Method Article

Ciągły test metylacji DNA sprzężony z endonukleazą oparty na fluorescencji w celu wykrycia inhibitorów metylotransferazy DNA

DOI:

10.3791/62949

⸱

August 5th, 2022

 ,  , 
1Department of Chemistry, Bucknell University, 2Program in Cell Biology/Biochemistry, Bucknell University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metylotransferazy DNA są potencjalnymi celami leków przeciwnowotworowych. W tym miejscu przedstawiono protokół oceny małych cząsteczek pod kątem hamowania metylotransferazy DNA. Test ten wykorzystuje endonukleazę do sprzężenia metylacji DNA z generowaniem fluorescencji i pozwala na monitorowanie aktywności enzymu w czasie rzeczywistym.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metylacja DNA, forma epigenetycznej regulacji genów, jest ważna dla prawidłowego funkcjonowania komórek. W komórkach białka zwane metylotransferazami DNA (DNMT) ustanawiają i utrzymują wzorzec metylacji DNA. Zmiany w normalnym wzorcu metylacji DNA są związane z rozwojem i progresją raka, co sprawia, że DNMT są potencjalnymi celami leków przeciwnowotworowych. W związku z tym identyfikacja i charakterystyka nowych małocząsteczkowych inhibitorów tych enzymów ma ogromne znaczenie. W pracy przedstawiono protokół, który może być wykorzystany do badań przesiewowych w kierunku inhibitorów metylotransferazy DNA. Test kinetyki sprzężonej w sposób ciągły pozwala na określenie początkowych prędkości metylacji DNA w obecności i bez potencjalnych inhibitorów małocząsteczkowych. Test wykorzystuje wrażliwą na metyl endonukleazę Gla I do sprzężenia metylacji hemimetylowanego substratu DNA z wytwarzaniem fluorescencji.

Ten ciągły test pozwala na monitorowanie aktywności enzymów w czasie rzeczywistym. Przeprowadzanie testu w małych objętościach na płytkach do mikromiareczkowania zmniejsza koszt odczynników. Korzystając z tego testu, przeprowadzono małe przykładowe badanie przesiewowe dla inhibitorów DNMT1, najobficiej występującego izoenzymu DNMT u ludzi. Wysoce podstawiony naturalny produkt antrachinonowy, kwas lakowy A, jest silnym, konkurencyjnym inhibitorem DNA DNMT1. Tutaj badamy trzy potencjalne inhibitory małocząsteczkowe - antrachinony lub cząsteczki podobne do antrachinonu z jednym do trzech podstawników - w dwóch stężeniach, aby opisać protokół testu. Prędkości początkowe służą do obliczenia procentowej aktywności obserwowanej w obecności każdej cząsteczki. Jeden z trzech badanych związków wykazuje zależne od stężenia hamowanie aktywności DNMT1, co wskazuje, że jest potencjalnym inhibitorem DNMT1.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metylacja DNA jest ważnym znakiem epigenetycznym, który reguluje ekspresję genów i strukturę chromatyny. Metylacja zachodzi głównie w dinukleotydach CpG — cytozynie, a następnie guanozynie; Grupę metylową dodaje się do pozycji 5 cytozyny. Prawidłowe wzorce metylacji DNA, a tym samym prawidłowa ekspresja genów, są potrzebne do prawidłowego rozwoju i funkcjonowania komórek. Wiele stanów chorobowych wiąże się ze zmianami w normalnym wzorcu metylacji1,2,3. Na przykład istnieje związek między inicjacją i progresją raka a zmianami we wzorcu metylacji DNA. Zazwyczaj komórki rakowe wykazują niższy ogólny poziom metylocytozyny, co przyczynia się do niestabilności genomu. W tym samym czasie metylocytozyna obecna w genomie jest skoncentrowana w regionach promotorowych genów supresorowych nowotworu, co prowadzi do wyciszenia genów tych ważnych białek. Warto zauważyć, że zmiany epigenetyczne są dynamiczne i odwracalne, w przeciwieństwie do mutacji DNA związanych z nowotworzeniem nowotworów. To sprawiło, że białka zaangażowane w epigenetyczną regulację genów stały się interesującymi celami dla leków2,4.

Metylotransferazy DNA (DNMT) to białka odpowiedzialne za generowanie i utrzymywanie wzorców metylacji DNA. U ludzi występują trzy katalitycznie aktywne izoenzymy, DNMT1, DNMT3a i DNMT3b. Podczas rozwoju i różnicowania metylotransferazy de novo, DNMT3a i DNMT3b, ustalają wzorce metylacji. Oba enzymy mogą wiązać katalitycznie nieaktywne białko DNMT3L, tworząc kompleksy, które wykazują zwiększoną aktywność1,5. Po podziale komórki komórki potomne zawierają hemimetylowane DNA - DNA zawierające metylocytozynę tylko w jednej nici dupleksu - ponieważ nowo zsyntetyzowane DNA jest pozbawione śladów metylacji. Główną funkcją DNMT1 jest metylacja tego hemimetylowanego DNA, a tym samym przywrócenie pełnego wzorca metylacji1,5.

Powiązania między aktywnością DNMT a rakiem są dobrze znane. Nadekspresja DNMT1, zarówno przez mechanizmy transkrypcyjne, jak i potranslacyjne, jest konsekwencją kilku powszechnych szlaków onkogennych6,7,8,9. Genetyczne podejścia do obniżenia aktywności DNMT1 przy użyciu alleli hipomorficznych skutkują zmniejszonym tworzeniem guza u myszy Apc(Min)10. Oligonukleotydy antysensowne, które powalają DNMT1, hamują neoplazję w hodowlach komórkowych i mysich modelach nowotworów11,12. Dlatego hamowanie aktywności DNMT1 wydaje się obiecującym podejściem do terapii raka. Jednak role, jakie odgrywają izoenzymy DNMT3, nie są takie proste. Mutacje DNMT3a występują w ostrej białaczce szpikowej13 i zespole mielodysplastycznym14. Wykazano, że co najmniej jedna ze zidentyfikowanych mutacji zmniejsza aktywność metylacji DNA enzymu15. Jednak DNMT3b ulega nadekspresji w raku piersi16 i raku jelita grubego17. Ponieważ różne izoenzymy DNMT odgrywają różne role w kancerogenezie, identyfikacja inhibitorów specyficznych dla izoenzymów będzie miała kluczowe znaczenie. Związki te będą nie tylko przydatne do opracowywania środków terapeutycznych, ale inhibitory specyficzne dla izoenzymów będą również nieocenionym narzędziem do analizy roli każdego izoenzymu DNMT w etiologii raka.

W literaturze opisano kilka inhibitorów DNMT. Znane inhibitory DNMT można podzielić na dwie klasy: nukleozydowe i nienukleozydowe. Inhibitory nukleozydów są zazwyczaj analogami cytydyny. Związki te są włączane do DNA i kowalencyjnie wychwytują DNMT. 5-azacytydyna i 5-aza-2'-deoksycytydyna zostały zatwierdzone do leczenia zespołu mielodysplastycznego i ostrej białaczki szpikowej4,18. Wysoka toksyczność, niska biodostępność i niestabilność chemiczna tych związków stanowią problem. Trwające prace mają na celu zbadanie skuteczności inhibitorów nukleozydów nowej generacji; SGI-110, pochodzący od 5-aza-2'-deoksycytydyny, jest jednym z przykładów19,20. Inhibitory nukleozydów nie są specyficzne dla izoenzymu i dezaktywują każdy napotkany izoenzym DNMT. W związku z tym leczenie środkiem demetylującym nukleozydy powoduje wyczerpanie wszystkich izoenzymów DNMT4,18. Inhibitory inne niż nukleozydy nie muszą być włączane do DNA, aby wywierać działanie hamujące. Zamiast tego cząsteczki te wiążą się bezpośrednio z DNMT, wprowadzając możliwość hamowania specyficznego dla izoenzymu. Do tej pory odkryto kilka inhibitorów niebędących nukleozydami, w tym SGI-102721, hydralazyna22, prokainamid23, RG108 i pochodne24, oraz produkty naturalne, (−)-3-galusan epigallokatechiny (EGCG)25 i kwas lakowy A26,27. Większość odkrytych do tej pory inhibitorów niebędących nukleozydami nie jest selektywna pod względem izoenzymów lub wykazuje słabe preferencje dla jednego izoenzymu DNMT. Ponadto siła działania tych cząsteczek musi zostać poprawiona, zwłaszcza w komórkach4,18. W związku z tym istnieje potrzeba odkrycia lub opracowania silniejszych, selektywnych izoenzymów inhibitorów DNMT.

Przeszkodą w odkrywaniu nowych małocząsteczkowych inhibitorów DNMT są pracochłonne testy tradycyjnie używane do badania aktywności DNMT28. Testy są zwykle nieciągłe i składają się z wielu etapów. Aktywność enzymatyczna DNMT jest nadal rutynowo oznaczana przy użyciu radioaktywnej S-adenozylometioniny (SAM)29,30,31,32,33,34. Opracowano również nieradioaktywne testy metylacji DNA. Na przykład opisano testy wykorzystujące wrażliwe na metyl endonukleazy restrykcyjne i elektroforezę do oddzielania produktów trawienia35,36. Tego typu nieciągłe, wieloetapowe testy nie są łatwo podatne na odkrywanie leków. Od połowy 2000 roku opracowano kilka testów metylacji DNA o wyższej przepustowości28. Do badań przesiewowych na obecność inhibitorów DNMT1 wykorzystano zbliżeniowy test scyntylacyjny37. Inny test wykorzystujący endonukleazę restrykcyjną wrażliwą na metyl został wykorzystany do badania przesiewowego na obecność inhibitorów DNMT3a25,38. Chociaż oba testy pozwoliły na wyższą przepustowość niż tradycyjne testy metylacji DNA, testy wymagają wielu etapów i nie pozwalają na obserwację aktywności metylacji w czasie rzeczywistym. Niedawno opisano ciągły test kinetyczny, który łączy tworzenie S-adenozylohomocysteiny (SAH), jednego z produktów reakcji metylacji, ze zmianą spektroskopową przy 340 nm związaną z utlenianiem NADPH39. Ten test wykorzystuje trzy enzymy sprzęgające do generowania sygnału spektroskopowego.

Opracowaliśmy oparty na fluorescencji test metylacji DNA sprzężony z endonukleazą, który wykorzystuje pojedynczy dostępny na rynku enzym sprzęgający i może generować dane w czasie rzeczywistym (Rysunek 1). Jako substrat stosuje się oligonukleotyd spinki do włosów zawierający trzy metylocytozyny. Substrat DNA zawiera fluorofor na końcu 5' i wygaszacz na końcu 3'. Metylacja hemimetylowanego miejsca CpG generuje miejsce rozszczepienia dla endonukleazy Gla I — w pełni metylowanej GCGC. Rozszczepienie Gla I oligonukleotydu produktu uwalnia fluorofor z wygaszacza i generuje fluorescencję w czasie rzeczywistym. Test może być wykorzystany do zbadania aktywności dowolnej izoformy DNMT; jednak wyższą aktywność obserwuje się w przypadku DNMT1, ponieważ ten izoenzym preferencyjnie metyluje hemimetylowane DNA1,5. Jeszcze silniejszą aktywność obserwuje się, jeśli domena autoinhibitoryjnej sekwencji ukierunkowanej na ogniska replikacji (RFTS) zostanie usunięta z DNMT1. Ta domena, znajdująca się w N-końcowym regionie regulatorowym, wiąże się z miejscem katalitycznym i zapobiega wiązaniu DNA. Usunięcie pierwszych ~600 aminokwasów powoduje powstanie okrojonego enzymu, który jest znacznie bardziej aktywny niż enzym o pełnej długości (~640-krotny wzrost kcat/Km)40. Ta aktywowana forma enzymu, określana jako DNMT1 (aminokwasy 621–1616) bez RFTS, pozwala na łatwiejszą identyfikację inhibitorów ze względu na zwiększoną moc katalityczną. W artykule przedstawiono protokół wykorzystania DNMT1 bez RFTS w testach przesiewowych pod kątem potencjalnych inhibitorów małocząsteczkowych. Za pomocą ciągłego testu sprzężonego z endonukleazą prędkość początkową określa się w obecności i bez kilku małych cząsteczek. Każdy potencjalny inhibitor jest badany w dwóch stężeniach w celu znalezienia zależnego od stężenia hamowania DNMT1. Procentowa aktywność obserwowana w obecności małych cząsteczek została obliczona w każdym przypadku.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Test metylacji DNA. Jako substrat stosuje się hemimetylowane DNA spinki do włosów z fluoroforem na końcu 5' i wygaszaczem na końcu 3'. DNMT1 katalizuje przenoszenie grupy metylowej z S-adenozylometioniny do niemetylowanego miejsca CpG, generując S-adenozylohomocysteinę i w pełni metylowane DNA. Produkt DNA zawiera miejsce rozszczepienia endonukleazy Gla I, która rozszczepia w pełni zmetylowane miejsca GCGC. Rozszczepienie DNA produktu uwalnia fluorofor 5' z wygaszacza 3', generując fluorescencję. Skróty: Fl = fluorofor; Q = wygaszacz; DNMT1 = metylotransferaza DNA 1; SAM = S-adenozylometionina; SAH = S-adenozylohomocysteina. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotuj roztwory testowe do badania przesiewowego

UWAGA: Stężenia substratów używanych w tym teście mogą być dostosowane. W przypadku DNMT1 bez RFTS, eksperymentalnie określone wartości Km dla substratu DNA spinki do włosów i SAM wynoszą odpowiednio 1–2 nM i 2 μM26,40.

  1. Przygotować 600 μl każdego badanego warunku oznaczania w probówkach do mikrowirówek na lodzie.
    UWAGA: Całkowita wymagana objętość roztworu testowego zależy od liczby przeprowadzanych kontrprób. Każdy warunek testu został przeprowadzony w trzech egzemplarzach dla tego protokołu.
    1. Dodaj ddH2O i 5x bufor metylacyjny (250 mM Tris pH7,5, 5 mM MgCl 2, 500 mM glutaminianu potasu, 5 mM ditiotreitol (DTT), 25% glicerolu) do każdej probówki, aby uzyskać końcowe stężenie 1x buforu. W przypadku testów zawierających związek 20 μM dodać 472 μL ddH2O i 120 μL 5x buforu. W przypadku testów zawierających 50 μM związek, dodać 470 μL ddH2O i 120 μL 5x buforu.
    2. Dodać 3,15 μl albuminy surowicy bydlęcej (BSA) o stężeniu 20 mg/ml do każdej próbki.
    3. Do każdej próbki dodać 2 μl substratu DNA spinki do włosów o stężeniu 3,15 μM i 1,33 μl 4,75 mM SAM.
      UWAGA: Stężenie substratów w mieszaninie roztworu do oznaczania jest 1,05 razy większe niż pożądane stężenia końcowe.
    4. Dodać inhibitor do końcowego stężenia 21 μM (1,26 μL z 10 mM) lub 52,5 μM (3,15 μL z 10 mM) do odpowiednich próbek. Dodać równoważną ilość dimetylosulfotlenku (DMSO) do próbki kontrolnej.
      UWAGA: Stężenie inhibitora stosowanego w badaniu przesiewowym może być różne. Maksymalne końcowe stężenie DMSO powinno wynosić ≤5% (v/v). Stężenia DMSO do 5% (v/v) nie mają wpływu na aktywność obserwowaną w teście26.
  2. Mieszać roztwory przez wirowanie (3 000 obr./min) przez 3 s. Wirować próbki przez kilka sekund w mini wirówce stołowej (1 200 × g), aby upewnić się, że roztwór został zebrany na dnie probówki.
  3. Porcję 95 μl każdego roztworu testowego do 6 kolejnych dołków na czarnej 96-dołkowej płytce o połowie powierzchni (Rysunek 2).
    UWAGA: Te testy przesiewowe przeprowadzono w dwóch partiach. Najpierw zbadano próbki 20 μM inhibitorów (łącznie 4 warunki), a następnie próbki inhibitorów 50 μM (łącznie 4 warunki).

figure-protocol-1
Rysunek 2: Ustawienie płytki testowej. Każdy roztwór testowy jest podawany do sześciu dołków na czarnej 96-dołkowej płytce: kontrola DMSO (niebieska), związek 1 (zielony), związek 2 (czerwony) i związek 3 (żółty). Zarówno DNMT1 bez RFTS, jak i Gla I zostaną dodane do trzech studni. Jako kontrola, tylko Gla I zostanie dodany do pozostałych trzech studni. Skróty: RFTS = Replication Foci Targeting Sequence; DNMT1 = metylotransferaza DNA 1; DMSO = dimetylosulfotlenek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Przygotuj roztwory enzymów do badania przesiewowego

UWAGA: DNMT1 bez RFTS może być wyrażony w E. coli i oczyszczony do jednorodności. Procedury wyrażania i oczyszczania dla DNMT1 bez RFTS zostały opisane wcześniej41. Ilość potrzebnego enzymu zależy od liczby przeprowadzanych testów. W tym przypadku w każdym zestawie wykonywane są cztery różne testy; Każdy test jest wykonywany w trzech egzemplarzach.

  1. Przygotować 75 μl każdego roztworu enzymatycznego w probówkach do mikrowirówek na lodzie.
    UWAGA: Potrzebne będą dwa roztwory enzymów. Jedno rozwiązanie będzie zawierało DNMT1 i Gla I; drugi będzie zawierał tylko Gla I.
    1. Dodaj ddH2O i 5x bufor metylacyjny (250 mM Tris pH7,5, 5 mM MgCl 2, 500 mM glutaminianu potasu, 5 mM DTT, 25% glicerolu) do każdej probówki, aby uzyskać końcowe stężenie 1x buforu. Do roztworu enzymu Gla I dodać 15 μl 5x buforu i 58,8 μl ddH2O. Do roztworu enzymu DNMT1+Gla I dodać 15 μl buforu 5x i 58,2 μl ddH2O.
    2. Dodać 1,2 μl 10 U/μL Gla I do każdego roztworu, aby uzyskać końcowe stężenie 0,16 U/μL.
    3. Dodać 0,6 μl 5 μM DNMT1 bez RFTS, aby uzyskać końcowe stężenie 40 nM do roztworu DNMT1 + Gla I.
  2. Delikatnie postukaj, aby wymieszać roztwory. Wirować próbki przez kilka sekund w mini wirówce stołowej (1 200 × g), aby upewnić się, że roztwór został zebrany na dnie probówki.
  3. Podwielokrotność 12 μl każdego roztworu enzymu do 6 dołków w 96-dołkowej płytce ze stożkowym dnem (Rysunek 3).

figure-protocol-2
Rysunek 3: Konfiguracja płytki enzymatycznej. Roztwory Gla I (szary) i DNMT1+Gla I (niebieski) są rozdzielane na porcje do sześciu dołków w 96-dołkowej płytce. Za pomocą pipety wielokanałowej enzym można jednocześnie dodać do rzędu roztworów testowych. Dla każdego warunku testu (sześć dołków) trzy dołki otrzymają DNMT1 + Gla I, a trzy dołki otrzymają tylko Gla I. Skrót: DNMT1 = metylotransferaza DNA 1. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Uruchom test i przeanalizuj dane.

  1. Rozgrzej czytnik płytek do temperatury 37 °C. Włożyć czarną płytkę zawierającą roztwory testowe. Potrząśnij płytką (podwójny orbital przy 425 cpm przez 5 s) i odczytaj fluorescencję o długości fali wzbudzenia 485 nm i długości fali emisji 528 nm. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 5 min.
    UWAGA: Alternatywnie do odczytów fluorescencji można użyć filtrów z odpowiednimi odcięciami długości fali.
  2. Zdjąć płytkę testową. Dodaj 5 μl roztworu enzymatycznego do każdej studzienki i mieszaj, pipetując w górę i w dół.
    UWAGA: Należy używać pipet wielokanałowych, aby można było jednocześnie zainicjować rząd próbek.
  3. Włóż płytkę do czytnika płytek. Rejestruj fluorescencję co 53 s przez 30 minut. Potrząsaj płytką (podwójny orbital przy 425 cpm przez 4 s) przed każdym odczytem.
  4. Średnie potrójne testy kontrolne Gla I dla każdego stanu. Odjąć średni ślad reakcji kontrolnej zawierający Gla I od potrójnych śladów otrzymanych w obecności DNMT1 bez RFTS. Określić błąd średni i błąd standardowy średniej dla skorygowanych kontrprób.
  5. Wykreślić średnią skorygowaną ścieżkę reakcji i dopasować początkową część liniową do linii, aby określić prędkość początkową.
  6. Określ procentową aktywność, dzieląc prędkość obserwowaną w obecności związku przez prędkość obserwowaną w reakcji kontrolnej zawierającej DMSO i mnożąc przez 100.

4. Dodatkowa kontrola testowa — sekwencyjne dodawanie enzymów

  1. Przygotować 550 μl roztworu do oznaczania w probówce mikrowirówkowej na lodzie. Dodać 110 μl 5x buforu metylacyjnego, 3,88 μl 3,15 μM substratu DNA spinki do włosów, 6,43 μl 47,5 mM SAM, 3,06 μl 20 mg/ml BSA i 426,6 μl ddH2O.
  2. Mieszać roztwór, wirując (3 000 obr./min) przez 3 s. Obracaj próbki przez kilka sekund w mini wirówce stołowej (1 200 × g), aby upewnić się, że roztwór został zebrany na dnie probówki.
  3. Porcję 90 μl roztworu do oznaczania rozdzielić na 6 kolejnych dołków na czarnej półpowierzchniowej 96-dołkowej płytce.
  4. Przygotuj roztwory enzymatyczne DNMT1 na lodzie. Dodać 4 μl 5x buforu metylacyjnego, 0,76 μl 5 μM DNMT1 bez RFTS i 15,24 μl ddH2O do jednej probówki. Dodać 4 μl 5x buforu metylacyjnego i 16 μl ddH2O do innej probówki.
  5. Delikatnie postukaj, aby wymieszać roztwory. Wirować próbki przez kilka sekund w mini wirówce stołowej (1 200 × g), aby upewnić się, że roztwór został zebrany na dnie probówki.
  6. Dodać 5 μl roztworu zawierającego DNMT1 do trzech studzienek w czarnej 96-dołkowej płytce o połowie powierzchni. Dodać 5 μl roztworu kontrolnego buforu do pozostałych trzech studzienek.
  7. Umieścić płytkę do mikromiareczkowania w czytniku płytek nagrzanym do temperatury 37 °C. Potrząsać płytką (podwójna orbitalna prędkość 425 cpm przez 3 s) i odczytać fluorescencję o długości fali wzbudzenia 485 nm i długości fali emisji 528 nm. Powtórz wstrząs i czytaj co 60 s przez 30 minut.
  8. Gdy płytka do oznaczania znajduje się w czytniku płytek, przygotuj roztwór Gla I na lodzie. Dodać 8 μl 5x buforu metylacyjnego, 0,64 μl 10 U/μL Gla I i 31,4 μl ddH2O do probówki mikrowirówkowej. Delikatnie postukaj, aby wymieszać roztwór. Obracać próbkę przez kilka sekund w mini wirówce stołowej (1 200 × g), aby upewnić się, że roztwór został zebrany na dnie probówki.
  9. Podaniec 6 μl roztworu Gla I do 6 studzienek na 96-dołkowej płytce ze stożkowym dnem.
  10. Po początkowym 30-minutowym czytaniu wyjmij czarną płytkę z czytnika płytek. Dodać 5 μl roztworu Gla I do wszystkich 6 studzienek i mieszać, pipetując w górę i w dół.
    UWAGA: Użyj pipety wielokanałowej, aby wszystkie studnie mogły być uruchamiane jednocześnie.
  11. Umieść czarną płytkę z powrotem w czytniku płytek. Rejestruj fluorescencję co 35 s przez 35 minut. Potrząsaj płytką (podwójny orbital przy 425 cpm przez 3 s) przed każdym odczytem.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Active DNMT1 jest warunkiem wstępnym dla tej analizy. DNMT1 pozbawiony RFTS został poddany ekspresji w E. coli i oczyszczony do jednorodności zgodnie z wcześniej opublikowanymi procedurami41. Aby upewnić się, że oczyszczony enzym jest aktywny, zastosowano nieciągły test sprzężony z endonukleazą w celu zbadania aktywności metylacji DNA36. Ten test wykorzystuje 32 pary zasad dupleksowego DNA z pojedynczym hemimetylowanym CpG umieszczonym w miejscu cięcia Sau3A1. Sau3...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zidentyfikować i scharakteryzować inhibitory metylotransferaz DNA, należy zmierzyć aktywność enzymu. Istnieje kilka metod badania aktywności metylotransferazy DNA. Aktywność jest powszechnie monitorowana za pomocą promieniotwórczości; transfer znakowanej grupy metylowej SAM można określić ilościowo 29,30,31,32,33,34. Opis...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Uniwersytetowi Bucknell i Wydziałowi Chemii za wsparcie tej pracy.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
96-dołkowy polistyren o płaskim dnie o połowie powierzchni bez obróbkiMikropłytka Corning3694
96-dołkowe stożkowe płyty dolne z polistyrenuThermoFisher249570
Albumina surowicy bydlęcej ZwiązekNEBB9000S
1ChemBridge5812086związek przesiewowy; zawieszony w DMSO do 10 mM
związek 2ChemBridge6722175związek przesiewowy; ponownie zawieszony w DMSO do 10 mM
związek 3ChemBridge5249376związek przesiewowy; ponownie zawieszony w DMSO do 10 mM
DitiothreitolSigmaD0632
Gla ISibEnzymeE494metylowrażliwa endonukleaza
GlycerolRPIG22025
Chlorek magnezuSigmaM0250
(5'-FAM-CCTATGCGmCATCAGTTTTCTGATGmCGmCATAGG-3'-Iowa Black Quencher)IDTspecjalnie zsyntetyzowanywewnętrznie hartowany DNA spinki do włosów (substrat)
Glutaminian potasuSigmaG1501
S-adenozylometioninaSigmaA4377kofaktor (substrat)
Tris BaseRPIZobacz materiał T60040
Oligonukleotyd TGL

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jurkowska, R. Z., Jurkowski, T. P., Jeltsch, A. Structure and function of mammalian DNA methyltransferases. Chembiochem. 12 (2), 206-222 (2011).
  2. Hamidi, T., Singh, A. K., Chen, T. Genetic alterations of DNA methylation machinery in human diseases. Epigenomics. 7 (2), 247-265 (2015).
  3. Norvil, A. B., Saha, D., Dar, M. S., Gowher, H. Effect of disease-associated germline mutations on structure function relationship of DNA methyltransferases. Genes. 10 (5), 369(2019).
  4. Foulks, J. M., et al. Epigenetic drug discovery: targeting DNA methyltransferases. Journal of Biomolecular Screening. 17 (1), 2-17 (2012).
  5. Goll, M. G., Bestor, T. H. Eukaryotic cytosine methyltransferases. Annual Review of Biochemistry. 74, 481-514 (2005).
  6. Bigey, P., Ramchandani, S., Theberge, J., Araujo, F. D., Szyf, M. Transcriptional regulation of the human DNA Methyltransferase (dnmt1) gene. Gene. 242 (1-2), 407-418 (2000).
  7. Detich, N., Ramchandani, S., Szyf, M. A conserved 3'-untranslated element mediates growth regulation of DNA methyltransferase 1 and inhibits its transforming activity. Journal of Biological Chemistry. 276 (27), 24881-24890 (2001).
  8. MacLeod, A. R., Rouleau, J., Szyf, M. Regulation of DNA methylation by the Ras signaling pathway. Journal of Biological Chemistry. 270 (19), 11327-11337 (1995).
  9. Slack, A., Cervoni, N., Pinard, M., Szyf, M. DNA methyltransferase is a downstream effector of cellular transformation triggered by simian virus 40 large T antigen. Journal of Biological Chemistry. 274 (15), 10105-10112 (1999).
  10. Eads, C. A., Nickel, A. E., Laird, P. W. Complete genetic suppression of polyp formation and reduction of CpG-island hypermethylation in Apc(Min/+) Dnmt1-hypomorphic mice. Cancer Research. 62, 1296-1299 (2002).
  11. MacLeod, A. R., Szyf, M. Expression of antisense to DNA methyltransferase mRNA induces DNA demethylation and inhibits tumorigenesis. Journal of Biological Chemistry. 270 (14), 8037-8043 (1995).
  12. Ramchandani, S., MacLeod, A. R., Pinard, M., von Hofe, E., Szyf, M. Inhibition of tumorigenesis by a cytosine-DNA, methyltransferase, antisense oligodeoxynucleotide. Proceedings of the National Academy Sciences of the United States of America. 94 (2), 684-689 (1997).
  13. Ley, T. J., et al. DNMT3A mutations in acute myeloid leukemia. New England Journal of Medicine. 363, 2424-2433 (2010).
  14. Walter, M. J., et al. Recurrent DNMT3A mutations in patients with myelodysplastic syndromes. Leukemia. 25 (7), 1153-1158 (2011).
  15. Russler-Germain, D. A., et al. The R882H DNMT3A mutation associated with AML dominantly inhibits wild-type DNMT3A by blocking its ability to form active tetramers. Cancer Cell. 25 (4), 442-454 (2014).
  16. Roll, J. D., Rivenbark, A. G., Jones, W. D., Coleman, W. B. DNMT3b overexpression contributes to a hypermethylator phenotype in human breast cancer cell lines. Molecular Cancer. 7, 15(2008).
  17. Nosho, K., et al. DNMT3B expression might contribute to CpG island methylator phenotype in colorectal cancer. Clinical Cancer Research. 15 (11), 3663-3671 (2009).
  18. Erdmann, A., Halby, L., Fahy, J., Arimondo, P. B. Targeting DNA methylation with small molecules: what's next. Journal of Medicinal Chemistry. 58 (6), 2569-2583 (2015).
  19. Chuang, J. C., et al. S110, a 5-Aza-2'-deoxycytidine-containing dinucleotide, is an effective DNA methylation inhibitor in vivo and can reduce tumor growth. Molecular Cancer Therapeutics. 9 (5), 1443-1450 (2010).
  20. Issa, J. J., et al. Safety and tolerability of guadecitabine (SGI-110) in patients with myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukaemia: a multicentre, randomised, dose-escalation phase 1 study. Lancet Oncology. 16 (9), 1099-1110 (2015).
  21. Datta, J., et al. A new class of quinoline-based DNA hypomethylating agents reactivates tumor suppressor genes by blocking DNA methyltransferase 1 activity and inducing its degradation. Cancer Research. 69 (10), 4277-4285 (2009).
  22. Zambrano, P., et al. A phase I study of hydralazine to demethylate and reactivate the expression of tumor suppressor genes. BMC Cancer. 5, 44(2005).
  23. Lee, B. H., Yegnasubramanian, S., Lin, X., Nelson, W. G. Procainamide is a specific inhibitor of DNA methyltransferase 1. Journal of Biological Chemistry. 280 (49), 40749-40756 (2005).
  24. Asgatay, S., et al. Synthesis and evaluation of analogues of N-phthaloyl-l-tryptophan (RG108) as inhibitors of DNA methyltransferase 1. Journal of Medicinal Chemstry. 57 (2), 421-434 (2014).
  25. Ceccaldi, A., et al. C5-DNA methyltransferase inhibitors: from screening to effects on zebrafish embryo development. Chembiochem. 12 (9), 1337-1345 (2011).
  26. Fagan, R. L., Wu, M., Chédin, F., Brenner, C. An ultrasensitive high throughput screen for DNA methyltransferase 1-targeted molecular probes. PLoS One. 8 (11), 78752(2013).
  27. Fagan, R. L., Cryderman, D. E., Kopelovich, L., Wallrath, L. L., Brenner, C. Laccaic acid A is a direct, DNA-competitive inhibitor of DNA methyltransferase 1. Journal of Biological Chemistry. 288 (33), 23858-23867 (2013).
  28. Eglen, R. M., Reisine, T. Screening for compounds that modulate epigenetic regulation of the transcriptome: an overview. Journal of Biomolecular Screening. 16 (10), 1137-1152 (2011).
  29. Holz-Schietinger, C., Matje, D. M., Reich, N. O. Mutations in DNA methyltransferase (DNMT3A) observed in acute myeloid leukemia patients disrupt processive methylation. Journal of Biological Chemistry. 287 (37), 30941-30951 (2012).
  30. Norvil, A. B., et al. Dnmt3b methylates DNA by a noncooperative mechanism, and its activity is unaffected by manipulations at the predicted dimer interface. Biochemistry. 57 (29), 4312-4324 (2018).
  31. Bashtrykov, P., Ragozin, S., Jeltsch, A. Mechanistic details of the DNA recognition by the Dnmt1 DNA methyltransferase. FEBS Letters. 586 (13), 1821-1823 (2012).
  32. Bashtrykov, P., et al. Targeted mutagenesis results in an activation of DNA methyltransferase 1 and confirms an autoinhibitory role of its RFTS domain. Chembiochem. 15 (5), 743-748 (2014).
  33. Berkyurek, A. C., et al. The DNA methyltransferase Dnmt1 directly interacts with the SET and RING finger-associated (SRA) domain of the multifunctional protein Uhrf1 to facilitate accession of the catalytic center to hemi-methylated DNA. Journal of Biological Chemistry. 289 (1), 379-386 (2014).
  34. Kanada, K., Takeshita, K., Suetake, I., Tajima, S., Nakagawa, A. Conserved threonine 1505 in the catalytic domain stabilizes mouse DNA methyltransferase 1. Journal of Biochemistry. 162 (4), 271-278 (2017).
  35. Bashtrykov, P., et al. Specificity of Dnmt1 for methylation of hemimethylated CpG sites resides in its catalytic domain. Chemistry & Biology. 19 (5), 572-578 (2012).
  36. Dolen, E. K., McGinnis, J. H., Tavory, R. N., Weiss, J. A., Switzer, R. L. Disease-associated mutations G589A and V590F relieve replication focus targeting sequence-mediated autoinhibition of DNA methyltransferase 1. Biochemistry. 58 (51), 5151-5159 (2019).
  37. Kilgore, J. A., et al. Identification of DNMT1 selective antagonists using a novel scintillation proximity assay. Journal of Biological Chemistry. 288 (27), 19673-19684 (2013).
  38. Ceccaldi, A., et al. Identification of novel inhibitors of DNA methylation by screening of a chemical library. ACS Chemical Biology. 8 (3), 543-548 (2013).
  39. Duchin, S., Vershinin, Z., Levy, D., Aharoni, A. A continuous kinetic assay for protein and DNA methyltransferase enzymatic activities. Epigenetics & Chromatin. 8, 56(2015).
  40. Syeda, F., et al. The replication focus targeting sequence (RFTS) domain is a DNA-competitive inhibitor of Dnmt1. Journal of Biological Chemistry. 286 (17), 15344-15351 (2011).
  41. Switzer, R. L., Medrano, J., Reedel, D. A., Weiss, J. Substituted anthraquinones represent a potential scaffold for DNA methyltransferase 1-specific inhibitors. PLoS One. 14 (7), 0219830(2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

DNA MethylationDNA MethyltransferaseMethylation AssayFluorescence AssayEndonuclease Coupled AssayDNMT1 InhibitorsPlate ReaderGla I EnzymeSmall Molecule InhibitorsEpigenetic Regulation

Related Articles