DUCT: Podwójny odlew z żywicy, a następnie tomografia mikrokomputerowa do analizy wątroby 3D

Podsumowanie

Mikrotomografia komputerowa z podwójnym odlewem z żywicy, czyli DUCT, umożliwia wizualizację, digitalizację i segmentację dwóch systemów rurowych jednocześnie, co ułatwia analizę 3D architektury organów. DUCT łączy wstrzyknięcie ex vivo dwóch żywic nieprzepuszczających promieni rentgenowskich, a następnie skanowanie mikrotomografii komputerowej i segmentację danych tomograficznych.

Streszczenie

Wątroba jest największym organem wewnętrznym u ludzi i myszy, a wysoka autofluorescencja stanowi poważne wyzwanie dla oceny trójwymiarowej (3D) architektury narządu na poziomie całego narządu. Architektura wątroby charakteryzuje się wieloma rozgałęzionymi strukturami oświetlonymi, które mogą być wypełnione żywicą, w tym drzewami naczyniowymi i żółciowymi, ustanawiając wysoce stereotypowy wzór w miąższu bogatym w hepatocyty. Protokół ten opisuje proces wykonywania mikrotomografii komputerowej z podwójnym odlewem żywicy lub "DUCT". DUCT polega na wstrzyknięciu do żyły wrotnej i przewodu żółciowego wspólnego za pomocą dwóch różnych żywic syntetycznych nieprzepuszczających promieni rentgenowskich, a następnie utrwaleniu tkanki. Kontrola jakości poprzez oczyszczenie jednego płata lub całej wątroby za pomocą optycznego środka czyszczącego pozwala na wstępne badanie przesiewowe odpowiednio wstrzykniętych próbek. W drugiej części rurociągu DUCT płat lub cała wątroba mogą być wykorzystane do skanowania za pomocą mikrotomografii komputerowej (microCT), (pół)automatycznej segmentacji i renderowania 3D sieci żył wrotnych i dróg żółciowych. Efektem mikrotomografii komputerowej są dane współrzędnych 3D dla dwóch żywic, co pozwala na analizę jakościową i ilościową obu układów oraz ich relacji przestrzennych. DUCT może być stosowany do wątroby myszy po urodzeniu i u dorosłych myszy i może być dalej rozszerzony na inne sieci kanalikowe, na przykład sieci naczyniowe i drogi oddechowe w płucach.

Wprowadzenie

Odlewanie żywicy organowej to technika, której początki sięgają XVII wieku¹. Jeden z pierwszych przykładów nowoczesnego odlewania żywicy został wykonany na ludzkiej wątrobie podczas autopsji. Wewnątrzwątrobowe drogi żółciowe wypełniono środkiem kontrastowym zmieszanym z żelatyną, a następnie obrazowano za pomocą tomografii komputerowej RTG². Celem techniki DUCT jest wizualizacja, digitalizacja i analiza dwóch rurowych sieci odlewanych z żywicy, w tandemie, w 3D.

DUCT opiera się na obszernej istniejącej wiedzy na temat jednosystemowego odlewania żywicy wątrobowej^3,4,5^,6,7,8 i obejmuje jednoczesną wizualizację 3D i analizę dwóch systemów⁹. W ramach projektu DUCT udało się przekształcić odlewanie żywicy pojedynczej w podwójne odlewnictwo żywicy, mieszając dwie żywice nieprzepuszczające promieni rentgenowskich o różnym kontraście i wstrzykując te żywice do dwóch różnych sieci, w szczególności do wspólnego przewodu żółciowego i żyły wrotnej. DUCT może być stosowany u młodych myszy po urodzeniu z powtarzalnymi wynikami już w 15. dniu po urodzeniu (P15). W porównaniu z technikami obrazowania opartymi na mikroskopii, główną zaletą jest to, że DUCT jest szybszy, wolny od przeciwciał, a autofluorescencja tkanki wątroby nie zakłóca obrazowania. Ponadto DUCT dostarcza danych ilościowych opisujących stan lumenizacji, średnicę wewnętrzną, łączność sieciową i perfuzję. Rozróżnienie między obecnością komórek tworzących światło a ich de facto morfogenezą w rurki jest niezbędne do analizy narządów, w których obecne są komórki przewodowe, ale nie tworzą jajowodów, jak może to mieć miejsce w przypadku zespołu Alagille'a¹⁰. Główną wadą DUCT jest ograniczona penetracja żywicy, która jest lepka i nie dostaje się do rur o małym kalibrze (<5 μm). DUCT może być stosowany do dowolnej struktury rurkowej po określeniu punktu wejścia do iniekcji, takiej jak tętniczy i żylny układ krążenia, drogi oddechowe, pozawątrobowy przewód żółciowy lub naczynia limfatyczne. W ten sposób może ułatwić analizę architektury całych narządów innych tkanek, takich jak płuca i trzustka.

Obrazy segmentowane mikrotomografią komputerową mogą być przetwarzane za pomocą dostępnego na rynku oprogramowania do obrazowania, takiego jak ImageJ, lub specjalnie napisanych potoków (np. MATLAB). Wątroba wstrzyknięta żywicą może być analizowana jakościowo pod kątem rozbudowy sieci i łączności lub ilościowo pod kątem objętości, długości, rozgałęzień, krętości pojedynczego systemu i interakcji między dwoma systemami, takich jak odległość między dwoma systemami lub zależność od punktu rozgałęzienia (czy system 1 rozgałęzia się w pobliżu rozgałęzienia systemu 2?). Rurociąg DUCT obejmujący wstrzykiwanie żywicy, skanowanie mikrotomografią komputerową i segmentację danych TK, w połączeniu ze szczegółową analizą ilościową mechanizmów architektonicznych dwóch systemów rurkowych, może stanowić standard dla analizy całej wątroby w modelach zwierzęcych.

Protokół

Protokół opisany w tym badaniu został zatwierdzony i jest zgodny z zasadami i przepisami dotyczącymi dobrostanu zwierząt Stockholms Norra Djurförsöksetiska nämnd (sztokholmska komisja etyki badań nad zwierzętami). Zwierzęta wykorzystane w tym badaniu były dzikimi lub homozygotycznymi zmutowanymi myszami Jag1H268Q na mieszanym tle C3H/N i C57bl6J. Do badania włączono zarówno mężczyzn, jak i kobiety. Zwierzęta wykorzystano w 15. dniu po urodzeniu lub jako dorosłe osobniki w wieku od 3 do 8 miesięcy.

1. Podwójne iniekcje żywicy

1. preparat
   1. Przygotuj roztwór żywicy. W przypadku podwójnych iniekcji żywicy należy przygotować zarówno żółtą, jak i zieloną żywicę, jak opisano w krokach 1.1.2-1.1.4.
   2. Przygotuj 1 ml porcji rozcieńczonej żywicy na mysz.
   3. Żółta żywica: Rozcieńczyć żółtą gumę silikonową (wysoka nieprzepuszczalność dla promieni rentgenowskich) przezroczystym rozcieńczalnikiem w rozcieńczeniu 3:1, aby przygotować żółtą żywicę do wstrzykiwań.
   4. Zielona żywica: Wymieszaj niebieską gumę silikonową (niewykrywalna nieprzepuszczalność dla promieni rentgenowskich) z przezroczystym rozcieńczalnikiem w rozcieńczeniu 1:1, aby uzyskać niebieską żywicę. Aby wytworzyć zieloną żywicę, wymieszaj rozcieńczoną niebieską żywicę z rozcieńczoną żółtą żywicą w stosunku 1:1. Dokładnie wymieszaj zieloną żywicę, aż kolor będzie jednorodny.
      UWAGA: Niebieska żywica ma bardzo niską nieprzepuszczalność dla promieni rentgenowskich, która nie jest wykrywalna za pomocą mikrotomografii komputerowej, co wymaga rozcieńczenia żółtą żywicą w celu wytworzenia dwóch żywic o różnej nieprzepuszczalności dla promieni rentgenowskich.
      UWAGA: Żywica może zawierać chromian ołowiu, który jest czynnikiem rakotwórczym. Wytwarza trujące gazy w ogniu. Z żywicą należy obchodzić się ostrożnie i należy ją wyrzucać jako odpady niebezpieczne.
   5. Przygotować dwa zestawy do wstrzykiwań (zestaw do wstrzykiwań #1 i zestaw do wstrzykiwań #2) z rurką zgodnie z opisem w punktach 1.1.6-1.1.11.
      UWAGA: W przypadku dorosłych myszy (>P30 (30. dzień po urodzeniu) = P30 - 2 lata) należy użyć zestawu iniekcyjnego #1 (rurka PE10 o średnicy zewnętrznej 0,6 mm) do iniekcji do wspólnego przewodu żółciowego i zestawu iniekcyjnego #2 (rurka PE50 o średnicy zewnętrznej 0,96 mm) do iniekcji żyły wrotnej. Dla młodych myszy po urodzeniu (do P30) przygotuj dwa zestawy do wstrzykiwań #1, jeden do przewodu żółciowego i jeden do wstrzykiwania do żyły wrotnej (brak zestawu do wstrzykiwań #2, ponieważ żyła wrotna jest zbyt wąska, aby pomieścić rurkę PE50).
   6. Aby przygotować zestaw iniekcyjny #1, odetnij 30 cm rurki PE10 i rozciągnij jeden koniec rurki ręcznie, ciągnąc ją, aż stanie się tak cienka, jak to możliwe (Rysunek 1A,B, średnica około 0,15 mm, nierozciągnięta rurka PE10 ma średnicę 0,6 mm).
   7. Przyciąć końcówkę rozciągniętej rurki PE10 po przekątnej, aby utworzyć skośną końcówkę (Rysunek 1B).
   8. Podłącz nierozciągnięty koniec rurki PE10 do igły 30 G (Rysunek 1A, zestaw do wstrzykiwań #1).
   9. Aby przygotować zestaw iniekcyjny #2, odetnij 30 cm rurki PE50 i rozciągnij jeden koniec rurki ręcznie, ciągnąc ją, aż stanie się wystarczająco cienka, aby zmieścić się w żyle wrotnej (Rysunek 1A,B, około 0,7 mm, nierozciągnięta rurka PE50 ma średnicę 0,96 mm).
   10. Przytnij końcówkę rozciągniętej rurki PE50 po przekątnej, aby utworzyć skośną końcówkę (Rysunek 1B).
   11. Podłącz nierozciągnięty koniec rurki PE50 do igły 23 G (Rysunek 1A, zestaw do wstrzykiwań #2).
       UWAGA: Każdy zestaw do wstrzykiwań może być użyty tylko do jednego wstrzyknięcia, ponieważ żywica stwardnieje w strzykawce i rurce. Dostosuj rozmiar rozciągniętej i ściętej końcówki w oparciu o rozmiar wspólnego przewodu żółciowego i żyły wrotnej myszy, w zależności od jej wieku, genotypu i fenotypu. Jeśli nie masz pewności co do rozmiaru i dopasowania rurki, włóż rurkę do odpowiedniego kanału lub naczynia po nacięciu i przed wypełnieniem rurki żywicą. Jeśli rurka jest zbyt szeroka, aby zmieścić się w kanale/naczyniu, rozciągnij ją dalej.
   12. Znieczulić zwierzę przez inhalację izofluranu (pierwsze 4% w komorze indukcyjnej i ~2% za pomocą stożka nosowego).
   13. Umieść mysz na wentylowanej ławce na podkładce preparacyjnej, podczas gdy mysz oddycha izofluranem przez stożek nosowy. Sprawdzić, czy zwierzę jest nieprzytomne za pomocą metody zalecanej przez instytut/IRB, np. poprzez uszczypnięcie jednej z łap.
       UWAGA: Izofluran może powodować senność lub zawroty głowy po inhalacji oraz może powodować uszkodzenie układu sercowo-naczyniowego i ośrodkowego układu nerwowego poprzez długotrwałe lub powtarzające się narażenie. Nie wdychaj go. Z substancją należy obchodzić się na wentylowanej ławce i w dobrze wentylowanych pomieszczeniach.
       UWAGA: Możliwe jest zastosowanie innej metody znieczulania, o ile jest ona zgodna z perfuzją serca.
   14. Gdy zwierzę straci przytomność, spryskaj stronę brzuszną 70% etanolem, aby zapobiec ingerencji sierści.
   15. Za pomocą nożyczek do skóry przetnij skórę, powięź i warstwę mięśni, zaczynając od linii środkowej jamy brzusznej i przetnij do jamy piersiowej, aby odsłonić narządy wewnętrzne.
   16. Chwyć wyrostek mieczykowaty kleszczami, aby podnieść mostek i przeciąć przeponę i klatkę piersiową po obu stronach, aby odsłonić serce i płuca.
   17. Zdejmij klatkę żebrową, przecinając nożyczkami żebra po lewej i prawej stronie klatki piersiowej. Zachowaj szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić wątroby, ponieważ spowoduje to wyciek żywicy.
   18. Za pomocą prostych kleszczy pociągnij serce w kierunku wątroby i odetnij prawy przedsionek.
   19. Wprowadzić igłę motylkową (23 G), podłączoną do perfuzyjnej pompy perystaltycznej, do lewej komory. Przeprowadzić perfuzję myszy przezskórnie zrównoważonym roztworem soli Hanksa (HBSS) i heparyną (1 U/g masy ciała myszy). Utylizuj przez 3 minuty z szybkością perfuzji 5 ml/min.
       UWAGA: Jeśli mysz jest prawidłowo ukrwiona, narządy wewnętrzne staną się blade, zwłaszcza wątroba. Jeśli zamiast tego płuca stają się białe, igła jest wprowadzana do prawej komory i powinna zostać przestawiona. Po perfuzji mysz ulega wykrwawieniu i można ją usunąć ze stożka nosowego i izofluranu.
   20. Wyłączyć pompę izofluranu.
2. Iniekcja żywicy - odlewanie żywicy układu żółciowego
   1. Przesuń mysz do mikroskopu preparacyjnego, brzuch do góry, ogon w kierunku eksperymentatora i odsuń się od eksperymentatora. Interesujące nas anatomiczne punkty orientacyjne są przedstawione na rysunku Rysunek 2A.
   2. Zlokalizuj żyłę główną dolną (Rysunek 2A), przesuwając jelito na bok. Użyj nożyczek sprężynowych, aby wykonać małe poprzeczne nacięcie w żyle głównej dolnej, aby umożliwić uwolnienie ciśnienia naczyniowego w wątrobie (Rysunek 2Bi).
   3. Odsłonić wspólny przewód żółciowy i żyłę wrotną zgodnie z opisem w krokach 1.2.4-1.2.6.
   4. Przesuń jelito i trzustkę na prawą stronę (eksperymentatora) za pomocą wacika zwilżonego roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS).
   5. Odwróć brzuszną stronę wątroby w kierunku serca za pomocą bawełnianego wacika nasączonego PBS, aby odsłonić powierzchnię trzewną i obszar wnęki.
   6. Zlokalizuj wspólny przewód żółciowy, który biegnie od okolicy wnęki przez trzustkę i do jelita przy zwieraczu Oddiego (Ryc. 2Bii, wspólny przewód żółciowy obrysowany żółtą przerywaną linią, czarne groty strzałek wskazują na zwieracz Oddi).
      UWAGA: Upewnij się, że wątroba jest wilgotna przez cały zabieg, posypując ją PBS.
   7. Oczyść otaczającą tkankę (obszar ~ 5 mm) ze wspólnego przewodu żółciowego za pomocą prostych kleszczy. Umieść jedwabną nić do szycia (rozmiar 4-0, 0,17 mm, długość 3 - 5 cm) pod wspólnym przewodzie żółciowym (Ryc. 2Bii) i zawiąż luźny węzeł wokół wspólnego przewodu żółciowego (Rysunek 2Biii).
      UWAGA: Wybierz obszar węzła w połowie drogi między obszarem wnęki a zwieraczem Oddiego oraz w pewnej odległości od żyły wrotnej, tak aby po zaciśnięciu szwu wokół przewodu żółciowego wspólnego nie przeszkadzał w iniekcji żyły wrotnej.
   8. Przytrzymaj nożyczki sprężynowe płasko przy wspólnym przewodzie żółciowym, aby wykonać ukośne nacięcie wspólnego przewodu żółciowego w miejscu, w którym wspólny przewód żółciowy wchodzi do trzustki i jelita obok zwieracza Oddi. (Rysunek 2Biv), żółta przerywana linia obrysowuje zwieracz obszaru Oddiego, podkreślona czarnymi grotami strzałek).
      UWAGA: Jest to kluczowy krok. Wykonaj ukośne, a nie poprzeczne cięcie i wykonaj nacięcie; Nie przecinaj przewodu żółciowego. Przecięcie całego przewodu żółciowego sprawia, że wprowadzenie rurki jest bardzo trudne.
   9. Tuż przed użyciem zmieszać 1 ml żółtej żywicy z 50 μl utwardzacza (napełniając i opróżniając strzykawkę o pojemności 1 ml) i napełnić strzykawkę Luer o pojemności 1 ml mieszaniną żywicy i utwardzacza.
   10. Połączyć napełnioną strzykawkę z rurką (zestaw #1). Nacisnąć tłok, aby całkowicie napełnić rurkę. Upewnij się, że mieszanina żywicy i utwardzacza kapie z końcówki rurki.
       UWAGA: Unikaj i usuwaj pęcherzyki powietrza ze strzykawki i rurki, aby uzyskać najlepsze wyniki.
   11. Za pomocą kleszczy wyprostuj obszar wokół nacięcia wspólnego przewodu żółciowego i włóż rurkę do otworu we wspólnym przewodzie żółciowym (Rysunek 2Bv), przy czym najdłuższą krawędzią skośnej końcówki skieruj się w dół w kierunku grzbietowej strony przewodu żółciowego. Ta orientacja zapewnia, że żywica może wydostać się z otworu rury, który jest skierowany do góry, do kanału (Rysunek 2Bv).
   12. Zaciśnij węzeł jedwabnej nici, aby zabezpieczyć rurkę wewnątrz wspólnego przewodu żółciowego (Rysunek 2Bvi).
   13. Wstrzyknąć żywicę do wspólnego przewodu żółciowego. Obserwuj woreczek żółciowy i poszczególne płaty wątroby.
   14. Masuj wątrobę bawełnianym wacikiem zwilżonym PBS, aby równomiernie rozprowadzić żywicę. Końcowe odgałęzienia dróg żółciowych wypełnionych żywicą (u myszy typu dzikiego) są słabo widoczne na powierzchni wątroby.
       UWAGA: Przewidywany czas napełnienia wątroby to 30 -100 s.
   15. Przestań wstrzykiwać żywicę, gdy kropki żywicy pojawią się na powierzchni wątroby (Rysunek 2Ci, niebieskie groty strzałek) lub gdy napotkany jest opór.
       UWAGA: Pracuj tak szybko, jak to możliwe, ponieważ żywica zaczyna twardnieć po dodaniu utwardzacza żywicy. Czas pracy od dodania utwardzacza wynosi około 15 min.
   16. Usuń rurkę, wyciągając ją ze wspólnego przewodu żółciowego i szybko zaciśnij jedwabny węzeł za pomocą kleszczy, aby zapobiec wyciekaniu żywicy. Odetnij luźne końce jedwabnego szwu, aby nie przeszkadzały w wstrzyknięciu żyły wrotnej.
   17. Rurkę zawierającą żywicę i pozostałą żywicę należy wyrzucić do odpadów niebezpiecznych, a igłę do odpadów po ostrych narzędziach.
3. Iniekcja żywicy - odlewanie żywicy żyły wrotnej
   1. Oczyść żyłę wrotną (obszar ~5 mm) z otaczającej ją tkanki około 2 cm od jej wejścia do wątroby za pomocą prostych kleszczy. Umieść jedwabną nić do szycia (rozmiar 4-0, 0,17 mm, długość 3 - 5 cm) pod oczyszczonym obszarem żyły wrotnej (Ryc. 2Ci) i zawiąż luźny węzeł od góry (Ryc. 2Cii).
   2. Wykonaj podłużne nacięcie w żyle wrotnej dystalnie do wątroby i węzła (Ryc. 2Ciii).
   3. Zmieszać 1 ml zielonej żywicy z 50 μl utwardzacza (napełniając i opróżniając strzykawkę o pojemności 1 ml) i napełnić strzykawkę Luer o pojemności 1 ml mieszaniną utwardzacza żywicy i utwardzacza.
   4. Połącz napełnioną strzykawkę z rurką (zestaw #2 dla myszy >P30, nowy zestaw #1 dla myszy UWAGA: Unikaj i usuwaj pęcherzyki powietrza ze strzykawki i rurki, aby uzyskać najlepsze wyniki.
   5. Za pomocą kleszczy wyprostuj żyłę wrotną, ciągnąc otaczającą tkankę w kierunku eksperymentatora i włóż rurkę najdłuższą krawędzią ściętej końcówki w kierunku grzbietowej strony naczynia (Rysunek 2Ciii).
   6. Dokręć jedwabną nić, aby zabezpieczyć rurkę w żyle wrotnej.
   7. Wstrzyknąć żywicę do żyły wrotnej. Obserwuj, jak naczynia krwionośne wypełniają się żywicą. Masuj wątrobę bawełnianym wacikiem zwilżonym PBS, aby równomiernie rozprowadzić żywicę (Rysunek 2Civ).
   8. Należy przerwać wstrzykiwanie żywicy, gdy wszystkie naczynia krwionośne są wypełnione (końce żył wrotnych są widoczne na obrzeżach wątroby) lub gdy napotkany jest opór.
      UWAGA: Pracuj szybko, ponieważ żywica zaczyna twardnieć po dodaniu utwardzacza. Czas pracy od dodania utwardzacza wynosi około 15 min dla zestawu iniekcyjnego #1 i 25 min dla zestawu iniekcyjnego #2.
   9. Usuń rurkę, wyciągając rurkę z żyły wrotnej i szybko zaciśnij jedwabny węzeł za pomocą kleszczy, aby zapobiec wyciekaniu żywicy.
   10. Rurkę zawierającą żywicę i pozostałą żywicę należy wyrzucić do odpadów niebezpiecznych, a igłę do odpadów po ostrych narzędziach.
4. Rozwarstwienie i unieruchomienie wątroby
   1. Wypreparuj całą wątrobę, odcinając ją od otaczającej tkanki i przepony.
   2. Delikatnie umieść całą wątrobę w pustej stożkowej probówce o pojemności 50 ml, stroną brzuszną skierowaną do góry, a stroną grzbietową spoczywającą na ścianie rurki stożkowej, aby zapobiec deformacji wątroby. Rurkę stożkową należy przechowywać przez noc poziomo w temperaturze 4 °C, aby żywica całkowicie stwardniała.
      UWAGA: Zamiast stożkowej rurki o pojemności 50 ml można użyć dowolnego pojemnika, który jest wystarczająco duży, aby zmieścić się w wątrobie. Używanie pojemnika z płaskim dnem zwiększy prawdopodobieństwo, że wątroba nie jest zdeformowana.
   3. Podziel wątrobę na poszczególne płaty. Dokonaj wyboru płatów, które będą używane do analizy mikrotomografii komputerowej (1.4.4-1.4.5) lub kontroli jakości (1.4.6-1.4.8). Opcjonalnie można użyć całej wątroby zarówno do oczyszczania optycznego, jak i mikrotomografii komputerowej, bez dzielenia jej na poszczególne płaty.
      UWAGA: Architektura wątroby w układzie żółciowym i naczyniowym jest różna w każdym płacie, dlatego wymagane są analizy dopasowanych płatów. Czyszczenie optyczne nie zakłóca skanowania mikrotomografią komputerową, a płat (płaty) używany do kontroli jakości może być następnie skanowany za pomocą mikrotomografii komputerowej. I odwrotnie, próbki zeskanowane za pomocą mikrotomografii komputerowej mogą być następnie oczyszczone optycznie w celu porównania. Dzięki temu możliwa jest cała analiza wątroby. U myszy typu dzikiego (tło genetyczne C3H/C57bl6) prawy płat przyśrodkowy jest najpierw wypełniany przez wstrzyknięcia żywicy, co czyni go odpowiednim płatem do analizy mikrotomografii komputerowej, o najwyższej odtwarzalności. Lewy płat boczny jest największym płatem, w związku z czym łatwo jest wstępnie przebadać jakość wtrysku. Wybór płata (lub całej wątroby) wykorzystywanego do kontroli jakości i skanowania mikrotomografią komputerową zależy od modelu zwierzęcego i pytania badawczego.
   4. W wentylowanym kapturze przygotuj 4% roztwór formaldehydu (10 -20 ml na probówkę). Utrwalić płatki używane do mikrotomografii komputerowej za pomocą 4% formaldehydu przez noc w temperaturze 4 °C, a następnie przemyć raz PBS (10 -20 ml na probówkę).
   5. Odpady formaldehydu należy zebrać w osobnym pojemniku. Płaty wątroby należy przechowywać w PBS w temperaturze 4 °C do krótkotrwałego przechowywania lub 70% etanolu do długotrwałego przechowywania. Przejdź do sekcji 2: Mikrotomografia komputerowa.
      UWAGA: Formaldehyd powoduje ostrą toksyczność w przypadku połknięcia, wdychania lub kontaktu ze skórą. Formaldehyd jest łatwopalną cieczą i parą. Powoduje poważne oparzenia skóry i uszkodzenia oczu. Może powodować reakcję alergiczną skóry. Śmiertelne w przypadku wdychania (stężonego lub w proszku). Może powodować podrażnienie dróg oddechowych. Podejrzewa się, że powoduje wady genetyczne. Może powodować raka. Powoduje uszkodzenie narządów (oczu, ośrodkowego układu nerwowego). Zwroty wskazujące środki ostrożności - przechowywać z dala od źródeł ciepła, gorących powierzchni, iskier, otwartego ognia i innych źródeł zapłonu. Zakaz palenia. Nosić rękawice ochronne i odzież ochronną. W przypadku rozlania należy natychmiast zdjąć całą zanieczyszczoną odzież. W kontakcie ze skórą: spłukać zanieczyszczony obszar wodą. W przypadku dostania się do dróg oddechowych: wyprowadzić osobę na świeże powietrze i monitorować oddech, jeśli jest to komfortowe. Natychmiast skontaktuj się z ośrodkiem zatruć/lekarzem. W przypadku dostania się do oczu: płukać oczy wodą przez kilka minut. Jeśli jest to możliwe, należy zdjąć soczewki kontaktowe.
   6. W celu kontroli jakości utrwal pozostałe płaty (co najmniej jeden) 50% metanolem (zmieszanym z wodą dejonizowaną) przez co najmniej 4 godziny, kołysząc w temperaturze pokojowej, a następnie 100% metanolem przez noc kołysząc w temperaturze pokojowej. Odpady metanolu należy zbierać w osobnym pojemniku.
      UWAGA: Metanol powoduje ostrą toksyczność w przypadku połknięcia, wdychania lub kontaktu ze skórą. Metanol jest łatwopalną cieczą i parą. Nosić rękawice i odzież ochronną. Unikaj oddychania podczas obchodzenia się i trzymaj z dala od ognia i ciepła. Po użyciu dokładnie umyj skórę. W przypadku rozlania należy natychmiast zdjąć całą zanieczyszczoną odzież. Spłucz skórę wodą. W przypadku dostania się do dróg oddechowych: Wyprowadzić osobę na świeże powietrze i zapewnić komfort oddychania. W przypadku dostania się do dróg oddechowych, połknięcia lub narażenia należy skontaktować się z ośrodkiem zatruć/lekarzem.
   7. W wentylowanym kapturze przygotuj roztwór alkoholu benzylowego i benzoesanu benzylu (BA: BB, 1:2) (5 -10 ml na płat).
   8. Umieść płat wątroby w 15- lub 50-mililitrowej probówce polipropylenowej (w zależności od wielkości płata) zawierającej roztwór BABB. Pozostaw go kołyszącego się w temperaturze pokojowej, aż stanie się przezroczysty. Ten krok może zająć od 2 do 16 godzin, w zależności od wielkości płata.
      UWAGA: Roztwór BABB rozpuszcza niektóre rodzaje tworzyw sztucznych. Próbki można bezpiecznie przechowywać w probówkach polipropylenowych lub szklanych pojemnikach.
      UWAGA: Benzoesan benzylu może powodować ostrą toksyczność po połknięciu. Jest toksyczny dla organizmów wodnych z długotrwałymi skutkami. Zwroty wskazujące środki ostrożności: po użyciu dokładnie umyć skórę. Jest szkodliwy po połknięciu, w kontakcie ze skórą lub wdychaniu . Unikaj wdychania oparów/oparów. Po użyciu dokładnie umyć ręce. Nie jeść, nie pić ani nie palić podczas korzystania z tego produktu. W przypadku połknięcia - w przypadku złego samopoczucia skontaktować się z ośrodkiem zatruć/lekarzem Stosować w wentylowanych pomieszczeniach. Zbierz rozlany płyn. Zawartość/pojemnik należy usunąć do zatwierdzonego zakładu utylizacji odpadów.
   9. Sprawdź jakość wtrysku. Za pomocą mikrotomografii komputerowej należy skanować tylko prawidłowo wstrzykniętą wątrobę.

2. Tomografia mikrokomputerowa

1. Przygotowanie próbki
   1. Przygotuj 1% żelu agarozowego, mieszając 100 ml wody destylowanej i 1 g proszku agarozowego. Umieść mieszaninę w kuchence mikrofalowej i gotuj roztwór, aż proszek agarozy się rozpuści.
   2. Temperować 1% żel agarozowy do ~40 °C, aby uniknąć termicznego uszkodzenia próbki wątroby.
   3. Umieść interesujący płat(y) w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i napełnij ją 1% żelem agarozowym do około 2/3 całkowitej objętości probówki. Ten krok minimalizuje niepożądany ruch próbki podczas pomiaru CT.
2. Pomiar CT
   UWAGA: Poniższe kroki są zależne od urządzenia CT, a konkretne ustawienia i działania mogą się różnić w zależności od urządzenia CT i producenta. W tym protokole zastosowany skaner mikrotomografii komputerowej został wyposażony w lampę rentgenowską o nanoogniskowym ognisku (180 kV/15 W) oraz dynamiczny płaski panel dynamiczny 41|100 (4048 px x 4048 px, rozmiar piksela 100 mm z binningiem 2) do pomiarów CT.
   1. Zamontuj stożkową rurkę o pojemności 15 ml z próbką na stoliku rotacyjnym urządzenia do badania prądem i pozwól jej dostosować się termicznie do komory pomiarowej przez co najmniej 1 godzinę.
   2. Gdy próbka jest dostosowana termicznie, wyśrodkuj ją w polu widzenia (FOV).
   3. Zoptymalizuj odległości źródło-próbka i próbka-detektor (SSD, SDD), aby osiągnąć wystarczającą rozdzielczość wokseli, np. 12 μm dla dorosłej próbki wątroby myszy lub 6,5 μm dla wątroby
   4. Ustaw parametry akwizycji (tj. przyspieszenie napięcia i prądu, ekspozycja, binning, uśrednianie) zgodnie z zaleceniami producenta urządzenia CT, aby osiągnąć wystarczający poziom wykrytego sygnału. Parametry te są zależne nie tylko od urządzenia CT, ale także od próbki i powinny być zoptymalizowane dla każdej próbki. W Hankeova et al.⁹ ustawienia były następujące: napięcie przyspieszające 80 kV, prąd przyspieszający 160 μA, czas naświetlania 400 ms i 2000 obrazów.
   5. Rozpocznij pomiar CT. Użyj dedykowanego oprogramowania do rekonstrukcji tomograficznej, aby zrekonstruować dane z tomografii komputerowej.

3. Analiza i segmentacja danych

UWAGA: Poniższe kroki są zależne od oprogramowania do przetwarzania obrazu; konkretne ustawienia i działania mogą się różnić w zależności od używanego oprogramowania.

1. Załaduj dane CT: Wybierz Plik > Importuj > Polecenie. Dalszy wybór zależy od konkretnego formatu danych CT, które mają być przetwarzane.
2. Użyj funkcji Określanie powierzchni na górnym panelu, aby podzielić żywicę na dane za pomocą globalnego progowania. W oknie dialogowym określ wartość progową z oceną histogramu, ustawiając pozycję czerwonej linii "Isovalue" tak, aby segmentować tylko naczynia wypełnione żywicą (tj. otoczone żółtą linią w prezentowanym "Panelu podglądu") (Rysunek 3A).
3. Na lewym panelu wybierz moduł Utwórz ROI z objętości/CAD/Siatki, aby utworzyć obszar zainteresowania (ROI) naczyń wypełnionych żywicą. W oknie dialogowym należy skorzystać z opcji Utwórz ROI(s) z bryły, wybrać nazwę przetwarzanego woluminu i zatwierdzić.
4. Wyeliminuj błędną segmentację klastrów szumów w obszarze tła tego zwrotu z inwestycji. Zaznacz ten ROI na prawym panelu, kliknij go prawym przyciskiem myszy i wybierz moduł Split ROI.
5. W oknie dialogowym ustaw parametr Minimalna głośność [woksel], aby wykluczyć wszystkie cząstki szumu - wartość ta jest zależna od eksperymentu i danych i musi być zoptymalizowana dla każdej próbki, która ma być analizowana (rysunek 3B).
6. Twórz gładkie, ciągłe i solidne maski kanałowe bez artefaktów w ROI odlewanym z żywicy - np. obecności pęcherzyków powietrza lub wycieku żywicy.
7. Na lewym panelu należy skorzystać z modułu Wygładzanie, ustawić parametr Siła wygładzania na 1 lub 2 (w zależności od indywidualnych danych, kiedy wyższe wartości mogą prowadzić do deformacji modelu, szczególnie w przypadku drobnych konstrukcji). W razie potrzeby uruchom ten proces dwa razy (Rysunek 3C).
8. Zidentyfikuj i oddziel poszczególne systemy rurowe w segmentowej masce z żywicy.
   1. Utwórz osobny zwrot z inwestycji dla systemu wypełnionego bardziej chłonną żywicą (żółtą żywicą używaną do iniekcji do wspólnego przewodu żółciowego) o wyższych wartościach intensywności w danych CT. Postępuj zgodnie z procedurą opisaną w kroku 3.2. (Rysunek 3Di).
   2. Zaznacz nowy zwrot z inwestycji i zwrot z inwestycji maski żywicy, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję Odejmij ROI(S) i odejmij nowy zwrot z inwestycji od zwrotu z inwestycji maski żywicznej, aby utworzyć nowy zwrot z inwestycji dla pozostałego systemu rurowego (Rysunek 3Dii, iii).
9. Eksportuj wynikowe zwroty z inwestycji dla obu systemów rurowych w różnych formatach, w oparciu o preferencje operatora, w celu późniejszego przetwarzania w innym oprogramowaniu. Następnie przetwórz wynikowe zwroty z inwestycji w oprogramowaniu graficznym woluminowym, aby wyeksportować ostateczną wizualizację w postaci obrazu lub wideo.

Wyniki

Co robić
Udane podwójne wstrzyknięcie żywicy osiąga się, gdy zarówno wewnątrzwątrobowe drogi żółciowe, jak i unaczynienie żyły wrotnej są dobrze wypełnione. W ramach kontroli jakości, oczyszczenie jednego płata (na przykład lewego płata bocznego) pozwala na weryfikację udanego wstrzyknięcia, a następnie obrazowanie płatów będących przedmiotem zainteresowania. Optycznie oczyszczony płat można później zeskanować za pomocą mikrotomografii komputerowej; Dzięki temu możliwe jest optyczne oczyszczenie całej wątroby. W dobrze wstrzykniętej wątrobie myszy unaczynienie żyły wrotnej powinno być wypełnione żywicą, aż obwód wątroby i żywica powinny być widoczne w bocznych gałęziach (Ryc. 4), a ta architektura jest wiernie odwzorowana w danych zeskanowanych i podzielonych na segmenty za pomocą mikrotomografii komputerowej. Ponadto, dobrze wstrzyknięte wewnątrzwątrobowe drogi żółciowe powinny być widoczne obok głównych odgałęzień żyły wrotnej rozciągających się prawie do obwodu, a żywica powinna być widoczna w głównych gałęziach bocznych. Jeśli płat kontrolny przejdzie etap kontroli jakości, interesujące go płaty (w tym optycznie oczyszczony) można zeskanować za pomocą mikrotomografii komputerowej. Wynik segmentacji danych z dobrze wstrzykniętej wątroby pokazano dla myszy P15 (Rysunek 4A,B) i dorosłej myszy (Figura 4C,D).

Czego nie robić
Nienaruszona tkanka wątroby jest warunkiem wstępnym udanego wstrzyknięcia. Zachowaj szczególną ostrożność podczas cięcia jamy brzusznej i przepony, aby przypadkowo nie naciąć tkanki wątroby. Jeśli podczas tej procedury dojdzie do fizycznego uszkodzenia wątroby, istnieje duże prawdopodobieństwo, że żywica wycieknie podczas wstrzykiwania żyły wrotnej (Ryc. 5A). Nie jest możliwe osiągnięcie dobrego wstrzyknięcia do układu naczyniowego, jeśli wątroba jest fizycznie uszkodzona.

Jednym z najczęstszych błędów jest niedopełnianie wątroby żywicą, co może prowadzić do problemów z wizualizacją lub analizą. Jedną z przyczyn niedopełnienia systemu jest przedwczesne stwardnienie żywicy w igle lub końcówce rurki przed zakończeniem iniekcji (Rysunek 5B, niebieskie groty strzałek, nawiasy przedstawiają duże pęcherzyki). Dobrą praktyką jest użycie jednego zestawu do wstrzykiwań na zwierzę i szybkie działanie po dodaniu utwardzacza do żywicy. Jeśli żywica stwardnieje podczas wstrzykiwania (co można zaobserwować za pomocą systemu wypełnionego do połowy, czego przykładem jest do połowy wypełnione unaczynienie żyły wrotnej), wyjmij rurkę, odetnij końcówkę rurki (zawsze po przekątnej, aby utworzyć skośną końcówkę) i naciśnij tłok. Jeśli żywica zacznie ponownie kapać, ostrożnie włóż rurkę i zabezpiecz ją szwem. Jeśli żywica stwardniała w igle, całkowicie wymień rurkę, napełnij ją żywicą (unikając pęcherzyków), ostrożnie włóż rurkę i zabezpiecz ją szwem. Wymiana rurki może być trudna, szczególnie u młodych myszy po urodzeniu Ryc. 5C, niebieskie groty oznaczają krew widoczną w końcowych odgałęzieniach). Można to zaobserwować, gdy końcówki naczyń są wypełnione krwią zamiast żywicy. Aby tego uniknąć, należy upewnić się, że żyła wrotna (poza wątrobą) nie zawiera krwi przed wstrzyknięciem. Trzecią przyczyną niedopełnienia wątroby jest to, że rurka jest wprowadzana zbyt głęboko do wątroby i wchodzi w gałąź w kierunku jednego z płatów. Aby temu zapobiec, włóż rurkę w odległości co najmniej 0,5 cm od wejścia do wątroby.

Na odwrót, jeden lub oba systemy są przepełnione żywicą (Rysunek 5D). Konieczne jest wzrokowe monitorowanie wątroby przez cały czas wstrzyknięcia. Odlewanie układu żółciowego za pomocą żywicy jest trudniejsze niż odlewanie żywicy za pomocą żyły wrotnej, ponieważ kanały wypełnione żywicą są słabo widoczne na powierzchni wątroby i trudno jest ocenić, kiedy system jest prawie pełny, a kiedy należy się zatrzymać. Kiedy na powierzchni wątroby pojawiają się małe żółte kropki z żywicy (Rysunek 2Ci, niebieski grot strzałki), jest to znak, że układ żółciowy jest całkowicie wypełniony, a żywica zaczyna wyciekać z przewodów. Niewielkie wycieki żywicy można ręcznie skorygować podczas segmentacji danych mikrotomografii komputerowej (Rysunek 5D, prawe panele).

Jeśli ciśnienie wtrysku jest zbyt wysokie, może to spowodować pęknięcie naczyń lub kanałów (Rysunek 5E), nieodwracalnie uszkadzając architekturę naczynia lub kanału. Wątroba nie będzie nadawała się do skanowania lub analizy mikrotomografii komputerowej. Aby uniknąć przepełnienia żywicy, zoptymalizuj odpowiednią objętość i ciśnienie używane do wstrzykiwania w każdym modelu myszy. Podczas pracy z myszami, które zostały poddane toksycznej diecie, modyfikacji genetycznej lub uszkodzeniu wątroby, które wpływa na układ żółciowy lub żylny, lub sztywności wątroby, może być konieczne dostosowanie ciśnienia i objętości wstrzyknięcia, ponieważ objętość i tolerowane ciśnienie mogą być inne niż u myszy typu dzikiego. Protokół ten opisuje ręczne wstrzykiwanie obu systemów, ale możliwe jest podłączenie strzykawki do pompy w celu ujednolicenia ciśnienia wtrysku. Bąbelki to kolejny bardzo powszechny artefakt iniekcji, który prowadzi do rzadkiego wypełnienia sieci rurowych (Rysunek 5F-H, niebieskie groty strzałek). Aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków, należy upewnić się, że strzykawka i rurka nie zawierają żadnych pęcherzyków, są całkowicie wypełnione żywicą, a żywica kapie z końcówki rurki przed wstrzyknięciem. Małe pęcherzyki, które pojawiają się jako negatywne obszary na danych mikrotomografii komputerowej, można ręcznie skorygować podczas etapów przetwarzania końcowego, chociaż jest to pracochłonne.

Fresh jest najlepszy
Użycie świeżej żółtej żywicy jest kluczowym czynnikiem, znacząco wpływającym na kontrast obu żywic i segmentację danych mikrotomografii komputerowej. Kiedy używa się świeżo otwartej żywicy (Rysunek 6A), istnieje wyraźna różnica w kontraście między żółtymi kanałami żółciowymi wstrzykniętymi żywicą (jasnobiałe) a zielonymi żyłami wrotnymi wstrzykniętymi żywicą (jasnoszare). Wątroba, do której wstrzykuje się świeżą żywicę, jest łatwo przetwarzana przy użyciu automatycznego globalnego progowania. Przy dłuższym przechowywaniu żywica wytrąca się, a kontrast zmniejsza się. Po 3 miesiącach przechowywania kontrast może być nadal wystarczający do odróżnienia żyły wrotnej od przewodu żółciowego (Ryc. 6B), ale wytrącanie wpływa na mieszanie dwóch żywic, co jest widoczne jako niejednorodne zmętnienie w wypełnionej żyle wrotnej (ryc. 6B, niebieskie groty strzałek). Niejednorodny kontrast negatywnie wpływa na automatyczne progowanie i wymaga ręcznych korekt, co wydłuża czas przetwarzania. Jeśli żywica jest starsza niż sześć miesięcy, kontrast uległ degradacji do punktu, w którym nie jest możliwe odróżnienie przewodu żółciowego wstrzykniętego na żółto od żyły wrotnej wstrzykniętej na zielono na podstawie samego kontrastu (Ryc. 6C). W takim przypadku przewód żółciowy i żyła wrotna muszą być segmentowane ręcznie na podstawie ich średnicy i położenia w okolicy wnękowej i śledzone ręcznie przez cały czas trwania mikrotomografii komputerowej. Ta procedura jest niezwykle czasochłonna i najlepiej jej unikać.

Rysunek 1: Zestaw do iniekcji do odlewania żywicy. (A) Zestaw iniekcyjny #1 składa się z igły 30 G i rurki PE10 o długości ~30 cm. Zestaw iniekcyjny #2 składa się z igły 23 G i rurki PE50 o długości ~30 cm. (B) Końcówka rurki jest rozciągana i cięta pod kątem, aby utworzyć skośną końcówkę. Linijka w A i B jest linijką centymetrową, z dużymi przyrostami co 1 cm, pośrednimi krokami co 5 mm i mniejszymi przyrostami 1 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Schemat blokowy odlewania podwójnej żywicy. (A) Schemat przedstawiający mysi układ krążenia żylnego i serce z zaznaczonym prawym przedsionkiem, który należy odciąć przed perfuzją, oraz lewą komorą, do której należy wprowadzić igłę w celu perfuzji w celu wypłukania krwi z układu krążenia. Żyła główna dolna powinna zostać przecięta pod nerkami, aby zmniejszyć ciśnienie naczyniowe. (B) Schemat blokowy wstrzykiwania żywicy do kanałów żółciowych. (i) Powiększony obraz (A) przedstawiający miejsce przecięcia IVC. (ii) Obraz przedstawiający wspólny przewód żółciowy (żółta przerywana linia) od okolicy wnęki wątroby do zwieracza Oddiego (czarne groty strzał), z nicią szwową pod oczyszczonym wspólnym przewodem żółciowym. (iii) Odpowiednia pozycja dla luźnego węzła górnego wokół wspólnego przewodu żółciowego. (iv) Żółta przerywana linia i czarne groty strzałek oznaczają zwieracz Oddi, pokazując kąt ukośny do nacięcia i jak powinien wyglądać otwór po nacięciu pod kątem ukośnym. (v) Schemat przedstawiający orientację otworu ukośnego rurki PE10 (do góry) po włożeniu. (vi) Wygląd wstrzykiwanej żółtej żywicy; Żywica powinna z łatwością przejść przez luźno zawiązany węzeł. IVC, żyła główna dolna; CBD, przewód żółciowy zwykły. (C) Schemat blokowy wstrzykiwania żywicy żyły wrotnej. (i) Zielona przerywana linia oznacza żyłę wrotną z obszaru wnęki. Niebieskie groty strzałek oznaczają przepełniony układ żółciowy. (ii) Odpowiednie miejsce na luźny węzeł górny wokół żyły wrotnej. (iii) Schemat przedstawiający otwór skośny (do góry) po włożeniu. (iv) Pojawienie się wątroby po wstrzyknięciu zielonej żywicy i żółtej żywicy; Zwróć uwagę na wypełnione żywicą naczynie krwionośne na obrzeżach wątroby. PV, żyła portalowa. Rysunek 2A został stworzony za pomocą Biorender.com. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Przetwarzanie danych Micro CT w oprogramowaniu graficznym objętościowym. (A) Określenie powierzchni, (i) przeszacowana wartość ISO (aktualny podgląd wyboru jest pokazany w kolorze żółtym), (ii) niedoszacowana wartość ISO, (iii) optymalny wybór wartości ISO dla prawidłowego wyznaczenia powierzchni żyły wrotnej i dróg żółciowych. (B) Podział obszaru zainteresowania (ROI) utworzony przez określenie powierzchni, (i) ustawienie wartości w oknie dialogowym na tyle wysoko, aby pozostał tylko jeden segment (największy), (ii) w żółtych ramkach pokazane są mniejsze (wykluczone) cząstki. (C) Wygładzanie powierzchni danych, (i) funkcja wygładzania znajduje się na lewym panelu, (ii) ustaw siłę wygładzania na 1 (maks. 2) i utwórz nowy wygładzony zwrot z inwestycji, (iii) wygładzone dane. (D) Rozdzielenie poszczególnych układów rurowych, (i) w funkcji wyznaczania powierzchni ustawić wartość ISO tak, aby w selekcji uwzględniony był tylko układ żółciowy (bieżący podgląd selekcji jest pokazany w kolorze żółtym), (ii) zaznaczyć ROI obu systemów i ROI tylko układu żółciowego i odjąć ROI układu żółciowego od ROI obu systemów, (iii) Żyła wrotna pokazana na szaro, układ żółciowy pokazany na zielono. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Dobrze wstrzyknięty przewód żółciowy (BD) i układ żyły wrotnej (PV). (A) Optycznie oczyszczony prawy płat przyśrodkowy (RML) po urodzeniu wątroby 15 (P15) wstrzyknięty z dwiema żywicami do dwóch układów. Podziałka liniowa 1 mm. (B) Renderowanie 3D P15 RML pokazane w (A) przedstawiające unaczynienie żyły wrotnej w kolorze białym i układ żółciowy w kolorze zielonym. Podziałka 1 mm. (C) Optycznie oczyszczony RML dorosłej wątroby wstrzyknięty dwiema żywicami do dwóch układów. Podziałka liniowa 1 mm. (D) Renderowanie 3D dorosłego RML pokazane w (C) przedstawiające unaczynienie żyły wrotnej w kolorze białym i układ żółciowy w kolorze zielonym. H = płaski, P = peryferyjny. Podziałka 1 mm. Panele A, B, D są adaptowane za zgodą Hankeova et al.⁹. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Typowe wyzwania związane z podwójnym wstrzykiwaniem żywicy do wątroby. (A) Obraz przedstawia wątrobę, która została przypadkowo nacięta podczas początkowego otwarcia jamy brzusznej, a żywica przecieka przez nacięcie (niebieski grot strzałki). (B) Słabo wstrzyknięty system żył wrotnych z powodu stwardnienia żywicy. Niebieskie groty strzałek oznaczają puste gałęzie końcowe, a czerwone nawiasy oznaczają duże bąbelki. Podziałka 1 mm. (C) Źle wstrzyknięty system żyły wrotnej z powodu słabej perfuzji przezsercowej. Niebieskie groty oznaczają krew widoczną na końcowych gałęziach. Podziałka 1 mm. (D) Przepełnienie układu żółciowego objawiające się izolowanymi kulkami żywicy. Lewy panel pokazuje optycznie oczyszczoną wątrobę, a prawe panele pokazują obraz renderowany 3D za pomocą mikrotomografii komputerowej. Niebieskie kropkowane kontury przedstawiają obszary powiększenia. Czarne groty strzałek oznaczają część wątroby, która została uszkodzona podczas oczyszczania optycznego po skanowaniu mikrotomografią komputerową. Podziałka 1 mm. (E) Wysokie ciśnienie podczas wstrzykiwania żywicy może spowodować pęknięcie żyły wrotnej (zwierzę w tym panelu jest nosicielem mutacji Jag1H268Q), oznaczonej niebieskimi grotami strzałek. Podziałka 1 mm. (F) Pęcherzyki w żywicy podczas iniekcji żyły wrotnej (niebieskie groty) i (G) iniekcja układu żółciowego (niebieska strzałka), podziałka 1 mm. (H) Mikrotomografia komputerowa pęcherzyków (niebieski grot strzałki), słabo wypełnione odgałęzienia końcowe (czerwone nawiasy) i wyciek żywicy (żółty grot strzałki), podziałka 1 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Różnicowy kontrast żywicy. (A) Świeżo otwarta żółta żywica generuje wystarczający kontrast, aby odróżnić żyłę wrotną wstrzykniętą żywicą (szarą) i drogi żółciowe (białą). (B) Trzy miesiące przechowywania żółtej żywicy prowadzą do wytrącania się żywicy, co skutkuje niejednorodnym zmętnieniem (szaro-biała żyła wrotna, niebieski grot strzałki). (C) Długotrwałe przechowywanie (>6 miesięcy) żółtej żywicy zmniejsza kontrast między żyłą wrotną (szary) a drogami żółciowymi (szary). Podziałka 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

O powodzeniu DUCT decyduje kilka kluczowych etapów, od przygotowania próbki po parametry urządzenia CT. Aby osiągnąć najlepsze wyniki, należy użyć dobrze skontrastowanej, dobrze wstrzykniętej i pozbawionej pęcherzyków powietrza żywicy, aby umożliwić proste przetwarzanie cyfrowe z automatycznym progowaniem w celu uzyskania danych 3D, obrazów i filmów. Dzięki szkoleniu i przestrzeganiu tego protokołu, 90% wstrzyknięć kończy się sukcesem i skutkuje powtarzalnymi danymi. Ważne jest, aby używać świeżej żółtej żywicy, aby uzyskać najlepszy kontrast między dwoma wtryskiwanymi systemami. Żółta żywica ma bardzo silną nieprzepuszczalność dla promieni rentgenowskich, podczas gdy niebieska żywica ma niewykrywalną nieprzepuszczalność dla promieni rentgenowskich. Najlepsze wyniki osiąga się w ciągu pierwszych trzech miesięcy po otwarciu nowej butelki z żółtą żywicą. Z czasem żywica wytrąca się, a po dłuższym przechowywaniu (>6 miesięcy) żółta i zielona żywica nie będą już widoczne w tomografii komputerowej. Obrazy o słabym kontraście wymagają rozległego i czasochłonnego ręcznego śledzenia i segmentacji obu systemów. Następnie dobrze rozciągnięta rurka jest niezbędna, aby zmieścić się we wspólnym przewodzie żółciowym dorosłych myszy oraz wspólnym przewodzie żółciowym i żyle wrotnej myszy po urodzeniu. Punkt wejścia do wstrzyknięcia należy utworzyć z zachowaniem ostrożności. Jeśli wspólny przewód żółciowy zostanie przecięty poprzecznie, prawdopodobnie odłączy się od otaczającej tkanki, uniemożliwiając pomyślne wejście rurki. Ten krok jest szczególnie delikatny dla myszy po urodzeniu, u których wspólny przewód żółciowy cofa się i "zwija się", jeśli odczepił się od otaczającej tkanki, co sprawia, że wprowadzenie rurki jest niezwykle trudne. Wspólne wejście do dróg żółciowych i wstrzyknięcie może wymagać pewnej praktyki. Podczas przygotowywania rurki z żywicą i podczas wstrzykiwania należy unikać tworzenia się pęcherzyków, ponieważ pęcherzyki stworzą negatywną przestrzeń na obrazach CT i będą wymagały czasochłonnej ręcznej korekty. Ważne jest, aby delikatnie masować wątrobę, przetaczając się po jej powierzchni zwilżonym wacikiem w trakcie i po zabiegu iniekcji, ponieważ ułatwia to równomierne rozprowadzanie żywicy. Po zakończeniu iniekcji i usunięciu rurki węzeł szwu jedwabnego należy szybko i ostrożnie zacisnąć, aby żywica nie wypłynęła z wątroby przed jej całkowitą polimeryzacją. Aby obrazowanie mikrotomografii komputerowej zakończyło się sukcesem, próbka musi być odpowiednio zamocowana za pomocą agarozy i dostosowana termicznie w celu wyeliminowania artefaktów ruchu w danych TK. Kluczowe znaczenie mają również ustawienia akwizycji, które należy zoptymalizować, aby osiągnąć odpowiednią rozdzielczość przestrzenną pozwalającą na rozdzielenie drobnych struktur.

Można wprowadzić modyfikacje techniczne w procedurze wstrzykiwania, aby uzyskać wstrzyknięcie u młodszych myszy. Obecnie odlewanie żywicą młodszych wątroby myszy jest ograniczone dostępnością wystarczająco cienkich rurek, przy czym PE10 jest najmniejszą dostępną na rynku rurką. Tanimizu i in. z powodzeniem wstrzyknęli atrament węglowy do wspólnego przewodu żółciowego embrionalnego dnia 17 (E17) za pomocą szklanych naczyń włosowatych¹¹. W związku z tym interesujące byłyby przyszłe testy mające na celu sprawdzenie, czy żywica może być dostarczana przez szklaną kapilarę. DUCT został następnie przystosowany do wstrzykiwania innych układów rurkowych, takich jak drogi oddechowe i naczynia płucne w płucach⁹. Podwójne wstrzykiwanie żywicy może być również zmodyfikowane tak, aby można je było stosować z innymi dostępnymi na rynku żywicami, lub ten protokół może być stosowany do wstrzykiwań z tuszem węglowym.

Jednym z głównych czynników ograniczających rurociąg DUCT jest lepkość żywicy. DUCT może być stosowany tylko do odlewania żywicą konstrukcji rurowych o średnicy powyżej 5 μm. W tym zestawie danych żywica może przenikać do rurek o najmniejszej średnicy 5^μm9. To ograniczenie wielkości wyklucza analizę drobnych przewodów i małych naczyń włosowatych. Aby jeszcze bardziej rozwinąć rurociąg DUCT do zbiorników mniejszego kalibru, należy przetestować inne dostępne na rynku żywice, a opracowanie nowych środków nieprzepuszczających promieni rentgenowskich o niskiej lepkości może poprawić penetrację światła.

W Hankeova i wsp.9 DUCT porównano z dwiema innymi powszechnie stosowanymi technikami, podwójnymi wstrzyknięciami tuszu węglowego, a następnie oczyszczaniem tkanek i standardową fotografią oraz iDISCO+ z barwieniem naczyń krwionośnych aktyną alfa-komórek mięśni gładkich i dróg żółciowych cytokeratyną 7, a następnie obrazowaniem 3D⁹. DUCT przewyższył pozostałe dwie metody pod względem podwójnej analizy (co było wyzwaniem dla iDISCO+ ze względu na wysoką autofluorescencję wątroby), obrazowania 3D i kwantyfikacji (niemożliwe w przypadku wstrzykiwania atramentu węglowego) oraz lumenizacji (DUCT dostarcza danych dla wewnętrznej architektury światła i perfuzji systemu). Jak wspomniano powyżej, głównym ograniczeniem DUCT jest minimalna wielkość strumienia świetlnego, który może być wstrzykiwany i analizowany (limit 5 μm), parametr, w którym zarówno wtrysk atramentu węglowego, jak i iDISCO+ wypadły lepiej. DUCT jest lepszy od pojedynczego systemu odlewania żywicy ^3,5,6, ponieważ umożliwia analizę każdego wtryskiwanego systemu z osobna, a także ułatwia podwójne badanie 3D w celu zbadania relacji architektonicznych między tymi dwoma systemami.

DUCT może być stosowany do badania dowolnych dwóch sieci rurowych w 3D. Jako dowód słuszności tej zasady, DUCT wykorzystano do wizualizacji układu wątroby, dróg żółciowych i żył wrotnych oraz unaczynienia tętnicy płucnej i dróg oddechowych w płucach⁹. Wewnątrzwątrobowe drogi żółciowe rozwijają się w sąsiedztwie żyły wrotnej, a żyła wrotna stanowi strukturalny szablon i centrum sygnalizacyjne, które reguluje wzrost i różnicowanie drzewa żółciowego¹². W badaniu Hankeova i ^wsp.9 w ramach projektu DUCT badano regenerację dróg żółciowych w mysim modelu zespołu Alagille'a cierpiącego na chorobę dziecięcą. Projekt DUCT ujawnił wcześniej nieopisywane mechanizmy architektoniczne, które układ żółciowy wykorzystywał do uzyskania objętości⁹ przypominającej typ dziki. Myszy z zespołem Alagille'a stosowały dwie różne strategie: (1) w wnękach i centralnych obszarach wątroby układ żółciowy zwiększył swoje rozgałęzienia, oraz (2) na obrzeżach wątroby drogi żółciowe generowane de novo były bardzo kręte. Te dwa czynniki połączyły się, aby uzyskać prawie normalną objętość układu żółciowego, pomimo nieprawidłowej architektury. Ponadto DUCT wykrył nieprawidłowe rozgałęzienia dróg żółciowych, które występowały niezależnie od rozgałęzienia żyły wrotnej i dróg żółciowych tworzących mostki łączące między dwiema żyłami wrotnymi⁹. Te fenotypy byłyby niemożliwe do wykrycia w odlewie z pojedynczej żywicy i mogłyby być błędnie zinterpretowane w przekrojach histologicznych 2D jako proliferacja dróg żółciowych. W ten sposób DUCT dostarcza danych opisujących architekturę 3D dwóch sieci rurowych na poziomie całego narządu lub płata z możliwością jakościowej i dogłębnej analizy ilościowej. Projekt DUCT może stać się nowym standardem w analizach rozwoju i regeneracji wątroby po urodzeniu w różnych modelach zwierzęcych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1,5 ml mikroprobówki SafeSeal	Sarstedt	72.706
23 G igła motylkowa z rurką	BD bioscience	367283
Igła 23 G	BD bioscience	305892
30 G	bioscience	305106
Agaroza	Top-Bio	P045
Alkohol benzylowy	Sigma Aldrich
Benzoesan benzylu	Sigma Aldrich	B6630
Corning 50 ml probówki	Sigma Aldrich	CLS430829-500EA	polipropylen
Waciki bawełniane	Medicarier	60406
Mikroskop preparacyjny	Leica Camera AG		Leica M60
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami firmy Dulbecco	ThermoFisher Scientific
Etanol 70%	VWR	83801.41
Rurka Falcon 15 ml	Verkon	331.850.084.006
Kleszcze zakrzywione	Fine Science Tools	11051-10	Fine Graefe 10 cm zakrzywione
Kleszcze proste	Fine Science Tools	11050-10	Fine Graefe 10 cm prosty
Roztwór formaldehydu	Sigma Aldrich	F8775
GE Phoenix v|tome|x L 240	mikrotomografii komputerowej	Waygate Technologoies
Zbilansowany roztwór soli Hanksa	ThermoFisher Scientific	14025092
Heparyna	Leo Pharma	B01AB01	5000 IE/ml
Izolfuran	Baxter	FDG9623
Metanol	ThermoFisher Scientific	11413413
MICROFIL	Flowtech	MV-122	żywica syntetyczna żółta
MICROFIL	Flowtech	MV-120	żywica syntetyczna niebieska
MICROFIL	Flowtech	MV-rozcieńczalnik	przezroczysty rozcieńczalnik do żywicy
Pipeta Pasteura	Verkon	130.690.424.503
Pompa perystaltyczna	AgnThos	010.6131.M20
phoenix Oprogramowanie datos|x 2.0	Oprogramowanie do rekonstrukcji danych Baker	Hughes
Rocker	VWR 444-0142
Szew jedwabny	AgnThos	14757	jedwab, 4-0, sterylny, 100 m
Nożyczki do skóry	Fine Science Tools	14058-09	Prosta końcówka tęczówki 9 cm
Nożyczki sprężynowe	Fine Science Tools	15000-03	Vannas micro, prosta końcówka 2 mm
Strzykawka 1 ml Luer	BD biologia	303172
Rurka PE10	BD bioscience	427401
Rurka PE50	BD bioscience	427411
Oprogramowanie VG Studio MAX 3.3	Volume Graphics GmbH		Oprogramowanie do przetwarzania i analizy danych CT