), komórkowe pole przemieszczenia (Rysunek 1C i Rysunek 2C) oraz komórkowe pole trakcyjne (Rysunek 1D i Rysunek 2D). Wyniki sugerują, że (1) w ciągu pierwszych 10 godzin rozprzestrzeniania się komórek na podłożach, które mają fizjologicznie istotną sztywność mechaniczną13,14,15,16,17,18, stosunek YAP N/C pojedynczych komórek B2B wykazuje bardziej zauważalną zmienność i fluktuację zależną od czasu w porównaniu z pojedynczym PC9 komórki (Rysunek 5 i Rysunek 6); oraz (2) komórki rakowe PC9 generują zauważalną trakcję w swoich regionach okołojądrowych (Rysunek 7). Zintegrowany system i metodologie opisane w tym protokole wykraczają poza specyficzne typy komórek i molekuł optogenetycznych. Naukowcy mogą zastosować te protokoły, aby dostosować swoje specyficzne eksperymenty z żywymi komórkami i wyjaśnić wieloaspektową dynamikę sygnalizacji w kontekście fizjologii i patologii komórki.

Protokół

1. Generowanie stabilnych linii komórkowych raka płuca człowieka (PC9) oraz nabłonka oskrzeli człowieka (Beas2B), edytowanych za pomocą CRISPR/Cas9, które endogennie ekspresują białko YAP znakowane mNeonGreen21-10/11

  1. Przeprowadź reakcję łańcuchową polimerazy (PCR), aby namnożyć sekwencję DNA kodującą 11th nić białka fluorescencyjnego mNeonGreen2 przy użyciu polimerazy DNA o wysokiej wierności (patrz na Tabela materiałów).
  2. Wprowadź amplifikowaną sekwencję DNA do locus genomowego YAP w liniach komórkowych PC9 i B2B, wykorzystując system edycji genów CRISPR-Cas9.
    UWAGA: Ta sekwencja DNA jest komplementarna do nici 1-10 mNeonGreen2 w celu emisji fluorescencji. Mapa sekwencji genomicznej YAP-mNeonGreen21-10/11 przedstawiono w Rycina uzupełniająca S1Mapa zawiera oznaczone sekwencje genomowe, donora oraz mNeonGreen2.
  3. Zweryfikuj ekspresję mNeonGreen2 zmodyfikowanej metodą CRISPR/Cas9 za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego (patrz na Tabela materiałów). Ponieważ mNeonGreen2 jest przyłączony do białka YAP, co sprawia, że komórki wykazują fluorescencję zawsze, gdy ekspresują YAP w kontekście jego natywnej sieci regulacyjnej genów, należy sprawdzić obecność intensywności fluorescencji w komórkach zmodyfikowanych metodą CRISPR/Cas9 i porównać ją z intensywnością w komórkach rodzicielskich (kontrolnych).
    UWAGA: Aby przeprowadzić tę procedurę, należy użyć (1) lasera o długości fali 488 nm (47,5 mW/mm2) do wzbudzenia, (2) obiektyw 40x (apertura numeryczna (NA) = 0,95) oraz filtr pasmowy emisji (ET525/50 nm) do pomiaru fluorescencji oraz (3) oprogramowanie ImageJ do pomiaru, kwantyfikacji i porównania intensywności fluorescencji.
  4. Potwierdzenie prawidłowej integracji mNeonGreen211 poprzez wyizolowanie genomowego DNA z linii komórkowych edytowanych metodą CRISPR/Cas9; przeprowadzenie reakcji PCR z użyciem starterów flankujących insert genomowy oraz sekwencjonowanie w celu potwierdzenia insercji w prawidłowych loci genomowych19,20.
  5. Wycisz mNeonGreen211 przy użyciu systemu edycji genów CRISPR/Cas9, a następnie należy sprawdzić redukcję intensywności fluorescencji w komórkach, wykorzystując te same systemy mikroskopowe i parametry obrazowania, które opisano w kroku 1.3.
    UWAGA: Ten krok potwierdza prawidłową integrację mNeonGreen211 poprzez porównanie intensywności fluorescencji. Jako kontrolę wykorzystano komórki modyfikowane za pomocą systemu CRISPR/Cas9 bez wyciszenia genu oraz komórki rodzielskie.
  6. Należy zebrać komórki z oznakowanym białkiem docelowym za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS).
    1. Aby przygotować komórki do sortowania metodą FACS, należy poddać je trypsynizacji, a następnie zawiesić w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS).
    2. Należy zebrać komórki o fluorescencji mNeonGreen2 powyżej poziomu tła linii komórkowych rodzicielskich w dwóch wzbogacających rundach sortowania FACS.
      UWAGA: Czas potrzebny na wygenerowanie opisanych tutaj linii komórkowych edytowanych za pomocą systemu CRISPR/Cas9 wynosi od 1 do 2 miesięcy. Wszystkie linie komórkowe są udostępniane publicznie na żądanie, aby inne laboratoria badawcze mogły zreplikować uzyskane wyniki.

2. Hodowla linii komórkowych PC9 i B2B

  1. Obie linie komórkowe należy hodować w inkubatorach do hodowli tkankowych z nawilżaniem, przy zawartości 5% CO2.2 w/na 37 °C.
  2. Kultura 106 komórki PC9 i Beas2B z endogennym znacznikiem w naczyniach 75 cm2 kolby zawierające 12 ml pożywki RPMI-1640 uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej i 100 µg/mL penicylina-streptomycyna. Przesiej obie linie komórkowe, gdy konfluencja komórek osiągnie ok. 80%.
  3. Obie linie komórkowe należy testować pod kątem obecności mykoplazm co 3 miesiące, używając zestawu do detekcji mykoplazm i ściśle przestrzegając wszystkich protokołów zalecanych przez producenta.
  4. Przechowywać linie komórkowe w temperaturze -80 °C zamrażarka.
  5. Należy użyć linii komórkowych, które są <20 pasaży od rozmrożenia dla wszystkich eksperymentów.

3. Konfiguracja środowiska sprzętowego i programowego

  1. Konfiguracja sprzętowa eksperymentu
    1. Podłącz sterownik konfokalny oraz mikroskop odwrócony do komputera (patrz Tabela Materiałów).
    2. Zainstaluj platformę oprogramowania (Tabela Materiałów).
    3. Włącz sterownik konfokalny oraz mikroskop odwrócony. Następnie uruchom program Elements.
    4. Otwórz panele sterowania konfokalu, laserem i mikroskopem odwróconym w programie Elements. Następnie sprawdź, czy trzy panele działają prawidłowo, testując ruch stolika zmotoryzowanego, przełączanie obiektywów mikroskopu oraz skanowanie przestrzenne linii laserowych.
  2. Konfiguracja programowa AMFIP
    1. Zainstaluj na komputerze IntelliJ, Java Development Kit 14.0, µManager wersję 2.0 gamma oraz Fiji ImageJ.
    2. Otwórz projekt AMFIP pobrany z GitHub (link: https://github.com/njheadshotz/AMFIP) w programie IntelliJ.
    3. Kliknij Settings | Compiler | Annotation Processors i zaznacz Enable annotation processing.
    4. Kliknij Project Structure | Artifacts i utwórz plik JAR. Ustaw katalog wyjściowy na mmplugins wewnątrz katalogu µManager .
    5. Kliknij Project Structure | Libraries i dodaj mmplugins oraz plugins z katalogu µManager .
    6. Kliknij add Configuration w menu rozwijanym Run i utwórz aplikację.
    7. W polu Main class wpisz ij.ImageJ.
    8. W polu VM option wpisz -Xmx3000m -Dforce.annotation.index=true.
    9. Ustaw katalog µManager jako Work directory.
    10. Kliknij Run , aby aktywować µManager z wtyczką AMFIP.
  3. Połącz µManager z mikroskopem odwróconym.
    1. Dodaj adaptacyjny sterownik mikroskopu odwróconego21 do katalogu µManager .
    2. Otwórz µManager. Kliknij Devices | Hardware Configuration Wizard i utwórz nową konfigurację.
    3. Dodaj sterownik Ti2 w sekcji Available Devices.
    4. Wybierz wszystkie urządzenia peryferyjne i zapisz nowy plik konfiguracji.
    5. Zrestartuj µManager i wybierz plik konfiguracji z kroku 3.2.4 w Micro-Manager Startup Configuration.

4. Przygotowanie żelu

  1. Potraktuj szklaną lamellę 3-aminopropyltrymethoxysilane przez 7 min w temperaturze pokojowej (24 °C).
  2. Użyj wody dejonizowanej (DI), aby opłukać szklaną lamellę, a następnie wysusz ją przez 20 min w temperaturze 160 °C.
  3. Potraktuj szklaną lamellę 0,5% glutaraldehydem przez 30 min i opłucz wodą DI.
  4. Zmieszaj roztwór akrylamidu, roztwór N,N′-metylenobisakrylamidu (bis) oraz koraliki fluorescencyjne zawieszone w 10 mM soli buforowanej HEPES. Jako inicjatory polimeryzacji zastosuj 10% (w/v) roztwór nadsiarczanu amonu oraz N,N,N′,N′-tetrametyloetylenodiaminę (TEMED). Zmień procentową zawartość każdego składnika, aby uzyskać pożądaną sztywność mechaniczną hydrożeli poliakrylamidowych (PAA), zgodnie z ustalonymi protokołami opisanymi wcześniej13,14.
    UWAGA: W niniejszym protokole dla żelu 2 kPa: akrylamid = 12,5% i bis-akrylamid = 6,5%; dla żelu 5 kPa: akrylamid = 12,5% i bis-akrylamid = 21,5%; oraz dla żelu 40 kPa: akrylamid = 12,5% i bis-akrylamid = 31,5%. Wszystkie podane wartości % oznaczają procent objętościowy.
  5. Po 35 min oddziel szklaną lamellę od utwardzonego hydrożelu PAA i przemyj hydrożel dwukrotnie 50 mM solą buforowaną HEPES (po 5 min za każdym razem).
  6. Potraktuj powierzchnię hydrożelu roztworem hydrazynianu przez 6 h.
  7. Opłucz hydrożel kwasem octowym przez 30 min. Usuń kwas octowy i płucz w PBS przez 30 min.
  8. Utlenij roztwór fibronektyny (50 µg/mL w PBS) za pomocą nadjodynianu sodu przez 30 min.
  9. Pokryj powierzchnię hydrożelu utlenionym roztworem fibronektyny i odczekaj 35 min.
  10. Dodaj PBS, aby zanurzyć hydrożel, i przechowuj w temperaturze 4 °C. Przykryj wszystkie płytki Petri zawierające hydrożele folią aluminiową, aby zapobiec ich ekspozycji na światło.

5. Hodowla komórkowa

UWAGA: Hodowlę komórkową należy prowadzić z zachowaniem technik aseptycznych.

  1. Przytwierdź szkiełka podstawowe z hydrożelami PAA do szklanej podstawy szalki Petriego o średnicy 35 mm, aby zapobiec fizycznemu przesunięciu żeli podczas wysiewania komórek i obrazowania.
    1. Za pomocą wysterylizowanej czystej pęsety wyjmij szkiełko podstawowe (z hydrożelem PAA na górnej powierzchni) z szalki Petriego zawierającej przygotowane żele.
    2. Użyj suchej chusteczki, aby usunąć krople wody z dolnej powierzchni szkiełka podstawowego.
    3. Użyj wysterylizowanej pęsety, aby przytrzymać szkiełko podstawowe.
    4. Nanieś małe krople (1-5 µL) kleju cyjanoakrylowego w dwóch przeciwległych narożnikach dolnej powierzchni.
    5. Użyj wysterylizowanych chusteczek, aby usunąć nadmiar kleju.
    6. Użyj wysterylizowanej pęsety, aby umieścić szkiełko podstawowe z powrotem w szalce Petriego z szklanym dnem. Lekko dociśnij narożniki szkiełka, aby upewnić się, że krople kleju w pełni przylegają do powierzchni szalki Petriego.
    7. Nałóż pokrywkę z powrotem na szalkę Petriego, aby zminimalizować odparowanie PBS z hydrożeli PAA. Odczekaj 3 min, aby klej mógł stężeć i wyschnąć w szalce Petriego.
    8. Napełnij szalkę Petriego 4 mL PBS.
    9. Powtórz kroki 5.1.1-5.1.8 dla pozostałych próbek hydrożeli PAA w szalkach Petriego przeznaczonych do obrazowania.
    10. Użyj 75% etanolu do wysterylizowania zewnętrznej powierzchni wszystkich szalek Petriego i przenieś je do komory biologicznej do hodowli tkanek. Włącz światło ultrafioletowe na 5 min i wysterylizuj próbki.
  2. Wysiej komórki na górną powierzchnię żelu.
    1. Wyłącz światło ultrafioletowe. Wyjmij kolbę (zawierającą komórki B2B/PC9) z inkubatora 37 °C do komory biologicznej. Użyj pipety podłączonej do pompy próżniowej, aby odessać całą pożywkę hodowlaną i dodaj 5 mL PBS, aby wypłukać kolbę.
    2. Dodaj 2 mL 0,05% trypsyny, aby odlepić komórki od dna kolby.
    3. Umieść kolbę w inkubatorze. Odczekaj 5 min.
    4. Przenieś kolbę do komory biologicznej. Dodaj do kolby 8 mL świeżej pożywki hodowlanej i pipetuj kilka razy w górę i w dół, aby jednorodnie zawiesić komórki.
    5. Przenieś całe 10 mL zawiesiny komórkowej do probówki 15 mL i wiruj przy 300 × g przez 5 min.
    6. Sprawdź pellet komórkowy na dnie probówki. Powoli przechyl probówkę poziomo i użyj pipety aspiracyjnej, aby usunąć z probówki całą pożywkę hodowlaną, nie dotykając pelletu komórkowego. Następnie dodaj 8 mL świeżej pożywki hodowlanej i pipetuj kilka razy w górę i w dół, aż wszystkie komórki zostaną jednorodnie zmieszane z pożywką.
    7. Nanieś 100 µL zawiesiny komórkowej (150 komórek/µL) na powierzchnię żelu i odczekaj 5 min. Następnie powoli dodaj 4 mL świeżej pożywki hodowlanej do szalek Petriego; unikaj dodawania świeżej pożywki bezpośrednio na żel.
    8. Umieść szalkę Petriego w inkubatorze 37 °C. Odczekaj, aż komórki przywrą do powierzchni żelu (B2B: 0,5-1 h; PC9: 4-5 h).

6. Obrazowanie komórek

UWAGA: AMFIP umożliwia automatyczne, wielokanałowe i długoterminowe obrazowanie poprzez koordynację z różnymi systemami sprzętowymi i programowymi: (1) AMFIP steruje programem µManager, aby automatycznie przesuwać zmotoryzowany stolik mikroskopu Ti2-E do wielu pól widzenia (FOVs) i pozyskiwać obrazy w jasnym polu za pomocą kamery monochromatycznej (Tabela materiałów); oraz (2) AMFIP aktywuje wiele plików makro w programie Elements za pomocą niestandardowego skryptu Java w celu realizacji automatycznych operacji obrazowania konfokalnego w stosach z (z-stack) oraz przełączania różnych kanałów laserowych (405 nm i 488 nm).

  1. Przygotuj środowisko do obrazowania długoterminowego.
    1. Umieść komorę inkubacyjną na zmotoryzowanym stoliku mikroskopu odwróconego. Ustaw poziom CO22 przepływ do 160 mL/min i dostosuj temperaturę komory (góra: 44 °C; kąpiel: 42 °C; etap: 40 °C). Następnie do kąpieli w komorze należy dodać 40 ml wody oczyszczonej.
    2. Wyjmij z inkubatora szalkę Petriego z dna szklanym zawierającą komórki i umieść ją w komorze środowiskowej.
    3. Włącz sterownik konfokalny oraz mikroskop odwrócony. Przełącz ścieżkę światła w prawo i obserwuj przyleganie komórek za pomocą µManaJeśli do żelu przywarła wystarczająca liczba komórek, przenieś szalkę Petriego z powrotem do inkubatora. Jeśli do żelu nie przywarło wystarczająco dużo komórek, kontynuuj inkubację komórek przez kolejne 30 min w przypadku komórek B2B i 60 min w przypadku komórek PC9.
    4. Odetnij dwa małe kawałki taśmy klejącej i naklej je na komorę wokół okrągłego otworu. Następnie nałóż niewielką ilość kleju na taśmę (wyłącznie na obszar, który zostanie zakryty przez szalkę Petriego).
    5. Wyjmij szalkę Petriego z inkubatora. Następnie powoli umieść szalkę w komorze, pozwalając, aby dno szalki zetknęło się z klejem.
    6. Docisnąć pokrywkę szalki Petriego przez 1 min, aby klej w pełni przylgnął do szalki i zastygł. Następnie delikatnie przesunąć szalkę Petriego w poziomie, aby upewnić się, że jest ona nieruchoma w komorze.
    7. Zamknij pokrywę komory.
  2. Ustaw parametry akwizycji obrazu dla obrazowania w polu jasnym.
    1. Otwórz IntelliJ i ustawić parametr T1 (np. 120 s) w linii 93 pliku Elementy_skryptu.javaUpewnij się, że wartość ta jest większa niż czas wykonania makra w Pierwiastki stosowane do obrazowania konfokalnego jednego pola widzenia (FOV). Kliknij w Uruchom przycisk uruchamiający Projekt AMFIP w programie IntelliJ.
    2. Kliknij Na żywo i Akwizycja wielowymiarowa przycisk w głównym interfejsie µManagerNastępnie należy przełączyć tor światła w mikroskopie odwróconym w prawo w celu obrazowania w polu jasnym, przełączyć obiektyw na 10x i włączyć światło diody emitującej światło (LED) (źródło światła do obrazowania w polu jasnym; natężenie: 5%).
      1. Kliknij na ścieżkę świetlną, obiektyw mikroskopu oraz przycisk lampy LED w Elementy Ti2 Użyj panelu lub naciśnij ręcznie odpowiednie przyciski na mikroskopie.
    3. Wyreguluj joystick XY oraz pokrętło płaszczyzny Z, aby znaleźć odpowiednią pozycję i płaszczyznę ostrości żelu na szalce Petriego. Użyj obiektywu 10x, aby zlokalizować odpowiednie pola widzenia (FOV) dla wielu pojedynczych komórek przytwierdzonych do żelu.
    4. Sprawdź Wiele pozycji (XY) pudełko na Wielowymiarowa akwizycja okno. Kliknij w Edytuj listę pozycji... przycisk i zaobserwować Lista pozycji stolika okno, które się pojawi. Następnie zmienić obiektyw na 40x, zwiększyć natężenie światła LED do 15%, ponownie ustawić zmotoryzowany stół XY w celu zlokalizowania pól widzenia (FOV) i zapisać współrzędne, klikając w Znakuj przycisk na Lista pozycji stolika okno
    5. Zarejestruj 67 wybranych pól widzenia (FOV). Kliknij w Zapisz jako... przycisk na Lista pozycji stolika okno do zapisywania współrzędnych. Wprowadzenie T1 (parametr, np. 120 s, zdefiniowany w kroku 6.2.1) do odstęp czasowy pozyskiwania obrazów do T1 w Punkty czasowe sekcja w Akwizycja wielowymiarowa okno
  3. Ustaw akwizycję obrazów dla 2D-YAP oraz obrazów kulek.
    1. Otwórz Pierwiastkiprzełączyć ścieżkę światła w prawo w celu obrazowania konfokalnego i wyłączyć oświetlenie LED. Następnie kliknąć Zdejmij blokadę przycisk i włącz kanał laserowy FITC (do obrazowania YAP) poprzez sprawdzenie FITC pudełko
    2. Dostosuj prędkość skanowania do 1 klatki na 2 s, klikając w 1/2 przyciskiem i obróć pokrętło płaszczyzny Z, aby szybko zlokalizować pozycję Z przytwierdzonych komórek. Zapisz dolną i górną granicę stosu Z (Z-stack).
    3. Kliknij w Makro na górnej wstążce wybierz Edytor makr pod Makro menu rozwijane, a następnie wprowadź wartości z kroku 6.3.2 do pliku makra.
    4. Włącz kanał lasera dla 4′,6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) (do obrazowania kulek), zaznaczając DAPI pole w celu znalezienia i zarejestrowania ogniskowej pozycji Z kulek. Przejdź do Edytor makr następnie wprowadź zapisane wartości do pliku makra.
  4. Skonfiguruj zadanie przesuwania stolika zmotoryzowanego za pomocą AMFIP.
    1. Przejdź do µManager i kliknij w Wtyczki | Automatyzacja aby otworzyć graficzny interfejs użytkownika (GUI) programu AMFIP. Kliknij w Dodaj punkt lub Usuń punkt przyciski służące do pobrania dokładnie wybranej liczby pól widzenia (FOV). Wprowadź zapisane współrzędne pól widzenia do Panel współrzędnych.
    2. Określ całkowity czas trwania eksperymentu w Całkowity czas eksperymentu pole tekstowe
    3. Kliknij w Dodatkowa konfiguracja czasu przycisk i zdefiniuj przedział czasowy T2 (np. 30 min) na przemieszczenie stolika motorowego do każdego pola widzenia (FOV).
    4. Zmaksymalizuj rozmiar okna Pierwiastki i przesuń interfejs graficzny (GUI) programu AMFIP na prawą stronę ekranu, aby zapobiec zakłócaniu przez GUI automatycznych operacji kursora.
    5. Kliknij w Wprowadź przycisk. Po zakończeniu działania pierwszej makra kliknij Pobierz! przycisk w Akwizycja wielowymiarowa okno
  5. Zutylizuj komórki po pozyskaniu obrazów.
    1. Po zakończeniu obrazowania długoterminowego zatrzymaj zadanie AMFIP, klikając w Pauza przycisk w wtyczka do automatyzacji okno i Zatrzymaj przycisk w Akwizycja wielowymiarowa okno
    2. Otwórz Pierwiastki i ustaw obrazowanie w stosie Z (Z-stack), klikając w Góra i Dół przyciski w Pozyskiwanie danych ND okno (ustaw zakres Z tak, aby był większy niż zakres Z kulek). Przełącz ścieżkę światła na prawą stronę i włącz podświetlenie LED (intensywność: 15%).
    3. Powoli i ostrożnie zdejmij pokrywy komory oraz szalki Petriego. W tym czasie monitoruj obraz w jasnym polu pod kątem ewentualnego dryfu pola widzenia (FOV).
    4. Używając plastikowej pipety, należy pobrać 0,5 ml roztworu dodecylosiarczanu sodu (SDS), a następnie ostrożnie trzymając pipetę nieco nad pożywką w szalce Petriego, dodać 1–2 krople roztworu SDS do pożywki.
    5. Po rozpuszczeniu komórek widocznych w polu jasnego pola, należy przekierować tor światła w lewo, wyłączyć światło LED i kliknąć w Zdejmij blokadę przycisk
    6. Przeprowadź obrazowanie Z-stack. Zapisz stos obrazów i nazwij go jako Referencja_N (N to numer kolejny każdego pola widzenia [FOV]).
    7. Kliknij w Wiele pozycji (XY) przycisk na Akwizycja wielowymiarowa okno. Następnie wybierz następne pole widzenia (FOV) i kliknij Przejdź do przycisk służący do przesunięcia zmotoryzowanego stolika do drugiego pola widzenia (FOV).
    8. Powtórz krok 6.5.7 dla każdego pola widzenia (FOV).

7. Pomiar stosunku YAP N/C

  1. Przeprowadź analizę obrazu w celu pomiaru stosunku YAP N/C, korzystając z oprogramowania Fiji ImageJ (Rycina 4).
    1. Otwórz program Fiji ImageJ. Zaimportuj stos obrazów w polu jasnym dla wszystkich FOV pozyskanych za pomocą µManager.
    2. Otwórz menu rozwijane Image i wybierz Stacks | Tools | Slice Keeper. Następnie wyeksportuj stos obrazów w polu jasnym dla każdego FOV.
    3. Zaimportuj obraz fluorescencyjny z kanału FITC i nałóż go na obraz w polu jasnym dla tego samego FOV. Aby to zrobić, wybierz obraz fluorescencyjny i zaznacz Overlay | Add Image... (Image to add: obraz w polu jasnym; położenie X i Y zależy od rozmiaru obrazu w polu jasnym pozyskanego różnymi kamerami; Opacity: 60-70).
    4. Otwórz menu rozwijane Analyze i wybierz Set Measurements…. Zaznacz Area, Integrated density oraz Mean gray value.
    5. Kliknij przycisk Freehand selections w głównym interfejsie ImageJ.
    6. Obrysuj ciało komórki i pożądane jądro. Następnie kliknij Analyze | Measure lub naciśnij klawisz M na klawiaturze.
    7. Przeanalizuj pojawiające się okno Results. Należy pamiętać, że wartości w kolumnie Area reprezentują powierzchnię wybranego obszaru (µm2), a wartości w kolumnie IntDen reprezentują intensywność fluorescencji wybranego obszaru.
    8. Oblicz stosunek YAP N/C, korzystając z następujących wzorów (1), (2) i (3):
      Równanie gęstości jądrowej \(D_{nuc} = \frac{I_{nuc}}{A_{nuc}}\) – wzór do analizy naukowej. (1)
      Analiza dyfuzji komórkowej; wzór Dcyto = (Icel - Inuc) / (Acel - Anuc); schemat (2)
      Równanie stosunku dyfuzji jądrowej do cytoplazmatycznej, R = D_nuc / D_cyto, wzór naukowy. (3)
      Gdzie Inuc i Icel reprezentują względną intensywność jądra i ciała komórki, a Anuc i Acel reprezentują powierzchnię jądra i ciała komórki. R to stosunek YAP N/C.
    9. Zapisz obrysy do przyszłych obliczeń siły trakcyjnej dipola oraz przemieszczenia okołokomórkowego i okołojądrowego. Aby to zrobić, kliknij Analyze | Tools | Save XY Coordinates...

8. Pomiar pola trakcyjnego

  1. Zastosuj mikroskopię sił trakcyjnych (traction force microscopy) za pomocą wtyczek Fiji ImageJ22,23.
    1. Otwórz program Fiji ImageJ.
    2. Zaimportuj stos obrazów kulek dla danego pola widzenia (FOV).
    3. Wybierz przekrój, który wykazuje najwyraźniejszy rozkład kulek, i wyodrębnij go, klikając Images | Stacks | Tools | Slice Keeper.
    4. Zaimportuj stos obrazów referencyjnych dla tego samego pola widzenia.
    5. Wybierz przekrój o tej samej jasności i kontraście co przekrój z kroku 8.1.3. Następnie wyodrębnij go jako obraz referencyjny.
    6. Wybierz Images | Stacks | Tools | Concatenate, aby połączyć dwa przekroje z kroków 8.1.3 i 8.1.5 (wybierz obraz referencyjny jako pierwszy przekrój).
    7. Wybierz Plugins | Template Matching | Align slices in stack lub Plugins | Image Stabilizer, aby wyrównać oba przekroje.
    8. Wybierz Image | Stacks | Stack to Images. Następnie wybierz Image | Lookup Tables | Green, aby zmienić kolor pierwszego przekroju na zielony, oraz Image | Lookup Tables | Red, aby zmienić kolor drugiego przekroju na czerwony.
    9. Wybierz Image | Color | Merge Channels, aby połączyć oba obrazy.
    10. Nałóż uzyskany obraz na obraz w jasnym polu dla tego samego pola widzenia i wykorzystaj ten nałożony obraz do obserwacji przemieszczeń kulek.
    11. Wybierz Plugins | PIV | iterative PIV(Basic).... Ustaw rozmiar okna interogacyjnego na 128/256; 64/128; 32/64 (co najmniej cztery kulki na okno interogacyjne). Ustaw próg korelacji na 0,6.
    12. Kliknij OK. Po zakończeniu obliczeń zapisz plik tekstowy z surowymi danymi przemieszczeń kulek w zwykłym folderze utworzonym przez użytkownika.
    13. Wybierz Plugins | FTTC | FTTC i wybierz plik tekstowy z kroku 8.1.9.
    14. Wprowadź rozmiar piksela (µm), moduł Younga żelu (Pascal) oraz szerokość i wysokość wykresu na podstawie eksperymentu i obrazu kulek.
    15. Kliknij OK, aby automatycznie zapisać plik tekstowy zawierający surowe dane siły trakcyjnej w tym samym katalogu, co plik tekstowy z kroku 8.1.12.
  2. Użyj oprogramowania do tworzenia wykresów (Tabela Materiałów), aby narysować pole trakcyjne w tej samej skali dla wielu komórek (Ryc. 1B,C oraz Ryc. 2B,C).
    1. Wstaw plik tekstowy zawierający surowe dane trakcyjne do arkusza kalkulacyjnego.
    2. Utwórz nowy arkusz, wpisz współrzędne Y trakcji w pierwszym wierszu (ujrzyj od wartości wysokich do niskich) i współrzędne X w pierwszej kolumnie (ujrzyj od niskich do wysokich).
    3. Wpisz wartość trakcji dla każdej współrzędnej z surowych danych.
    4. Zapisz arkusz z kroku 8.2.2 jako plik *.csv.
    5. Otwórz program Origin.
    6. Kliknij File | Open i zaimportuj plik *.csv z kroku 8.2.4. Zaznacz wszystkie komórki i kliknij Plot | Contour| Contour - Color Fill.
    7. W oknie Plotting: plotvm wybierz „Y across the columns”, aby automatycznie przypisać wartości Y do pierwszego wiersza, a wartości X do pierwszej kolumny. Następnie nadaj tytuł i kliknij OK.
    8. W wyświetlonym oknie wykresu dwukrotnie kliknij mapę ciepła (heatmap).
    9. Kliknij Levels w oknie Colormap/Contours. Następnie zmień poziom skali na odpowiedni zakres (0–300 w tej analizie) i kliknij OK.
    10. Kliknij Lines, odznacz opcję Show on Major Levels Only i zaznacz Hide All. Następnie kliknij OK.
    11. Kliknij prawym przyciskiem myszy na wykresie i wybierz Export Graphs…. Zapisz obraz w określonej ścieżce.
  3. Użyj programu MATLAB do obliczenia dipolej trakcji komórkowej.
    1. Zapisz plik tekstowy z surowymi danymi trakcyjnymi (z kroku 8.1.12) oraz plik współrzędnych obszaru zainteresowania (ROI) granicy komórki (z kroku 7.1.9) w tym samym folderze, który zdefiniowano w kroku 8.1.12. Przenieś wszystkie pliki MATLAB znajdujące się w pakiecie AMFIP do tego folderu.
    2. Otwórz program MATLAB. Otwórz folder zdefiniowany w kroku 8.1.12 i otwórz plik funkcji obliczania trakcji dipolej absdipole.m, który został przeniesiony do tego folderu w kroku 8.3.1.
    3. Wczytaj dwa pliki tekstowe/csv z kroku 8.3.1 do przestrzeni roboczej MATLAB i przypisz macierze do dwóch zmiennych (np. traction i roi).
    4. Uruchom funkcję absdiple (traction,roi).
      UWAGA: Pierwsza kolumna wyniku to dipolej siła trakcyjna w nN (nanoniutony). Druga kolumna wyniku to kąt dipolej siły trakcyjnej względem osi poziomej.

Wyniki

Wyraźne różnice w dystrybucji i dynamice YAP w komórkach nowotworowych PC9 oraz prawidłowych komórkach B2B zmodyfikowanych za pomocą systemu CRISPR/Cas9 podczas rozprzestrzeniania się komórek
Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne rozkładu YAP w pojedynczych komórkach B2B i PC9 na żelach PAA o sztywności 2, 5 i 40 kPa oraz na szkiełku nakrywkowej przedstawiono w Rysunek 1A i Rysunek 2ALokalizacja jądrowa YAP w komórkach B2B zwiększała się wraz ze wzrostem sztywności podłoża (Rycina 1A), podczas gdy komórki PC9 wykazywały podobne stężenie YAP w jądrze i cytoplazmie na podłożach o różnej sztywności (Rysunek 2A). Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne rozkładu YAP w pojedynczych, rozprzestrzeniających się komórkach B2B i PC9 na podłożu z hydrożelu o sztywności 5 kPa (z 0th h do potęgi 10th (h po przywieraniu komórek do podłoży) przedstawiono w Rycina 1B i Rysunek 2Bodpowiednio. Komórka B2B wykazywała monotoniczny wzrost powierzchni rozprzestrzeniania się w czasie, któremu towarzyszył spadek stosunku YAP N/C (Rycina 1B), podczas gdy komórka PC9 utrzymywała stosunkowo niezmienną powierzchnię rozprzestrzenienia, orientację oraz stosunek YAP N/C przez cały 10-godzinny proces rozprzestrzeniania (Rysunek 2B). W ciągu 10 h trwania wczesnego rozprzestrzeniania się, reprezentatywna komórka B2B w sposób konstytutywny odkształcała powierzchnię podłoża i wywierała zmieniające się w czasie siły trakcyjne w obrębie całej powierzchni komórki (Rycina 1C i Rysunek 1D).

W przeciwieństwie do nich, reprezentatywna komórka PC9 wykazywała przemieszczenie i trakcję jedynie na dwóch końcach ciała komórki, a jej trakcja zmalała po 7,5 h (Rysunek 2C i Rysunek 2D). Więcej obrazów time-lapse oraz pomiarów trakcji komórek B2B i PC9 we wczesnej fazie rozprzestrzeniania znajduje się w Rysunku dodatkowym S2 i Rysunku dodatkowym S3). Zaobserwowano również inne tryby dynamiki komórek PC9 (Rysunek 6). Równolegle do tych różnych charakterystyk rozprzestrzeniania, komórki B2B i PC9 wykazały odmienną dystrybucję i dynamikę YAP (Rysunek 3). Na żelu o sztywności 5 kPa, YAP w komórkach B2B był skoncentrowany w jądrze w 0tej h, a w 10tej h uległ bardziej jednorodnemu rozkładowi w obrębie ciała komórki. Natomiast komórki PC9 wykazywały bardziej jednorodną dystrybucję YAP w jądrze i cytoplazmie przez cały 10-godzinny proces rozprzestrzeniania. Aby ilościowo przeanalizować aktywność i translokację YAP w komórkach B2B i PC9, obliczono stosunek YAP N/C, stosując algorytm opisany na Rysunku 4.

Aby dokładniej zbadać odmienną dynamikę YAP, porównano zmiany czasowe w stosunku YAP N/C, powierzchni komórki/jądra oraz trakcję wielu pojedynczych komórek B2B (n = 10) i komórek PC9 (n = 5) (Rycina 5). Stwierdzono, że średni stosunek YAP N/C w komórkach B2B spadł z 2,54 ± 0,22 do 1,79 ± 0,21 (n = 10; p = 0,0022**; Rycina 5A), podczas gdy średni stosunek YAP N/C w komórkach PC9 zmienił się z 1,92 ± 0,26 do 1,57 ± 0,07 (n = 5; p = 0,187 (nieistotne statystycznie (ns)); Rycina 5A). Średnia trakcja dipolowa komórek B2B zmieniła się z 256,17 ± 123,69 nN do 287,44 ± 99,79 nN (p = 0,7593 (ns); Rycina 5B). Średnia trakcja dipolowa komórek PC9 zmieniła się z 141,19 ± 33,62 nN do 168,52 ± 73,01 nN (p = 0,7137 (ns); Rycina 5B). Średnia powierzchnia rozprzestrzenienia komórek B2B wzrosła z 613,89 ± 102,43 µm2 do 942,51 ± 226,71 µm2 (p = 0,0512 (ns); Rycina 5C).

Średnia powierzchnia rozprzestrzenienia komórek PC9 zmieniła się z 495,78 ± 97,04 µm2 do 563,95 ± 89,92 µm2 (p = 0,5804 (ns); Rycina 5C). Średnia powierzchnia rozprzestrzenienia jądra komórek B2B wzrosła z 181,55 ± 36,18 µm2 do 239,38 ± 43,12 µm2 (p = 0,1217 (ns); Rycina 5D), a średnia powierzchnia rozprzestrzenienia jądra komórek PC9 zmieniła się z 133,31 ± 30,05 µm2 do 151,93 ± 22,49 µm2 (p = 0,5944 (ns); Rycina 5D). Wyniki te sugerują, że (1) komórki B2B wykazują konstytutywnie zależny od sztywności podłoża stosunek YAP N/C; (2) siła trakcyjna komórek B2B jest wyższa niż komórek PC9; oraz (3) w przeciwieństwie do komórek B2B, komórki PC9 wykazują ograniczony wzrost powierzchni komórki i zmiany w stosunku YAP N/C podczas 10 h procesu rozprzestrzeniania.

Korelacja rozkładu i dynamiki YAP ze stanami migracji komórek B2B
Porównano stosunek YAP N/C oraz trakcję dipolową wszystkich komórek B2B (n=10) i PC9 (n=5) w funkcji powierzchni rozprzestrzenienia komórki oraz powierzchni rozprzestrzenienia jądra. Stosunek YAP N/C oraz trakcja dipolowa komórek PC9 nie korelowały wyraźnie z ich małymi zakresami powierzchni rozprzestrzenienia komórki i jądra (Rycina 6). W przeciwieństwie do nich, stosunek YAP N/C i trakcja dipolowa komórek B2B wydawały się wykazywać dwa odrębne trendy (Rycina 6A i Rycina 6C), co sugeruje, że w tym eksperymencie mogą współistnieć dwie grupy komórek B2B. W pierwszej grupie stosunek YAP N/C i trakcja dipolowa wzrastają wraz z powiększaniem się powierzchni rozprzestrzenienia komórki i osiągają swoje maksima przy ~ 1000 µm2 (Rycina 6C i Rycina 6D, zaznaczone żółtą przerywaną linią). W drugiej grupie stosunek YAP N/C i trakcja dipolowa wzrastają wolniej wraz z powiększaniem się powierzchni rozprzestrzenienia komórki i utrzymują niemal stałe wartości przy dalszym wzroście powierzchni rozprzestrzenienia komórki (Rycina 6C,D, zaznaczone zieloną przerywaną linią).

Komórki nowotworowe PC9 generują siły trakcyjne w obszarach okołojądrowych
Pojedyncze, rozprzestrzeniające się komórki PC9 przemieszczają podłoże w obszarach okołojądrowych, zaczynając od 6tej godziny hodowli (Rysunek 7C). Aby zwizualizować przemieszczenie okołojądrowe spowodowane trakcją komórkową, nałożyliśmy na siebie obrazy fluorescencyjnych kulek wykonane przed (czerwony) i po (zielony) usunięciu komórek z podłoży (szczegóły znajdują się w sekcji protokołu). Kuleczki, które nie uległy przemieszczeniu, będą widoczne jako żółte na nałożonych obrazach, co wynika z sumowania kolorów czerwonego i zielonego. W przeciwieństwie do nich, kuleczki przemieszczone z pozycji spoczynkowych na skutek trakcji komórkowej wykażą rozdzielone kolory zielony i czerwony.

Warto zauważyć, że zarówno w komórkach PC9 (Rycyna 7C,D), jak i B2B (Rycyna 7E), przemieszczenie kulek zaobserwowano w cytoplazmie i w obrębie jądra, oprócz przemieszczeń na granicy komórki. Aby uwydatnić przemieszczenie okołojądrowe, wykorzystano równanie Boussinesqa z teorii liniowej sprężystości do przewidzenia teoretycznego dwuwymiarowego przemieszczenia generowanego przez hipotetyczną siłę dipolową na granicy komórki (czarna przerywana linia na Rycynie 7B)24. Porównując tę teoretyczną krzywą z rzeczywistym przemieszczeniem podłoża zmierzonym wzdłuż tej samej osi (biała przerywana linia na Rycynie 7D), stwierdzono, że rzeczywiste przemieszczenia w obrębie jądra były od 1,5 do 8 razy większe od wartości teoretycznej (Rycyna 7B), co wskazuje na obecność siły trakcyjnej w regionach okołojądrowych.

Analiza ekspresji YAP, schemat mechaniki komórki, przedstawiający przemieszczenie i trakcję na różnych podłożach.
Rycina 1: Zmiany w ekspresji/rozmieszczeniu YAP, pole przemieszczenia podłoża i pole trakcji prawidłowej komórki B2B na podłożach o różnej sztywności oraz podczas wczesnego rozprzestrzeniania się. (A) Ekspresja YAP w komórce B2B wysianej na żelach PAA o sztywności 2, 5 i 40 kPa oraz na szkiełku podstawowym po 60 h od początkowego przylegania komórki do podłoża. (B) Komórka B2B została wysiana na żelu PAA o sztywności 5 kPa i obrazowana przez 10 h po początkowym przyleganiu komórki do podłoża. Ekspresja YAP jest reprezentowana przez intensywność zielonej fluorescencji. Uwaga: Intensywność YAP wewnątrz jądra stopniowo maleje, ale pozostaje wyższa niż w cytoplazmie w czasie. Paski kolorów wskazują poziomy ekspresji YAP (zielony = wysoka ekspresja; czarny = niska ekspresja) w punktach (A) i (B). (C) Odkształcenie podłoża (nałożone na obraz w jasnym polu) w miejscu położenia komórki jest reprezentowane przez pole przemieszczenia w każdym punkcie czasowym. Kierunek i wielkość przemieszczenia są odpowiednio wskazane przez kierunek strzałki i kolor. Przemieszczenie staje się większe na końcach ciała komórki B2B wraz ze zwiększaniem się powierzchni rozprzestrzeniania się komórki. Pasek kolorów wskazuje wielkość przemieszczenia (karmazynowy = wysoka wartość; czarny = niska wartość). (D) Pole trakcji (nałożone na obraz w jasnym polu) obliczone z pola przemieszczenia. Trakcja koncentruje się na granicy komórek B2B. Białe i żółte przerywane obrysy wyznaczają odpowiednio granice komórki i jądra. Pasek kolorów wskazuje wielkość trakcji (karmazynowy = wysoka wartość; czarny = niska wartość). Paski skali = 20 µm. Skróty: YAP = Yes-associated protein; PAA = poliakrylamid. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza ekspresji YAP; obrazy immunofluorescencyjne; sekwencje czasowe, pola przemieszczenia i mapy sił trakcyjnych.
Rycina 2: Zmiany w ekspresji/rozmieszczeniu YAP, pole przemieszczenia podłoża oraz pole trakcji komórki nowotworowej PC9 na podłożach o różnej sztywności i podczas wczesnego rozprzestrzeniania się. (A) Ekspresja YAP w komórce PC9 wysianej na żelach PAA o sztywności 2, 5 i 40 kPa oraz na szklanej lamelce po 65 h od początkowego przyкрепienia komórki do podłoża. (B) Komórka PC9 została wysiana na żelu PAA 5 kPa i obrazowana przez 10 h po początkowym przyкрепieniu komórki do podłoża. Ekspresję YAP reprezentuje intensywność zielonej fluorescencji. Uwaga: Intensywność YAP osiąga plateau od 1,5 h wzwyż. Paski kolorów wskazują poziomy ekspresji YAP (zielony = wysoka ekspresja; czarny = niska ekspresja) w częściach (A) i (B). (C) Deformacja podłoża (nałożona na obraz w jasnym polu) w miejscu lokalizacji komórki jest reprezentowana przez pole przemieszczenia fluorescencyjnych kulek w każdym punkcie czasowym. Kierunek i wielkość przemieszczenia są odpowiednio wskazane przez kierunek strzałek i kolor. Pole przemieszczenia wywołane przez komórki PC9 jest mniejsze niż to wywołane przez komórkę B2B. W ciągu 10-godzinnego procesu rozprzestrzeniania się powierzchnia komórek PC9 pozostaje prawie stała. Pasek kolorów wskazuje wielkość przemieszczenia (karmazynowy = wysoka wartość; czarny = niska wartość). (D) Pole trakcji (nałożone na obraz w jasnym polu) obliczone na podstawie pola przemieszczenia. Trakcja generowana przez tę reprezentatywną komórkę PC9 stopniowo maleje od 6th do 10th godziny. Białe i żółte przerywane obrysy wyznaczają odpowiednio granice komórki i jądra. Pasek kolorów wskazuje wielkość trakcji (karmazynowy = wysoka wartość; czarny = niska wartość). Paski skali = 20 µm. Skróty: YAP = Yes-associated protein; PAA = poliakrylamid. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza jądra komórkowego B2B, obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej, wykresy intensywności YAP, komórki prawidłowe vs nowotworowe.
Rysunek 3: Rozkład YAP w komórkach B2B i PC9 we wczesnym stadium rozprzestrzeniania. (A) Intensywność YAP w komórce B2B mierzona wzdłuż wyznaczonej czerwonej osi w 0th i 10th h. (B) W 0th h intensywność YAP wykazuje drastyczne różnice w stężeniu między jądrem a cytoplazmą. W 10th h intensywność YAP staje się bardziej jednorodna w całym ciele komórki. (C) Intensywność YAP w komórce PC9 mierzona wzdłuż wyznaczonej niebieskiej osi w 0th i 10th h. (D) W 0th h intensywność YAP w jądrze wydaje się wyższa niż w cytoplazmie, choć różnica ta nie jest tak wyraźna jak w komórkach B2B. W 10th h intensywność YAP w jądrze nadal wydaje się nieco wyższa niż w cytoplazmie, z trendem zmienności podobnym do tego w 0th h. Paski skali = 20 µm (A, C). Skrót: YAP = Yes-associated protein. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Analiza fluorescencji YAP; intensywność jądra; schemat granic komórki; mikroskopia; metoda naukowa
Rysunek 4: Pomiar stosunku YAP N/C. (1) Użyj programu Fiji ImageJ do obrysowania jądra komórkowego i pomiaru jego rzutowanej powierzchni 2D Anuc. (2) Zmierz intensywność fluorescencji wewnątrz jądra Inuc. (3) Obrysuj ciało komórki i zmierz jego rzutowaną powierzchnię Acel. (4) Zmierz intensywność fluorescencji wewnątrz komórki Icel. (5) Oblicz gęstość YAP w jądrze Dnuc, gęstość YAP w cytoplazmie Dcyto oraz ich stosunek R: Dnuc=Inuc/Anuc; Dcyto=(Icel-Inuc)/(Acel-Anuc); R=Dnuc/Dcyto. Pasek kolorów wskazuje poziomy ekspresji YAP (zielony = wysoka ekspresja; czarny = niska ekspresja). Pasek skali = 20 µm. Skróty: YAP = Yes-associated protein; N = jądro; C = cytoplazma. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Wykresy zachowania komórek: stosunek YAP, trakcja dipolowa, rozprzestrzenianie się komórek, powierzchnia jądra; B2B vs. PC9 w czasie.
Rycina 5: Odmienna ekspresja YAP, morfologia komórek/jąder oraz trakcja komórkowa w rakowych komórkach PC9 i normalnych komórkach B2B podczas rozprzestrzeniania się komórek. (A) Zmiana stosunku YAP N/C podczas pierwszych 10 h rozprzestrzeniania się pojedynczych komórek. Średni stosunek YAP N/C komórek B2B (kolumna czerwona; n = 10) zmienił się z 2,54 ± 0,22 na 1,79 ± 0,21 (n = 10; p = 0,0022**), podczas gdy średni stosunek YAP N/C komórek PC9 (kolumna niebieska; n = 5) zmienił się z 1,92 ± 0,26 na 1,57 ± 0,07 (p = 0,187 (ns)). (B) Średnia trakcja dipolowa jako funkcja czasu. Średnia trakcja dipolowa komórek B2B zmieniła się z 256,17 ± 123,69 nN na 287,44 ± 99,79 nN (p = 0,7593 (ns)), a średnia trakcja dipolowa komórek PC9 zmieniła się z 141,19 ± 33,62 nN na 168,52 ± 73,01 nN (p = 0,7137 (ns)). (C) Średnia powierzchnia komórki jako funkcja czasu. Średnia powierzchnia rozprzestrzeniania się komórek B2B wzrosła z 613,89 ± 102,43 µm2 do 942,51 ± 226,71 µm2 (p = 0,0512 (ns)), a średnia powierzchnia rozprzestrzeniania się komórek PC9 zmieniła się z 495,78 ± 97,04 µm2 na 563,95 ± 89,92 µm2 (p = 0,5804 (ns)). (D) Średnia powierzchnia jądra jako funkcja czasu. Średnia powierzchnia rozprzestrzeniania się jądra komórek B2B wzrosła z 181,55 ± 36,18 µm2 do 239,38 ± 43,12 µm2 (p = 0,1217 (ns)), a średnia powierzchnia rozprzestrzeniania się jądra komórek PC9 zmieniła się z 133,31 ± 30,05 µm2 na 151,93 ± 22,49 µm2 (p = 0,5944 (ns)). Skróty: YAP = Yes-associated protein; N = jądro; C = cytoplazma; ns = nieistotne statystycznie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Wykresy zachowania komórkowego: stosunek YAP N/C, trakcje dipolowe względem powierzchni komórki/jądra; analiza B2B, PC9.
Rysunek 6: Stosunek YAP N/C i siła trakcji dipolowej jako funkcja powierzchni rozprzestrzenienia komórki i jądra. Stosunek YAP N/C oraz trakcje dipolowe komórek B2B (n=10) i komórek PC9 (n=5) obliczono od 6tej do 10tej godziny po przytwierdzeniu do podłoża. (A) Stosunek YAP N/C jako funkcja powierzchni rozprzestrzenienia komórki. Stosunki YAP N/C komórek B2B wahają się od 1,16 do 2,53, podczas gdy stosunki YAP N/C komórek PC9 wynoszą od 1,27 do 1,88. Powierzchnia rozprzestrzenienia komórek B2B waha się od 391,94 µm2 do 1986,40 µm2. Powierzchnia rozprzestrzenienia komórek PC9 mieści się w zakresie od 284,46 µm2 do 830,12 µm2. (B) Stosunek YAP N/C jako funkcja powierzchni rozprzestrzenienia jądra. Powierzchnia rozprzestrzenienia jądra komórek B2B waha się od 107,09 µm2 do 514,28 µm2. Powierzchnia rozprzestrzenienia jądra komórek PC9 mieści się w zakresie od 58,03 µm2 do 259,65 µm2. Trakcje dipolowe komórek B2B jako funkcja powierzchni rozprzestrzenienia komórki (C) oraz powierzchni rozprzestrzenienia jądra (D). Rozprzestrzeniające się i niemigrujące komórki B2B wykazują wyższą trakcję (od 47,50 nN do 1051,48 nN) przy mniejszej powierzchni komórki i jądra. Z kolei rozprzestrzeniające się i migrujące komórki B2B wykazują niższą trakcję (od 105,80 nN do 310,28 nN) przy większych zakresach powierzchni komórki i jądra. Skróty: YAP = Yes-associated protein; N = jądro; C = cytoplazma. Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Analiza przemieszczenia komórek z wykorzystaniem równania Boussinesqa wraz z przemieszczeniami okołokomórkowymi i okołojądrowymi.
Rycina 7: Przemieszczenie okołojądrowe w normalnych komórkach B2B i rakowych komórkach PC9. (A) Schematyczny widok z boku przedstawiający przemieszczenie okołojądrowe i okołokomórkowe mierzone na podstawie przemieszczenia kulek w podłożu. (B) Przemieszczenie podłoża pod komórką PC9 mierzone wzdłuż osi komórki (biała przerywana linia na 7D). Teoretyczne przemieszczenie generowane przez siłę dipolową na granicy komórki przedstawiono za pomocą równania Boussinesqa (czarna przerywana krzywa). (C) i (D) Nałożone na siebie obrazy fluorescencyjnych kulek z (czerwone) i bez (zielone) komórek dla komórek PC9 w 6tej h po przywieraniu (widok z góry). Żółte kulki (dokładne nałożenie kolorów czerwonego i zielonego) wskazują brak przemieszczenia. Rozdzielone zielone i czerwone kulki (wskazane żółtymi strzałkami) reprezentują przemieszczenie okołojądrowe. Żółte strzałki wskazują te skurczone obszary okołojądrowe zlokalizowane na obwodzie jądra. (E) Przemieszczenie okołojądrowe generowane przez komórkę B2B w 1,5tej h po przywieraniu komórki do podłoża. Paski skali = 10 µm (C–E). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina dodatkowa S1: Mapa sekwencji genomicznej YAP-mNeonGreen21-10/11. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina dodatkowa S2: Zmiany w ekspresji/dystrybucji YAP, pole przemieszczenia podłoża oraz pole trakcji prawidłowych komórek B2B podczas wczesnego rozprzestrzeniania się. (A, D, G, J, M) Komórkę B2B wysiano na żel PAA o sztywności 5 kPa i obrazowano przez 10 h po początkowym przytwierdzeniu komórki do podłoża. Ekspresja YAP jest reprezentowana przez intensywność fluorescencji zielonej. Uwaga: intensywność YAP wewnątrz jądra stopniowo maleje, lecz w czasie pozostaje wyższa niż w cytoplazmie. Paski kolorów wskazują poziomy ekspresji YAP (zielony = wysoka ekspresja; czarny = niska ekspresja) w (A, D, G, J, M). (B, E, H, K, N) Deformacja podłoża (nałożona na obraz w jasnym polu) w miejscu położenia komórki jest reprezentowana przez pole przemieszczenia w każdym punkcie czasowym. Kierunek i wielkość przemieszczenia są odpowiednio wskazane przez kierunek i kolor strzałek. Przemieszczenie staje się większe na obwodzie ciała komórki B2B wraz ze wzrostem powierzchni rozprzestrzeniania się komórki. Paski kolorów wskazują wielkość przemieszczenia (karmazynowy = wysoka wielkość; czarny = niska wielkość) w (B, E, H, K, N). (C, F, I, L, O) Pole trakcji (nałożone na obraz w jasnym polu) obliczone z pola przemieszczenia za pomocą mikroskopii sił trakcyjnych (TFM). Trakcja jest skoncentrowana na obwodzie komórek B2B. Paski kolorów wskazują wielkość trakcji (karmazynowy = wysoka wielkość; czarny = niska wielkość) w (C, F, I, L, O). Paski skali = 20 µm. Skróty: YAP = Yes-associated protein; PAA = poliakrylamid. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina pomocnicza S3: Zmiany w ekspresji/rozmieszczeniu YAP, pole przemieszczenia podłoża i pole sił trakcyjnych komórek raka PC9 podczas wczesnego rozprzestrzeniania się. (A, D, G, J) Komórka PC9 została wysiana na żelu PAA o sztywności 5 kPa i obrazowana przez 10 h po początkowej adhezji komórki do podłoża. Ekspresja YAP jest reprezentowana przez intensywność zielonej fluorescencji. Uwaga: Intensywność YAP wewnątrz jądra stopniowo spada, ale w czasie pozostaje zbliżona lub nieco niższa niż w cytoplazmie. Paski kolorów wskazują poziomy ekspresji YAP (zielony = wysoka ekspresja; czarny = niska ekspresja) w (A, D, G, J). (B, E, H, K) Deformacja podłoża (nałożona na obraz w jasnym polu) w miejscu położenia komórki jest reprezentowana przez pole przemieszczenia w każdym punkcie czasowym. Kierunek i wielkość przemieszczenia są odpowiednio wskazane przez kierunek i kolor strzałek. Przemieszczenie staje się większe na obwodzie ciała komórki PC9 wraz ze wzrostem powierzchni rozprzestrzeniania się komórki. Paski kolorów wskazują wielkość przemieszczenia (karmazynowy = wysoka wartość; czarny = niska wartość) w (B, E, H, K). (C, F, I, L) Pole sił trakcyjnych (nałożone na obraz w jasnym polu) obliczone na podstawie pola przemieszczenia. Siła trakcyjna jest skoncentrowana na obwodzie komórek PC9. Paski kolorów wskazują wielkość siły trakcyjnej (karmazynowy = wysoka wartość; czarny = niska wartość) w (C, F, I, L). Paski skali = 20 µm. Skróty: YAP = Yes-associated protein; PAA = poliakrylamid. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Proces obrazowania (krok 6.3) ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia, że obrazy fluorescencyjne są wystarczająco dobrej jakości, aby uzyskać prawidłowe wyniki kwantyfikacji. Obrazy stosu z białka fluorescencyjnego lub kulek powinny mieć zakres z, który jest wystarczająco duży, aby zawierać obrazy ostrej dla wszystkich pozycji Z, które obejmuje próbka. Kolejnym krytycznym krokiem jest zebranie obrazów referencyjnych kulek fluorescencyjnych po rozpuszczeniu komórek (krok 6.5). Ponieważ obrazy referencyjne muszą być wykonywane w tych samych pozycjach co w kroku 6.3, nie należy indukować względnego przemieszczenia między szalką Petriego, komorą środowiskową i mikroskopem. Badacze wykonujący etap rozpuszczania muszą być ostrożni, aby zdjąć pokrywę szalki Petriego i upewnić się, że zastosowane zakłócenia mechaniczne nie są wystarczająco duże, aby zmienić położenie szalki w komorze środowiskowej.

Poniżej znajdują się rozwiązania niektórych błędów, które mogą wystąpić podczas eksperymentów. Jeśli po kliknięciu Enter w kroku 6.4 nie zostanie aktywowane żadne makro, najprawdopodobniej jest to spowodowane tym, że lewy dolny obszar ekranu jest zajęty przez okno inne niż Element. W takim przypadku lewy dolny obszar okna musi zostać wyczyszczony, aby można było aktywować makra w Elementach. Innym częstym błędem jest to, że obrazy w jasnym polu wydają się czarne. Problem ten jest spowodowany niewystarczającym odstępem czasu między akwizycją obrazów fluorescencyjnych i obrazów w jasnym polu. Niewielkie opóźnienia w zliczaniu czasu obrazowania fluorescencyjnego mogą kumulować się w czasie i powodować znaczne opóźnienia oraz zakłócać obrazowanie w jasnym polu. Jednym z rozwiązań jest dostosowanie czasu trwania jednego cyklu obrazowania dla wszystkich pozycji tak, aby był krótszy (nierówny) odstępowi czasu między rozpoczęciem kolejnych ruchów. Ta operacja odświeża zliczanie czasu i eliminuje skumulowany błąd na początku każdego cyklu obrazowania.

Ta w pełni optyczna technologia przesłuchań obsługuje (1) szeroką gamę sprzętu/oprogramowania, w tym między innymi firmę Nikon, (2) różne typy zatwierdzonych systemów hydrożelowych, w tym żele żelatynowe, PEG, Matrigel i żele kolagenowe I, oraz (3) programowalne dostosowywanie w oparciu o różne potrzeby badaczy. Jeśli jednak którakolwiek z funkcji sterowania dolnego poziomu nie jest dostępna w komercyjnym mikroskopie, dostosowanie funkcji za pomocą AMFIP staje się wyzwaniem. Innym ograniczeniem tej techniki jest dryft przestrzenny próbki zarówno w płaszczyźnie XY, jak i ogniskowej (Z). Chociaż to ograniczenie można przezwyciężyć podczas przetwarzania końcowego obrazów, konieczne jest ulepszenie funkcji automatycznego ustawiania ostrości, aby skorygować dryf próbek w czasie rzeczywistym. To ulepszenie zwiększy przepustowość procesu obrazowania i zmniejszy potencjalny błąd spowodowany dryftem podczas eksperymentów.

Mechanoprzetworniki, takie jak YAP, mogą służyć jako nowe cele terapeutyczne dla rozwoju obiecujących terapii przeciwnowotworowych 25,26,27. Pojawiające się dane sugerują, że YAP sprzyja proliferacji i inwazji komórek nowotworowych. Indukowana mechanicznie translokacja YAP z cytoplazmy do jądra aktywuje transkrypcję genów związanych z migracją, proliferacją, inwazją i apoptozą komórek, prowadząc do nieprawidłowych zachowań komórek 28,29,30,31. Prace te miały na celu zbadanie potencjalnej korelacji między stosunkiem YAP N/C a mechaniką komórkową w dwóch typowych ludzkich liniach raka płuca i prawidłowych liniach komórkowych. Podczas 10-godzinnego okresu rozprzestrzeniania się komórek komórki PC9 wykazują podobne stężenia YAP w jądrze i cytoplazmie (ryc. 3D i ryc. 5A). Komórki B2B wykazują wyższe stężenie YAP w jądrze niż w cytoplazmie (Figura 3C i Figura 5A). Ta zależność stwierdzona we wczesnej fazie rozprzestrzeniania się różni się od większości opublikowanych wyników, które porównują stężenie YAP w jądrze między komórkami normalnymi a nowotworowymi. Chociaż niekoniecznie na wczesnym etapie rozprzestrzeniania się, większość opublikowanych wyników pokazuje, że YAP jest bardziej skoncentrowany w jądrze komórek rakowych niż w jądrze normalnych komórek27,28. Tylko jedno badanie dotyczące raka piersi wykazało wyjątek32, który pokazuje, że YAP jest bardziej skoncentrowany w cytoplazmie, co zgadza się z naszymi obecnymi obserwacjami dokonanymi w komórkach PC9 raka płuc. Zgodnie z najlepszą wiedzą autorów, praca ta jest pierwszą, która wykazała niższy stosunek YAP N/C w linii komórkowej ludzkiego raka płuca. Autorzy stawiają hipotezę, że przyczyną stabilnego stosunku YAP N / C w komórkach PC9 może być niewielka zmienność obszaru rozprzestrzeniania się komórka/jądro i trakcja w komórkach PC9 na wczesnym etapie rozprzestrzeniania się. Trwa analiza mechanizmów molekularnych leżących u podstaw niskiego stosunku YAP N/C w komórkach PC9 i B2B.

W ciągu pierwszych 10 godzin rozprzestrzeniania się te dwie linie komórkowe wykazują wyraźny związek między stosunkiem YAP N / C, trakcją komórek i obszarem rozprzestrzeniania się (ryc. 5). W przypadku komórek B2B wyższy stosunek YAP N / C jest skorelowany z wyższym obszarem rozprzestrzeniania się komórek i jądra (ryc. 6A, B), co jest zgodne z raportowanymi danymi innych normalnych komórek33. Co ciekawe, chociaż trend rozwojowy tego związku występuje na ogół we wszystkich zarejestrowanych komórkach B2B, stwierdza się dwa różne stopnie (wysoki i niski) tego związku. Komórki B2B, które rozprzestrzeniają się i migrują jednocześnie, wykazują niższą trakcję i większą powierzchnię rozprzestrzeniania się komórek i jąder przy wyższym stosunku YAP N/C (2,05 ± 0,32). W przypadku komórek B2B, które rozprzestrzeniają się i pozostają w tym samym miejscu, wykazują wyższą trakcję i mniejszą powierzchnię rozprzestrzeniania się komórek i jądra przy niższym stosunku YAP N/C (1,74 ± 0,21). Te dwa stopnie zależności są pokazane w rozwidlonych rozproszonych grupach danych (Rysunek 6C,D). Jak podano w literaturze, stacjonarne normalne komórki, takie jak komórki brionalnego fibroblastu NIH 3T3, mają większą przyczepność niż komórki migrujące34. Dane przedstawione w tym artykule sugerują, że rozprzestrzeniające się i niemigrujące komórki B2B miały większą przyczepność niż rozprzestrzeniające się i migrujące komórki B2B, co prawdopodobnie sugeruje, że wysoka przyczepność jest potrzebna, aby komórki niemigrujące ustabilizowały się na podłożu.

Ponadto dane te pokazują, że stacjonarne normalne komórki B2B generują większą siłę okołojądrową, podczas gdy poprzednie badania przeprowadzone przez innych badaczy wykazały tylko wyższą trakcję komórek generowaną na obrzeżach komórek stacjonarnych 34,35,36,37. Autorzy sądzą, że różnica w wewnętrznej tendencji migracji w eksperymentach może powodować te sprzeczne wyniki. W opublikowanych eksperymentach zastosowano mikrowzory w kształcie kwadratu, aby ograniczyć rozprzestrzenianie się pojedynczych komórek i zahamować migrację; Nie wiadomo, czy komórki miały tendencję do migracji. Ponieważ komórki migrujące często wykazują dużą siłę przyciągania na obrzeżach komórek38, jest prawdopodobne, że komórki z tendencją do migracji nadal będą utrzymywać wysoką przyczepność na obrzeżach, nawet jeśli ich migracja jest ograniczona. W niniejszym badaniu komórki stacjonarne nie są ograniczone żadnym mikrowzorcem, ale nie migrują, co wskazuje, że komórki mają tendencję do utrzymywania stanu bez migracji. Inną możliwością jest to, że kształt komórki określony przez mikrowzór może wpływać na rozkład zrostów ogniskowych i sił trakcyjnych39. Wyniki tego badania zostały wygenerowane bez żadnych ograniczających mikrowzorców i reprezentują rozkład sił komórek stacjonarnych w ich pierwotnym kształcie.

Zgodnie z najlepszą wiedzą autorów, tylko jedna publikacja do tej pory donosiła o odkryciu sił okołojądrowych w normalnych komórkach (mysich fibroblastach embrionalnych), potencjalnie spowodowanych przez czapeczkę aktynową rozciągającą się w jądrze40. Translokacja cytoplazmy do jądra YAP jest skorelowana ze wzrostem siły okołojądrowej40. Dokładne przeszukanie odpowiedniej literatury nie przyniosło żadnych publikacji, które donosiłyby o oddziaływaniu okołojądrowym lub kapku aktynowym w komórkach nowotworowych. Pośrednie badanie na komórkach raka czerniaka wykazało, że obręcz aktyny (inna organizacja aktyny okołojądrowej zlokalizowana wokół jądra, ale nie pokrywająca jądra) zmniejsza tempo migracji komórek41, pośrednio sugerując istnienie siły okołojądrowej. Nie podano jednak żadnych bezpośrednich danych doświadczalnych. W tym badaniu autorzy odkryli, że zarówno komórki PC9, jak i B2B wykazują przemieszczenie i trakcję okołojądrową. Mechanizmy powstawania sił okołojądrowych i ich skutki pozostają kontrowersyjne. W normalnych komórkach stwierdzono, że czapeczka aktynowa odgrywa rolę w regulacji morfologii jądra i organizacji chromatyny42, przesyłaniu sygnałów mechanicznych z ogniskowych zrostów do jądra przez łączniki kompleksu nukleoszkieletu i cytoszkieletu (LINC)43 oraz regulacji migracji komórek44. Lamina A/C jest związana z powstawaniem i rozrywaniem kapu aktynowego 40,41,42,43,44. Jednak w raporcie, w którym stwierdzono, że kapon aktynowy generuje siły okołojądrowe, nie uwzględniono potencjalnej roli obręczy aktynowej40. W komórkach nowotworowych nadekspresja laminy A ułatwia tworzenie obręczy aktynowej i ogranicza migrację komórek rakowych. Nadekspresja laminy B zmniejsza tworzenie się obrzeży aktynowych i sprzyja migracji. Oddziaływanie okołojądrowe może być zaangażowane w ten proces ze względu na istnienie organizacji aktyny okołojądrowej i efekt Laminy A. Jednak wyniki tego badania nie wykazały żadnych dowodów na zmierzone siły okołojądrowe ani zachowanie kapu aktynowego. Dlatego odkrycie sił okołojądrowych w komórkach PC9 w niniejszym badaniu jest pierwszym raportem pokazującym siły okołojądrowe i przemieszczenia w komórkach raka płuc. Autorzy badają obecnie mechanizmy molekularne i funkcje sił okołojądrowych w komórkach PC9 i B2B zaprojektowanych przez CRISPR/Cas9.

Poza całkowicie optycznym badaniem mechanobiologicznym, które zostało zademonstrowane w tym artykule, zintegrowany wielofunkcyjny system może być zastosowany do optycznego badania niezliczonych innych istotnych sygnałów fizjologicznych i patobiologicznych w żywych systemach. Na przykład laboratorium autorów ustaliło niedawno wiele stabilnie transdukowanych linii komórek nowotworowych u ludzi, które wykazują współekspresję trzech wrażliwych na światło białek błonowych: wskaźnika napięcia błonowego QuasAr2 (wzbudzenie: 640 nm; emisja: 660 nm-740 nm), membranowy depolaryzator napięcia CheRiff (wzbudzenie: 488 nm) i hiperpolaryzator napięcia membranowego eNpHR3 (wzbudzenie: 590 nm). Te trzy funkcjonalne białka mogą być aktywowane przez spektrum-ortogonalne linie laserowe w sposób wolny od przesłuchów, umożliwiając we wszystkich optycznych dwukierunkowych komunikatach sygnalizacyjnych (odczyt i kontrola) elektrofizjologii błonowej. Korzystając ze zintegrowanego systemu optoelektronicznego i ręcznego patch-clampu, autorzy przeprowadzili walidację w pełni optycznej kontroli i odczytu napięcia błony (Vm) w pojedynczych ludzkich komórkach nowotworowych i wielokomórkowych sferoidach guza. Całkowicie optyczne badania elektrofizjologiczne otwierają możliwość szczegółowych badań nad wcześniej niedostępną bioelektrycznością w komórkach nowotworowych, co może pomóc w rozwoju biologii guza z nowej osi.

Oświadczenia

Nie ma żadnych konfliktów interesów, które można by zadeklarować.

Podziękowania

Ten projekt jest wspierany finansowo przez Cancer Pilot Award od UF Health Cancer Center (X. T. and D. S.) oraz Gatorade Award Start-up Package (X. T.). Autorzy szczerze doceniają intelektualne dyskusje i wsparcie techniczne ze strony dr Jonathana Lichta (UFHCC), dr Rolfa Renne (UFHCC), dr Ji-Hyun Lee (biostatystyka, UF), dr Hugh Fana (MAE, UF), dr Warrena Dixona (MAE, UF), dr Ghatu Subhash (MAE, UF), dr Marka Sheplaka (MAE & ECE, UF), dr Malisy Sarntinoranont (MAE, UF), dr Scotta Banksa (MAE, UF, UF), dr Matthew Traum (MAE, UF), dr David Hahn (University of Arizona), dr Weihong Wang (Oracle Corporation), dr Youhua Tan (Hong Kong Polytechnic University) oraz zespół wsparcia firmy Nikon (dr Jose Serrano-Velez, Larry Kordon i dr Jon Ekman). Autorzy są głęboko wdzięczni za hojne i skuteczne wsparcie ze strony wszystkich członków laboratoriów badawczych Tanga, Siemanna i Guana oraz wszystkich pracowników MAE i ECE oraz Wydziałów Fizyki i Radioterapii Onkologicznej UF.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
(3-Aminopropylo)trietoksysilanSigma-aldrich440140
0,05 % TrypsynaCorning25-051-CI
75 cm2 kolbaCorning430641U
8 Wirówka stołowaThermo75007210
System konfokalny A1RNikonHD25
KwasoctowySigma-aldrich695092lodowcowy, odczynnik ACS, ≥ 99,7%
Komórki BEAS-2B (B2B)Sigma-aldrich95102433ludzkie komórki nabłonkowe z tkanki płucnej
Mikrosfery modyfikowane karboksylanemInvitrogenF8797
(RPMI-1640)Gibco11875093
Dell2018z systemem operacyjnym Windows 10
Komora środowiskowa TIZBTokai HitTIZB
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Gibco26140
Fibronektyna Białko ludzkie, osoczeGibco33016015
Fidżi ImageJNarodowe Instytuty Zdrowia i Laboratorium Oprzyrządowania Optycznego i Obliczeniowego1.53k
Szalka Petriego ze szklanym dnemMatTekP35G-1.5-14-C
HEPES buforowany sól fizjologicznaSigma-aldrich51558
Roztwór hydratu hydrazynySigma-aldrich53847
IntelliJ IDEAJetBrains2020Platforma programistyczna
Java Zestaw programistyczny JavaOracle14.0
KimwipeKimtech Science3066-05
MATLABMathWorks2020b
Monochromatyczny  KameraFLIRBFS-U3-70S7M-C
MycoAlert Zestaw do wykrywania mykoplazmyLonzaLT07-218
Roztwór N,N′-MetylenobisakryloamiduSigma-aldrichM1533
Platforma oprogramowania NIS-ElementsoprogramowaniaNikon4.50
OriginOriginLabOriginPro 2017 (Learning Edition)analiza danych i oprogramowanie do tworzenia wykresów
Penicylina-streptomycynaGibco15140122
Komórki PC9Sigma-aldrich90071810ludzkie komórki gruczolakoraka  z tkanki płucnej
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Gibco10010023
Phusion Polimeraza DNA o wysokiej wiernościNew England Biolabs  F-553Spolimeraza DNA o wysokiej wierności
Taśma klejącaTaśma klejącaklejąca Roztwór
dodecylosiarczanu soduSigma-aldrich05030
Super klejKlej cyjanoakrylowyGorilla
Mikroskop odwrócony Ti2-ENikonMEA54000
TI2-S-SE-E Stolik zmotoryzowany z enkoderemNikonMEC56120
μ Managerw wersji 2.0oprogramowanie do mikroskopii gamma typu open source (https://micro-manager.org/)
Pożywka hodowlana Komputer stacjonarny Platforma

Bibliografia

  1. Werley, C., Boccardo, S., Rigamonti, A., Hansson, E., Cohen, A. Multiplexed optical sensors in arrayed islands of cells for multimodal recordings of cellular physiology. Nature Communications. 11 (1), 3881(2020).
  2. Yang, B., et al. Epi-illumination SPIM for volumetric imaging with high spatial-temporal resolution. Nature Methods. 16 (6), 501-504 (2019).
  3. Saraswathibhatla, A., Galles, E. E., Notbohm, J. Spatiotemporal force and motion in collective cell migration. Scientific Data. 7 (1), 197(2020).
  4. Saraswathibhatla, A., Henkes, S., Galles, E. E., Sknepnek, R., Notbohm, J. Coordinated tractions control the size of a collectively moving pack in a cell monolayer. Extreme Mechanics Letters. 48, 101438(2021).
  5. Wang, W., Kim, C. K., Ting, A. Y. Molecular tools for imaging and recording neuronal activity. Nature Chemical Biology. 15 (2), 101-110 (2019).
  6. Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nature Methods. 9 (7), 697-710 (2012).
  7. Carpenter, A. E., Kamentsky, L., Eliceiri, K. W. A call for bioimaging software usability. Nature Methods. 9 (7), 666-670 (2012).
  8. Skylaki, S., Hilsenbeck, O., Schroeder, T. Challenges in long-term imaging and quantification of single-cell dynamics. Nature Biotechnology. 34 (11), 1137-1144 (2016).
  9. Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
  10. Luo, Q., et al. Automatic multi-functional integration program (AMFIP) towards all-optical mechanobiology interrogation. bioRxiv. , (2021).
  11. Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using manager. Current Protocols in Molecular Biology. 92 (1), 14-20 (2010).
  12. Tulpule, A., et al. Kinase-mediated RAS signaling via membraneless cytoplasmic protein granules. Cell. 184 (10), 2649-2664 (2021).
  13. Tang, X., Tofangchi, A., Anand, S. V., Saif, T. A. A novel cell traction force microscopy to study multi-cellular system. PLOS Computational Biology. 10 (6), 1003631(2014).
  14. Tang, X., et al. Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells. Biophysical Journal. 99 (8), 2460-2469 (2010).
  15. Guimarães, C. F., Gasperini, L., Marques, A. P., Reis, R. L. The stiffness of living tissues and its implications for tissue engineering. Nature Reviews Materials. 5, 351-370 (2020).
  16. Phelps, E. A., et al. Maleimide cross-linked bioactive PEG hydrogel exhibits improved reaction kinetics and cross-linking for cell encapsulation and in situ delivery. Advanced Materials. 24 (1), 64-70 (2012).
  17. Bajaj, P., Tang, X., Saif, T. A., Bashir, R. Stiffness of the substrate influences the phenotype of embryonic chicken cardiac myocytes. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 95 (4), 1261-1269 (2010).
  18. Temples, M. N., Adjei, I. M., Nimocks, P. M., Djeu, J., Sharma, B. Engineered three-dimensional tumor models to study natural killer cell suppression. ACS Biomaterials Science & Engineering. 6 (7), 4179-4199 (2020).
  19. Feng, S., et al. Improved split fluorescent proteins for endogenous protein labeling. Nature Communications. 8, 370(2017).
  20. Guan, J., Liu, H., Shi, X., Feng, S., Huang, B. Tracking multiple genomic elements using correlative CRISPR imaging and sequential DNA FISH. Biophysical Journal. 112 (6), 1077-1084 (2017).
  21. Micro-Manager. , Available from: https://micro-manager.org/wiki/NikonTi2 (2021).
  22. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  23. Martiel, J. L., et al. Measurement of cell traction forces with ImageJ. Methods in Cell Biology. 125, 269-287 (2015).
  24. Okumurai, I. A. On the generalization of Cerruti's problem in an elastic half-space. Doboku Gakkai Ronbunshu. 1995, 1-10 (1995).
  25. Piccolo, S., Dupont, S., Cordenonsi, M. The biology of YAP/TAZ: hippo signaling and beyond. Physiological Reviews. 94 (4), 1287-1312 (2014).
  26. Hong, W. W., Guan, K. L. The YAP and TAZ transcription co-activators: Key downstream effectors of the mammalian Hippo pathway. Seminars in Cell and Developmental Biology. 23 (7), 785-793 (2012).
  27. Zanconato, F., Cordenonsi, M., Piccolo, S. YAP/TAZ at the roots of cancer. Cancer Cell. 29 (6), 783-803 (2016).
  28. Wang, Y., et al. Overexpression of yes-associated protein contributes to progression and poor prognosis of non-small-cell lung cancer. Cancer Science. 101 (5), 1279-1285 (2010).
  29. Li, H., et al. Inhibition of YAP suppresses CML cell proliferation and enhances efficacy of imatinib in vitro and in vivo. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 35 (1), 134(2016).
  30. Tang, X., et al. A mechanically-induced colon cancer cell population shows increased metastatic potential. Molecular Cancer. 13, 131(2014).
  31. Panciera, T., Azzolin, L., Cordenonsi, M., Piccolo, S. Mechanobiology of YAP and TAZ in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (12), 758-770 (2017).
  32. Yuan, M., et al. Yes-associated protein (YAP) functions as a tumor suppressor in breast. Cell Death and Differentiation. 15 (11), 1752-1759 (2008).
  33. Koushki, N., et al. Lamin A redistribution mediated by nuclear deformation determines dynamic localization of YAP. bioRxiv. , (2020).
  34. Chang, S. S., Rape, A. D., Wong, S. A., Guo, W. H., Wang, Y. L. Migration regulates cellular mechanical states. Molecular Biology of the Cell. 30 (26), 3104-3111 (2019).
  35. Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. Geometric guidance of integrin mediated traction stress during stem cell differentiation. Biomaterials. 69, 174-183 (2015).
  36. Lee, J., Abdeen, A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. Matrix directed adipogenesis and neurogenesis of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue and bone marrow. Acta Biomaterialia. 42, 46-55 (2016).
  37. Tang, X., Bajaj, P., Bashir, R., Saif, T. A. How far cardiac cells can see each other mechanically. Soft Matter. 7 (13), 6151-6158 (2011).
  38. Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
  39. Rape, A., Guo, W. H., Wang, Y. L. The regulation of traction force in relation to cell shape and focal adhesions. Biomaterials. 32 (8), 2043-2051 (2011).
  40. Shiu, J. Y., Aires, L., Lin, Z., Vogel, V. Nanopillar force measurements reveal actin-cap-mediated YAP mechanotransduction. Nature Cell Biology. 20 (3), 262-271 (2018).
  41. Fracchia, A., Asraf, T., Salmon-Divon, M., Gerlitz, G. Increased lamin B1 levels promote cell migration by altering perinuclear actin organization. Cells. 9 (10), 2161(2020).
  42. Ramdas, N. M., Shivashankar, G. V. Cytoskeletal control of nuclear morphology and chromatin o1rganization. Journal of Molecular Biology. 427 (3), 695-706 (2015).
  43. Khatau, S. B., et al. A perinuclear actin cap regulates nuclear shape. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (45), 19017-19022 (2009).
  44. Kim, D. H., Cho, S., Wirtz, D. Tight coupling between nucleus and cell migration through the perinuclear actin cap. Journal of Cell Science. 127 (11), 2528-2541 (2014).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wielofunkcyjne obrazowanieobrazowanie ywych kom rekanaliza si trakcyjnych kom rekmikroskopia konfokalnamikroskopia fluorescencyjnakom rki modyfikowane metod CRISPRdynamika rozprzestrzeniania si kom rekstosunek j dra do cytoplazmy
W pełni optyczne badanie mechanobiologiczne białka związanego z Tak w ludzkim raku i normalnych komórkach przy użyciu wielofunkcyjnego systemu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.