Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ciągły test metylacji DNA sprzężony z endonukleazą oparty na fluorescencji w celu wykrycia inhibitorów metylotransferazy DNA

2.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62949

⸱

5 sierpnia 2022

 ,  , 
1Department of Chemistry, Bucknell University, 2Program in Cell Biology/Biochemistry, Bucknell University

W tym artykule

Podsumowanie

Metylotransferazy DNA są potencjalnymi celami leków przeciwnowotworowych. W tym miejscu przedstawiono protokół oceny małych cząsteczek pod kątem hamowania metylotransferazy DNA. Test ten wykorzystuje endonukleazę do sprzężenia metylacji DNA z generowaniem fluorescencji i pozwala na monitorowanie aktywności enzymu w czasie rzeczywistym.

Streszczenie

Metylacja DNA, forma epigenetycznej regulacji genów, jest ważna dla prawidłowego funkcjonowania komórek. W komórkach białka zwane metylotransferazami DNA (DNMT) ustanawiają i utrzymują wzorzec metylacji DNA. Zmiany w normalnym wzorcu metylacji DNA są związane z rozwojem i progresją raka, co sprawia, że DNMT są potencjalnymi celami leków przeciwnowotworowych. W związku z tym identyfikacja i charakterystyka nowych małocząsteczkowych inhibitorów tych enzymów ma ogromne znaczenie. W pracy przedstawiono protokół, który może być wykorzystany do badań przesiewowych w kierunku inhibitorów metylotransferazy DNA. Test kinetyki sprzężonej w sposób ciągły pozwala na określenie początkowych prędkości metylacji DNA w obecności i bez potencjalnych inhibitorów małocząsteczkowych. Test wykorzystuje wrażliwą na metyl endonukleazę Gla I do sprzężenia metylacji hemimetylowanego substratu DNA z wytwarzaniem fluorescencji.

Ten ciągły test pozwala na monitorowanie aktywności enzymów w czasie rzeczywistym. Przeprowadzanie testu w małych objętościach na płytkach do mikromiareczkowania zmniejsza koszt odczynników. Korzystając z tego testu, przeprowadzono małe przykładowe badanie przesiewowe dla inhibitorów DNMT1, najobficiej występującego izoenzymu DNMT u ludzi. Wysoce podstawiony naturalny produkt antrachinonowy, kwas lakowy A, jest silnym, konkurencyjnym inhibitorem DNA DNMT1. Tutaj badamy trzy potencjalne inhibitory małocząsteczkowe - antrachinony lub cząsteczki podobne do antrachinonu z jednym do trzech podstawników - w dwóch stężeniach, aby opisać protokół testu. Prędkości początkowe służą do obliczenia procentowej aktywności obserwowanej w obecności każdej cząsteczki. Jeden z trzech badanych związków wykazuje zależne od stężenia hamowanie aktywności DNMT1, co wskazuje, że jest potencjalnym inhibitorem DNMT1.

Wprowadzenie

Metylacja DNA jest ważnym znakiem epigenetycznym, który reguluje ekspresję genów i strukturę chromatyny. Metylacja zachodzi głównie w dinukleotydach CpG — cytozyny poprzedzającej guanozynę; grupa metylowa jest dodawana do pozycji 5 cytozyny. Prawidłowe wzory metylacji DNA, a tym samym właściwa ekspresja genów, są niezbędne do odpowiedniego rozwoju i funkcjonowania komórek. Wiele stanów chorobowych wiąże się ze zmianami w normalnym wzorze metylacji1,2,3. Na przykład istnieje związek między inicjacją i progresją nowotworu a zmianami w wzorcu metylacji DNA. Typowo komórki nowotworowe wykazują niższy ogólny poziom metylocytozyny, co przyczynia się do niestabilności genomu. Jednocześnie metylocytozyna obecna w genomie koncentruje się w regionach promotorowych genów supresorowych nowotworów, co prowadzi do wyciszenia genów tych istotnych białek. Co istotne, zmiany epigenetyczne są dynamiczne i odwracalne, w przeciwieństwie do mutacji DNA związanych z tumorigenezą. Sprawiło to, że białka zaangażowane w epigenetyczną regulację genów stały się interesującymi celami terapeutycznymi2,4.

Metylotransferazy DNA (DNMT) to białka odpowiedzialne za generowanie i utrzymywanie wzorów metylacji DNA. U ludzi występują trzy katalitycznie aktywne izozymy: DNMT1, DNMT3a i DNMT3b. Podczas rozwoju i różnicowania, metylotransferazy de novo, DNMT3a i DNMT3b, ustanawiają wzory metylacji. Oba enzymy mogą wiązać katalitycznie nieaktywne białko DNMT3L, tworząc kompleksy o zwiększonej aktywności1,5. Po podziale komórki komórki potomne zawierają DNA hemimetylowane — DNA zawierające metylocytozynę tylko w jednej nici dupleksu — ponieważ nowo zsyntetyzowane DNA jest pozbawione znaczników metylacji. Główną funkcją DNMT1 jest metylacja tego hemimetylowanego DNA, co prowadzi do przywrócenia pełnego wzoru metylacji1,5.

Związki między aktywnością DNMT a nowotworami są dobrze udokumentowane. Nadekspresja DNMT1, wynikająca z mechanizmów transkrypcyjnych lub potranslacyjnych, jest konsekwencją kilku powszechnych szlaków onkogennych6,7,8,9. Podejścia genetyczne mające na celu obniżenie aktywności DNMT1 przy użyciu alleli hypomorficznych skutkują zmniejszeniem formowania się guzów u myszy Apc(Min)10. Oligonukleotydy antysensowne powodujące knockdown DNMT1 hamują neoplazję w hodowlach komórkowych oraz w modelach nowotworowych u myszy11,12. Zatem hamowanie aktywności DNMT1 wydaje się obiecującym podejściem w terapii nowotworów. Jednakże role odgrywane przez izozymy DNMT3 nie są tak jednoznaczne. Mutacje DNMT3a występują w ostrej białaczkach szpikowej13 oraz w zespole mielodysplastycznym14. Wykazano, że przynajmniej jedna z zidentyfikowanych mutacji zmniejsza aktywność metylacji DNA enzymu15. Z drugiej strony, DNMT3b jest nadeksprymowany w raku piersi16 oraz raku jelita grubego17. Biorąc pod uwagę, że różne izozymy DNMT odgrywają odmienne role w kancerogenezie, kluczowe będzie zidentyfikowanie inhibitorów specyficznych dla poszczególnych izozymów. Związki te będą nie tylko użyteczne w opracowywaniu leków, ale inhibitory specyficzne dla izozymów stanowią również nieocenione narzędzie do analizy roli każdego izozymu DNMT w etiologii nowotworów.

W literaturze opisano wiele inhibitorów DNMT. Znane inhibitory DNMT można podzielić na dwie klasy: nukleozydowe i nienukleozydowe. Inhibitory nukleozydowe to zazwyczaj analogi cytydyny. Związki te są włączane do DNA i kowalencyjnie wiążą DNMT. 5-azacytydyna oraz 5-aza-2'-deoksycytydyna zostały zatwierdzone do leczenia zespołu mielodysplastycznego i ostrej białaczki szpikowej4,18. Problemem jest wysoka toksyczność, niska biodostępność oraz niestabilność chemiczna tych związków. Obecne badania analizują skuteczność nowej generacji inhibitorów nukleozydowych; przykładem jest SGI-110, pochodna 5-aza-2'-deoksycytydyny19,20. Inhibitory nukleozydowe nie są specyficzne dla izoenzymów i dezaktywują każdą napotkaną izoformę DNMT. W związku z tym leczenie środkiem nukleozydowym demetylującym prowadzi do wyczerpania wszystkich izoform DNMT4,18. Inhibitory nienukleozydowe nie muszą być wbudowywane do DNA, aby wywołać efekt hamujący. Zamiast tego cząsteczki te wiążą się bezpośrednio z DNMT, co stwarza możliwość inhibicji specyficznej dla konkretnej izoformy. Do tej pory odkryto kilka inhibitorów nienukleozydowych, w tym SGI-102721, hydrazynę22, procainamid23, RG108 i jego pochodne24, a także produkty naturalne, takie jak (−)-epigallokatechina-3-galczan (EGCG)25 oraz kwas lakaiczny A26,27. Większość odkrytych dotychczas inhibitorów nienukleozydowych nie jest selektywna względem izoenzymów lub wykazuje słabe preferencje wobec jednej izoformy DNMT. Ponadto moc tych cząsteczek wymaga poprawy, zwłaszcza w komórkach4,18. Istnieje zatem potrzeba odkrycia lub opracowania bardziej silnych i selektywnych względem izoform inhibitorów DNMT.

Przeszkodą w odkrywaniu nowych małocząsteczkowych inhibitorów DNMT są pracochłonne testy tradycyjnie stosowane do badania aktywności DNMT28. Testy te są zazwyczaj nieciągłe i składają się z wielu etapów. Aktywność enzymatyczna DNMT jest wciąż rutynowo badana przy użyciu radioaktywnej S-adenozylometioniny (SAM)29,30,31,32,33,34. Opracowano również nieradioaktywne testy metylacji DNA. Opisano na przykład testy wykorzystujące endonukleazy restrykcyjne wrażliwe na metylację oraz elektroforezę do rozdziału produktów trawienia35,36. Tego typu nieciągłe, wieloetapowe testy nie nadają się do sprawnego poszukiwania nowych leków. Od połowy lat 2000. opracowano kilka testów metylacji DNA o wyższej przepustowości28. Do przesiewania inhibitorów DNMT1 wykorzystano test bliskości scyntylacyjnej37. Inny test, wykorzystujący endonukleazę restrykcyjną wrażliwą na metylację, został zastosowany do przesiewania inhibitorów DNMT3a25,38. Choć oba testy pozwalały na uzyskanie wyższej przepustowości niż tradycyjne testy metylacji DNA, wymagają one wielu etapów i nie umożliwiają obserwacji aktywności metylacji w czasie rzeczywistym. Niedawno opisano test kinetyczny ciągły, który łączy tworzenie S-adenozylohomocysteiny (SAH), będącej jednym z produktów reakcji metylacji, ze zmianą spektroskopową przy 340 nm związaną z utlenianiem NADPH39. Test ten wykorzystuje trzy enzymy sprzęgające do generowania sygnału spektroskopowego.

Opracowaliśmy oparty na fluorescencji test metylacji DNA sprzężony z endonukleazą, który wykorzystuje pojedynczy, dostępny komercyjnie enzym sprzęgający i może generować dane w czasie rzeczywistym (Rycina 1). Jako substrat wykorzystuje się oligonukleotyd w formie spinki do włosów zawierający trzy metylocytyzyny. Substratowy DNA posiada fluorofor na końcu 5' oraz wygaszacz na końcu 3'. Metylacja hemimetylowanej sekwencji CpG tworzy miejsce cięcia dla endonukleazy Gla I — w pełni zmetylowane GCGC. Cięcie produktu oligonukleotydowego przez Gla I uwalnia fluorofor z wygaszacza, co generuje fluorescencję w czasie rzeczywistym. Test można wykorzystać do badania aktywności dowolnej izoformy DNMT; jednak wyższą aktywność obserwuje się w przypadku DNMT1, ponieważ izozym ten preferencyjnie metyluje DNA hemimetylowany1,5. Jeszcze silniejszą aktywność obserwuje się po usunięciu autoinhibicyjnej domeny RFTS (Replication Foci Targeting Sequence) z DNMT1. Domena ta, znajdująca się w N-końcowym regionie regulacyjnym, wiąże się z centrum katalitycznym i zapobiega wiązaniu DNA. Usunięcie pierwszych ok. 600 aminokwasów prowadzi do powstania skróconego enzymu, który jest znacznie bardziej aktywny niż enzym pełnowymiarowy (ok. 640-krotny wzrost kcat/Km)40. Ta aktywowana forma enzymu, określana jako DNMT1 pozbawiony domeny RFTS (aminokwasy 621–1616), pozwala na łatwiejszą identyfikację inhibitorów dzięki zwiększonej mocy katalitycznej. Niniejsza praca przedstawia protokół wykorzystania DNMT1 pozbawionego domeny RFTS w testach przesiewowych potencjalnych małocząsteczkowych inhibitorów. Przy użyciu ciągłego testu sprzężonego z endonukleazą wyznaczono prędkość początkową w obecności i w nieobecności kilku małych cząsteczek. Każdy potencjalny inhibitor badano w dwóch stężeniach, aby sprawdzić zależność inhibicji DNMT1 od stężenia. W każdym przypadku obliczono procent aktywności zaobserwowany w obecności małych cząsteczek.

Schemat metylacji DNA; proces DNMT1 z fluorescencją, wzbudzeniem, emisją, aktywnością enzymatyczną.
Rysunek 1: Test metylacji DNA. Jako substrat wykorzystuje się hemimetylowaną spinkę DNA z fluoroforem na końcu 5' i wygaszaczem na końcu 3'. DNMT1 katalizuje transfer grupy metylowej z S-adenozylometioniny do niemetylowanego miejsca CpG, generując S-adenozylohomocysteinę i w pełni zmetylowane DNA. Produkt DNA zawiera miejsce cięcia dla endonukleazy Gla I, która tnie w pełni zmetylowane sekwencje GCGC. Cięcie produktu DNA uwalnia fluorofor 5' z wygaszacza 3', co generuje fluorescencję. Skróty: Fl = fluorofor; Q = wygaszacz; DNMT1 = metylotransferaza DNA 1; SAM = S-adenozylometionina; SAH = S-adenozylohomocysteina. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie roztworów do testu przesiewowego

UWAGA: Stężenia substratów stosowanych w tym badaniu mogą zostać dostosowane. Dla DNMT1 pozbawionej domeny RFTS eksperymentalnie określone wartości Km dla substratu DNA w formie spinki oraz SAM wynoszą odpowiednio 1–2 nM i 2 µM26,40.

  1. Przygotować w probówkach do mikrocentryfugi na lodzie po 600 µL każdego badanego wariantu testowego.
    UWAGA: Całkowita objętość roztworu testowego zależy od liczby wykonywanych powtórzeń. W niniejszym protokole każdy wariant testowy przeprowadzono w trzech powtórzeniach.
    1. Do każdej probówki dodać ddH2O oraz 5x bufor do metylacji (250 mM Tris pH 7.5, 5 mM MgCl2, 500 mM glutaminianu potasu, 5 mM ditiotreitolu (DTT), 25% glicerolu), aby uzyskać końcowe stężenie buforu 1x. Dla testów zawierających 20 µM związku dodać 472 µL ddH2O i 120 µL buforu 5x. Dla testów zawierających 50 µM związku dodać 470 µL ddH2O i 120 µL buforu 5x.
    2. Do każdej próbki dodać 3,15 µL albuminy surowicy bydlęcej (BSA) o stężeniu 20 mg/mL.
    3. Do każdej próbki dodać 2 µL substratu DNA w formie spinki (hairpin DNA) o stężeniu 3,15 µM oraz 1,33 µL SAM o stężeniu 4,75 mM.
      UWAGA: Stężenie substratów w mieszaninie roztworu testowego wynosi 1,05x pożądanych stężeń końcowych.
    4. Do odpowiednich próbek dodać inhibitor do stężenia końcowego 21 µM (1,26 µL stężenia 10 mM) lub 52,5 µM (3,15 µL stężenia 10 mM). Do próbki kontrolnej dodać równoważną ilość dimetylosulfotlenku (DMSO).
      UWAGA: Stężenie inhibitora stosowane w badaniach przesiewowych może być zmienne. Maksymalne końcowe stężenie DMSO powinno wynosić ≤5% (v/v). Stężenia DMSO do 5% (v/v) nie wpływają na aktywność obserwowaną w teście26.
  2. Wymieszać roztwory za pomocą wibratora (vortex) (3 000 rpm) przez 3 s. Wirować próbki przez kilka sekund w laboratoryjnej mikrocentryfarze (1 200 × g), aby upewnić się, że roztwór zgromadził się na dnie probówki.
  3. Nanieść po 95 µL każdego roztworu testowego do 6 kolejnych dołków w czarnej płytce 96-dołkowej o zredukowanej powierzchni (half-area plate) (Rysunek 2).
    UWAGA: Te badania przesiewowe przeprowadzono w dwóch seriach. Najpierw zbadano próbki z 20 µM inhibitora (łącznie 4 warianty), a następnie próbki z 50 µM inhibitora (łącznie 4 warianty).

Schemat porównania warunków z wykorzystaniem kolorowych kół do wizualnej analizy danych.
Rycina 2: Układ płytki do testu. Każdy roztwór testowy jest rozdzielany do sześciu dołków w czarnej płytce 96-dołkowej: kontrola DMSO (niebieski), związek 1 (zielony), związek 2 (czerwony) oraz związek 3 (żółty). Zarówno DNMT1 pozbawiony RFTS, jak i Gla I zostaną dodane do trzech dołków. Jako kontrolę, sam Gla I zostanie dodany do pozostałych trzech dołków. Skróty: RFTS = Replication Foci Targeting Sequence; DNMT1 = DNA methyltransferase 1; DMSO = dimethylsulfoxide. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

2. Przygotowanie roztworów enzymów do przesiewu

UWAGA: DNMT1 pozbawiony domeny RFTS może być wyrażany w E. coli i oczyszczany do homogenności. Procedury ekspresji i oczyszczania DNMT1 pozbawionego RFTS zostały opisane wcześniej41. Objętość potrzebnego enzymu zależy od liczby przeprowadzanych analiz. W niniejszym przypadku w każdym zestawie wykonuje się cztery różne analizy; każda analiza jest przeprowadzana w trzech powtórzeniach.

  1. Przygotować 75 µL każdego z roztworów enzymów w probówkach do mikrocentryfugi na lodzie.
    UWAGA: Potrzebne będą dwa roztwory enzymów. Jeden roztwór będzie zawierał DNMT1 i Gla I, a drugi będzie zawierał tylko Gla I.
    1. Do każdej probówki dodać ddH2O oraz 5x bufor do metylacji (250 mM Tris pH 7.5, 5 mM MgCl2, 500 mM glutaminian potasu, 5 mM DTT, 25% glicerolu), aby uzyskać końcowe stężenie buforu 1x. Do roztworu enzymu Gla I dodać 15 µL 5x buforu i 58,8 µL ddH2O. Do roztworu enzymów DNMT1+Gla I dodać 15 µL 5x buforu i 58,2 µL ddH2O.
    2. Do każdego roztworu dodać 1,2 µL Gla I o stężeniu 10 U/µL, aby uzyskać końcowe stężenie 0,16 U/µL.
    3. Do roztworu DNMT1+Gla I dodać 0,6 µL DNMT1 pozbawionego domeny RFTS o stężeniu 5 µM, aby uzyskać końcowe stężenie 40 nM.
  2. Delikatnie opukiwać probówki, aby wymieszać roztwory. Wirować próbki przez kilka sekund w miniwirówce nakładkowej (1 200 × g), aby upewnić się, że roztwór zebrał się na dnie probówki.
  3. Odmiarkować 12 µL każdego roztworu enzymu do 6 dołków w 96-dołkowej płytce z dnem stożkowym (Rysunek 3).

Schemat sekwencyjny z naprzemiennymi niebieskimi i szarymi okręgami, ilustrujący koncepcję periodyczności.
Rysunek 3: Przygotowanie płytki z enzymem. Roztwory Gla I (szare) oraz DNMT1+Gla I (niebieskie) są rozdzielane w ilościach aliquotowych do sześciu dołków w płytce 96-dołkowej. Za pomocą pipety wielokanałowej enzym można dodać jednocześnie do rzędu roztworów testowych. Dla każdego warunku testowego (sześć dołków), trzy dołki otrzymają DNMT1+Gla I, a trzy dołki otrzymają sam Gla I. Skrót: DNMT1 = DNA methyltransferase 1. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

3. Przeprowadzenie analizy i analiza danych.

  1. Podgrzej czytnik płytek do 37 °C. Włóż czarną płytkę zawierającą roztwory do analizy. Wstrząśnij płytką (podwójny ruch orbitalny z częstotliwością 425 cpm przez 5 s) i zmierz fluorescencję przy długości fali wzbudzenia 485 nm i długości fali emisji 528 nm. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 °C przez 5 min.
    UWAGA: Alternatywnie do pomiarów fluorescencji można zastosować filtry o odpowiednich zakresach odcięcia długości fali.
  2. Wyjmij płytkę do analizy. Dodaj 5 µL roztworu enzymu do każdej studzienki i wymieszaj poprzez pipetowanie w górę i w dół.
    UWAGA: Użyj pipet wielokanałowych, aby reakcje w całym rzędzie próbek mogły rozpocząć się jednocześnie.
  3. Włóż płytkę do czytnika. Rejestruj fluorescencję co 53 s przez 30 min. Wstrząśnij płytką (podwójny ruch orbitalny z częstotliwością 425 cpm przez 4 s) przed każdym pomiarem.
  4. Wyznacz średnią z trzech powtórzeń kontrolnych analiz Gla I dla każdego warunku. Odejmij średnią krzywą reakcji kontrolnej z Gla I od trzech krzywych uzyskanych w obecności DNMT1 pozbawionego RFTS. Oblicz średnią oraz błąd standardowy średniej dla skorygowanych powtórzeń.
  5. Nanieś na wykres średnią skorygowaną krzywą reakcji i dopasuj linię do początkowego odcinka liniowego w celu wyznaczenia prędkości początkowej.
  6. Wyznacz procent aktywności, dzieląc prędkość obserwowaną w obecności związku przez prędkość obserwowaną w reakcji kontrolnej z DMSO i mnożąc wynik przez 100.

4. Dodatkowa kontrola testu — sekwencyjne dodawanie enzymów

  1. Przygotować 550 µL roztworu do testu w probówce do mikrocentryfugi na lodzie. Dodać 110 µL 5x buforu do metylacji, 3,88 µL 3,15 µM substratu DNA w formie spinki (hairpin DNA), 6,43 µL 47,5 mM SAM, 3,06 µL 20 mg/mL BSA oraz 426,6 µL ddH2O.
  2. Wymieszać roztwór za pomocą wortexowania (3 000 rpm) przez 3 s. Wirować próbki przez kilka sekund w laboratoryjnej miniwirówce (1 200 × g), aby upewnić się, że roztwór zebrał się na dnie probówki.
  3. Nanieść po 90 µL roztworu do testu do 6 kolejnych dołków w czarnej płytce 96-dołkowej o zredukowanej powierzchni (half-area).
  4. Przygotować roztwory enzymu DNMT1 na lodzie. Do jednej probówki dodać 4 µL 5x buforu do metylacji, 0,76 µL 5 µM DNMT1 pozbawionego domeny RFTS oraz 15,24 µL ddH2O. Do drugiej probówki dodać 4 µL 5x buforu do metylacji i 16 µL ddH2O.
  5. Delikatnie opukać probówki, aby wymieszać roztwory. Wirować próbki przez kilka sekund w laboratoryjnej miniwirówce (1 200 × g), aby upewnić się, że roztwór zebrał się na dnie probówki.
  6. Dodać 5 µL roztworu zawierającego DNMT1 do trzech dołków w czarnej płytce 96-dołkowej o zredukowanej powierzchni. Dodać 5 µL roztworu kontrolnego z buforem do pozostałych trzech dołków.
  7. Umieścić płytkę mikrotytrową w czytniku płytek podgrzanym do 37 °C. Wstrząsnąć płytką (podwójny ruch orbitalny z częstotliwością 425 cpm przez 3 s) i zmierzyć fluorescencję przy długości fali wzbudzenia 485 nm i długości fali emisji 528 nm. Powtarzać wstrząsanie i pomiar co 60 s przez 30 min.
  8. Podczas gdy płytka do testu znajduje się w czytniku, przygotować roztwór Gla I na lodzie. Do probówki do mikrocentryfugi dodać 8 µL 5x buforu do metylacji, 0,64 µL 10 U/µL Gla I oraz 31,4 µL ddH2O. Delikatnie opukać probówkę, aby wymieszać roztwór. Wirować próbkę przez kilka sekund w laboratoryjnej miniwirówce (1 200 × g), aby upewnić się, że roztwór zebrał się na dnie probówki.
  9. Nanieść po 6 µL roztworu Gla I do 6 dołków w płytce 96-dołkowej z dnem stożkowym.
  10. Po zakończeniu wstępnego 30-minutowego pomiaru wyjąć czarną płytkę z czytnika. Dodać 5 µL roztworu Gla I do wszystkich 6 dołków i wymieszać poprzez pipetowanie w górę i w dół.
    UWAGA: Należy użyć pipety wielokanałowej, aby reakcję we wszystkich dołkach można było rozpocząć jednocześnie.
  11. Umieścić czarną płytkę z powrotem w czytniku. Rejestrować fluorescencję co 35 s przez 35 min. Wstrząsnąć płytką (podwójny ruch orbitalny z częstotliwością 425 cpm przez 3 s) przed każdym pomiarem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Warunkiem koniecznym do przeprowadzenia tej analizy jest aktywna DNMT1. DNMT1 pozbawiona domeny RFTS została wyekspresjonowana w E.coli i oczyszczona do homogenności zgodnie z wcześniej opisanymi procedurami41. Aby upewnić się, że oczyszczony enzym był aktywny, w celu zbadania aktywności metylacji DNA zastosowano nieciągły test sprzężony z endonukleazą36. W teście tym wykorzystano dupleks DNA o długości 32 par zasad z pojedynczym hemimetylowanym CpG zlokalizowanym ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Aby zidentyfikować i scharakteryzować inhibitory metylotransferaz DNA, należy zmierzyć aktywność enzymu. Istnieje kilka metod badania aktywności metylotransferazy DNA. Aktywność jest powszechnie monitorowana za pomocą promieniotwórczości; transfer znakowanej grupy metylowej SAM można określić ilościowo 29,30,31,32,33,34. Opis...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Autorzy dziękują Uniwersytetowi Bucknell i Wydziałowi Chemii za wsparcie tej pracy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
96-dołkowy polistyren o płaskim dnie o połowie powierzchni bez obróbkiMikropłytka Corning3694
96-dołkowe stożkowe płyty dolne z polistyrenuThermoFisher249570
Albumina surowicy bydlęcej ZwiązekNEBB9000S
1ChemBridge5812086związek przesiewowy; zawieszony w DMSO do 10 mM
związek 2ChemBridge6722175związek przesiewowy; ponownie zawieszony w DMSO do 10 mM
związek 3ChemBridge5249376związek przesiewowy; ponownie zawieszony w DMSO do 10 mM
DitiothreitolSigmaD0632
Gla ISibEnzymeE494metylowrażliwa endonukleaza
GlycerolRPIG22025
Chlorek magnezuSigmaM0250
(5'-FAM-CCTATGCGmCATCAGTTTTCTGATGmCGmCATAGG-3'-Iowa Black Quencher)IDTspecjalnie zsyntetyzowanywewnętrznie hartowany DNA spinki do włosów (substrat)
Glutaminian potasuSigmaG1501
S-adenozylometioninaSigmaA4377kofaktor (substrat)
Tris BaseRPIZobacz materiał T60040
Oligonukleotyd TGL

Bibliografia

  1. Jurkowska, R. Z., Jurkowski, T. P., Jeltsch, A. Structure and function of mammalian DNA methyltransferases. Chembiochem. 12 (2), 206-222 (2011).
  2. Hamidi, T., Singh, A. K., Chen, T. Genetic alterations of DNA methylation machinery in human diseases. Epigenomics. 7 (2), 247-265 (2015).
  3. Norvil, A. B., Saha, D., Dar, M. S., Gowher, H. Effect of disease-associated germline mutations on structure function relationship of DNA methyltransferases. Genes. 10 (5), 369(2019).
  4. Foulks, J. M., et al. Epigenetic drug discovery: targeting DNA methyltransferases. Journal of Biomolecular Screening. 17 (1), 2-17 (2012).
  5. Goll, M. G., Bestor, T. H. Eukaryotic cytosine methyltransferases. Annual Review of Biochemistry. 74, 481-514 (2005).
  6. Bigey, P., Ramchandani, S., Theberge, J., Araujo, F. D., Szyf, M. Transcriptional regulation of the human DNA Methyltransferase (dnmt1) gene. Gene. 242 (1-2), 407-418 (2000).
  7. Detich, N., Ramchandani, S., Szyf, M. A conserved 3'-untranslated element mediates growth regulation of DNA methyltransferase 1 and inhibits its transforming activity. Journal of Biological Chemistry. 276 (27), 24881-24890 (2001).
  8. MacLeod, A. R., Rouleau, J., Szyf, M. Regulation of DNA methylation by the Ras signaling pathway. Journal of Biological Chemistry. 270 (19), 11327-11337 (1995).
  9. Slack, A., Cervoni, N., Pinard, M., Szyf, M. DNA methyltransferase is a downstream effector of cellular transformation triggered by simian virus 40 large T antigen. Journal of Biological Chemistry. 274 (15), 10105-10112 (1999).
  10. Eads, C. A., Nickel, A. E., Laird, P. W. Complete genetic suppression of polyp formation and reduction of CpG-island hypermethylation in Apc(Min/+) Dnmt1-hypomorphic mice. Cancer Research. 62, 1296-1299 (2002).
  11. MacLeod, A. R., Szyf, M. Expression of antisense to DNA methyltransferase mRNA induces DNA demethylation and inhibits tumorigenesis. Journal of Biological Chemistry. 270 (14), 8037-8043 (1995).
  12. Ramchandani, S., MacLeod, A. R., Pinard, M., von Hofe, E., Szyf, M. Inhibition of tumorigenesis by a cytosine-DNA, methyltransferase, antisense oligodeoxynucleotide. Proceedings of the National Academy Sciences of the United States of America. 94 (2), 684-689 (1997).
  13. Ley, T. J., et al. DNMT3A mutations in acute myeloid leukemia. New England Journal of Medicine. 363, 2424-2433 (2010).
  14. Walter, M. J., et al. Recurrent DNMT3A mutations in patients with myelodysplastic syndromes. Leukemia. 25 (7), 1153-1158 (2011).
  15. Russler-Germain, D. A., et al. The R882H DNMT3A mutation associated with AML dominantly inhibits wild-type DNMT3A by blocking its ability to form active tetramers. Cancer Cell. 25 (4), 442-454 (2014).
  16. Roll, J. D., Rivenbark, A. G., Jones, W. D., Coleman, W. B. DNMT3b overexpression contributes to a hypermethylator phenotype in human breast cancer cell lines. Molecular Cancer. 7, 15(2008).
  17. Nosho, K., et al. DNMT3B expression might contribute to CpG island methylator phenotype in colorectal cancer. Clinical Cancer Research. 15 (11), 3663-3671 (2009).
  18. Erdmann, A., Halby, L., Fahy, J., Arimondo, P. B. Targeting DNA methylation with small molecules: what's next. Journal of Medicinal Chemistry. 58 (6), 2569-2583 (2015).
  19. Chuang, J. C., et al. S110, a 5-Aza-2'-deoxycytidine-containing dinucleotide, is an effective DNA methylation inhibitor in vivo and can reduce tumor growth. Molecular Cancer Therapeutics. 9 (5), 1443-1450 (2010).
  20. Issa, J. J., et al. Safety and tolerability of guadecitabine (SGI-110) in patients with myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukaemia: a multicentre, randomised, dose-escalation phase 1 study. Lancet Oncology. 16 (9), 1099-1110 (2015).
  21. Datta, J., et al. A new class of quinoline-based DNA hypomethylating agents reactivates tumor suppressor genes by blocking DNA methyltransferase 1 activity and inducing its degradation. Cancer Research. 69 (10), 4277-4285 (2009).
  22. Zambrano, P., et al. A phase I study of hydralazine to demethylate and reactivate the expression of tumor suppressor genes. BMC Cancer. 5, 44(2005).
  23. Lee, B. H., Yegnasubramanian, S., Lin, X., Nelson, W. G. Procainamide is a specific inhibitor of DNA methyltransferase 1. Journal of Biological Chemistry. 280 (49), 40749-40756 (2005).
  24. Asgatay, S., et al. Synthesis and evaluation of analogues of N-phthaloyl-l-tryptophan (RG108) as inhibitors of DNA methyltransferase 1. Journal of Medicinal Chemstry. 57 (2), 421-434 (2014).
  25. Ceccaldi, A., et al. C5-DNA methyltransferase inhibitors: from screening to effects on zebrafish embryo development. Chembiochem. 12 (9), 1337-1345 (2011).
  26. Fagan, R. L., Wu, M., Chédin, F., Brenner, C. An ultrasensitive high throughput screen for DNA methyltransferase 1-targeted molecular probes. PLoS One. 8 (11), 78752(2013).
  27. Fagan, R. L., Cryderman, D. E., Kopelovich, L., Wallrath, L. L., Brenner, C. Laccaic acid A is a direct, DNA-competitive inhibitor of DNA methyltransferase 1. Journal of Biological Chemistry. 288 (33), 23858-23867 (2013).
  28. Eglen, R. M., Reisine, T. Screening for compounds that modulate epigenetic regulation of the transcriptome: an overview. Journal of Biomolecular Screening. 16 (10), 1137-1152 (2011).
  29. Holz-Schietinger, C., Matje, D. M., Reich, N. O. Mutations in DNA methyltransferase (DNMT3A) observed in acute myeloid leukemia patients disrupt processive methylation. Journal of Biological Chemistry. 287 (37), 30941-30951 (2012).
  30. Norvil, A. B., et al. Dnmt3b methylates DNA by a noncooperative mechanism, and its activity is unaffected by manipulations at the predicted dimer interface. Biochemistry. 57 (29), 4312-4324 (2018).
  31. Bashtrykov, P., Ragozin, S., Jeltsch, A. Mechanistic details of the DNA recognition by the Dnmt1 DNA methyltransferase. FEBS Letters. 586 (13), 1821-1823 (2012).
  32. Bashtrykov, P., et al. Targeted mutagenesis results in an activation of DNA methyltransferase 1 and confirms an autoinhibitory role of its RFTS domain. Chembiochem. 15 (5), 743-748 (2014).
  33. Berkyurek, A. C., et al. The DNA methyltransferase Dnmt1 directly interacts with the SET and RING finger-associated (SRA) domain of the multifunctional protein Uhrf1 to facilitate accession of the catalytic center to hemi-methylated DNA. Journal of Biological Chemistry. 289 (1), 379-386 (2014).
  34. Kanada, K., Takeshita, K., Suetake, I., Tajima, S., Nakagawa, A. Conserved threonine 1505 in the catalytic domain stabilizes mouse DNA methyltransferase 1. Journal of Biochemistry. 162 (4), 271-278 (2017).
  35. Bashtrykov, P., et al. Specificity of Dnmt1 for methylation of hemimethylated CpG sites resides in its catalytic domain. Chemistry & Biology. 19 (5), 572-578 (2012).
  36. Dolen, E. K., McGinnis, J. H., Tavory, R. N., Weiss, J. A., Switzer, R. L. Disease-associated mutations G589A and V590F relieve replication focus targeting sequence-mediated autoinhibition of DNA methyltransferase 1. Biochemistry. 58 (51), 5151-5159 (2019).
  37. Kilgore, J. A., et al. Identification of DNMT1 selective antagonists using a novel scintillation proximity assay. Journal of Biological Chemistry. 288 (27), 19673-19684 (2013).
  38. Ceccaldi, A., et al. Identification of novel inhibitors of DNA methylation by screening of a chemical library. ACS Chemical Biology. 8 (3), 543-548 (2013).
  39. Duchin, S., Vershinin, Z., Levy, D., Aharoni, A. A continuous kinetic assay for protein and DNA methyltransferase enzymatic activities. Epigenetics & Chromatin. 8, 56(2015).
  40. Syeda, F., et al. The replication focus targeting sequence (RFTS) domain is a DNA-competitive inhibitor of Dnmt1. Journal of Biological Chemistry. 286 (17), 15344-15351 (2011).
  41. Switzer, R. L., Medrano, J., Reedel, D. A., Weiss, J. Substituted anthraquinones represent a potential scaffold for DNA methyltransferase 1-specific inhibitors. PLoS One. 14 (7), 0219830(2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Test fluorescencyjnytest sprzężony z endonukleaząinhibitory DNMT1czytnik płytekenzym Gla Imałocząsteczkowe inhibitoryregulacja epigenetyczna
Ciągły test metylacji DNA sprzężony z endonukleazą oparty na fluorescencji w celu wykrycia inhibitorów metylotransferazy DNA
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.