Artykuł metodologiczny

Wizualizacja dynamiki plus-end mikrotubul w modelu choroby Huntingtona opartym na pierwotnych fibroblastach skóry człowieka

DOI:

10.3791/62963

⸱

8 stycznia 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1A.N. Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, Lomonosov Moscow State University, 2Faculty of Bioengineering and Bioinformatics, Lomonosov Moscow State University, 3Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine of Federal Medical Biological Agency, 4Center for Precision Genome Editing and Genetic Technologies for Biomedicine, Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine of Federal Medical Biological Agency

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół jest dedykowany do wizualizacji mikrotubul plus-end poprzez transfekcję białka EB3 w celu zbadania ich dynamicznych właściwości w pierwotnej hodowli komórkowej. Protokół został wdrożony na ludzkich pierwotnych fibroblastach skóry uzyskanych od pacjentów z chorobą Huntingtona.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transfekcja z fluorescencyjnie znakowanym białkiem markerowym w połączeniu z poklatkową mikroskopią wideo jest klasyczną metodą badania dynamicznych właściwości cytoszkieletu. Protokół ten oferuje technikę transfekcji pierwotnej fibroblastów u ludzi, która może być trudna ze względu na specyfikę warunków pierwotnej hodowli komórek. Dodatkowo, utrzymanie właściwości dynamicznych cytoszkieletu wymaga niskiego poziomu transfekcji, aby uzyskać dobry stosunek sygnału do szumu bez powodowania stabilizacji mikrotubul. Ważne jest, aby podjąć środki w celu ochrony komórek przed stresem wywołanym światłem i blaknięciem barwnika fluorescencyjnego. W trakcie naszej pracy przetestowaliśmy różne metody i protokoły transfekcji, a także różne wektory, aby wybrać najlepszą kombinację warunków odpowiednich do badań pierwotnych fibroblastów u ludzi. Przeanalizowaliśmy powstałe filmy poklatkowe i obliczyliśmy dynamikę mikrotubul za pomocą ImageJ. Dynamika końców dodatnich mikrotubul w różnych częściach komórek nie jest podobna, dlatego podzieliliśmy analizę na podgrupy - region centrosomów, blaszkę i ogon fibroblastów. Warto zauważyć, że protokół ten może być wykorzystany do analizy in vitro dynamiki cytoszkieletu w próbkach pobranych od pacjentów, umożliwiając kolejny krok w kierunku zrozumienia dynamiki rozwoju różnych chorób.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroba Huntingtona (HD) jest nieuleczalną chorobą neurodegeneracyjną spowodowaną mutacją w genie kodującym białko huntingtyny (HTT). HTT jest przede wszystkim związany z pęcherzykami i mikrotubulami i prawdopodobnie bierze udział w procesach transportu zależnych od mikrotubul1,2. Do zbadania wpływu zmutowanego HTT na dynamikę mikrotubul wykorzystano wizualizację in vitro białka EB3, które reguluje dynamiczne właściwości mikrotubul poprzez wiązanie i stabilizację rosnących plus-endów. Aby załadować znakowany fluorescencyjnie EB3 do fibroblastów ludzkiej skóry, zastosowano transfekcję plazmidu. Do tego badania wykorzystaliśmy pierwotną hodowlę fibroblastów uzyskaną z biopsji skóry pacjentów z HD.

Mutacja w genie białka HTT prowadzi do wydłużenia przewodu poliglutaminowego3. HTT odgrywa rolę w takich procesach komórkowych jak endocytoza4, transport komórek1,2, degradacja białek5, itd. Znaczna część tych procesów obejmuje różne elementy cytoszkieletu komórkowego, w tym mikrotubule.

Ludzkie komórki pierwotne są najlepszym modelem do jak najdokładniejszego odtwarzania zdarzeń zachodzących w komórkach pacjenta. Aby stworzyć takie modele, należy wyizolować komórki z ludzkiego materiału biopsyjnego (np. z próbek chirurgicznych). Uzyskana w ten sposób pierwotna linia komórkowa nadaje się do badania patogenezy przy użyciu różnych metod genetycznych, biochemicznych, molekularnych i biologii komórki. Również ludzkie pierwotne hodowle komórkowe służą jako prekursor do tworzenia różnych kultur transzróżnicowanych i transgenicznych6.

Jednakże, w przeciwieństwie do unieśmiertelnionych kultur komórkowych, istotną wadą komórek pierwotnych jest ich ograniczona zdolność przejścia. Dlatego zalecamy stosowanie komórek we wczesnej fazie pasaży (do 15). Starsze kultury bardzo szybko się degenerują, tracąc swoje unikalne właściwości. W związku z tym nowo uzyskane komórki pierwotne powinny być przechowywane w stanie zamrożonym do długotrwałego przechowywania.

Pierwotne hodowle komórkowe są podatne na warunki uprawy. Dlatego często wymagają unikalnego podejścia i optymalizacji warunków uprawy. W szczególności pierwotne fibroblasty ludzkiej skóry używane w naszych eksperymentach są wymagające dla substratu. W związku z tym zastosowaliśmy różne dodatkowe powłoki (np. żelatynę lub fibronektynę) w zależności od rodzaju eksperymentu.

Cytoszkielet komórki określa kształt komórki, ruchliwość i lokomocję. Dynamika cytoszkieletu ma kluczowe znaczenie dla wielu procesów wewnątrzkomórkowych zarówno w interfazie, jak i mitozie. W szczególności cytoszkielet polimeryzowany z tubuliny jest wysoce dynamicznym i polarnym strukturą, umożliwiającą ukierunkowany transport wewnątrzkomórkowy za pośrednictwem białka motorycznego. Końce mikrotubul są w ciągłym przegrupowaniu, ich fazy składania przeplatają się z fazami demontażu, a to zachowanie nazywa się "niestabilnością dynamiczną"7,8,9. Różne powiązane białka zmieniają równowagę reakcji polimeryzacji, prowadząc albo do tworzenia polimeru, albo do tworzenia monomeru białkowego. Dodanie podjednostek tubuliny następuje głównie na dodatnim końcu mikrotubul10. Rodzina białek wiążących koniec (EB) składa się z trzech członków: EB1, EB2 i EB3. Służą one jako białka śledzące plus-end (+TIP) i regulują dynamiczne właściwości mikrotubul poprzez wiązanie i stabilizację ich rosnących plus-ends11.

Wiele badań wykorzystuje mikroiniekcję lub transfekcję tubuliny znakowaną cząsteczkami fluorescencyjnymi z obrazowaniem poklatkowym i analizą wideo do wizualizacji mikrotubul in vitro. Metody te mogą być inwazyjne i szkodliwe dla komórek, zwłaszcza pierwotnych komórek ludzkich. Najtrudniejszym krokiem jest znalezienie warunków do transfekcji komórek. Staraliśmy się osiągnąć jak najwyższy poziom transfekcji bez wpływu na żywotność i natywną morfologię komórek. W badaniu zastosowano klasyczną metodę do badania różnic w dynamice mikrotubul w fibroblastach skóry zdrowych dawców i pacjentów z chorobą Huntingtona.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół jest zgodny z wytycznymi Federalnego Centrum Badań i Klinicznych Medycyny Fizyko-Chemicznej Federalnej Medycznej Agencji Biologicznej z dnia 08 września 2015 roku.

UWAGA: Rysunek 1 przedstawia przegląd protokołu.

1. Uzyskanie pierwotnej kultury fibroblastów ludzkiej skóry (Rysunek 2)

  1. Dostarczyć biopsję do laboratorium w ciągu kilku godzin w pożywce Modified Eagle Media (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 50 μg/ml penicyliny i 50 U/ml streptomycyny.
    UWAGA: Biopsja skóry musi być wykonana w sterylnych warunkach przez lekarza po podpisaniu przez pacjenta świadomej zgody.
  2. Umieścić tkankę biopsyjną na szalce Petriego o średnicy 6 cm razem z niewielką ilością pożywki.
  3. Za pomocą sterylnego skalpela pokrój próbkę biopsji na kawałki o wielkości około 0,5-1 mm. Umieść 1-2 uzyskane fragmenty na szalce Petriego o średnicy 3,5 cm i umieść sterylne szkiełko nakrywkowe na fragmentach biopsji. Powoli dodaj 1,5 ml pożywki wzrostowej do następującej kompozycji: DMEM, 50 U/ml penicyliny-streptomycyny i 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
  4. Hodowla fibroblastów w pożywce wzrostowej w inkubatorze CO2 utrzymywanym w temperaturze 5% CO2 , 37 °C, 80% wilgotności.
    UWAGA: Po 4-7 dniach najpierw keratynocyty, a następnie fibroblasty zaczynają migrować z tkanki na dno naczynia.

2. Przechowywanie, zamrażanie i rozmrażanie kultury pierwotnej

  1. Usunąć komórki z szalki hodowlanej (patrz punkty 3.2-3.4).
  2. Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przez 5 minut przy 200 x g. Następnie wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 900 μl schłodzonego FBS.
  3. Przenieś kropla po kropli do probówki do kriokonserwacji i dodaj 100 μl dimetylosulfotlenku (DMSO).
  4. Umieścić kriosondę w zamrażarce o niskiej temperaturze -80 °C. Dwadzieścia cztery godziny później przenieść kriosondę do ciekłego azotu (-196 °C) w celu długotrwałego przechowywania.
  5. W celu rozmrożenia kriokonserwowanych komórek należy wyjąć kriowial z magazynu azotu i w ciągu 1 minuty przenieść 1 ml zawartości do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 9 ml pożywki transportowej podgrzanej do temperatury 37 °C.
  6. Ostrożnie zawiesić, a następnie odwirować probówkę przez 5 minut przy 200 x g. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad komórkowy w wymaganej objętości pożywki wzrostowej i umieścić go na szalce Petriego o wymaganej średnicy.

3. Hodowla komórek

  1. Przykryj dno naczynia autoklawowanym 0,1% roztworem żelatyny przygotowanym w wodzie destylowanej. Inkubować przez 15 min.
    UWAGA: Do wizualizacji transfekcji należy używać talerzy ze szklanym dnem (naczynia konfokalne o grubości szkła 170 μm).
  2. Przygotować pożywkę hodowlaną o następującym składzie: DMEM uzupełniony 10% FBS, 2 mM L-alanylo-L-glutaminy, 50 U/ml penicyliny-streptomycyny. Dokładnie wymieszać i przechowywać w temperaturze 4 °C. Podgrzać podłoże do temperatury 37 °C przed dodaniem do komórek.
  3. Oceń kulturę pod mikroskopem. Usuń pożywkę i przemyj fibroblasty roztworem soli fosforanowej (DPBS) firmy Dulbecco.
  4. Dodaj 1 ml podgrzanego 0,25% roztworu trypsyny do komórek. Sprawdź komórki pod mikroskopem, czy całkowicie odrywają się od podłoża. Dezaktywować trypsynę za pomocą 1 ml pożywki hodowlanej.
  5. Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Odwirować probówkę o stężeniu 200 x g przez 5 minut, usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki hodowlanej.
  6. Policz liczbę komórek. Obliczyć wymaganą liczbę komórek do ich wysiewu o gęstości 8-15 x 103/cm2 i ponownie zawiesić w 2 ml pożywki hodowlanej.
  7. Usunąć roztwór żelatyny z naczynia hodowlanego i natychmiast dodać 2 ml zawiesiny komórkowej. Hodować fibroblasty w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 .
  8. Odświeżaj podłoże co 2-4 dni.
    UWAGA: Do eksperymentów użyj komórek 4-11 pasaży.

4. Transfekcja

  1. Zastąp pożywkę żywą świeżą pożywką hodowlaną na 24 godziny przed transfekcją.
    UWAGA: Zbieg komórek powinien wynosić 70-80%.
  2. Przygotuj kompleks DNA-lipid w oparciu o obszar i gęstość wysiewu komórek. Użyj środka do transfekcji na bazie liposomów.
    UWAGA: Użyj gęstości wysiewu komórek jako 1 x 104 komórki/cm2.
  3. Dodać 3 μl dostępnego w handlu odczynnika do transfekcji do 125 μl optymalnej minimalnej pożywki niezbędnej (Opti-MEM) niezawierającej żadnych antybiotyków, nie dotykając ścianek probówki. Delikatnie zawiesić ponownie.
  4. Rozcieńczyć plazmidowy DNA (GFP-EB3) dodając 1 μg plazmidowego DNA do 125 μl Opti-MEM. Delikatnie ponownie zawiesić.
    UWAGA: Kodowanie wektora wyrażeń GFP-EB311 zostało otrzymane jako miły prezent od dr I. Kaveriny (Vanderbilt University, Nashville) za zgodą dr A. Akhmanova (Erasmus University, Rotterdam)11.
  5. Dodać rozcieńczone plazmidowe DNA do każdej probówki z rozcieńczonym odczynnikiem do transfekcji (1:1). Inkubować przez 30 minut.
  6. Dodać kompleks DNA-lipid do 6-centymetrowej szalki Petriego zawierającej komórki i mieszać z huśtawką w kształcie krzyża przez 30 s. Inkubować komórki ze środkiem transfekcyjnym przez 24 godziny, a następnie zmienić na świeże podłoże. Analizuj skuteczność transfekcji po 24 h i 48 h.
    UWAGA: 24 h po transfekcji sprawność wynosiła 10-15%, a po 48 h do 40%.

5. Przygotowanie do obrazowania

  1. Przed obrazowaniem komórek na żywo zmień pożywkę hodowlaną na pożywkę bez barwnika wskaźnikowego pH, aby zmniejszyć autofluorescencję.
  2. Ostrożnie nałożyć olej mineralny na powierzchnię podłoża, aby całkowicie pokryć podłoże, izolując je od środowiska zewnętrznego w celu zmniejszenia penetracjiO2 i parowania medium.
  3. Do wykonania zdjęć należy użyć lampy rtęciowej i obiektywu 60x lub 100x z dużym otworem przysłony cyfrowej.
    UWAGA: W przypadku obserwacji in vivo mikroskop musi być wyposażony w inkubator w celu utrzymania niezbędnych warunków dla komórek, w tym podgrzanie stołu obiektowego i soczewki do +37 °C, zamkniętą komorę z dopływem CO2 oraz regulator poziomu wilgotności. Użyj podwójnie destylowanej wody, aby wytworzyć wilgoć. Sprawdź poziom podwójnie destylowanej wody przed filmowaniem.
  4. Umieść naczynie konfokalne z komórkami w uchwycie mikroskopu przed obrazowaniem. Upewnij się, że antena i aparat są bezpiecznie przymocowane do uchwytu, aby uniknąć dryfowania podczas robienia zdjęć.

6. Ustawianie parametrów obrazowania

  1. Wybierz niskie wartości ekspozycji, ponieważ światło indukuje uszkadzające komórki reaktywne formy tlenu (ROS).
    UWAGA: Aby zbadać dynamikę mikrotubul w fibroblastach ludzkiej skóry, wybrano ekspozycję 300 ms.
  2. Skoncentruj się na obiekcie zainteresowania.
    UWAGA: W przypadku długotrwałego obrazowania poklatkowego należy użyć systemu automatycznej stabilizacji ostrości, aby skompensować możliwe przesunięcie wzdłuż osi z.
  3. Wybierz optymalne warunki obrazowania w zależności od wrażliwości komórek na światło i szybkości blaknięcia fluorochromu.
    UWAGA: Ponieważ mikrotubule są strukturami wysoce dynamicznymi, można wybrać rozsądnie krótki przedział czasu, a liczba klatek na sekundę musi być wystarczająco wysoka. Do zbadania dynamiki mikrotubul w fibroblastach skóry stosowaliśmy z częstotliwością 1 klatki/s przez 3-5 minut.
  4. Wybierając następny obiekt, aby uzyskać obraz, odsuń się od już zobrazowanego obszaru. Ponieważ obszar ten był pod wpływem światła, zauważalne będzie fotowybielanie.
    UWAGA: Ponieważ zastosowano stosunkowo wysoką częstotliwość obrazowania, migawka nie zamykała się między obrazami, a lampa świeciła przez cały okres obrazowania, dlatego zwiększyło się blaknięcie.
  5. Wybierz optymalny film do wizualnego badania dynamiki mikrotubul, biorąc pod uwagę jakość transfekcji, jakość obrazów mikrotubul (optymalny stosunek sygnału do szumu) oraz brak dryftu w przypadku analizowanej komórki (Rysunek 3).
  6. Wykorzystaj wybrane filmy, aby zbadać dynamikę plus-końcówek mikrotubul, śledząc je w programie ImageJ lub Fiji (Rysunek 4).
    UWAGA: Instrukcje dotyczące analizy ilościowej znajdują się na rysunku uzupełniającym 2 i pliku uzupełniającym 1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Powstałe filmy GFP-EB3 wykonane przy użyciu protokołu (Rysunek 1) ilustrują dynamiczne właściwości mikrotubul. Mikrotubule biorą udział w różnych procesach komórkowych, a ich właściwości dynamiczne wpływają na różne charakterystyki życia pierwotnej hodowli komórek ludzkich z materiału biopsyjnego pacjentów (Rysunek 2).

Następujące parametry określają dynamiczną niestabilność mikrotubul: tempo wzrostu (polimeryzacji) i kurczenia się (dep...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lepszej jakości wyniki analizy dynamiki mikrotubul można uzyskać z wysokiej jakości obrazów mikroskopowych. Ważne jest, aby zachować wszystkie warunki niezbędne do obrazowania poklatkowego żywych komórek i prawidłowo dostosować parametry obrazowania. Ważne jest stosowanie specjalnych naczyń do hodowli komórkowych ze szklanym dnem (naczynia konfokalne), ponieważ szkło ma inny współczynnik załamania światła niż plastik. Niezwykle ważna jest również grubość szkła i jego jednorodność na całej jego powierzchni, ponieważ param...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało sfinansowane przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego Federacji Rosyjskiej, grant nr 075-15-2019-1669 (transfekcja fibroblastów), przez Rosyjską Fundację Naukową, grant nr 19-15-00425 (wszystkie inne prace nad hodowlą fibroblastów in vitro). Był on częściowo wspierany przez program rozwojowy Moskiewskiego Uniwersytetu Państwowego im. Łomonosowa PNR5.13 (obrazowanie i analiza). Autorzy dziękują za wsparcie Centrum Doskonałości firmy Nikon w Instytucie Biologii Fizyko-Chemicznej im. A. N. Biełozierskiego. Szczególne podziękowania kierujemy do Ekateriny Taran za pomoc, pomoc w podkładaniu głosu. Autorzy dziękują również Pavlowi Belikovowi za pomoc w montażu wideo. Figury w rękopisie zostały stworzone przy użyciu BioRender.com.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Oprzyrządowanie
Camera iXon DU897 EMCCDAndor Technology
Eppendorf Wirówka 5804 REppendorf Corporate
Zestaw filtrów fluorescencyjnych HYQ FITCNikonAlternatywa: Leica, Olympus, Zeiss
LUNA-II Automated Cell CounteLogos BiosystemsL40002
Inkubator mikroskopowy do dożywotniego filmowaniaOkolabRegulator temperatury H301-T-UNIT-BL-PLUS
Kontroler gazu CO2-O2-UNIT-BL
Soczewka obiektywu CFI Plan Apo Lambda 60x Oil 1.4 (WD 0.13)NikonAlternatywa: Leica, Olympus, Zeiss
Mikroskop fluorescencyjny szerokokątny Eclipse Ti-ENikonAlternatywa: Leica, Olympus, Zeiss<
strong>Software
Fiji (Image J version 2.1.0/1.53c)Oprogramowanie
Open source NISElements NikonAlternatywa: Leica, Olympus, Zeiss
Dodatkowe odczynniki
Olej mineralny (jasnobiały olej)MP151694
Cell culture dish
Cell Culture DishSPL Lifesciences20035
Confocal Dish (grubość szkła 170 µ m)SPL Lifesciences211350Alternatywa:
Stożkowa probówka wirówkowaSPL Lifesciences50015
Fiolki kriogeniczneCorning-Costar430659
Gniazdo probówek do mikrowirówek615001
Cultivation
Lipofectamine 3000 Odczynnik do transfekcjiThermo Fisher ScientificL3000001
DimetylosulfotlenekPanEkofigure-materials-1135
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media)PanEkoC420figure-materials-2
DPBS (Dulbecco's roztwór soli fosforanowej)PanEkoP060figure-materials-3
Surowica bydlęca płodu (FBS)HyclonK053/SH30071.03
Żelatyna (skóra bydlęca)PanEkofigure-materials-4070
GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050038
Opti-MEM (1x) + GlutamaxGibco519850026
Penicylina-streptomycynaPanEkoA063figure-materials-5
Trypsin-EDTA (0,25%)Thermo Fisher Scientific25200072
Transfekcja
Plazmidowe DNA z EB3-GFPUprzejmy dar dr I. Kaveriny [Vanderbilt University, Nashville] za zgodą dr A. Akhmanova
[Erasmus University, Rotterdam]		Stepanova et al., 2003 DOI: 10.1523/JNEUROSCI.23-07-02655.2003
do przetwarzania obrazów MatTek

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Engelender, S., et al. Huntingtin-associated Protein 1 (HAP1) Interacts with the p150 Glued Bubunit of Dynactin. Human Molecular Genetics. 6 (13), 2205-2212 (1997).
  2. Caviston, J. P., Ross, J. L., Antony, S. M., Tokito, M., Holzbaur, E. L. Huntingtin facilitates dynein/dynactin-mediated vesicle transport. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (24), 10045-10050 (2007).
  3. MacMillan, J. C., et al. Molecular analysis and clinical correlations of the Huntington's disease mutation. The Lancet. 342 (8877), 954-958 (1993).
  4. Proskura, A. L., Vechkapova, S. O., Zapara, T. A., Ratushniak, A. S. Protein-protein interactions of huntingtin in the hippocampus. Molecular Biology. 51 (4), 647-653 (2017).
  5. Steffan, J. S., et al. The Huntington's disease protein interacts with p53 and CREB-binding protein and represses transcription. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6763-6768 (2000).
  6. Nekrasov, E. D., et al. Manifestation of Huntington's disease pathology in human induced pluripotent stem cell-derived neurons. Molecular Neurodegeneration. 11 (1), 1-15 (2016).
  7. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).
  8. Walker, R. A., et al. Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies. The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1437-1448 (1988).
  9. Desai, A., Mitchison, T. J. Microtubule polymerization dynamics. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 13 (1), 83-117 (1997).
  10. Allen, C., Borisy, G. G. Structural polarity and directional growth of microtubules of Chlamydomonas flagella. Journal of Molecular Biology. 90 (2), 381-402 (1974).
  11. Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
  12. Shelden, E., Wadsworth, P. Observation and quantification of individual microtubule behavior in vivo: microtubule dynamics are cell-type specific. Journal of Cell Biology. 120 (4), 935-945 (1993).
  13. O'Brien, E. T., Salmon, E. D., Walker, R. A., Erickson, H. P. Effects of magnesium on the dynamic instability of individual microtubules. Biochemistry. 29 (28), 6648-6656 (1990).
  14. Drechsel, D. N., Hyman, A. A., Cobb, M. H., Kirschner, M. W. Modulation of the dynamic instability of tubulin assembly by the microtubule-associated protein tau. Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1141-1154 (1992).
  15. Gildersleeve, R. F., Cross, A. R., Cullen, K. E., Fagen, A. P., Williams, R. C. Microtubules grow and shorten at intrinsically variable rates. Journal of Biological Chemistry. 267 (12), 7995-8006 (1992).
  16. Penazzi, L., Bakota, L., Brandt, R. Microtubule dynamics in neuronal development, plasticity, and neurodegeneration. International Review of Cell and Molecular Biology. 321, 89-169 (2016).
  17. van de Willige, D., Hoogenraad, C. C., Akhmanova, A. Microtubule plus-end tracking proteins in neuronal development. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (10), 2053-2077 (2016).
  18. Applegate, K. T., et al. plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. Journal of Structural Biology. 176 (2), 168-184 (2011).
  19. Komarova, Y. A., Vorobjev, I. A., Borisy, G. G. Life cycle of MTs: persistent growth in the cell interior, asymmetric transition frequencies and effects of the cell boundary. Journal of Cell Science. 115 (17), 3527-3539 (2002).
  20. Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., vanden Broek, B., Jalink, K. Optimizing imaging conditions for demanding multi-color super resolution localization microscopy. PLoS One. 11 (7), 0158884(2016).
  21. Dixit, R., Cyr, R. Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy. The Plant Journal. 36 (2), 280-290 (2003).
  22. Grzelak, A., Rychlik, B., Bartosz, G. Light-dependent generation of reactive oxygen species in cell culture media. Free Radical Biology and Medicine. 30 (12), 1418-1425 (2001).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Dynamika mikrotubulwizualizacja ko c w dodatnichludzkie fibroblasty sk rytransfekcja bia kiem fluorescencyjnymmikroskopia poklatkowadynamika cytoszkieletuobrazowanie bia ka EB3mikroskopia konfokalnaanaliza w programie ImageJ

Powiązane artykuły