Artykuł metodologiczny

DUCT: Podwójny odlew z żywicy, a następnie tomografia mikrokomputerowa do analizy wątroby 3D

3.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62941

⸱

28 września 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Karolinska Institutet, 2Central European Institute of Technology

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Mikrotomografia komputerowa z podwójnym odlewem z żywicy, czyli DUCT, umożliwia wizualizację, digitalizację i segmentację dwóch systemów rurowych jednocześnie, co ułatwia analizę 3D architektury organów. DUCT łączy wstrzyknięcie ex vivo dwóch żywic nieprzepuszczających promieni rentgenowskich, a następnie skanowanie mikrotomografii komputerowej i segmentację danych tomograficznych.

Streszczenie

Wątroba jest największym organem wewnętrznym u ludzi i myszy, a wysoka autofluorescencja stanowi poważne wyzwanie dla oceny trójwymiarowej (3D) architektury narządu na poziomie całego narządu. Architektura wątroby charakteryzuje się wieloma rozgałęzionymi strukturami oświetlonymi, które mogą być wypełnione żywicą, w tym drzewami naczyniowymi i żółciowymi, ustanawiając wysoce stereotypowy wzór w miąższu bogatym w hepatocyty. Protokół ten opisuje proces wykonywania mikrotomografii komputerowej z podwójnym odlewem żywicy lub "DUCT". DUCT polega na wstrzyknięciu do żyły wrotnej i przewodu żółciowego wspólnego za pomocą dwóch różnych żywic syntetycznych nieprzepuszczających promieni rentgenowskich, a następnie utrwaleniu tkanki. Kontrola jakości poprzez oczyszczenie jednego płata lub całej wątroby za pomocą optycznego środka czyszczącego pozwala na wstępne badanie przesiewowe odpowiednio wstrzykniętych próbek. W drugiej części rurociągu DUCT płat lub cała wątroba mogą być wykorzystane do skanowania za pomocą mikrotomografii komputerowej (microCT), (pół)automatycznej segmentacji i renderowania 3D sieci żył wrotnych i dróg żółciowych. Efektem mikrotomografii komputerowej są dane współrzędnych 3D dla dwóch żywic, co pozwala na analizę jakościową i ilościową obu układów oraz ich relacji przestrzennych. DUCT może być stosowany do wątroby myszy po urodzeniu i u dorosłych myszy i może być dalej rozszerzony na inne sieci kanalikowe, na przykład sieci naczyniowe i drogi oddechowe w płucach.

Wprowadzenie

Odlewanie żywicy organowej to technika, której początki sięgają XVII wieku1. Jeden z pierwszych przykładów nowoczesnego odlewania żywicy został wykonany na ludzkiej wątrobie podczas autopsji. Wewnątrzwątrobowe drogi żółciowe wypełniono środkiem kontrastowym zmieszanym z żelatyną, a następnie obrazowano za pomocą tomografii komputerowej RTG2. Celem techniki DUCT jest wizualizacja, digitalizacja i analiza dwóch rurowych sieci odlewanych z żywicy, w tandemie, w 3D.

DUCT opiera się na obszernej istniejącej wiedzy na temat jednosystemowego odlewania żywicy wątrobowej3,4,5,6,7,8 i obejmuje jednoczesną wizualizację 3D i analizę dwóch systemów9. W ramach projektu DUCT udało się przekształcić odlewanie żywicy pojedynczej w podwójne odlewnictwo żywicy, mieszając dwie żywice nieprzepuszczające promieni rentgenowskich o różnym kontraście i wstrzykując te żywice do dwóch różnych sieci, w szczególności do wspólnego przewodu żółciowego i żyły wrotnej. DUCT może być stosowany u młodych myszy po urodzeniu z powtarzalnymi wynikami już w 15. dniu po urodzeniu (P15). W porównaniu z technikami obrazowania opartymi na mikroskopii, główną zaletą jest to, że DUCT jest szybszy, wolny od przeciwciał, a autofluorescencja tkanki wątroby nie zakłóca obrazowania. Ponadto DUCT dostarcza danych ilościowych opisujących stan lumenizacji, średnicę wewnętrzną, łączność sieciową i perfuzję. Rozróżnienie między obecnością komórek tworzących światło a ich de facto morfogenezą w rurki jest niezbędne do analizy narządów, w których obecne są komórki przewodowe, ale nie tworzą jajowodów, jak może to mieć miejsce w przypadku zespołu Alagille'a10. Główną wadą DUCT jest ograniczona penetracja żywicy, która jest lepka i nie dostaje się do rur o małym kalibrze (<5 μm). DUCT może być stosowany do dowolnej struktury rurkowej po określeniu punktu wejścia do iniekcji, takiej jak tętniczy i żylny układ krążenia, drogi oddechowe, pozawątrobowy przewód żółciowy lub naczynia limfatyczne. W ten sposób może ułatwić analizę architektury całych narządów innych tkanek, takich jak płuca i trzustka.

Obrazy segmentowane mikrotomografią komputerową mogą być przetwarzane za pomocą dostępnego na rynku oprogramowania do obrazowania, takiego jak ImageJ, lub specjalnie napisanych potoków (np. MATLAB). Wątroba wstrzyknięta żywicą może być analizowana jakościowo pod kątem rozbudowy sieci i łączności lub ilościowo pod kątem objętości, długości, rozgałęzień, krętości pojedynczego systemu i interakcji między dwoma systemami, takich jak odległość między dwoma systemami lub zależność od punktu rozgałęzienia (czy system 1 rozgałęzia się w pobliżu rozgałęzienia systemu 2?). Rurociąg DUCT obejmujący wstrzykiwanie żywicy, skanowanie mikrotomografią komputerową i segmentację danych TK, w połączeniu ze szczegółową analizą ilościową mechanizmów architektonicznych dwóch systemów rurkowych, może stanowić standard dla analizy całej wątroby w modelach zwierzęcych.

Protokół

Protokół opisany w tym badaniu został zatwierdzony i jest zgodny z zasadami i przepisami dotyczącymi dobrostanu zwierząt Stockholms Norra Djurförsöksetiska nämnd (sztokholmska komisja etyki badań nad zwierzętami). Zwierzęta wykorzystane w tym badaniu były dzikimi lub homozygotycznymi zmutowanymi myszami Jag1H268Q na mieszanym tle C3H/N i C57bl6J. Do badania włączono zarówno mężczyzn, jak i kobiety. Zwierzęta wykorzystano w 15. dniu po urodzeniu lub jako dorosłe osobniki w wieku od 3 do 8 miesięcy.

1. Podwójne iniekcje żywicy

  1. preparat
    1. Przygotuj roztwór żywicy. W przypadku podwójnych iniekcji żywicy należy przygotować zarówno żółtą, jak i zieloną żywicę, jak opisano w krokach 1.1.2-1.1.4.
    2. Przygotuj 1 ml porcji rozcieńczonej żywicy na mysz.
    3. Żółta żywica: Rozcieńczyć żółtą gumę silikonową (wysoka nieprzepuszczalność dla promieni rentgenowskich) przezroczystym rozcieńczalnikiem w rozcieńczeniu 3:1, aby przygotować żółtą żywicę do wstrzykiwań.
    4. Zielona żywica: Wymieszaj niebieską gumę silikonową (niewykrywalna nieprzepuszczalność dla promieni rentgenowskich) z przezroczystym rozcieńczalnikiem w rozcieńczeniu 1:1, aby uzyskać niebieską żywicę. Aby wytworzyć zieloną żywicę, wymieszaj rozcieńczoną niebieską żywicę z rozcieńczoną żółtą żywicą w stosunku 1:1. Dokładnie wymieszaj zieloną żywicę, aż kolor będzie jednorodny.
      UWAGA: Niebieska żywica ma bardzo niską nieprzepuszczalność dla promieni rentgenowskich, która nie jest wykrywalna za pomocą mikrotomografii komputerowej, co wymaga rozcieńczenia żółtą żywicą w celu wytworzenia dwóch żywic o różnej nieprzepuszczalności dla promieni rentgenowskich.
      UWAGA: Żywica może zawierać chromian ołowiu, który jest czynnikiem rakotwórczym. Wytwarza trujące gazy w ogniu. Z żywicą należy obchodzić się ostrożnie i należy ją wyrzucać jako odpady niebezpieczne.
    5. Przygotować dwa zestawy do wstrzykiwań (zestaw do wstrzykiwań #1 i zestaw do wstrzykiwań #2) z rurką zgodnie z opisem w punktach 1.1.6-1.1.11.
      UWAGA: W przypadku dorosłych myszy (>P30 (30. dzień po urodzeniu) = P30 - 2 lata) należy użyć zestawu iniekcyjnego #1 (rurka PE10 o średnicy zewnętrznej 0,6 mm) do iniekcji do wspólnego przewodu żółciowego i zestawu iniekcyjnego #2 (rurka PE50 o średnicy zewnętrznej 0,96 mm) do iniekcji żyły wrotnej. Dla młodych myszy po urodzeniu (do P30) przygotuj dwa zestawy do wstrzykiwań #1, jeden do przewodu żółciowego i jeden do wstrzykiwania do żyły wrotnej (brak zestawu do wstrzykiwań #2, ponieważ żyła wrotna jest zbyt wąska, aby pomieścić rurkę PE50).
    6. Aby przygotować zestaw iniekcyjny #1, odetnij 30 cm rurki PE10 i rozciągnij jeden koniec rurki ręcznie, ciągnąc ją, aż stanie się tak cienka, jak to możliwe (Rysunek 1A,B, średnica około 0,15 mm, nierozciągnięta rurka PE10 ma średnicę 0,6 mm).
    7. Przyciąć końcówkę rozciągniętej rurki PE10 po przekątnej, aby utworzyć skośną końcówkę (Rysunek 1B).
    8. Podłącz nierozciągnięty koniec rurki PE10 do igły 30 G (Rysunek 1A, zestaw do wstrzykiwań #1).
    9. Aby przygotować zestaw iniekcyjny #2, odetnij 30 cm rurki PE50 i rozciągnij jeden koniec rurki ręcznie, ciągnąc ją, aż stanie się wystarczająco cienka, aby zmieścić się w żyle wrotnej (Rysunek 1A,B, około 0,7 mm, nierozciągnięta rurka PE50 ma średnicę 0,96 mm).
    10. Przytnij końcówkę rozciągniętej rurki PE50 po przekątnej, aby utworzyć skośną końcówkę (Rysunek 1B).
    11. Podłącz nierozciągnięty koniec rurki PE50 do igły 23 G (Rysunek 1A, zestaw do wstrzykiwań #2).
      UWAGA: Każdy zestaw do wstrzykiwań może być użyty tylko do jednego wstrzyknięcia, ponieważ żywica stwardnieje w strzykawce i rurce. Dostosuj rozmiar rozciągniętej i ściętej końcówki w oparciu o rozmiar wspólnego przewodu żółciowego i żyły wrotnej myszy, w zależności od jej wieku, genotypu i fenotypu. Jeśli nie masz pewności co do rozmiaru i dopasowania rurki, włóż rurkę do odpowiedniego kanału lub naczynia po nacięciu i przed wypełnieniem rurki żywicą. Jeśli rurka jest zbyt szeroka, aby zmieścić się w kanale/naczyniu, rozciągnij ją dalej.
    12. Znieczulić zwierzę przez inhalację izofluranu (pierwsze 4% w komorze indukcyjnej i ~2% za pomocą stożka nosowego).
    13. Umieść mysz na wentylowanej ławce na podkładce preparacyjnej, podczas gdy mysz oddycha izofluranem przez stożek nosowy. Sprawdzić, czy zwierzę jest nieprzytomne za pomocą metody zalecanej przez instytut/IRB, np. poprzez uszczypnięcie jednej z łap.
      UWAGA: Izofluran może powodować senność lub zawroty głowy po inhalacji oraz może powodować uszkodzenie układu sercowo-naczyniowego i ośrodkowego układu nerwowego poprzez długotrwałe lub powtarzające się narażenie. Nie wdychaj go. Z substancją należy obchodzić się na wentylowanej ławce i w dobrze wentylowanych pomieszczeniach.
      UWAGA: Możliwe jest zastosowanie innej metody znieczulania, o ile jest ona zgodna z perfuzją serca.
    14. Gdy zwierzę straci przytomność, spryskaj stronę brzuszną 70% etanolem, aby zapobiec ingerencji sierści.
    15. Za pomocą nożyczek do skóry przetnij skórę, powięź i warstwę mięśni, zaczynając od linii środkowej jamy brzusznej i przetnij do jamy piersiowej, aby odsłonić narządy wewnętrzne.
    16. Chwyć wyrostek mieczykowaty kleszczami, aby podnieść mostek i przeciąć przeponę i klatkę piersiową po obu stronach, aby odsłonić serce i płuca.
    17. Zdejmij klatkę żebrową, przecinając nożyczkami żebra po lewej i prawej stronie klatki piersiowej. Zachowaj szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić wątroby, ponieważ spowoduje to wyciek żywicy.
    18. Za pomocą prostych kleszczy pociągnij serce w kierunku wątroby i odetnij prawy przedsionek.
    19. Wprowadzić igłę motylkową (23 G), podłączoną do perfuzyjnej pompy perystaltycznej, do lewej komory. Przeprowadzić perfuzję myszy przezskórnie zrównoważonym roztworem soli Hanksa (HBSS) i heparyną (1 U/g masy ciała myszy). Utylizuj przez 3 minuty z szybkością perfuzji 5 ml/min.
      UWAGA: Jeśli mysz jest prawidłowo ukrwiona, narządy wewnętrzne staną się blade, zwłaszcza wątroba. Jeśli zamiast tego płuca stają się białe, igła jest wprowadzana do prawej komory i powinna zostać przestawiona. Po perfuzji mysz ulega wykrwawieniu i można ją usunąć ze stożka nosowego i izofluranu.
    20. Wyłączyć pompę izofluranu.
  2. Iniekcja żywicy - odlewanie żywicy układu żółciowego
    1. Przesuń mysz do mikroskopu preparacyjnego, brzuch do góry, ogon w kierunku eksperymentatora i odsuń się od eksperymentatora. Interesujące nas anatomiczne punkty orientacyjne są przedstawione na rysunku Rysunek 2A.
    2. Zlokalizuj żyłę główną dolną (Rysunek 2A), przesuwając jelito na bok. Użyj nożyczek sprężynowych, aby wykonać małe poprzeczne nacięcie w żyle głównej dolnej, aby umożliwić uwolnienie ciśnienia naczyniowego w wątrobie (Rysunek 2Bi).
    3. Odsłonić wspólny przewód żółciowy i żyłę wrotną zgodnie z opisem w krokach 1.2.4-1.2.6.
    4. Przesuń jelito i trzustkę na prawą stronę (eksperymentatora) za pomocą wacika zwilżonego roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS).
    5. Odwróć brzuszną stronę wątroby w kierunku serca za pomocą bawełnianego wacika nasączonego PBS, aby odsłonić powierzchnię trzewną i obszar wnęki.
    6. Zlokalizuj wspólny przewód żółciowy, który biegnie od okolicy wnęki przez trzustkę i do jelita przy zwieraczu Oddiego (Ryc. 2Bii, wspólny przewód żółciowy obrysowany żółtą przerywaną linią, czarne groty strzałek wskazują na zwieracz Oddi).
      UWAGA: Upewnij się, że wątroba jest wilgotna przez cały zabieg, posypując ją PBS.
    7. Oczyść otaczającą tkankę (obszar ~ 5 mm) ze wspólnego przewodu żółciowego za pomocą prostych kleszczy. Umieść jedwabną nić do szycia (rozmiar 4-0, 0,17 mm, długość 3 - 5 cm) pod wspólnym przewodzie żółciowym (Ryc. 2Bii) i zawiąż luźny węzeł wokół wspólnego przewodu żółciowego (Rysunek 2Biii).
      UWAGA: Wybierz obszar węzła w połowie drogi między obszarem wnęki a zwieraczem Oddiego oraz w pewnej odległości od żyły wrotnej, tak aby po zaciśnięciu szwu wokół przewodu żółciowego wspólnego nie przeszkadzał w iniekcji żyły wrotnej.
    8. Przytrzymaj nożyczki sprężynowe płasko przy wspólnym przewodzie żółciowym, aby wykonać ukośne nacięcie wspólnego przewodu żółciowego w miejscu, w którym wspólny przewód żółciowy wchodzi do trzustki i jelita obok zwieracza Oddi. (Rysunek 2Biv), żółta przerywana linia obrysowuje zwieracz obszaru Oddiego, podkreślona czarnymi grotami strzałek).
      UWAGA: Jest to kluczowy krok. Wykonaj ukośne, a nie poprzeczne cięcie i wykonaj nacięcie; Nie przecinaj przewodu żółciowego. Przecięcie całego przewodu żółciowego sprawia, że wprowadzenie rurki jest bardzo trudne.
    9. Tuż przed użyciem zmieszać 1 ml żółtej żywicy z 50 μl utwardzacza (napełniając i opróżniając strzykawkę o pojemności 1 ml) i napełnić strzykawkę Luer o pojemności 1 ml mieszaniną żywicy i utwardzacza.
    10. Połączyć napełnioną strzykawkę z rurką (zestaw #1). Nacisnąć tłok, aby całkowicie napełnić rurkę. Upewnij się, że mieszanina żywicy i utwardzacza kapie z końcówki rurki.
      UWAGA: Unikaj i usuwaj pęcherzyki powietrza ze strzykawki i rurki, aby uzyskać najlepsze wyniki.
    11. Za pomocą kleszczy wyprostuj obszar wokół nacięcia wspólnego przewodu żółciowego i włóż rurkę do otworu we wspólnym przewodzie żółciowym (Rysunek 2Bv), przy czym najdłuższą krawędzią skośnej końcówki skieruj się w dół w kierunku grzbietowej strony przewodu żółciowego. Ta orientacja zapewnia, że żywica może wydostać się z otworu rury, który jest skierowany do góry, do kanału (Rysunek 2Bv).
    12. Zaciśnij węzeł jedwabnej nici, aby zabezpieczyć rurkę wewnątrz wspólnego przewodu żółciowego (Rysunek 2Bvi).
    13. Wstrzyknąć żywicę do wspólnego przewodu żółciowego. Obserwuj woreczek żółciowy i poszczególne płaty wątroby.
    14. Masuj wątrobę bawełnianym wacikiem zwilżonym PBS, aby równomiernie rozprowadzić żywicę. Końcowe odgałęzienia dróg żółciowych wypełnionych żywicą (u myszy typu dzikiego) są słabo widoczne na powierzchni wątroby.
      UWAGA: Przewidywany czas napełnienia wątroby to 30 -100 s.
    15. Przestań wstrzykiwać żywicę, gdy kropki żywicy pojawią się na powierzchni wątroby (Rysunek 2Ci, niebieskie groty strzałek) lub gdy napotkany jest opór.
      UWAGA: Pracuj tak szybko, jak to możliwe, ponieważ żywica zaczyna twardnieć po dodaniu utwardzacza żywicy. Czas pracy od dodania utwardzacza wynosi około 15 min.
    16. Usuń rurkę, wyciągając ją ze wspólnego przewodu żółciowego i szybko zaciśnij jedwabny węzeł za pomocą kleszczy, aby zapobiec wyciekaniu żywicy. Odetnij luźne końce jedwabnego szwu, aby nie przeszkadzały w wstrzyknięciu żyły wrotnej.
    17. Rurkę zawierającą żywicę i pozostałą żywicę należy wyrzucić do odpadów niebezpiecznych, a igłę do odpadów po ostrych narzędziach.
  3. Iniekcja żywicy - odlewanie żywicy żyły wrotnej
    1. Oczyść żyłę wrotną (obszar ~5 mm) z otaczającej ją tkanki około 2 cm od jej wejścia do wątroby za pomocą prostych kleszczy. Umieść jedwabną nić do szycia (rozmiar 4-0, 0,17 mm, długość 3 - 5 cm) pod oczyszczonym obszarem żyły wrotnej (Ryc. 2Ci) i zawiąż luźny węzeł od góry (Ryc. 2Cii).
    2. Wykonaj podłużne nacięcie w żyle wrotnej dystalnie do wątroby i węzła (Ryc. 2Ciii).
    3. Zmieszać 1 ml zielonej żywicy z 50 μl utwardzacza (napełniając i opróżniając strzykawkę o pojemności 1 ml) i napełnić strzykawkę Luer o pojemności 1 ml mieszaniną utwardzacza żywicy i utwardzacza.
    4. Połącz napełnioną strzykawkę z rurką (zestaw #2 dla myszy >P30, nowy zestaw #1 dla myszy UWAGA: Unikaj i usuwaj pęcherzyki powietrza ze strzykawki i rurki, aby uzyskać najlepsze wyniki.
    5. Za pomocą kleszczy wyprostuj żyłę wrotną, ciągnąc otaczającą tkankę w kierunku eksperymentatora i włóż rurkę najdłuższą krawędzią ściętej końcówki w kierunku grzbietowej strony naczynia (Rysunek 2Ciii).
    6. Dokręć jedwabną nić, aby zabezpieczyć rurkę w żyle wrotnej.
    7. Wstrzyknąć żywicę do żyły wrotnej. Obserwuj, jak naczynia krwionośne wypełniają się żywicą. Masuj wątrobę bawełnianym wacikiem zwilżonym PBS, aby równomiernie rozprowadzić żywicę (Rysunek 2Civ).
    8. Należy przerwać wstrzykiwanie żywicy, gdy wszystkie naczynia krwionośne są wypełnione (końce żył wrotnych są widoczne na obrzeżach wątroby) lub gdy napotkany jest opór.
      UWAGA: Pracuj szybko, ponieważ żywica zaczyna twardnieć po dodaniu utwardzacza. Czas pracy od dodania utwardzacza wynosi około 15 min dla zestawu iniekcyjnego #1 i 25 min dla zestawu iniekcyjnego #2.
    9. Usuń rurkę, wyciągając rurkę z żyły wrotnej i szybko zaciśnij jedwabny węzeł za pomocą kleszczy, aby zapobiec wyciekaniu żywicy.
    10. Rurkę zawierającą żywicę i pozostałą żywicę należy wyrzucić do odpadów niebezpiecznych, a igłę do odpadów po ostrych narzędziach.
  4. Rozwarstwienie i unieruchomienie wątroby
    1. Wypreparuj całą wątrobę, odcinając ją od otaczającej tkanki i przepony.
    2. Delikatnie umieść całą wątrobę w pustej stożkowej probówce o pojemności 50 ml, stroną brzuszną skierowaną do góry, a stroną grzbietową spoczywającą na ścianie rurki stożkowej, aby zapobiec deformacji wątroby. Rurkę stożkową należy przechowywać przez noc poziomo w temperaturze 4 °C, aby żywica całkowicie stwardniała.
      UWAGA: Zamiast stożkowej rurki o pojemności 50 ml można użyć dowolnego pojemnika, który jest wystarczająco duży, aby zmieścić się w wątrobie. Używanie pojemnika z płaskim dnem zwiększy prawdopodobieństwo, że wątroba nie jest zdeformowana.
    3. Podziel wątrobę na poszczególne płaty. Dokonaj wyboru płatów, które będą używane do analizy mikrotomografii komputerowej (1.4.4-1.4.5) lub kontroli jakości (1.4.6-1.4.8). Opcjonalnie można użyć całej wątroby zarówno do oczyszczania optycznego, jak i mikrotomografii komputerowej, bez dzielenia jej na poszczególne płaty.
      UWAGA: Architektura wątroby w układzie żółciowym i naczyniowym jest różna w każdym płacie, dlatego wymagane są analizy dopasowanych płatów. Czyszczenie optyczne nie zakłóca skanowania mikrotomografią komputerową, a płat (płaty) używany do kontroli jakości może być następnie skanowany za pomocą mikrotomografii komputerowej. I odwrotnie, próbki zeskanowane za pomocą mikrotomografii komputerowej mogą być następnie oczyszczone optycznie w celu porównania. Dzięki temu możliwa jest cała analiza wątroby. U myszy typu dzikiego (tło genetyczne C3H/C57bl6) prawy płat przyśrodkowy jest najpierw wypełniany przez wstrzyknięcia żywicy, co czyni go odpowiednim płatem do analizy mikrotomografii komputerowej, o najwyższej odtwarzalności. Lewy płat boczny jest największym płatem, w związku z czym łatwo jest wstępnie przebadać jakość wtrysku. Wybór płata (lub całej wątroby) wykorzystywanego do kontroli jakości i skanowania mikrotomografią komputerową zależy od modelu zwierzęcego i pytania badawczego.
    4. W wentylowanym kapturze przygotuj 4% roztwór formaldehydu (10 -20 ml na probówkę). Utrwalić płatki używane do mikrotomografii komputerowej za pomocą 4% formaldehydu przez noc w temperaturze 4 °C, a następnie przemyć raz PBS (10 -20 ml na probówkę).
    5. Odpady formaldehydu należy zebrać w osobnym pojemniku. Płaty wątroby należy przechowywać w PBS w temperaturze 4 °C do krótkotrwałego przechowywania lub 70% etanolu do długotrwałego przechowywania. Przejdź do sekcji 2: Mikrotomografia komputerowa.
      UWAGA: Formaldehyd powoduje ostrą toksyczność w przypadku połknięcia, wdychania lub kontaktu ze skórą. Formaldehyd jest łatwopalną cieczą i parą. Powoduje poważne oparzenia skóry i uszkodzenia oczu. Może powodować reakcję alergiczną skóry. Śmiertelne w przypadku wdychania (stężonego lub w proszku). Może powodować podrażnienie dróg oddechowych. Podejrzewa się, że powoduje wady genetyczne. Może powodować raka. Powoduje uszkodzenie narządów (oczu, ośrodkowego układu nerwowego). Zwroty wskazujące środki ostrożności - przechowywać z dala od źródeł ciepła, gorących powierzchni, iskier, otwartego ognia i innych źródeł zapłonu. Zakaz palenia. Nosić rękawice ochronne i odzież ochronną. W przypadku rozlania należy natychmiast zdjąć całą zanieczyszczoną odzież. W kontakcie ze skórą: spłukać zanieczyszczony obszar wodą. W przypadku dostania się do dróg oddechowych: wyprowadzić osobę na świeże powietrze i monitorować oddech, jeśli jest to komfortowe. Natychmiast skontaktuj się z ośrodkiem zatruć/lekarzem. W przypadku dostania się do oczu: płukać oczy wodą przez kilka minut. Jeśli jest to możliwe, należy zdjąć soczewki kontaktowe.
    6. W celu kontroli jakości utrwal pozostałe płaty (co najmniej jeden) 50% metanolem (zmieszanym z wodą dejonizowaną) przez co najmniej 4 godziny, kołysząc w temperaturze pokojowej, a następnie 100% metanolem przez noc kołysząc w temperaturze pokojowej. Odpady metanolu należy zbierać w osobnym pojemniku.
      UWAGA: Metanol powoduje ostrą toksyczność w przypadku połknięcia, wdychania lub kontaktu ze skórą. Metanol jest łatwopalną cieczą i parą. Nosić rękawice i odzież ochronną. Unikaj oddychania podczas obchodzenia się i trzymaj z dala od ognia i ciepła. Po użyciu dokładnie umyj skórę. W przypadku rozlania należy natychmiast zdjąć całą zanieczyszczoną odzież. Spłucz skórę wodą. W przypadku dostania się do dróg oddechowych: Wyprowadzić osobę na świeże powietrze i zapewnić komfort oddychania. W przypadku dostania się do dróg oddechowych, połknięcia lub narażenia należy skontaktować się z ośrodkiem zatruć/lekarzem.
    7. W wentylowanym kapturze przygotuj roztwór alkoholu benzylowego i benzoesanu benzylu (BA: BB, 1:2) (5 -10 ml na płat).
    8. Umieść płat wątroby w 15- lub 50-mililitrowej probówce polipropylenowej (w zależności od wielkości płata) zawierającej roztwór BABB. Pozostaw go kołyszącego się w temperaturze pokojowej, aż stanie się przezroczysty. Ten krok może zająć od 2 do 16 godzin, w zależności od wielkości płata.
      UWAGA: Roztwór BABB rozpuszcza niektóre rodzaje tworzyw sztucznych. Próbki można bezpiecznie przechowywać w probówkach polipropylenowych lub szklanych pojemnikach.
      UWAGA: Benzoesan benzylu może powodować ostrą toksyczność po połknięciu. Jest toksyczny dla organizmów wodnych z długotrwałymi skutkami. Zwroty wskazujące środki ostrożności: po użyciu dokładnie umyć skórę. Jest szkodliwy po połknięciu, w kontakcie ze skórą lub wdychaniu . Unikaj wdychania oparów/oparów. Po użyciu dokładnie umyć ręce. Nie jeść, nie pić ani nie palić podczas korzystania z tego produktu. W przypadku połknięcia - w przypadku złego samopoczucia skontaktować się z ośrodkiem zatruć/lekarzem Stosować w wentylowanych pomieszczeniach. Zbierz rozlany płyn. Zawartość/pojemnik należy usunąć do zatwierdzonego zakładu utylizacji odpadów.
    9. Sprawdź jakość wtrysku. Za pomocą mikrotomografii komputerowej należy skanować tylko prawidłowo wstrzykniętą wątrobę.

2. Tomografia mikrokomputerowa

  1. Przygotowanie próbki
    1. Przygotuj 1% żelu agarozowego, mieszając 100 ml wody destylowanej i 1 g proszku agarozowego. Umieść mieszaninę w kuchence mikrofalowej i gotuj roztwór, aż proszek agarozy się rozpuści.
    2. Temperować 1% żel agarozowy do ~40 °C, aby uniknąć termicznego uszkodzenia próbki wątroby.
    3. Umieść interesujący płat(y) w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i napełnij ją 1% żelem agarozowym do około 2/3 całkowitej objętości probówki. Ten krok minimalizuje niepożądany ruch próbki podczas pomiaru CT.
  2. Pomiar CT
    UWAGA: Poniższe kroki są zależne od urządzenia CT, a konkretne ustawienia i działania mogą się różnić w zależności od urządzenia CT i producenta. W tym protokole zastosowany skaner mikrotomografii komputerowej został wyposażony w lampę rentgenowską o nanoogniskowym ognisku (180 kV/15 W) oraz dynamiczny płaski panel dynamiczny 41|100 (4048 px x 4048 px, rozmiar piksela 100 mm z binningiem 2) do pomiarów CT.
    1. Zamontuj stożkową rurkę o pojemności 15 ml z próbką na stoliku rotacyjnym urządzenia do badania prądem i pozwól jej dostosować się termicznie do komory pomiarowej przez co najmniej 1 godzinę.
    2. Gdy próbka jest dostosowana termicznie, wyśrodkuj ją w polu widzenia (FOV).
    3. Zoptymalizuj odległości źródło-próbka i próbka-detektor (SSD, SDD), aby osiągnąć wystarczającą rozdzielczość wokseli, np. 12 μm dla dorosłej próbki wątroby myszy lub 6,5 μm dla wątroby
    4. Ustaw parametry akwizycji (tj. przyspieszenie napięcia i prądu, ekspozycja, binning, uśrednianie) zgodnie z zaleceniami producenta urządzenia CT, aby osiągnąć wystarczający poziom wykrytego sygnału. Parametry te są zależne nie tylko od urządzenia CT, ale także od próbki i powinny być zoptymalizowane dla każdej próbki. W Hankeova et al.9 ustawienia były następujące: napięcie przyspieszające 80 kV, prąd przyspieszający 160 μA, czas naświetlania 400 ms i 2000 obrazów.
    5. Rozpocznij pomiar CT. Użyj dedykowanego oprogramowania do rekonstrukcji tomograficznej, aby zrekonstruować dane z tomografii komputerowej.

3. Analiza i segmentacja danych

UWAGA: Poniższe kroki są zależne od oprogramowania do przetwarzania obrazu; konkretne ustawienia i działania mogą się różnić w zależności od używanego oprogramowania.

  1. Załaduj dane CT: Wybierz Plik > Importuj > Polecenie. Dalszy wybór zależy od konkretnego formatu danych CT, które mają być przetwarzane.
  2. Użyj funkcji Określanie powierzchni na górnym panelu, aby podzielić żywicę na dane za pomocą globalnego progowania. W oknie dialogowym określ wartość progową z oceną histogramu, ustawiając pozycję czerwonej linii "Isovalue" tak, aby segmentować tylko naczynia wypełnione żywicą (tj. otoczone żółtą linią w prezentowanym "Panelu podglądu") (Rysunek 3A).
  3. Na lewym panelu wybierz moduł Utwórz ROI z objętości/CAD/Siatki, aby utworzyć obszar zainteresowania (ROI) naczyń wypełnionych żywicą. W oknie dialogowym należy skorzystać z opcji Utwórz ROI(s) z bryły, wybrać nazwę przetwarzanego woluminu i zatwierdzić.
  4. Wyeliminuj błędną segmentację klastrów szumów w obszarze tła tego zwrotu z inwestycji. Zaznacz ten ROI na prawym panelu, kliknij go prawym przyciskiem myszy i wybierz moduł Split ROI.
  5. W oknie dialogowym ustaw parametr Minimalna głośność [woksel], aby wykluczyć wszystkie cząstki szumu - wartość ta jest zależna od eksperymentu i danych i musi być zoptymalizowana dla każdej próbki, która ma być analizowana (rysunek 3B).
  6. Twórz gładkie, ciągłe i solidne maski kanałowe bez artefaktów w ROI odlewanym z żywicy - np. obecności pęcherzyków powietrza lub wycieku żywicy.
  7. Na lewym panelu należy skorzystać z modułu Wygładzanie, ustawić parametr Siła wygładzania na 1 lub 2 (w zależności od indywidualnych danych, kiedy wyższe wartości mogą prowadzić do deformacji modelu, szczególnie w przypadku drobnych konstrukcji). W razie potrzeby uruchom ten proces dwa razy (Rysunek 3C).
  8. Zidentyfikuj i oddziel poszczególne systemy rurowe w segmentowej masce z żywicy.
    1. Utwórz osobny zwrot z inwestycji dla systemu wypełnionego bardziej chłonną żywicą (żółtą żywicą używaną do iniekcji do wspólnego przewodu żółciowego) o wyższych wartościach intensywności w danych CT. Postępuj zgodnie z procedurą opisaną w kroku 3.2. (Rysunek 3Di).
    2. Zaznacz nowy zwrot z inwestycji i zwrot z inwestycji maski żywicy, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję Odejmij ROI(S) i odejmij nowy zwrot z inwestycji od zwrotu z inwestycji maski żywicznej, aby utworzyć nowy zwrot z inwestycji dla pozostałego systemu rurowego (Rysunek 3Dii, iii).
  9. Eksportuj wynikowe zwroty z inwestycji dla obu systemów rurowych w różnych formatach, w oparciu o preferencje operatora, w celu późniejszego przetwarzania w innym oprogramowaniu. Następnie przetwórz wynikowe zwroty z inwestycji w oprogramowaniu graficznym woluminowym, aby wyeksportować ostateczną wizualizację w postaci obrazu lub wideo.

Wyniki

Procedura
Prawidłowa podwójna iniekcja żywicy zostaje osiągnięta, gdy zarówno wewnątrzwątrobowe drogi żółciowe, jak i naczynia żylne wrotne są dobrze wypełnione. W ramach kontroli jakości oczyszczanie jednego płata (na przykład lewego płata bocznego) pozwala na weryfikację powodzenia iniekcji przed obrazowaniem wybranych płatów. Optycznie oczyszczony płat może zostać przeskanowany później za pomocą microCT; w związku z tym możliwe jest optyczne oczyszczenie całej wątroby. W dobrze nasyconej żywicą wątrobie mysiej naczynia żylne wrotne powinny być wypełnione żywicą aż do obwodu wątroby, a żywica powinna być widoczna w odgałęzieniach bocznych (Rysunek 4) – taka architektura jest wiernie odwzorowana w danych przeskanowanych i segmentowanych za pomocą microCT. Ponadto prawidłowo wypełnione wewnątrzwątrobowe drogi żółciowe powinny być widoczne obok głównych gałęzi żyły wrotnej, rozciągając się niemal do obwodu, a żywica powinna być widoczna w głównych odgałęzieniach bocznych. Jeśli płat kontrolny przejdzie etap kontroli jakości, płaty będące przedmiotem zainteresowania (w tym ten optycznie oczyszczony) mogą zostać przeskanowane za pomocą microCT. Wynik segmentacji danych z dobrze nasyconej żywicą wątroby przedstawiono dla myszy P15 (Rysunek 4A,B) oraz myszy dorosłej (Rysunek 4C,D).

Czego unikać
Nienaruszona tkanka wątroby jest warunkiem koniecznym do prawidłowego wykonania wstrzyknięcia. Podczas nacinania jamy brzusznej i przepony należy zachować szczególną ostrożność, aby przypadkowo nie uszkodzić tkanki wątroby. Jeśli podczas tej procedury dojdzie do mechanicznego uszkodzenia wątroby, istnieje duże prawdopodobieństwo wycieku żywicy podczas wstrzykiwania do żyły wrotnej (Rycina 5A). W przypadku fizycznego uszkodzenia wątroby nie jest możliwe prawidłowe wypełnienie układu naczyniowego.

Jednym z częstych błędów jest niedostateczne wypełnienie wątroby żywicą, co może utrudniać wizualizację lub analizę. Jedną z przyczyn niedopełnienia układu jest przedwczesne twardnienie żywicy w igle lub końcówce cewki przed zakończeniem wstrzykiwania (Rycina 5B, niebieskie groty strzałek, nawiasy wskazują duże pęcherzyki powietrza). Dobrą praktyką jest stosowanie jednego zestawu do iniekcji na jedno zwierzę i szybka praca po dodaniu czynnika utwardzającego do żywicy. Jeśli żywica stwardnieje podczas iniekcji (co można zauważyć po połowie wypełnionym układzie, tutaj zilustrowanym w przypadku naczyniówki żyły wrotnej wypełnionej w połowie), należy usunąć cewkę, odciąć jej końcówkę (zawsze pod kątem, aby uzyskać ścięty koniec) i nacisnąć tłok. Jeśli żywica ponownie zacznie kapać, należy ostrożnie ponownie wprowadzić cewkę i zabezpieczyć ją szwem. Jeśli żywica stwardniała w igle, należy całkowicie wymienić cewkę, wypełnić ją żywicą (unikając pęcherzyków powietrza), ostrożnie ponownie wprowadzić cewkę i zabezpieczyć ją szwem. Wymiana cewki może być trudna, szczególnie u młodych myszy postnatalnych Rycina 5C, niebieskie groty strzałek oznaczają krew widoczną w gałęziach końcowych). Można to zaobserwować, gdy końce naczyń są wypełnione krwią zamiast żywicy. Aby tego uniknąć, należy upewnić się, że żyła wrotna (poza wątrobą) nie zawiera krwi przed iniekcją. Trzecią przyczyną niedopełnienia wątroby jest zbyt głębokie wprowadzenie cewki do wątroby, w wyniku czego trafia ona do gałęzi prowadzącej do jednego z płatów. Aby temu zapobiec, należy wprowadzić cewkę w odległości co najmniej 0,5 cm od miejsca wejścia do wątroby.

W przeciwnym razie jeden lub oba systemy zostają przepełnione żywicą (Rysunek 5D). Konieczne jest monitorowanie wątroby wizualnie przez cały czas trwania wstrzykiwania. Odlewanie systemu żółciowego za pomocą żywicy jest trudniejsze niż odlewanie żywicy w żyle wrotnej, ponieważ wypełnione żywicą przewody są słabo widoczne na powierzchni wątroby, co utrudnia ocenę momentu, w którym system jest prawie pełny i należy przerwać proces. Pojawienie się małych żółtych kropek żywicy na powierzchni wątroby (Rysunek 2Ci, niebieska grot strzałki) jest sygnałem, że system żółciowy jest całkowicie wypełniony, a żywica zaczyna wyciekać z przewodów. Niewielkie wycieki żywicy można ręcznie skorygować podczas segmentacji danych microCT (Rysunek 5D, panele po prawej).

Jeśli ciśnienie wtrysku jest zbyt wysokie, może to doprowadzić do pęknięcia naczyń lub przewodów (Rysunek 5E), co nieodwracalnie uszkodzi architekturę naczyń lub przewodów. W takim przypadku wątroba nie będzie nadawać się do skanowania lub analizy microCT. Aby uniknąć przepełnienia żywicą, należy zoptymalizować objętość i ciśnienie stosowane podczas wtrysku dla każdego modelu mysiego. W przypadku pracy z myszami poddanymi działaniu toksycznej diety, modyfikacjom genetycznym lub urazom wątroby wpływającym na układ żółciowy lub żylny, a także przy sztywności wątroby, konieczne może być dostosowanie ciśnienia i objętości wtrysku, ponieważ tolerowana objętość i ciśnienie mogą różnić się od tych u myszy typu dzikiego. Niniejszy protokół opisuje ręczny wtrysk do obu układów, jednak możliwe jest podłączenie strzykawki do pompy w celu zestandaryzowania ciśnienia wtrysku. Pęcherzyki powietrza to kolejny bardzo częsty artefakt wtrysku, który prowadzi do niepełnego wypełnienia sieci cewkowych (Rysunek 5F-H, niebieskie groty strzałek). Aby uniknąć powstawania pęcherzyków, należy upewnić się, że strzykawka i rurki nie zawierają pęcherzyków powietrza, są całkowicie wypełnione żywicą, a żywica wycieka z końcówki rurki przed rozpoczęciem wtrysku. Małe pęcherzyki, które pojawiają się jako obszary ubytkowe w danych microCT, można skorygować ręcznie podczas etapów post-processingu, choć jest to proces żmudny.

Świeżość ma kluczowe znaczenie
Stosowanie świeżej żółtej żywicy jest kluczowym czynnikiem, który znacząco wpływa na kontrast między dwiema żywicami oraz segmentację danych microCT. Przy użyciu świeżo otwartej żywicy (Rysunek 6A) występuje wyraźna różnica w kontraście między wstrzykniętymi żółtą żywicą drogami żółciowymi (jasnobiałe) a wstrzykniętymi zieloną żywicą żyłami wrotnymi (jasnoszare). Wątroba wstrzyknięta świeżą żywicą jest łatwo przetwarzana przy użyciu zautomatyzowanego globalnego progowania. Podczas długiego przechowywania żywica wytrąca się, co prowadzi do zmniejszenia kontrastu. Po 3 miesiącach przechowywania kontrast może być wciąż wystarczający, aby odróżnić żyłę wrotną od drogi żółciowej (Rysunek 6B), jednak wytrącanie wpływa na mieszanie się obu żywic, co objawia się jako niejednorodna opalescencja w wypełnionej żyle wrotnej (Rys. 6B, niebieskie groty strzałek). Niejednorodny kontrast negatywnie wpływa na automatyczne progowanie i wymaga ręcznych korekt, co wydłuża czas przetwarzania. Jeśli żywica jest starsza niż sześć miesięcy, kontrast ulega pogorszeniu do stopnia, w którym nie jest możliwe odróżnienie wstrzykniętej żółtą żywicą drogi żółciowej od wstrzykniętej zieloną żywicą żyły wrotnej na podstawie samego kontrastu (Rysunek 6C). W takim przypadku drogi żółciowe i żyły wrotne muszą być segmentowane ręcznie na podstawie ich średnicy i położenia w obszarze wnęki, a następnie śledzone ręcznie w całym zestawie danych microCT. Procedura ta jest niezwykle czasochłonna i najlepiej jej unikać.

Dobór rozmiaru i pomiar cewników; obraz mikroskopowy przedstawiający średnice rurek PE10 i PE50 z linijką.
Rysunek 1: Zestaw do wstrzykiwania dla odlewu z żywicy. (A) Zestaw do wstrzykiwania nr 1 składa się z igły 30 G i rurki PE10 o długości ~30 cm. Zestaw do wstrzykiwania nr 2 składa się z igły 23 G i rurki PE50 o długości ~30 cm. (B) Końcówka rurki jest rozciągnięta i ścięta pod kątem w celu utworzenia ściętego wierzchołka. Linijka na zdjęciach A i B to linijka centymetrowa z głównymi podziałkami 1 cm, podziałkami pośrednimi 5 mm i podziałkami pomocniczymi 1 mm. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Procedura wstrzykiwania do przewodu żółciowego i żyły wrotnej, schemat i układ eksperymentalny, metoda perfuzji wątroby.
Rysunek 2: Schemat blokowy podwójnego odlewu z żywicy. (A) Schemat przedstawiający żylny układ krwionośny myszy oraz serce z zaznaczonym prawym przedsionkiem, który należy wyciąć przed perfuzją, oraz lewą komorą, do której należy wprowadzić igłę w celu przeprowadzenia perfuzji i wypłukania krwi z układu krążenia. Żyła główna dolna powinna zostać przecięta poniżej nerek, aby zmniejszyć ciśnienie naczyniowe. (B) Schemat blokowy wstrzykiwania żywicy do przewodu żółciowego. (i) Powiększony obraz (A) pokazujący miejsce przecięcia IVC. (ii) Obraz przedstawiający wspólny przewód żółciowy (żółta przerywana linia) od obszaru wnęki wątroby do zwieracza Oddiego (czarne groty strzałek), z nicią chirurgiczną pod odsłoniętym wspólnym przewodem żółciowym. (iii) Odpowiednia pozycja dla luźnego węzła nadgarstkowego wokół wspólnego przewodu żółciowego. (iv) Żółta przerywana linia i czarne groty strzałek oznaczają zwieracz Oddiego, pokazując ukośny kąt nacięcia oraz wygląd otworu po wykonaniu nacięcia pod kątem. (v) Schemat demonstrujący orientację ściętego końca rurki PE10 (skierowanego do góry) podczas wprowadzania. (vi) Wygląd wstrzykiwanej żółtej żywicy; żywica powinna łatwo przejść przez luźno zawiązany węzeł. IVC, żyła główna dolna; CBD, wspólny przewód żółciowy. (C) Schemat blokowy wstrzykiwania żywicy do żyły wrotnej. (i) Zielona przerywana linia oznacza żyłę wrotną od obszaru wnęki. Niebieskie groty strzałek oznaczają przepełniony układ żółciowy. (ii) Odpowiednia lokalizacja dla luźnego węzła nadgarstkowego wokół żyły wrotnej. (iii) Schemat demonstrujący otwarcie ściętego końca (do góry) podczas wprowadzania. (iv) Wygląd wątroby po wstrzyknięciu zielonej i żółtej żywicy; zwróć uwagę na wypełnione żywicą naczynie krwionośne na obwodzie wątroby. PV, żyła wrotna. Rysunek 2A został stworzony za pomocą Biorender.com. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza obrazu struktur 3D; schematy z histogramami widmowymi; wyniki segmentacji mikroskopowej.
Rycina 3: Przetwarzanie danych Micro CT w oprogramowaniu Volume Graphics. (A) Wyznaczanie powierzchni: (i) zawyżona wartość izo-powierzchni (obecny podgląd zaznaczenia wyświetlony w kolorze żółtym), (ii) zaniżona wartość izo-powierzchni, (iii) optymalny dobór wartości izo-powierzchni dla prawidłowego wyznaczenia powierzchni żyły wrotnej i dróg żółciowych. (B) Podział obszaru zainteresowania (ROI) utworzonego poprzez wyznaczenie powierzchni: (i) ustawienie w oknie dialogowym wartości na tyle wysokiej, aby pozostał tylko jeden segment (największy), (ii) w żółtych ramkach pokazano mniejsze (wykluczone) cząstki. (C) Wygładzanie powierzchni danych: (i) funkcja wygładzania znajduje się w panelu lewym, (ii) ustawienie siły wygładzania na 1 (maks. 2) i utworzenie nowego wygładzonego ROI, (iii) dane po wygładzeniu. (D) Separacja poszczególnych układów rurkowatych: (i) w funkcji wyznaczania powierzchni ustawiono wartość izo-powierzchni tak, aby w zaznaczeniu znalazł się tylko układ żółciowy (obecny podgląd zaznaczenia wyświetlony w kolorze żółtym), (ii) zaznaczenie ROI obu układów oraz ROI tylko układu żółciowego i odjęcie ROI układu żółciowego od ROI obu układów, (iii) żyła wrotna przedstawiona na szaro, układ żółciowy przedstawiony na zielono. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Schematy rozwoju naczyniowego, od P15 do dorosłości; mikroskopia gałęzi żyły wrotnej (PV) i przewodów żółciowych (BD); badanie anatomiczne.
Rysunek 4: Prawidłowo wstrzyknięte systemy przewodów żółciowych (BD) i żyły wrotnej (PV). (A) Optycznie przejaśniony prawy płat przyśrodkowy (RML) wątroby w 15. dniu po urodzeniu (P15), w który wstrzyknięto dwie żywice do obu systemów. Pasek skali 1 mm. (B) Rendering 3D RML P15 przedstawionego w (A), obrazujący naczynia żyły wrotnej na biało, a system żółciowy na zielono. Pasek skali 1 mm. (C) Optycznie przejaśniony RML wątroby dorosłej, w który wstrzyknięto dwie żywice do obu systemów. Pasek skali 1 mm. (D) Rendering 3D dorosłego RML przedstawionego w (C), obrazujący naczynia żyły wrotnej na biało, a system żółciowy na zielono. H = wnęka, P = obwodowy. Pasek skali 1 mm. Panele A, B, D zostały opracowane za zgodą Hankeova et al.9. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza sieci naczyniowej; obrazowanie wątroby; mikroskopia; wzorce przestrzenne; wizualizacja anatomiczna.
Rysunek 5: Typowe problemy podczas podwójnych iniekcji żywicy do wątroby. (A) Obraz przedstawia wątrobę, która została przypadkowo nacięta podczas początkowego otwierania jamy brzusznej, a żywica wycieka przez nacięcie (niebieski grot strzałki). (B) Nieprawidłowo wypełniony system żyły wrotnej z powodu twardnienia żywicy. Niebieskie groty strzałek wskazują puste gałęzie końcowe, a czerwone nawiasy duże pęcherzyki powietrza. Pasek skali 1 mm. (C) Nieprawidłowo wypełniony system żyły wrotnej z powodu niewłaściwej perfuzji transkardialnej. Niebieskie groty strzałek wskazują krew widoczną w gałęziach końcowych. Pasek skali 1 mm. (D) Przepełniony system żółciowy objawiający się izolowanymi grudkami żywicy. Panele po lewej stronie przedstawiają wątrobę poddaną oczyszczaniu optycznemu, a panele po prawej obraz renderowany mikro-CT 3D. Niebieskie przerywane obrysy wyznaczają obszary powiększenia. Czarne groty strzałek wskazują część wątroby uszkodzoną podczas oczyszczania optycznego po skanowaniu mikro-CT. Pasek skali 1 mm. (E) Wysokie ciśnienie podczas iniekcji żywicy może spowodować pęknięcie żyły wrotnej (zwierzę na tym panelu posiada mutację Jag1H268Q), zaznaczone niebieskimi grotami strzałek. Pasek skali 1 mm. (F) Pęcherzyki powietrza w żywicy podczas iniekcji do żyły wrotnej (niebieskie groty strzałek) oraz (G) iniekcji do systemu żółciowego (niebieski grot strzałki), pasek skali 1 mm. (H) Skan mikro-CT pęcherzyków powietrza (niebieski grot strzałki), słabo wypełnionych gałęzi końcowych (czerwone nawiasy) i wycieku żywicy (żółty grot strzałki), pasek skali 1 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Postęp zaniku wątroby, schemat: MRI pokazujące zmiany w PV i BD w czasie w 1. tygodniu, 3. i 6. miesiącu.
Rysunek 6: Różnicowy kontrast żywicy. (A) Świeżo otwarta żółta żywica zapewnia wystarczający kontrast, aby odróżnić wstrzykniętą żywicą żyłę wrotną (szara) i drogi żółciowe (białe). (B) Trzymanie żółtej żywicy przez trzy miesiące prowadzi do wytrącenia żywicy, co skutkuje niejednorodną nieprzezroczystością (szaro-biała żyła wrotna, niebieska grot strzałki). (C) Przechowywanie żółtej żywicy przez dłuższy czas (>6 miesięcy) zmniejsza kontrast między żyłą wrotną (szara) a drogami żółciowymi (szare). Pasek skali 100 µm. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

O powodzeniu DUCT decyduje kilka kluczowych etapów, od przygotowania próbki po parametry urządzenia CT. Aby osiągnąć najlepsze wyniki, należy użyć dobrze skontrastowanej, dobrze wstrzykniętej i pozbawionej pęcherzyków powietrza żywicy, aby umożliwić proste przetwarzanie cyfrowe z automatycznym progowaniem w celu uzyskania danych 3D, obrazów i filmów. Dzięki szkoleniu i przestrzeganiu tego protokołu, 90% wstrzyknięć kończy się sukcesem i skutkuje powtarzalnymi danymi. Ważne jest, aby używać świeżej żółtej żywicy, aby uzyskać najlepszy kontrast między dwoma wtryskiwanymi systemami. Żółta żywica ma bardzo silną nieprzepuszczalność dla promieni rentgenowskich, podczas gdy niebieska żywica ma niewykrywalną nieprzepuszczalność dla promieni rentgenowskich. Najlepsze wyniki osiąga się w ciągu pierwszych trzech miesięcy po otwarciu nowej butelki z żółtą żywicą. Z czasem żywica wytrąca się, a po dłuższym przechowywaniu (>6 miesięcy) żółta i zielona żywica nie będą już widoczne w tomografii komputerowej. Obrazy o słabym kontraście wymagają rozległego i czasochłonnego ręcznego śledzenia i segmentacji obu systemów. Następnie dobrze rozciągnięta rurka jest niezbędna, aby zmieścić się we wspólnym przewodzie żółciowym dorosłych myszy oraz wspólnym przewodzie żółciowym i żyle wrotnej myszy po urodzeniu. Punkt wejścia do wstrzyknięcia należy utworzyć z zachowaniem ostrożności. Jeśli wspólny przewód żółciowy zostanie przecięty poprzecznie, prawdopodobnie odłączy się od otaczającej tkanki, uniemożliwiając pomyślne wejście rurki. Ten krok jest szczególnie delikatny dla myszy po urodzeniu, u których wspólny przewód żółciowy cofa się i "zwija się", jeśli odczepił się od otaczającej tkanki, co sprawia, że wprowadzenie rurki jest niezwykle trudne. Wspólne wejście do dróg żółciowych i wstrzyknięcie może wymagać pewnej praktyki. Podczas przygotowywania rurki z żywicą i podczas wstrzykiwania należy unikać tworzenia się pęcherzyków, ponieważ pęcherzyki stworzą negatywną przestrzeń na obrazach CT i będą wymagały czasochłonnej ręcznej korekty. Ważne jest, aby delikatnie masować wątrobę, przetaczając się po jej powierzchni zwilżonym wacikiem w trakcie i po zabiegu iniekcji, ponieważ ułatwia to równomierne rozprowadzanie żywicy. Po zakończeniu iniekcji i usunięciu rurki węzeł szwu jedwabnego należy szybko i ostrożnie zacisnąć, aby żywica nie wypłynęła z wątroby przed jej całkowitą polimeryzacją. Aby obrazowanie mikrotomografii komputerowej zakończyło się sukcesem, próbka musi być odpowiednio zamocowana za pomocą agarozy i dostosowana termicznie w celu wyeliminowania artefaktów ruchu w danych TK. Kluczowe znaczenie mają również ustawienia akwizycji, które należy zoptymalizować, aby osiągnąć odpowiednią rozdzielczość przestrzenną pozwalającą na rozdzielenie drobnych struktur.

Można wprowadzić modyfikacje techniczne w procedurze wstrzykiwania, aby uzyskać wstrzyknięcie u młodszych myszy. Obecnie odlewanie żywicą młodszych wątroby myszy jest ograniczone dostępnością wystarczająco cienkich rurek, przy czym PE10 jest najmniejszą dostępną na rynku rurką. Tanimizu i in. z powodzeniem wstrzyknęli atrament węglowy do wspólnego przewodu żółciowego embrionalnego dnia 17 (E17) za pomocą szklanych naczyń włosowatych11. W związku z tym interesujące byłyby przyszłe testy mające na celu sprawdzenie, czy żywica może być dostarczana przez szklaną kapilarę. DUCT został następnie przystosowany do wstrzykiwania innych układów rurkowych, takich jak drogi oddechowe i naczynia płucne w płucach9. Podwójne wstrzykiwanie żywicy może być również zmodyfikowane tak, aby można je było stosować z innymi dostępnymi na rynku żywicami, lub ten protokół może być stosowany do wstrzykiwań z tuszem węglowym.

Jednym z głównych czynników ograniczających rurociąg DUCT jest lepkość żywicy. DUCT może być stosowany tylko do odlewania żywicą konstrukcji rurowych o średnicy powyżej 5 μm. W tym zestawie danych żywica może przenikać do rurek o najmniejszej średnicy 5μm9. To ograniczenie wielkości wyklucza analizę drobnych przewodów i małych naczyń włosowatych. Aby jeszcze bardziej rozwinąć rurociąg DUCT do zbiorników mniejszego kalibru, należy przetestować inne dostępne na rynku żywice, a opracowanie nowych środków nieprzepuszczających promieni rentgenowskich o niskiej lepkości może poprawić penetrację światła.

W Hankeova i wsp.9 DUCT porównano z dwiema innymi powszechnie stosowanymi technikami, podwójnymi wstrzyknięciami tuszu węglowego, a następnie oczyszczaniem tkanek i standardową fotografią oraz iDISCO+ z barwieniem naczyń krwionośnych aktyną alfa-komórek mięśni gładkich i dróg żółciowych cytokeratyną 7, a następnie obrazowaniem 3D9. DUCT przewyższył pozostałe dwie metody pod względem podwójnej analizy (co było wyzwaniem dla iDISCO+ ze względu na wysoką autofluorescencję wątroby), obrazowania 3D i kwantyfikacji (niemożliwe w przypadku wstrzykiwania atramentu węglowego) oraz lumenizacji (DUCT dostarcza danych dla wewnętrznej architektury światła i perfuzji systemu). Jak wspomniano powyżej, głównym ograniczeniem DUCT jest minimalna wielkość strumienia świetlnego, który może być wstrzykiwany i analizowany (limit 5 μm), parametr, w którym zarówno wtrysk atramentu węglowego, jak i iDISCO+ wypadły lepiej. DUCT jest lepszy od pojedynczego systemu odlewania żywicy 3,5,6, ponieważ umożliwia analizę każdego wtryskiwanego systemu z osobna, a także ułatwia podwójne badanie 3D w celu zbadania relacji architektonicznych między tymi dwoma systemami.

DUCT może być stosowany do badania dowolnych dwóch sieci rurowych w 3D. Jako dowód słuszności tej zasady, DUCT wykorzystano do wizualizacji układu wątroby, dróg żółciowych i żył wrotnych oraz unaczynienia tętnicy płucnej i dróg oddechowych w płucach9. Wewnątrzwątrobowe drogi żółciowe rozwijają się w sąsiedztwie żyły wrotnej, a żyła wrotna stanowi strukturalny szablon i centrum sygnalizacyjne, które reguluje wzrost i różnicowanie drzewa żółciowego12. W badaniu Hankeova i wsp.9 w ramach projektu DUCT badano regenerację dróg żółciowych w mysim modelu zespołu Alagille'a cierpiącego na chorobę dziecięcą. Projekt DUCT ujawnił wcześniej nieopisywane mechanizmy architektoniczne, które układ żółciowy wykorzystywał do uzyskania objętości9 przypominającej typ dziki. Myszy z zespołem Alagille'a stosowały dwie różne strategie: (1) w wnękach i centralnych obszarach wątroby układ żółciowy zwiększył swoje rozgałęzienia, oraz (2) na obrzeżach wątroby drogi żółciowe generowane de novo były bardzo kręte. Te dwa czynniki połączyły się, aby uzyskać prawie normalną objętość układu żółciowego, pomimo nieprawidłowej architektury. Ponadto DUCT wykrył nieprawidłowe rozgałęzienia dróg żółciowych, które występowały niezależnie od rozgałęzienia żyły wrotnej i dróg żółciowych tworzących mostki łączące między dwiema żyłami wrotnymi9. Te fenotypy byłyby niemożliwe do wykrycia w odlewie z pojedynczej żywicy i mogłyby być błędnie zinterpretowane w przekrojach histologicznych 2D jako proliferacja dróg żółciowych. W ten sposób DUCT dostarcza danych opisujących architekturę 3D dwóch sieci rurowych na poziomie całego narządu lub płata z możliwością jakościowej i dogłębnej analizy ilościowej. Projekt DUCT może stać się nowym standardem w analizach rozwoju i regeneracji wątroby po urodzeniu w różnych modelach zwierzęcych.

Oświadczenia

Osobny projekt w laboratorium ERA jest finansowany przez ModeRNA. ModeRNA nie odgrywał żadnej roli w opisanym tutaj projekcie/protokole.

Podziękowania

Dziękujemy Kari Huppert i Stacey Huppert za ich wiedzę i pomoc w zakresie kaniulacji dróg żółciowych oraz za ich laboratoryjną gościnność. Dziękujemy również Nadji Schultz i Charlotte L. Mattsson za ich pomoc w kaniulacji dróg żółciowych wspólnych.

Dziękujemy następującym Agencjom Przyznającym za ich wsparcie:

Za pracę w ERA Lab: Karolinska Institutet (2-560/2015-280), Stockholms Läns Landsting (CIMED (2-538/2014-29)), Ragnar Söderbergs stiftelse (Grant dla Szwedzkich Fundacji), European Association for the Study of the Liver (Nagroda Daniela Alagille'a), Swedish Heart-Lung Foundation (20170723) i Vetenskapsrådet (2019-01350).

Za pracę w JK Lab: Dziękujemy za infrastrukturę badawczą CzechNanoLab wspieraną przez MEYS CR (LM2018110). J.K. dzięki wsparciu grantu FSI-S-20-6353.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,5 ml mikroprobówki SafeSealSarstedt72.706
23 G igła motylkowa z rurkąBD bioscience367283
Igła 23 GBD bioscience305892
30 Gbioscience305106
AgarozaTop-BioP045
Alkohol benzylowySigma Aldrich
Benzoesan benzyluSigma AldrichB6630
Corning 50 ml probówkiSigma AldrichCLS430829-500EApolipropylen
Waciki bawełnianeMedicarier60406
Mikroskop preparacyjnyLeica Camera AGLeica M60
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami firmy DulbeccoThermoFisher Scientific
Etanol 70%VWR83801.41
Rurka Falcon 15 mlVerkon331.850.084.006
Kleszcze zakrzywioneFine Science Tools11051-10Fine Graefe 10 cm zakrzywione
Kleszcze prosteFine Science Tools11050-10Fine Graefe 10 cm prosty
Roztwór formaldehyduSigma AldrichF8775
GE Phoenix v|tome|x L 240mikrotomografii komputerowejWaygate Technologoies
Zbilansowany roztwór soli HanksaThermoFisher Scientific14025092
HeparynaLeo PharmaB01AB015000 IE/ml
IzolfuranBaxterFDG9623
MetanolThermoFisher Scientific11413413
MICROFILFlowtechMV-122żywica syntetyczna żółta
MICROFILFlowtechMV-120żywica syntetyczna niebieska
MICROFILFlowtechMV-rozcieńczalnikprzezroczysty rozcieńczalnik do żywicy
Pipeta PasteuraVerkon130.690.424.503
Pompa perystaltycznaAgnThos010.6131.M20
phoenix Oprogramowanie datos|x 2.0Oprogramowanie do rekonstrukcji danych BakerHughes
RockerVWR 444-0142
Szew jedwabnyAgnThos14757jedwab, 4-0, sterylny, 100 m
Nożyczki do skóryFine Science Tools14058-09Prosta końcówka tęczówki 9 cm
Nożyczki sprężynoweFine Science Tools15000-03Vannas micro, prosta końcówka 2 mm
Strzykawka 1 ml LuerBD biologia303172
Rurka PE10BD bioscience427401
Rurka PE50BD bioscience427411
Oprogramowanie VG Studio MAX 3.3Volume Graphics GmbHOprogramowanie do przetwarzania i analizy danych CT
BD 10800614190144 Skaner CT

Bibliografia

  1. Narat, J. K., Loef, J. A., Narat, M. On the preparation of multicolored corrosion specimens. The Anatomical Record. 64, 155-160 (1936).
  2. Ludwig, J., et al. Anatomy of the human biliary system studied by quantitative computer-aided three-dimensional imaging techniques. Hepatology. 27, 893-899 (1998).
  3. Masyuk, T. V., Ritman, E. L., LaRusso, N. F. Quantitative assessment of the rat intrahepatic biliary system by three-dimensional reconstruction. American Journal of Pathology. 158, 2079-2088 (2001).
  4. Masyuk, T. V., Ritman, E. L., LaRusso, N. F. Hepatic artery and portal vein remodeling in rat liver: Vascular response to selective cholangiocyte proliferation. American Journal of Pathology. 162, 1175-1182 (2003).
  5. Sparks, E. E., et al. Notch signaling regulates formation of the three-dimensional architecture of intrahepatic bile ducts in mice. Hepatology. 51, 1391-1400 (2010).
  6. Cuervo, H., et al. Endothelial notch signaling is essential to prevent hepatic vascular malformations in mice. Hepatology. 64, 1302-1316 (2016).
  7. Thakurdas, S. M., et al. Jagged1 heterozygosity in mice results in a congenital cholangiopathy which is reversed by concomitant deletion of one copy of Poglut1 (Rumi). Hepatology. 63, 550-565 (2016).
  8. Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. 3-Dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (68), e4272(2012).
  9. Hankeova, S., et al. DUCT reveals architectural mechanisms contributing to bile duct recovery in a mouse model for Alagille syndrome. Elife. 1, 1-29 (2021).
  10. Andersson, E. R., et al. Mouse model of Alagille syndrome and mechanisms of Jagged1 missense mutations. Gastroenterology. 154, 1080-1095 (2018).
  11. Tanimizu, N., et al. Intrahepatic bile ducts are developed through formation of homogeneous continuous luminal network and its dynamic rearrangement in mice. Hepatology. 64, 175-188 (2016).
  12. Ober, E. A., Lemaigre, F. P. Development of the liver: Insights into organ and tissue morphogenesis. Journal of Hepatology. 68, 1049-1062 (2018).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza w troby 3Dwstrzykiwanie do y y wrotnejuk ad ciowywstrzykiwanie ywicyarchitektura w trobysieci rurkowatesieci naczynioweautomatyczna segmentacja
DUCT: Podwójny odlew z żywicy, a następnie tomografia mikrokomputerowa do analizy wątroby 3D
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.