Artykuł metodologiczny

Selektywne czyszczenie dzikich nicieni Caenorhabditis w celu wzbogacenia o bakterie mikrobiomu jelitowego

3.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62937

⸱

13 sierpnia 2021

 ,  ,  , 
1Department of Biology, San Diego State University, 2Institut de Biologie de l’École Normale Supérieure

W tym artykule

Podsumowanie

Dzikie nicienie Caenorhabditis są związane z wieloma drobnoustrojami, często w świetle jelit lub infekującymi jelita. Protokół ten szczegółowo opisuje metodę wzbogacania niekulturowych drobnoustrojów kolonizujących jelito, wykorzystując odporność naskórka dauer.

Streszczenie

Caenorhabditis elegans (C. elegans) okazał się doskonałym modelem do badania interakcji gospodarz-mikroorganizm i mikrobiomu, szczególnie w kontekście jelit. Niedawne pobieranie próbek ekologicznych dzikich nicieni Caenorhabditis ujawniło różnorodny wachlarz powiązanych mikroorganizmów, w tym bakterie, wirusy, grzyby i mikrosporydia. Wiele z tych drobnoustrojów ma interesujące fenotypy kolonizacji lub infekcji, które wymagają dalszych badań, ale często nie nadają się do hodowli. Protokół ten przedstawia metodę wzbogacania pożądanych drobnoustrojów jelitowych w C. elegans i pokrewnych nicieniach oraz zmniejszania obecności wielu zanieczyszczających drobnoustrojów przylegających do naskórka. Protokół ten polega na zmuszaniu zwierząt do wcześniejszego etapu rozwoju i stosowaniu serii mycia antybiotykami i detergentami w celu usunięcia zanieczyszczeń zewnętrznych. Ponieważ u zwierząt dauer zachodzą zmiany fizjologiczne, które chronią nicienie przed trudnymi warunkami środowiskowymi, wszelkie drobnoustroje jelitowe będą chronione przed tymi warunkami. Jednak, aby wzbogacenie zadziałało, mikrob będący przedmiotem zainteresowania musi zostać utrzymany, gdy zwierzęta rozwijają się w dauery. Kiedy zwierzęta opuszczają stadium dauer, rozmnażają się pojedynczo w poszczególne linie. Populacje F1 są następnie selekcjonowane pod kątem pożądanych drobnoustrojów lub fenotypów infekcji oraz pod kątem widocznego zanieczyszczenia. Metody te pozwolą naukowcom wzbogacić niezdolne do hodowli drobnoustroje w świetle jelita, które stanowią część naturalnego mikrobiomu C. elegans i wewnątrzkomórkowych patogenów jelitowych. Drobnoustroje te można następnie badać pod kątem fenotypów kolonizacji lub infekcji oraz ich wpływu na kondycję gospodarza.

Wprowadzenie

Model genetyczny C. elegans to doskonały system in vivo do badania interakcji gospodarz-mikroorganizm1,2. Mają stosunkowo prostą fizjologię w porównaniu z innymi zwierzętami, jednak większość ich biologii komórkowej jest zasadniczo podobna do biologii ssaków, co czyni je dobrym modelem do badań biologicznych1,3,4. Dodatkowo są mikroskopijne, łatwe w utrzymaniu i pozostają przezroczyste przez cały krótki okres użytkowania. Właściwości te umożliwiają szybkie badania mechanizmów rządzących interakcjami gospodarz-mikroorganizm oraz wizualizację infekcji in vivo i kolonizacji genetycznie giętkich gospodarzy5,6. Wreszcie, C. elegans szybko reaguje na infekcje bakteryjne, grzybicze i wirusowe, co czyni je doskonałym modelem do badania interakcji gospodarz-mikroorganizm i mikrobiomu jelitowego7,8,9.

Zwiększenie liczby próbek dzikich C. elegans i innych nicieni pozwoliło na badania nad ekologią wolno żyjących nicieni i naturalną zmiennością genetyczną10,11. Jednocześnie pobieranie próbek przyczyniło się również do odkrycia naturalnie występujących biologicznych patogenów i drobnoustrojów, które wchodzą w interakcje z C. elegans12,13,14,15, co doprowadziło do powstania wielu systemów modelowych gospodarz-mikroorganizm, które badają interakcje z wirusami, bakteriami, mikrosporydiami, lęgniowcami lub grzybamixref"17,18,19,20. Zazwyczaj dziki C. elegans znajduje się w gnijących łodygach i owocach, często w bardziej umiarkowanym klimacie, i przeważnie rozmnaża się sam21. Po przyniesieniu tych próbek do laboratorium, dzikie nicienie są izolowane w populacjach klonalnych, przenoszących szereg powiązanych mikrobiot. Podczas odkrywania nowych drobnoustrojów będących przedmiotem zainteresowania w nicieniach Caenorhabditis, zwierzęta są często bezpośrednio badane pod kątem infekcji lub kolonizacji za pomocą mikroskopii przy użyciu łatwych do wizualizacji fenotypów. Na przykład infekcja wirusowa może być wizualizowana jako rozpad struktur jelitowych, a stadia mikrosporydiów można zobaczyć wewnątrz komórek gospodarza jako zarodniki lub meronts14,22. W przypadku odkrycia drobnoustroju będącego przedmiotem zainteresowania do przyszłych badań, należy go oddzielić od innych zanieczyszczających drobnoustrojów występujących w dzikich nicieniach, tak aby można go było badać w izolacji. W wielu przypadkach interesujący nas mikrob nie może być hodowany in vitro, co sprawia, że konieczne jest wzbogacenie drobnoustroju w nicienie gospodarza.

Na przykład, ten protokół opisuje dziki izolat C. tropicalis zawierający bakterię, która kolonizuje światło jelita nicieni, przylegając do komórek nabłonka jelitowego w sposób kierunkowy. Fenotypowo bakteria rośnie prostopadle wzdłuż wewnętrznych stron światła jelita, nadając jej wygląd przypominający szczecinę, uwidoczniony pod standardowym mikroskopem Normarskiego we wszystkich stadiach rozwoju zwierzęcia, w tym w stadium dauera. Płytka pożywki wzrostowej nicieni (NGM), na której hodowano ten dziki szczep C. tropicalis, zawierała widoczne zanieczyszczenie innymi drobnoustrojami. Protokół ten został opracowany w celu zmniejszenia dodatkowego zanieczyszczającego wzrostu drobnoustrojów na płytkach w celu zbadania tej nieznanej bakterii przylegającej. Nicienie zostały zmuszone do przejścia w fazę dauer w celu ochrony bakterii w świetle, a następnie oczyszczone za pomocą serii płukań. Następnie nieznany gatunek bakterii został zidentyfikowany poprzez preparację jelit i amplifikację PCR rybosomalnego DNA 16S do sekwencjonowania.

Ogólnie rzecz biorąc, ten protokół może potencjalnie wzbogacić każdy interesujący mikrob związany z dziko schwytanym nicieniem. Następnie naukowcy zidentyfikują docelowy mikroorganizm, zwizualizują fenotypy infekcji lub kolonizacji in vivo za pomocą mikroskopii i zbadają wpływ na kondycję gospodarza lub inne aspekty interakcji gospodarz-mikroorganizm. Izolacja i badanie nowych gatunków drobnoustrojów, które wchodzą w interakcje z nicieniami Caenorhabditis, może odkryć genetyczne mechanizmy odporności gospodarza i nowe paradygmaty interakcji gospodarz-mikroorganizm istotne dla patogenezy drobnoustrojów i badań mikrobiomu.

Protokół

1. Wywoływanie powstawania dauer dla dzikich nicieni na płytkach NGM

  1. Hoduj dziki szczep Caenorhabditis na standardowych płytkach NGM z OP50-1 E. coli jako źródłem pożywienia po uzyskaniu robaków z nienadającym się do hodowli mikrobem o znaczeniu. Inkubować nicienie w temperaturze 20 °C.
    UWAGA: Standardowa temperatura do hodowli nicieni Caenorhabditis wynosi od 15 do 25 °C, ale powinna być określona empirycznie, aby zapobiec utracie interesującego mikroba
    2. .
  2. Głodzić talerz zwierząt w temperaturze 20 °C przez 4-5 dni, aż wszystkie OP50-1 zostaną zużyte, a większość osiągnie etap dauer.
    UWAGA: Dauery to długowieczne larwy, które rozwijają się z powodu braku odżywiania i mają ochronne skórki.

2. Mycie nicieni

  1. Dodaj 5 ml pożywki M9 z minimalnymi solami (42 mM Na2HPO4, 22 mM KH2PO4, 8,6 mM NaCl, 19 mM NH4Cl) do 6 cm płytki z wygłodzonymi robakami.
  2. Używając sterylnej szklanej pipety i gruszki, odpipetuj M9 i robaki z płytki i przenieś je do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
  3. Za pomocą wirówki klinicznej odwirowywać robaki w probówce o wielkości 1000 x g przez 30 s w temperaturze pokojowej.
  4. Używając sterylnej pipety o pojemności 15 ml, usunąć i wyrzucić supernatant M9 znajdujący się powyżej osadu robaków. Nie należy przeszkadzać żywym robakom na dnie probówki, pozostawiając około 50 μl M9 nad robakami.
  5. Dodać 10 ml M9 + 0,05% Triton X-100 do tej samej probówki wirówkowej i odpowiednio dokręcić nakrętkę probówki.
  6. Inkubować probówkę na nutatorze przez 20 minut w temperaturze pokojowej, aby usunąć zewnętrzne drobnoustroje. Wyjmij rurkę z nutatora i obracaj ślimaki z prędkością 1000 x g przez 30 s.
  7. Za pomocą sterylnej pipety usunąć i wyrzucić supernatant M9 znajdujący się powyżej osadu robaków. Nie należy przeszkadzać żywym robakom na dnie probówki, pozostawiając około 50 μl M9 nad robakami.
  8. Wykonaj i powtórz kroki 2.5-2.8 jeszcze trzy razy.

3. Dezynfekcja nicieni

  1. Przygotować roztwór antybiotyku i karty charakterystyki w 10 ml buforu M9, dodając 0,25% SDS (250 μl 10% SDS), 50 μg/ml karbenicyliny, 25 μg/ml kanamycyny, 12,5 μg/ml tetracykliny, 100 μg/ml gentamycyny, 50 μg/ml streptomycyny, 37,5 μg/ml chloramfenikolu, i 200 μg/ml cefotaksymu (patrz tabela materiałów).
  2. Probówkę zawierającą nicienie inkubować w roztworze antybiotyku i SDS na nutatorze w temperaturze pokojowej przez noc.
    UWAGA: Wszystkie robaki i zarodki inne niż dauer umrą, ale wiele robaków dauer przetrwa ten proces czyszczenia.

4. Usuwanie roztworu antybiotyku i SDS

  1. Obracaj robaki w tubie o masie 1000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Za pomocą sterylnej pipety usunąć supernatant z probówki wirówki, nie naruszając robaków na dnie probówki.
  2. Dodać 10 ml M9 + 0,05% Triton X-100 i odpowiednio dokręcić nakrętkę tubki. Inkubować probówkę na nutatorze przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Wyjmij probówkę z nutatora i obracaj ślimaki w tempie 1000 x g przez 1 minutę. Wykonaj i powtórz kroki 4.2-4.3 trzy razy.
  4. Po ostatnim umyciu pozostawić osad robaka w spokoju na dnie w 100 μl roztworu, a resztę wyrzucić.

5. Rozmnażanie czystego szczepu nicieni

  1. Za pomocą sterylnej szklanej pipety przenieś 100 μl supernatantu i osadu na środek 10 cm płytki NGM wysianej OP50-1. Pozostaw płytkę do wyschnięcia, nie naruszając płynu w środku.
  2. Pozwól dauers wyczołgać się ze środka i przejść przez trawnik OP50-1 przez 5-10 minut.
  3. Ostrożnie podnieś jeden dauer i wyłóż go na 6-centymetrowy talerz z nasionami NGM. W sumie należy zebrać co najmniej 10 talerzy i umieścić je w pojedynczych 6 cm talerzach NGM wysianych OP50-1 (łącznie 10 talerzy).
  4. Inkubować płytki przez 4-5 dni w temperaturze 20 °C, aż do momentu, gdy dauery wyrosną, a następne pokolenie (F1) osiągnie stadium dorosłe. Sprawdź wzrokowo, czy na wszystkich płytkach nie ma zanieczyszczeń, które są widoczne jako rozwój drobnoustrojów innych niż OP50-1.
  5. Dla każdej czystej płytki sprawdź propagację interesującego drobnoustroju za pomocą mikroskopii normarskiej lub fluorescencyjnej, takiej jak fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH)12, w zależności od fenotypu będącego przedmiotem zainteresowania.

6. Sekcja jelit i identyfikacja gatunków drobnoustrojów metodą PCR

  1. Hoduj zwierzęta w temperaturze 20 °C przez 3-4 dni, aby mogły umrzeć z głodu i zmniejszyć ilość bakterii OP50-1. Dodaj 5 ml pożywki M9 do płytki z wygłodzonymi robakami.
  2. Za pomocą sterylnej szklanej pipety i gruszki odpipetuj robaki M9 + z płytki i przenieś je do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
  3. Za pomocą wirówki klinicznej odwirowywać robaki w probówce o wielkości 1000 x g przez 30 s w temperaturze pokojowej.
  4. Za pomocą sterylnej pipety o pojemności 15 ml usunąć supernatant z probówki wirówkowej, nie naruszając żywych robaków na dnie probówki.
  5. Dodaj 10 ml M9 + 0,05% Triton X-100 i inkubuj probówkę na nutatorze przez 20 minut, aby usunąć zewnętrzne drobnoustroje. Powtórz cztery razy, aby umyć robaki.
  6. Po ostatnim przemyciu, za pomocą sterylnej końcówki pipety, usunąć supernatant w 100 μl roztworu, nie naruszając osadu znajdującego się na dnie.
  7. Używając sterylnej końcówki pipety, przenieś M9 i robaki na niewysiewaną płytkę NGM i pozwól jej wyschnąć, podczas gdy robaki pełzają przez 20 minut, aby pomóc usunąć OP50-1 z naskórka i jelita.
  8. Dodać 250 μl M9 do wysuszonej płytki i za pomocą szklanej pipety przenieść robaki M9 + na nową płytkę NGM bez nasion. Ponownie pozwól tej płytce wyschnąć i pozwól robakom pełzać przez 20 minut.
  9. Dodaj 250 μl M9 do płytki i przenieś 100 μl robaków M9 + do czystego szkiełka zegarka.
  10. Używając dwóch sterylnych igieł strzykawkowych 26 G, odetnij nicienie, przytrzymując robaka jedną igłą i używając drugiej igły do przecięcia robaka. Po dekapitacji jelito (ziarniste) i gonada (przezroczysta) z organizmu w naturalny sposób wyjdą z organizmu.
  11. Odetnij kawałek odsłoniętego jelita, przytrzymując jedyno jedną igłą i przecinając je drugą.
    UWAGA: Jeśli to możliwe, sprawdź, czy interesujący nas mikrob jest nadal obecny w jelitach za pomocą mikroskopii Normarski, FISH lub immunohistochemistry23.
  12. Przenieś pojedyncze wycięte jelito do probówki PCR o pojemności 0,5 ml zawierającej 10 μl sterylnej wody. Powtórzyć tę czynność dla łącznie co najmniej 5 probówek PCR zawierających jelita różnych zwierząt.
  13. Zamrażać probówki do PCR w temperaturze -80 °C przez co najmniej 5 minut. Wyjmij probówki do PCR z zamrażarki i rozmrozić próbki.
  14. Odpipetuj płyn kilka razy w górę i w dół, aby oddzielić bakterie od jelita.
  15. Przeprowadź PCR przy użyciu uniwersalnych par starterów przeciwko sekwencji DNA małej podjednostki rybosomalnej bakterii, drożdży lub mikrosporydiów, w zależności od podejrzanego typu drobnoustroju.
    UWAGA: Na przykład przykładowy protokół z użyciem uniwersalnych bakteryjnych starterów 16S przedstawiono w tabeli 1.
  16. Oczyść amplikon za pomocą zestawu do czyszczenia i zagęszczania DNA na bazie filtra (patrz tabela materiałów) i wykonaj sekwencjonowanie Sangera.

Wyniki

Dziki szczep C. tropicalis (JU1848) został wyizolowany z zgniłych owoców palmy w lesie Nouragues w Gujanie Francuskiej (Rycyna 1A)24. Stwierdzono, że szczep ten posiada cienkie drobnoustroje, które kolonizują światło jelita w sposób kierunkowy (Rycina 1B). Drobnoustrój ten był łatwo przenoszony na szczep C. elegans N2 via współhodowla ze szczepem JU1848, gdzie w podobny sposób kolonizował światło jelita.

Propagowanie szczepu JU1848 na standardowych płytkach NGM zaszczepionych E. coli OP50-1 przez wiele pokoleń nieustannie prowadziło do widocznej kontaminacji, przejawiającej się w postaci różnych ciemnych, śluzowatych kolonii pojawiających się na trawniku OP50-1 (Rysunek 2A). Płytkę z dzikim szczepem JU1848 poddano głodzeniu, aby wymusić przejście zwierząt w stan dauer, a następnie oczyszczono zgodnie z opisem. Pojedyncze osobniki w stadium dauer, które przeżyły oczyszczanie, przeniesiono na indywidualne płytki NGM o średnicy 6 cm zaszczepione OP50-1 i pozostawiono do wzrostu na 4 dni w temperaturze 20 °C. Na wielu płytkach z potomstwem F1 nie zaobserwowano widocznej kontaminacji mikrobiologicznej (Rysunek 2B). Potwierdzono, że potomstwo F1 nadal posiada bakterie przylegające do światła jelita (patrz poniżej).

Czyste zwierzęta JU1848 przemyto i zdekapitowano w celu wyizolowania fragmentów jelit zgodnie z opisem w protokole (kroki 6.1-6.12). Zweryfikowano obecność bakterii przylegających do światła wypreparowanego jelita za pośrednictwem mikroskopia nomarska (Rycina 3). Podejrzewano, że drobnoustrój w świetle jelita JU1848 jest bakterią, dlatego wypreparowane jelita wykorzystano jako matrycę do reakcji PCR z użyciem uniwersalnych bakteryjnych starterów 16S, 27F oraz 1492R. Produkty PCR z łącznie sześciu indywidualnie wypreparowanych jelit poddano sekwencjonowaniu poprzez metodą Sangera, a czyste chromatogramy wykazały, że wszystkie sześć sekwencji było identycznych. Na podstawie tych sekwencji bakterię tę zidentyfikowano jako nowy gatunek w klasie Alphaproteobacteria, którego nie można było przypisać do żadnego znanego rzędu ani rodzaju (Plik uzupełniający 1).

Proces rozkładu owocu kawowca i anatomia; obraz mikroskopowy przekroju poprzecznego owocu z etykietami.
Rycina 1: Bakterie przylegające kolonizujące światło dzikiego C. tropicalis. (A) Zdjęcie próbki terenowej zgniłych owoców palmy Euterpe sp. (rodzina: Arecaceae) w lesie Nouragues w Gujanie Francuskiej. (B) Obraz mikroskopii Nomarskiego szczepu JU1848, na którym widoczne są tysiące długich, cienkich bakterii tworzących strukturę przypominającą pędzel w świetle (lu) jelita gospodarza (in). Warstwy bakterii (ba) pokrywające jelito są zaznaczone nawiasami ([). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Obraz mikroskopowy wzrostu grzybów (A) w porównaniu z kontrolą (B) dla badania mikrobiologicznego w eksperymencie na szalce Petriego.
Rycina 2: Zanieczyszczający wzrost mikrobiologiczny znika po oczyszczaniu nematod. (A) Dziki szczep JU1848 wykazuje zauważalny wzrost mikrobiologiczny na standardowych szalkach NGM o średnicy 6 cm zaszczepionych bakteriami E. coli OP50-1. (B) Po oczyszczeniu szalka z potomstwem F1 z jednego dauer nie wykazuje widocznego zanieczyszczenia mikrobiologicznego po 4 dniach inkubacji w 20 °C. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Obraz mikroskopowy morfologii komórkowej, wyróżniający struktury wewnątrzkomórkowe do analizy biologicznej.
Rysunek 3: Bakterie przylegające widoczne w świetle rozciętego jelita. Obraz z kontrastowym mikroskopem Nomarskiego przedstawiający czyste zwierzę JU1848 po dekapitacji, co spowodowało wypadnięcie jelit. Bakterie kolonizujące (ba) są zaznaczone nawiasem ([) i widoczne w świetle (lu) fragmentu jelita (in) znajdującego się poza ciałem nicienia (nb). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

OdczynnikStężenieIlość
starter 27F (5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)20 mM2.5 µL
starter 1492R (5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)20 mM2.5 µL
Wypreparowane jelito w wodzieNie dotyczy3 µL
bufor do PCR 10x10x5 µL
dNTP10 mM1 µL
Polimeraza Taq5 J/µL0.5 µL
WodaN/A35.5 µL

Tabela 1: Przykładowy protokół PCR z użyciem uniwersalnych starterów bakteryjnych i wypreparowanego jelita.

Plik uzupełniający 1: Wyrównanie MUSCLE sekwencji bakteryjnego 16S rDNA uzyskanych w drodze PCR z sześciu wypreparowanych jelit JU1848. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Protokół ten opisuje izolację i identyfikację drobnoustrojów z dziko izolowanych nicieni Caenorhabditis przy użyciu szeregu procedur czyszczenia. Wiele drobnoustrojów jest związanych z dziko izolowanymi nicieniami, a niektóre z nich mają ekscytujące fenotypy, które można wykorzystać w przyszłych badaniach nad interakcjami gospodarz-mikroorganizm i odpornością wrodzoną. Wiele mikrobiomów hodowlanych i bakterii chorobotwórczych wyizolowano z dzikich nicieni Caenorhabditis przy użyciu standardowych technik wzrostu bakterii in vitro 25,26. Jednak nie wszystkie drobnoustroje można hodować in vitro i konieczne staje się wzbogacenie ich w dzikie nicienie. Niektóre drobnoustroje mają odporne stadium przetrwalnikowe, takie jak mikrosporydia, a wysokie stężenia SDS mogą być używane do zabijania większości bakterii i grzybów, co pozwala na specyficzne wzbogacenie zarodników12. Protokół ten przedstawia metodę wzbogacania niehodowlanych drobnoustrojów jelitowych, które nie są oporne na SDS i leczenie antybiotykami.

Przedstawiona tutaj technika wykorzystuje odporność środowiskową obserwowaną u zwierząt dauer ze względu na zmiany fizjologiczne, takie jak wzmocnienie naskórka, tłumienie pompowania gardła i zakrywanie ust zatyczką policzkową27. Krytycznym krokiem w tym protokole jest całonocna inkubacja z różnymi antybiotykami i 0,25% SDS. Ten krok służy do zabicia wszystkich drobnoustrojów zewnętrznych, pozostawiając nienaruszone drobnoustroje wewnętrzne. Podczas gdy wykazano, że C. elegans dauers przeżywa stężenie SDS na poziomie 10% przez 30 minut27, protokół ten wykorzystuje umiarkowaną, ale przedłużoną inkubację, aby nie tylko zabić drobnoustroje, ale także dodatkowo wystawić bakterie na działanie antybiotyków. Co więcej, umiarkowane stężenie SDS może pomóc w zapewnieniu przetrwania dauerów z innych gatunków Caenorhabditis , ponieważ narażenie C. tropicalis na 1% SDS w ciągu nocy spowodowało śmierć wszystkich zwierząt dauer. Jeśli wszystkie dauery umrą, należy zmniejszyć stężenie SDS i/lub czas ekspozycji na SDS. I odwrotnie, jeśli płytki generacji F1 nadal mają widoczne zanieczyszczenia po oczyszczeniu, należy zwiększyć stężenie SDS i czas inkubacji.

Kolejnym krytycznym krokiem jest izolacja pojedynczych zwierząt dauer po oczyszczeniu. Ten krok jest kluczowy, ponieważ nie wszystkie zwierzęta są czyste po SDS i antybiotykoterapii. Dlatego zwierzęta umieszcza się na środku 10-centymetrowej płyty NGM z OP50-1 i pozwala im czołgać się promieniście na zewnątrz. Często najlepiej jest wybrać bardziej dystalne zwierzęta, ponieważ dłuższe czołganie się przez OP50-1 wydaje się pomagać w usuwaniu wszelkich potencjalnych ocalałych drobnoustrojów przyczepionych do naskórka. Prowadzi to jednak do ograniczenia protokołu, ponieważ trudniej będzie wzbogacić go dla interesującego drobnoustroju, jeśli nie występuje on w populacji z dużą częstotliwością. Tutaj przylegające Alphaproteobacteria były obecne u 90%-95% populacji; Dlatego większość czystych płytek zawierała bakterię mikrobiomu. Jeśli jednak interesujący nas mikroorganizm jest obecny w populacji ze znacznie mniejszą częstotliwością, może być konieczne przeprowadzenie badań przesiewowych znacznie większej liczby płytekF1 .

Protokół ten może być prawdopodobnie wykorzystany do wyizolowania dowolnej liczby nienadających się do hodowli drobnoustrojów, które można znaleźć w dzikich nicieniach. Jednak mikrob musi znajdować się w tkance chronionej przez naskórek dauer, zdolny do przetrwania u zwierząt dauer i mieć obserwowalny fenotyp u gospodarza. W związku z tym technika ta może być stosowana do wzbogacania innych bakterii mikrobiomu w świetle jelita oprócz opisanych tutaj gatunków Alphaproteobacteria, w tym bakterii, które nie przylegają. Protokół został również wykorzystany do wzbogacenia fakultatywnej bakterii wewnątrzkomórkowej, Bordetella atropi, która infekuje nicienie Oscheius tipulae28. Po wzbogaceniu stwierdzono, że B. atropi tworzy kolonie na płytkach NGM, co pokazuje, że interesujący mikroorganizm może zostać odkryty jako nadający się do hodowli in vitro po usunięciu szybciej rosnących zanieczyszczeń. Ta technika prawdopodobnie zadziałałaby w przypadku mikrosproidianów i wirusów, w tym wirusa Orsay, biorąc pod uwagę tę zdolność do wzbogacania bakterii wewnątrzkomórkowych. Jednak mikroorganizmy te muszą być w stanie przetrwać przejście do i z dauer.

Należy pamiętać, że chociaż protokół ten można wykonać w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 1, przez cały czas należy zachować sterylną technikę, aby zapobiec dalszemu skażeniu mikrobiologicznemu. Protokół może być zmieniany w zależności od potrzeb badacza, w tym rodzajów/stężeń antybiotyków, procentowej zawartości SDS i/lub dodatku leków przeciwgrzybiczych, takich jak nystatyna. Często liczba zanieczyszczających drobnoustrojów znajdujących się w dziko izolowanych nicieniach może się znacznie różnić. W tym przypadku widoczna utrata wzrostu E. coli innego niż OP50-1 na płytkach NGM została wykorzystana jako odczyt dla czystego szczepu nicieni. Mogą jednak istnieć populacje zanieczyszczających mikroorganizmów, które nie nadają się do hodowli, dlatego konieczne jest przeprowadzenie metody metagenomicznej, takiej jak sekwencjonowanie amplikonów 16S rRNA, aby zobaczyć zakres zanieczyszczenia26. Po oczyszczeniu szczepu robaka można go zamrozić i przechowywać do przyszłych badań. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten pozwala naukowcom wzbogacić niezdolne do hodowli drobnoustroje w dzikich nicieniach, umożliwiając im badanie wpływu na sprawność gospodarza, scharakteryzowanie fenotypów kolonizacji lub infekcji oraz wykorzystanie narzędzi genetycznych w celu zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw interakcji gospodarz-mikroorganizm.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękuję Dr. Christianowi Braendle i Stacji Polowej Centre Nationale de la Recherche Scientifique (CNRS) Nouragues Field.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AgaroseFisher ScientificBP1356
10% SDSIgła InvitrogenAM9822
BD PrecisionGlide - 26 gFisher Scientific305115
CarbenicillinMillipore-SigmaC1389-1G
CefotaksymMillipore-SigmaC7039-500mg
ChloramfenikolZestaw do czyszczenia i koncentratora DNA Millipore-SigmaC0378-25G
Zymo Research11-303C
DreamTaq PolimerazaFisher ScientificEP0711
GentamycynaMillipore-SigmaG1264-250mg
KanamycynaMillipore-SigmaK1876-1G
KH2PO4Fisher ScientificP-286
NaClFisher ScientificS-671
NH4ClFisher ScientificA-661
StreptomycynaMillipore-SigmaS6501-50G
TetracyklinaMillipore-SigmaT7660-5G
Triton X-100Fisher ScientificBP-151
Okulary do zegarkówVWR470144-850

Bibliografia

  1. Balla, K. M., Troemel, E. R. Caenorhabditis elegans as a model for intracellular pathogen infection. Cellular Microbiology. 15, 1313-1322 (2013).
  2. Pukkila-Worley, R., Ausubel, F. M. Immune defense mechanisms in the Caenorhabditis elegans intestinal epithelium. Current Opinion in Immunology. 24, 3-9 (2012).
  3. Bossinger, O., Fukushige, T., Claeys, M., Borgonie, G., McGhee, J. D. The apical disposition of the Caenorhabditis elegans intestinal terminal web is maintained by LET-413. Developmental Biology. 268, 448-456 (2004).
  4. Dimov, I., Maduro, M. F. The C. elegans intestine: organogenesis, digestion, and physiology. Cell and Tissue Research. 377, 383-396 (2019).
  5. Zhang, F., et al. Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research. Frontiers in Microbiology. 8, 485(2017).
  6. Szumowski, S. C., Botts, M. R., Popovich, J. J., Smelkinson, M. G., Troemel, E. R. The small GTPase RAB-11 directs polarized exocytosis of the intracellular pathogen N. parisii for fecal-oral transmission from C. elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 8215-8220 (2014).
  7. Bakowski, M. A., et al. Ubiquitin-mediated response to microsporidia and virus infection in C. elegans. PLoS Pathogens. 10, 1004200(2014).
  8. Sowa, J. N., et al. The Caenorhabditis elegans RIG-I Homolog DRH-1 Mediates the Intracellular Pathogen Response upon Viral Infection. Journal of Virology. 94, 01173(2020).
  9. Zugasti, O., et al. Activation of a G protein-coupled receptor by its endogenous ligand triggers the innate immune response of Caenorhabditis elegans. Nature Immunology. 15, 833-838 (2014).
  10. Félix, M. -A., Duveau, F. Population dynamics and habitat sharing of natural populations of Caenorhabditis elegans and C. briggsae. BMC Biology. 10, 59(2012).
  11. Lee, D., et al. Balancing selection maintains hyper-divergent haplotypes in Caenorhabditis elegans. Nature Ecology and Evolution. 5, 794-807 (2021).
  12. Luallen, R. J., et al. Discovery of a natural microsporidian pathogen with a broad tissue tropism in Caenorhabditis elegans. PLOS Pathogens. 12, 1005724(2016).
  13. Osman, G. A., et al. Natural infection of C. elegans by an oomycete reveals a new pathogen-specific immune response. Current Biology. 28, 640-648 (2018).
  14. Felix, M. A., et al. Natural and experimental infection of Caenorhabditis nematodes by novel viruses related to nodaviruses. PLoS Biology. 9, 1000586(2011).
  15. Zhang, G., et al. A large collection of novel nematode-infecting microsporidia and their diverse interactions with Caenorhabditis elegans and other related nematodes. PLoS Pathogens. 12, 1006093(2016).
  16. Félix, M. -A., Wang, D. Natural viruses of Caenorhabditis nematodes. Annual Review Genetics. 53, 313-326 (2019).
  17. Grover, M., Barkoulas, M. C. elegans as a new tractable host to study infections by animal pathogenic oomycetes. PLoS Pathogens. 17, 1009316(2021).
  18. Bakowski, M. A., Luallen, R. J., Troemel, E. R. Microsporidia Infections in Caenorhabditis Elegans and Other Nematodes. Microsporidia: Pathogens of Opportunity: First Edition. , (2014).
  19. Taffoni, C., Pujol, N. Mechanisms of innate immunity in C. elegans epidermis. Tissue Barriers. 3, 1078432(2015).
  20. Dirksen, P., et al. CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3: Genes, Genomes, Genetics. 10, 3025-3039 (2020).
  21. Frézal, L., Félix, M. -A. C. elegans outside the Petri dish. eLife. 4, 05849(2015).
  22. Troemel, E. R., Félix, M. -A., Whiteman, N. K., Barrière, A., Ausubel, F. M. Microsporidia are natural intracellular parasites of the nematode Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 6, 2736-2752 (2008).
  23. Luallen, R. J., Bakowski, M. A., Troemel, E. R. Characterization of microsporidia-induced developmental arrest and a transmembrane leucine-rich repeat protein in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 10, 0124065(2015).
  24. Félix, M. -A., et al. Species richness, distribution and genetic diversity of Caenorhabditis nematodes in a remote tropical rainforest. BMC Evolutionary Biology. 13, 10(2013).
  25. Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Félix, M. -A., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 3941-3949 (2016).
  26. Berg, M., et al. Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments. ISME Journal. 10, 1998-2009 (2016).
  27. Androwski, R. J., Flatt, K. M., Schroeder, N. E. Phenotypic plasticity and remodeling in the stress-induced C. elegans dauer. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 6, 278(2017).
  28. Tran, T. D., Ali, M. A., Lee, D., Félix, M. -A., Luallen, R. J. Bacterial filamentation is an in vivo mechanism for cell-to-cell spreading. bioRxiv. , (2021).

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

stadium dauerwzbogacanie mikroorganizmówoddziaływania między gospodarzem a mikroorganizmamiprzemywanie antybiotykamiprzemywanie detergentamisekcja nicienifenotypy kolonizacjimikroskopia fluorescencyjna
Selektywne czyszczenie dzikich nicieni Caenorhabditis w celu wzbogacenia o bakterie mikrobiomu jelitowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.