Method Article

Mikroprzepływowe wytwarzanie mikrokapsułek typu core-shell zawierających sferoidy ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

DOI:

10.3791/62944

⸱

October 13th, 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology and Biomedical Engineering, Mayo Clinic

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł opisuje enkapsulację ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) za pomocą urządzenia do ogniskowania przepływu współosiowego. Wykazaliśmy, że ta technologia enkapsulacji mikroprzepływowej umożliwia efektywne tworzenie sferoid hPSC.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trójwymiarowe (3D) lub sferoidalne hodowle ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) oferują korzyści w postaci lepszych wyników różnicowania i skalowalności. W tym artykule opisano strategię solidnego i powtarzalnego tworzenia sferoid hPSC, w której urządzenie do ogniskowania przepływu współosiowego jest wykorzystywane do uwięzienia hPSC wewnątrz mikrokapsułek typu rdzeń-powłoka. Roztwór rdzeniowy zawierał jednokomórkową zawiesinę hPSC i stał się lepki dzięki wprowadzeniu poli(glikolu etylenowego) o wysokiej masie cząsteczkowej (PEG) i pożywek o gradiencie gęstości. Strumień skorupy składał się z PEG-4 arm-maleimidu lub PEG-4-Mal i płynął wzdłuż strumienia rdzenia w kierunku dwóch kolejnych złączy naftowych. Tworzenie się kropel nastąpiło na pierwszym złączu olejowym, a roztwór powłoki owinął się wokół rdzenia. Chemiczne sieciowanie powłoki nastąpiło na drugim złączu olejowym poprzez wprowadzenie do tych kropel środka sieciującego di-tiolowego (1,4-ditiotreitol lub DTT). Środek sieciujący reaguje z maleimidowymi grupami funkcyjnymi za pomocą chemii kliknięć, w wyniku czego wokół mikrokapsułek tworzy się hydrożelowa powłoka. Nasza technologia enkapsulacji pozwoliła na wyprodukowanie kapsułek o średnicy 400 μm z szybkością 10 kapsułek na sekundę. Powstałe w ten sposób kapsułki miały hydrożelową otoczkę i wodny rdzeń, który pozwalał pojedynczym komórkom szybko łączyć się w agregaty i tworzyć sferoidy. Proces enkapsulacji nie wpłynął negatywnie na żywotność hPSC, przy czym >95% żywotności zaobserwowano 3 dni po enkapsulacji. Dla porównania, hPSC zamknięte w mikrocząstkach żelu stałego (bez rdzenia wodnego) nie tworzyły sferoid i miały <50% żywotności 3 dni po enkapsulacji. Sferoidalne tworzenie hPSC wewnątrz mikrokapsułek typu rdzeń-otoczka nastąpiło w ciągu 48 godzin po enkapsulacji, przy czym średnica sferoidy jest funkcją gęstości inokulacji komórek. Ogólnie rzecz biorąc, technologia enkapsulacji mikroprzepływowej opisana w tym protokole dobrze nadawała się do enkapsulacji hPSC i tworzenia sferoidów.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Istnieje duże zainteresowanie hodowlami 3D ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) ze względu na zwiększoną pluripotencję i potencjał różnicowania zapewniany przez ten format hodowli1,2,3. hPSC są zazwyczaj formowane w sferoidy lub inne formaty kultur 3D za pomocą bioreaktorów, mikrostudzienek, hydrożeli i rusztowań polimerowych4,5,6. Herkapsulacja oferuje inny sposób organizowania pojedynczych hPSC w sferoidy. Po zamknięciu w kapsułkach sferoidy hPSC mogą być z łatwością przenoszone na płytki mikromiareczkowe w celu różnicowania, modelowania choroby lub eksperymentów z testami leków. Zamknięcie hPSC w warstwie hydrożelu chroni również komórki przed uszkodzeniem przy ścinaniu i pozwala na hodowlę sferoid w bioreaktorze przy dużej szybkości mieszania7.

Nasza metodologia enkapsulacji komórek macierzystych ewoluowała z czasem. Po pierwsze, skupiliśmy się na stałych mikrocząsteczkach hydrożelu i wykazaliśmy udaną enkapsulację i hodowlę mysich embrionalnych komórek macierzystych (mESC)8. Zauważono jednak, że ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) miały niską żywotność, gdy były zamknięte w takich mikrocząsteczkach hydrożelu, prawdopodobnie ze względu na większą potrzebę ponownego nawiązania przez te komórki kontaktów komórka-komórka po enkapsulacji. Doszliśmy do wniosku, że heterogeniczna mikrokapsułka, posiadająca wodny rdzeń, może lepiej nadawać się do enkapsulacji komórek, które polegają na szybkim ponownym nawiązaniu kontaktów komórka-komórka. Koncepcja urządzenia mikroprzepływowego skupiającego przepływ współosiowy do wytwarzania mikrokapsułek z rdzeniem wodnym/powłoką hydrożelową została zaadaptowana z He et al.9, ale zamiast alginianu zastosowanego w pierwotnym podejściu, do powłoki włączono hydrożel na bazie PEG. Po raz pierwszy wykazaliśmy udaną enkapsulację i sferoidalne tworzenie pierwotnego hepatocytu w mikrokapsułkach typu core-shell10, a ostatnio opisaliśmy enkapsulację komórek hES i iPS7. Jak opisano w Rysunek 1A, kapsułki są wytwarzane w urządzeniu skupiającym przepływ, w którym strumienie przepływu powłoki i rdzenia przechodzą z przepływu z boku na bok do przepływu współosiowego przed wyrzuceniem do fazy olejowej. Strumień rdzenia zawiera komórki i dodatki zwiększające lepkość roztworu (niereaktywny PEG MW 35kD i jodiksanol - nazwa handlowa OptiPrep), natomiast strumień otoczki zawiera cząsteczki reaktywne (PEG-4-Mal). Ciągły współosiowy strumień przepływu jest dyskretyzowany na kropelki, które zachowują architekturę rdzeń-powłoka. Struktura rdzenia-powłoki jest utrwalana przez wystawienie na działanie di-tiolowego środka sieciującego (DTT), który reaguje z PEG-4-Mal poprzez chemię kliknięć i powoduje powstanie cienkiej (~10 μm) hydrożelowej powłoki lub powłoki. Po rozbiciu emulsji i przeniesieniu kapsułek do fazy wodnej, cząsteczki PEG dyfundują z rdzenia i są zastępowane cząsteczkami wody. W ten sposób powstają wodne mikrokapsułki rdzeniowe i hydrożelowe.

Poniżej znajdują się instrukcje krok po kroku, jak tworzyć urządzenia mikroprzepływowe, jak przygotować komórki i jak przeprowadzić enkapsulację hPSC.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Produkcja urządzeń

  1. Wykonaj projekty urządzenia do mikroenkapsulacji i dysocjacji za pomocą oprogramowania CAD10,11.
  2. Powlekaj kolejno trzy warstwy fotorezystu SU-8 na płytce krzemowej (Rysunek 2A), aby uzyskać struktury o pożądanych wysokościach: 60, 100 i 150 μm.
    UWAGA: Proces dla górnej i dolnej formy jest identyczny.
    1. Odwiruj czystą 10-centymetrową płytkę krzemową ujemnym fotorezystem SU-8 2025 z prędkością 1,100 obr./min, aby utworzyć pierwszą warstwę o grubości 60 μm. Po miękkim pieczeniu w temperaturze 65 °C przez 3 minuty i w temperaturze 95 °C przez 10 minut na gorącej płycie, naświetl formę za pomocą nakładki bez maski, przesyłając plik projektowy z wzorem kanału rdzenia do komputera μPG 101. Następnie kontynuuj pieczenie poekspozycyjne w temperaturze 65 °C przez 3 minuty i w temperaturze 95 °C przez 10 minut.
    2. Drugą warstwę SU-8 2025 (40 μm) należy obrócić z prędkością 1 500 obr./min i odsłonić, przesyłając odpowiedni plik CAD dla wzoru kanału powłoki.
      UWAGA: Wypieki miękkie i poekspozycyjne były podobne do poprzedniego kroku.
    3. Trzecią warstwę SU-8 2025 należy obrócić z prędkością 1 400 obr./min, aby osiągnąć wysokość 50 μm i powtórzyć powyższy proces, ale odsłonić struktury na fazę olejową.
    4. Rozwiń formę ze wszystkimi trzema warstwami w jednym kroku, zanurzając ją w wywoływaczu SU-8, aż cały nienaświetlony fotorezyst zostanie usunięty.
    5. Formę pieczemy na twardo na gorącej płycie w temperaturze 160 °C przez 10 minut, aby poprawić przyczepność i uszczelnić drobne pęknięcia, które mogą pojawić się po wywołaniu.
    6. Wystaw formę na działanie chlorotrimetylosilanu, aby uniknąć wiązania elastomeru w następnym kroku i umieść ją na 15-centymetrowych szalkach Petriego do czasu użycia.
  3. Przygotuj formę urządzenia dysocjacyjnego w taki sam sposób, jak opisano w Rysunek 1D i Rysunek 2B. Odwiruj jedną warstwę fotorezystu SU-8 na płytce krzemowej, jak opisano wcześniej w kroku 1.2.3, aby uzyskać struktury o pożądanej wysokości: 50 μm. Przeprowadzaj pieczenie miękkie i poekspozycyjne, wywoływanie i pieczenie na twardo podobnie jak w poprzednim kroku.
    UWAGA: Szereg trójkątnych słupków pokrywał całą komorę, przy czym odstępy między słupkami zmniejszały się wraz ze zmniejszaniem się szerokości komory w kierunku wylotu. Słupki trójkątne miały po 200 μm na bok i rozstaw od 400 μm (na wlocie) do 30 μm (na wylocie).
  4. Przygotuj formy metodą miękkiej litografii przy użyciu polidimetylosiloksanu (PDMS).
    1. Wymieszaj bazę elastomerową PDMS i utwardzacz elastomerowy w stosunku 10:1 w/w w wirówce planetarnej. Wlej mieszaninę zarówno na formy główne do mikrokapsułkowania, jak i do formy głównej dysocjacji, aby utworzyć warstwę o grubości 3-4 mm.
      UWAGA: Mieszanina 50 g bazy elastomerowej z 5 g utwardzacza wystarcza do pokrycia formy wzorcowej o grubości 3 mm.
    2. Umieścić szalki Petriego zawierające formy w eksykatorze próżniowym na 15 minut w celu odgazowania nieutwardzonego PDMS.
    3. Przenieś szalki Petriego do piekarnika i piecz w temperaturze 80 °C przez minimum 60 minut.
    4. Wyjmij główne formy z piekarnika i pozwól im ostygnąć. Za pomocą precyzyjnego noża ostrożnie przytnij PDMS zgodnie z kształtem wafla i oderwij kawałki PDMS z formy wzorcowej.
    5. Wytnij płyty PDMS, przycinając krawędzie każdego urządzenia skalpelem, a następnie wybij porty fluidów wlotowych/wylotowych w urządzeniu dysocjacyjnym i tylko w górnym urządzeniu mikroprzepływowym za pomocą igieł ze stali nierdzewnej. Przykryj urządzenia magiczną taśmą, aby uniknąć zanieczyszczenia.
      UWAGA: Wskaźnik igły wynosi 14 G i 15 G odpowiednio dla portów wlotowych i wylotowych.
    6. W celu klejenia, wzorzyste boki górnych i dolnych kawałków PDMS należy potraktować plazmąO2 na wytrawiaczu plazmowym przez 2 minuty.
    7. Wyrównaj obie części PDMS pod stereoskopem po dodaniu cienkiej warstwy oddzielającej wody destylowanej bezpośrednio do mikrokanalików (2 μl).
    8. Umieść wyrównane urządzenie PDMS w piekarniku w temperaturze 80 °C na noc, aby zakończyć wiązanie i przywrócić PDMS do pierwotnego stanu hydrofobowego. Przechowuj urządzenia do czasu dalszego użytkowania.
      UWAGA: W ten sposób powstaje współosiowe urządzenie skupiające przepływ o trzech różnych wysokościach: 120 μm dla rdzenia, 200 μm dla powłoki i 300 μm dla kanałów olejowych.
    9. W celu użycia urządzenia zaraz po klejeniu plazmowym należy ostrożnie, ale stanowczo wstrzyknąć 30 μl hydrofobowego roztworu powłoki do kanałów płynnych w celu uzyskania powłoki hydrofobowej. Następnie należy natychmiast przedmuchnąć powietrze do kanałów, aż w urządzeniu nie zaobserwuje się pozostałości roztworu powłoki hydrofobowej.
    10. Połączyć urządzenie dysocjacyjne, traktując najpierw wzorzystą stronę urządzenia i oczyszczone szkło szkiełkowe plazmąO2 przez 2 minuty, a następnie zmontować je do dalszego utwardzania w piecu w temperaturze 80 °C przez noc.
      UWAGA: Urządzenia można przechowywać do czasu dalszego użycia.

2. Przygotowanie roztworów

  1. Roztwory podstawowe. Najpierw przygotuj roztwory podstawowe (roztwory stężone), które zostaną rozcieńczone do niższych stężeń do rzeczywistego użycia.
    UWAGA: Roztwory podstawowe są używane w celu zaoszczędzenia czasu przygotowania, zaoszczędzenia materiałów, zmniejszenia przestrzeni do przechowywania i poprawy dokładności podczas przygotowywania roztworu roboczego w niższych stężeniach.
    1. Przygotuj 30 ml 2x roztworu rdzeniowego (16% PEG i 34% gradientu gęstości): wymieszaj 4,8 g 35 kDa PEG, 10,2 ml pożywki gradientowej gęstości i 19,8 ml pożywki DMEM/F12. Przefiltruj ten roztwór rdzeniowy za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm.
    2. Przygotuj 50 ml oleju mineralnego z 3% środkiem powierzchniowo czynnym: wymieszaj 48,5 ml oleju mineralnego i 1,5 ml środka powierzchniowo czynnego. Przechowywać w sterylnym stanie po przefiltrowaniu przez filtr strzykawkowy 0,22 μm.
    3. Przygotuj 50 ml oleju mineralnego z 0,5% środkiem powierzchniowo czynnym: wymieszaj 49,75 ml oleju mineralnego i 0,25 ml środka powierzchniowo czynnego. Przechowywać w sterylnym stanie.
    4. Przygotuj 1 M ditioteritol (DTT): rozpuść 1,5425 g DTT w 10 ml wody destylowanej. Przechowywać w sterylnym stanie.
    5. Przygotować 1 M trietanoloaminy (TEA): dodać 66,4 μl herbaty do 433,6 μl wody destylowanej. Przechowywać w sterylnym stanie.
    6. Przygotuj 1% Pluronic F127 (PF127): rozpuść 100 mg PF127 w 10 ml wody destylowanej. Przechowywać w sterylnym stanie.
  2. Rozwiązania robocze
    1. Przygotuj emulsję sieciującą, mieszając 4,5 ml oleju mineralnego z 3% środkiem powierzchniowo czynnym i 300 μl 1 M DTT (stosunek 1:15). Wirować roztwór przez 2 minuty i sonikować przez 45-60 minut w łaźni ultradźwiękowej w temperaturze 20 °C. Załadować ten roztwór do strzykawki o pojemności 5 ml z igłą 27 G.
      UWAGA: Emulsja jest wytwarzana przez sonikację mieszaniny oleju i wody.
    2. Przygotować roztwór oleju ekranującego, ładując olej mineralny z 0,5% środkiem powierzchniowo czynnym do strzykawki o pojemności 5 ml z igłą 27 G.
    3. Przygotuj roztwór otoczki (8% w/v PEG-4-Mal i 15 mM TEA), dodając 32 mg PEG-4-Mal w 400 μL 1x DPBS, aby utworzyć 8% w/v roztworu, i wirować roztwór przez 2 min. Następnie dodaj 6 μl 1 M TEA (końcowe stężenie 15 mM TEA). Na koniec odwirować przy 13 000 x g przez 5 minut przez filtr wirowy i trzymać w ciemności na kołysce przez 30 minut. Następnie załadować ten roztwór do strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 27 G.
      UWAGA: Pozostaw pojemnik PEG-4-Mal w temperaturze pokojowej na 10 minut przed otwarciem pokrywy i przedmuchnij gazemN2, aby zastąpić O2 przez N2 przed zamknięciem pokrywy. Zwiruj herbatę przed dodaniem do roztworu.
  3. Przygotować zawiesinę komórek w roztworze rdzeniowym
    1. Traktować hPSC trypsyną przez 5 do 10 minut w temperaturze 37 °C. Następnie zbierz je z talerzy. Ugasić trypsynę pożywką po oderwaniu komórek, a następnie przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    2. Odwirować zawiesinę komórek masowych (400 x g, 5 min). Ostrożnie odessać supernatant, a następnie ponownie zawiesić osad komórkowy przy użyciu minimalnej objętości pożywki wzrostowej. Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek.
      UWAGA: Typowe porcje komórek zawierają 12-20 x 106 komórek i wystarczają do wytworzenia 400 μl roztworu rdzeniowego.
    3. Pobrać 12-20 x 106 komórek z zawiesiny komórek masowych i odwirować zawiesinę komórki/pożywki (400 x g, 5 min).
    4. Ostrożnie odessać pożywkę z osadu komórkowego. Następnie dodać 200 μl pożywki i 200 μl 2x roztworu PEG (końcowe stężenie 30-50 x 106 komórek/ml) i delikatnie wymieszać.
      UWAGA: Niskie stężenia komórek (mniej niż 20 x 106 komórek/ml) skutkowały wieloma pustymi kapsułkami.
    5. Dodać 30 μl 1% PF127 do roztworu.
    6. Włożyć mikromieszadło (2 mm x 7 mm) do strzykawki o pojemności 1 ml, a następnie załadować do strzykawki komórkę zawierającą roztwór rdzeniowy za pomocą igły 27 G. Utrzymuj roztwór w chłodzie z lodem podczas całego procesu kapsułkowania.

3. Konfiguracja eksperymentalna

  1. Umieść klejone urządzenie kropelkowe PDMS, cztery kawałki mikrorurek o długości 20 cm i jeden kawałek mikrorurek wlotowych o długości 5 cm (0,38 mm ID x 1,1 mm OD), jeden kawałek 10-centymetrowej rurki wylotowej (0,5 mm ID x 1,5 mm OD) i sześć sztuk 0,5 cm rurki mocującej (1 mm ID x 1,8 mm OD) pod bakteriobójczym źródłem światła (zwykle wbudowanym w komory bezpieczeństwa biologicznego) i sterylizuj przez 30 Min.
  2. Użyj kleszczyków, aby dopasować rurkę do portów wlotowych płynu i portów dysocjacyjnych.
  3. Użyj trzech kawałków mikrorurek wlotowych o długości 20 cm do powłoki, oleju, wlotów emulsji sieciującej i jednego elementu do wlotu urządzenia dysocjacyjnego. Następnie włożyć przeciwległy koniec rurek do igły strzykawki z odpowiednim roztworem. W międzyczasie połącz wlot rdzenia urządzenia mikroprzepływowego i wylot urządzenia dysocjującego za pomocą jednej mikrorurki o średnicy 5 cm (Rysunek 1C).
    UWAGA: Mikrorurki wlotowe powinny być szczelnie zabezpieczone w rurkach złączkowych, które zostały włożone w ostatnim kroku.
  4. Włóż jedną rurkę wylotową do portu wylotowego płynu i umieść drugi koniec w zbiorniku zbiorczym.
  5. Umieść urządzenie na stoliku mikroskopu i przymocuj rurkę, aby uniknąć przesuwania. Ustaw mikroskop i ustaw ostrość na dyszy urządzenia w celu kontroli przepływu.
  6. Umieść każdą strzykawkę na różnych pompkach strzykawkowych i odpowiednio zabezpiecz (Rysunek 1B). Zaprogramuj każdą pompę zgodnie z protokołami producenta na następujące natężenia przepływu: rdzeń (3-5 μl/min), płaszcz (3-5 μl/min), olej osłonowy (20-80 μl/min) i olej sieciujący (40-60 μl/min). Uruchom przepływ we wszystkich pompach.
  7. Poczekaj, aż każdy płyn dostanie się do urządzenia i wypełnij kanały, jednocześnie wypychając pozostałe powietrze.
    UWAGA: Jeśli w przewodzie dolotowym znajduje się duża ilość powietrza, tymczasowo zwiększ każde natężenie przepływu, aż powietrze zostanie całkowicie usunięte. Należy pamiętać, że nadmierne natężenie przepływu może prowadzić do awarii wiązania PDMS-PDMS.
  8. Gdy tworzenie się kapsułki zostanie ustabilizowane (Rysunek 3), umieść przeciwległy koniec probówki do nowej stożkowej probówki z 5 ml pożywki mTeSR.
    UWAGA: Pożywka zawiera 10 μM inhibitora ROCK, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny.
  9. Po zebraniu wystarczającej liczby kapsułek inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 10 minut. Kapsułki znajdujące się w fazie olejowej znajdują się w górnej części probówki (patrz Rysunek 4A). Delikatne stukanie w rurkę powoduje, że kapsułki osiadają na dnie. Następnie większość oleju i pożywek może zostać zasysana.
  10. Zebrać kapsułki z dna stożkowej tuby, umieścić je na sitku do komórek (wielkość porów 100 μm) i przemyć dużą ilością pożywki. Następnie zbierz mikrokapsułki za pomocą pożywki o pojemności 2 ml na 6-dołkowej płytce hodowlanej, przepuszczając pożywkę przez filtr, gdy jest ona odwrócona na wierzchu płytki dołka (patrz Rysunek 4A).

4. hodowla i analiza hPSC w mikrokapsułkach

  1. Podstawowa kultura
    1. Inkubować kapsułki z komórkami macierzystymi w 6-dołkowym naczyniu do hodowli w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
    2. Zmieniaj pożywkę co drugi dzień, zbierając kapsułki na filtrze sitkowym, myjąc je nadmiarem pożywki i ponownie umieszczając w nowej studzience na 6-dołkowych płytkach z 2 ml pożywki, tak jak to zostało zrobione w kroku 3.10.
    3. Trzymaj kapsułki przez co najmniej 10 dni.
  2. Wykonaj test żywy/martwy, aby określić żywotność zamkniętych w kapsułkach komórek macierzystych.
    1. Rozmrozić żywe/martwe roztwory do oznaczania (homodimer-1 etydyny-1 i kalceina AM).
    2. Dodać 4 μl 2 μM homodimimu etydyny-1 i 1 μl 4 μM roztworów kalceiny AM do 2 ml sterylnego DPBS. Wiruj, aby zapewnić całkowite wymieszanie.
    3. Zebrać około 100 mikrokapsułek na sitku do komórek i przepłukać je sterylnym DPBS, aby umożliwić dyfuzję pożywki z kapsułek.
    4. Zebrać je ponownie na 12-dołkową płytkę hodowlaną, używając 1 ml roztworu przygotowanego w kroku 4.2.2. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 minut.
    5. Wizualizacja komórek pod mikroskopem fluorescencyjnym.
      UWAGA: Żywotność komórek określa się ilościowo, obliczając procent żywych komórek, które są wizualizowane jako zielone, w całkowitej liczbie komórek.
  3. Charakterystyka wielkości sferoidy.
    1. W razie potrzeby umieść płytkę studzienkową z mikrokapsułkami pod mikroskopem i zmierz średnicę sferoid pokazanych na odpowiednim oprogramowaniu za pomocą odpowiednich pasków podziałki.
    2. Zmierz i przeanalizuj rozmiar sferoidy.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Postępując zgodnie z wyżej wymienionym protokołem, czytelnik będzie mógł wytwarzać urządzenia mikroprzepływowe i produkować mikrokapsułki przenoszące komórki. Rysunek 3A pokazuje przykłady optymalnych i nieoptymalnych mikrokapsułek wytwarzanych przy użyciu mikroprzepływowego generowania kropel. Różne formulacje PEG-4-Mal skutkowały powstawaniem kapsułek o różnej morfologii - pomarszczone kapsułki wiązały się ze słabym żelowaniem, niską integralnością mechaniczną i nie wytrzymywały hodowli w bioreaktor...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj proces enkapsulacji prowadzi do powtarzalnego tworzenia sferoid hPSC. Format mikrokapsułek ułatwia dozowanie sferoid do studzienek płytki mikromiareczkowej w celu przeprowadzenia eksperymentów mających na celu ulepszenie/optymalizację protokołów różnicowania lub testowanie terapii. Kapsułkowane sferoidy komórek macierzystych mogą być również stosowane w hodowlach zawiesinowych, w których otoczka hydrożelowa chroni komórki przed uszkodzeniem wywołanym ścinaniem7.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było częściowo wspierane przez granty z Mayo Clinic Center for Regenerative Medicine, J. W. Kieckhefer Foundation, Al Nahyan Foundation, Regenerative Medicine Minnesota (RMM 101617 TR 004) i NIH (DK107255).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,22 &mikro; m Filtry strzykawkoweGenesee Scientific25-244
1 ml strzykawka luer-lock końcówkaBD309628
1x DPBSCorning23220003
4-ramienny PEG maleimid, 10kDaLaysan Inc.164-68
ml strzykawka z końcówką luer-lockBD309646
6-DOŁKOWA PŁYTKA NIEPODDANA DZIAŁANIUUSA ScientificCC7672-7506
Pakiet aplikatorówAquapel Aquapel Glass Treatment47100
Oprogramowanie CADAutodeskAutoCAD v2020
FILTR SIATKOWY 100 µ m wielkość porówkardynał335583
ChlorotrimetylosilanAldrich386529-100 ml
Countess II FL Automatyczny licznik komórekTechnologia życiaA27974
Cyfrowa płyta grzejnaPłytka znamionowa
Cyfrowy mikser wirowyFisher Scientific215370
Woda destylowanaGibco15230-162
Ditiotheritol (DTT)SigmaD0632-10G
DMEM/F12 mediagibco11320-033
Stożkowe probówki wirówkowe Falcon 15 mlFisher scientific14-959-53A
Fisherbrand accuSpin Micro 17 Mikrowirówkana żywo13-100-675
Inkubator CO2 HERACELL VIOS 160iThermo Scientific50144906
Zmotoryzowany mikroskop z odwróconą fluorescencjąOlympusOlympus IX83
Laurell Spin CoatersLaurell TechnologiesWS-650MZ-23NPPB
Zestaw do barwienia żywych/martwych ssakówFisherL3224
Magiczna taśmaZszywki483535
Micro Medical Rurki (0,015" ID x 0,043" OD)Scientific Commodities, IncBB31695-PE/2
Mikro mieszadłoDaigger ScientificEF3288E
MilliporeSigma Kleszcze filtracyjneFisher scientificXX6200006P
Olej mineralnySigmaM8410-1L
mTeSR 1 Basal MediumSTEMCELL TECHNOLOGY85850
Igły ze stali nierdzewnej  14 GaugeDostawa CML901-14-025
Igły ze stali nierdzewnej  15 GaugeCML dostawa901-15-050
OptiPrepSTEMCELL TECHNOLOGY7820
PiekarnikThermo ScientificHERA THERM Piekarnik
Penicylina:Streptomycyna (10 000 U/ml Penicylina G, 10 mg/ml Streptomycyna)Gemini400-109
Petri Naczynie 150X20 Sterylny otwórwentylacyjny Sarstedt, Inc.82.1184.500
System czyszczenia plazmowegoYield Engineering System, Inc.YES-G500
Pluronic F-127SigmaP2443-250G
Poli(glikol etylenowy) 35kDaSigma94646-250G-F
Igła PrecisionGlide 27GBD305109
Inhibitor skał Y-27632 dihydroklorydSELLECK CHEMS1049-10mg
Wafel krzemowy 100mmWafel uniwersytecki452
Szkło ślizgowe (75 mm i ostre 25 mm)CardinalHealthM6146
Span 80SigmaS6760-250ML
SpeedMixerThinkyARE-310
Spin-X Filtr probówkowy wirówkowy (0,22 &mikro; m)Costar8160
SU-8 2025Kayaku Advanced MaterialsY111069 0500L1GL
SU-8 deweloperKayaku Advanced MaterialsY020100 4000L1PE
Surgical Design Royaltek Ostrza skalpela chirurgicznego ze stali nierdzewnej Fisherscientific22-079-684
SYLGARD TM 184 Zestaw elastomerów silikonowych (PDMS)Dow Corning2065622
Pompa strzykawkowaNew Era Pump System, IncNE-4000
TrietanoloaminaSigma-aldrichT58300-25G
TrypLE ExpressGibco12604-013
Rurka Tygon (0,02" ID x 0,06" OD)Cole-Parmer06419-01
Rurka Tygon (0,04" ID x 0,07" OD)Cole-Parmer06419-04
Myjka ultradźwiękowa FS20DFisher ScientificCPN-962-152R
Eksykator próżniowyBel-ArtF42025-0000
Mikroskop stereoskopowy Zeiss Stemi DV4 8x-32xZEISS435421-0000-000
μ Pisarka laserowa PG 101Heidelberg InstrumentsHI 1128
5

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhu, Z., Huangfu, D. Human pluripotent stem cells: an emerging model in developmental biology. Development. 140 (4), 705-717 (2013).
  2. Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. Advances in pluripotent stem cells: history, mechanisms, technologies, and applications. Stem Cell Reviews and Reports. 16 (1), 3-32 (2020).
  3. Chan, S. W., Rizwan, M., Yim, E. K. Emerging methods for enhancing pluripotent stem cell expansion. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 70(2020).
  4. Lei, Y., Schaffer, D. V. A fully defined and scalable 3D culture system for human pluripotent stem cell expansion and differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 5039-5048 (2013).
  5. Olmer, R., et al. Suspension culture of human pluripotent stem cells in controlled, stirred bioreactors. Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (10), 772-784 (2012).
  6. Kraehenbuehl, T. P., Langer, R., Ferreira, L. S. Three-dimensional biomaterials for the study of human pluripotent stem cells. Nature Methods. 8 (9), 731-736 (2011).
  7. Fattahi, P., et al. Core-shell hydrogel microcapsules enable formation of human pluripotent stem cell spheroids and their cultivation in a stirred bioreactor. Scientific Reports. 11 (1), 1-13 (2021).
  8. Siltanen, C., et al. Microfluidic fabrication of bioactive microgels for rapid formation and enhanced differentiation of stem cell spheroids. Acta Biomaterialia. 34, 125-132 (2016).
  9. Agarwal, P., et al. One-step microfluidic generation of pre-hatching embryo-like core-shell microcapsules for miniaturized 3D culture of pluripotent stem cells. Lab on a Chip. 13 (23), 4525-4533 (2013).
  10. Siltanen, C., et al. One step fabrication of hydrogel microcapsules with hollow core for assembly and cultivation of hepatocyte spheroids. Acta Biomaterialia. 50, 428-436 (2017).
  11. Rahimian, A., Siltanen, C., Feyzizarnagh, H., Escalante, P., Revzin, A. Microencapsulated immunoassays for detection of cytokines in human blood. ACS Sensors. 4 (3), 578-585 (2019).
  12. Kim, M., Lee, J., Jones, C. N., Revzin, A., Tae, G. Heparin-based hydrogel as a matrix for encapsulation and cultivation of primary hepatocytes. Biomaterials. 31, 3596-3603 (2010).
  13. Shin, D. S., et al. Photodegradable hydrogels for capture, detection, and release of live cells. Angewandte Chemie International Edition. , (2014).
  14. You, J., et al. Bioactive photodegradable hydrogel for cultivation and retrieval of embryonic stem cells. Advanced Functional Materials. , (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microfluidic EncapsulationCore Shell MicrocapsulesHuman Pluripotent Stem CellsStem Cell Spheroids3D Cell CultureHydrogel MicrocapsulesDroplet MicrofluidicsSpheroid FormationCell Viability AssayFluorescence Microscopy

Related Articles