Artykuł metodologiczny

Izolacja magnetyczna komórek mikrogleju od noworodków myszy do pierwotnych hodowli komórkowych

3.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62964

⸱

25 lipca 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1NeuroDiderot, Inserm UMR-1141, Hôpital Robert Debré 48, Université de Paris, 2Department of anesthesia and critical care, APHP-Sorbonne university

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Pierwotne kultury mikrogleju są powszechnie używane do oceny nowych cząsteczek przeciwzapalnych. Niniejszy protokół opisuje powtarzalną i odpowiednią metodę magnetycznego izolowania mikrogleju od nowonarodzonych młodych.

Streszczenie

Mikroglej, jako makrofagi rezydujące w mózgu, mają fundamentalne znaczenie dla wielu funkcji, w tym reakcji na stres środowiskowy i homeostazy mózgu. Mikroglej może przyjmować szerokie spektrum fenotypów aktywacji. Co więcej, mikroglej, który popiera fenotyp prozapalny, jest związany zarówno z zaburzeniami neurorozwojowymi, jak i neurodegeneracyjnymi. Badania in vitro są szeroko stosowane w badaniach mających na celu ocenę potencjalnych strategii terapeutycznych w określonych typach komórek. W tym kontekście badanie aktywacji mikrogleju i zapalenia układu nerwowego in vitro przy użyciu pierwotnych kultur mikrogleju jest bardziej istotne niż linie komórek mikrogleju lub mikroglej pochodzący z komórek macierzystych. Jednak stosowanie niektórych kultur pierwotnych może cierpieć z powodu braku odtwarzalności. W protokole tym zaproponowano powtarzalną i odpowiednią metodę magnetycznego izolowania mikrogleju od nowonarodzonych młodych. Wykazano tutaj aktywację mikrogleju za pomocą kilku bodźców po 4 godzinach i 24 godzinach poprzez kwantyfikację ekspresji mRNA i test fagocytarny z kulkami Cy3. Oczekuje się, że obecne prace dostarczą łatwej do odtworzenia techniki izolowania fizjologicznie istotnego mikrogleju od młodzieńczych stadiów rozwojowych.

Wprowadzenie

Mikroglej to komórki podobne do makrofagów rezydujące w centralnym układzie nerwowym, pochodzące z erytropoetycznych prekursorów woreczka żółtkowego, które migrują do nabłonka nerwowego podczas wczesnego rozwoju embrionalnego1. Oprócz funkcji odpornościowych, odgrywają również znaczącą rolę podczas rozwoju neurologicznego, szczególnie w synaptogenezie, homeostazie neuronów i mielinizacji2. W wieku dorosłym mikroglej rozwija długie procesy komórkowe, aby stale skanować środowisko. W przypadku zaburzeń homeostazy, takich jak uszkodzenie mózgu lub choroba mózgu, mikroglej może zmienić swój wygląd morfologiczny, aby przyjąć kształt ameboidalny, migrować do uszkodzonego obszaru, zwiększać i uwalniać wiele czynników cytoprotekcyjnych lub cytotoksycznych. Mikroglej ma niejednorodne stany aktywacji w zależności od etapu rozwoju i rodzaju odniesionego urazu3,4,5. W tym badaniu te stany aktywacji są ogólnie klasyfikowane do trzech różnych fenotypów: prozapalny/fagocytarny, przeciwzapalny i immunoregulacyjny, mając na uwadze, że w rzeczywistości sytuacja może być bardziej złożona6.

Badanie in vivo aktywacji mikrogleju i badań przesiewowych pod kątem strategii neuroprotekcyjnych na wczesnych etapach rozwoju mózgu może być wyzwaniem ze względu na (1) kruchość zwierząt przed odsadzeniem i (2) niską liczbę komórek mikrogleju. Dlatego badania in vitro nad mikroglejem są szeroko stosowane w odniesieniu do toksyczności7,8,9, strategie neuroprotekcyjne5,10,11,12,13,14, oraz co-cultures15,16,17,18,19,20,21. W badaniach in vitro można wykorzystać linie komórek mikrogleju, mikroglej pochodzący z komórek macierzystych lub pierwotną hodowlę mikrogleju. Wszystkie te podejścia mają zalety i wady, a wybór zależy od początkowego pytania biologicznego. Korzyści płynące z zastosowania pierwotnych kultur mikrogleju to jednorodne tło genetyczne, historia wolna od patogenów i kontrola czasu, w którym mikroglej jest stymulowany po śmierci zwierzęcia22.

Z biegiem lat opracowano różne metody (cytometria przepływowa, wstrząsanie lub znakowanie magnetyczne) do hodowli pierwotnego mikrogleju od gryzoni, zarówno noworodków, jak i dorosłych23,24,25,26,27,28,29. W niniejszej pracy izolacja mikrogleju od mysich noworodków jest przeprowadzana przy użyciu wcześniej opisanej technologii sortowania komórek aktywowanych magnetycznie przy użyciu pokrytego mikrokulkami anty-mysiego CD11b25,27,29. CD11b jest receptorem integryny ulegającym ekspresji na powierzchni komórek szpikowych, w tym mikrogleju. Gdy w mózgu nie ma prowokacji zapalnej, prawie wszystkie komórki CD11b+ są mikroglejowe30. W porównaniu z innymi wcześniej opublikowanymi metodami23,24,25,26,27,28,29, niniejszy protokół równoważy natychmiastowe analizy aktywacji mikrogleju ex vivo i powszechne in vitro pierwotna hodowla mikrogleju. Tak więc mikroglej jest (1) izolowany w dniu pourodzeniowym (P)8 bez usuwania mieliny, (2) hodowany bez surowicy i (3) wystawiany na działanie siRNA, miRNA, związku farmakologicznego i / lub bodźców zapalnych tylko 48 godzin po izolacji mózgu. Każdy z tych trzech aspektów sprawia, że obecny protokół jest istotny i szybki. Przede wszystkim zastosowanie mikrogleju pediatrycznego pozwala na uzyskanie dynamicznych i reaktywnych żywotnych komórek w hodowli bez konieczności dodatkowego etapu demielinizacji, który mógłby potencjalnie modyfikować reaktywność mikrogleju in vitro. Niniejszy protokół ma na celu jak największe zbliżenie się do fizjologicznego środowiska mikrogleju. Rzeczywiście, mikroglej nigdy nie napotyka surowicy, a ten protokół również nie wymaga stosowania surowicy. Co więcej, wystawienie mikrogleju już po 48 godzinach od hodowli zapobiega utracie przez nie zdolności fizjologicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Protokół został zatwierdzony, a wszystkie zwierzęta były traktowane zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi Institut National de la Santé et de la Recherche Scientifique (Inserm, Francja). Przedstawiono magnetyczną izolację mikrogleju z mózgów 24 młodych myszy OF1 (zarówno samca, jak i samicy) w P8, podzielonych na płytki 6-dołkowe, 12-dołkowe lub 96-dołkowe. Prace eksperymentalne prowadzono pod kapturem w celu utrzymania sterylnych warunków.

1. Przygotowanie sterylnych roztworów do izolacji i hodowli komórkowej

  1. Przygotuj 50 ml 1x Zbilansowanego Roztworu Soli Hanksa (HBSS) bez Ca2+ i Mg2+ (HBSS-/-) z dostępnego w handlu roztworu 10x (patrz Tabela Materiałów).
  2. Przygotować mieszaninę dysocjacyjną zgodnie ze składem podanym w tabeli 1, korzystając z dostępnego w handlu zestawu do dysocjacji tkanek (patrz tabela materiałów).
  3. Przygotuj 200 ml 1x HBSS z Ca2+ i Mg2+ (HBSS+/+) z dostępnego w handlu roztworu 10x.
  4. Przygotuj 200 ml 1x PBS + 0,5% BSA (określane jako bufor do sortowania komórek).
  5. Przygotować mikrogranulki CD11b zgodnie z tabelą 2.
  6. Przygotuj 500 ml pożywki hodowlanej bez surowicy makrofagów (SFM) + 1% penicyliny-streptomycyny (P/S). Przygotować porcje z probówek o pojemności 50 ml i przechowywać je w temperaturze 4 °C. W dalszej części tekstu nazywa się to pożywką mikrogleju.
    UWAGA: Wszystkie roztwory izolacyjne muszą być świeżo przygotowane w sterylnych warunkach w dniu eksperymentu i przechowywane na lodzie. Można przygotować pożywkę do hodowli komórek mikrogleju, umieścić ją w probówkach o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C do wykorzystania w przyszłości. Filtracja nie jest potrzebna.

2. Sekcja mózgu

  1. Odetnij głowę szczeniaka dużymi nożyczkami bez wcześniejszego znieczulenia ogólnego.
  2. Przeciąć skórę od szyi do nosa zgodnie ze szwem strzałkowym (15-20 mm) małymi nożyczkami (Rysunek 1A-C).
  3. Włóż końcówki małych nożyczek w otwór wielki równolegle do czaszki. Przytnij ostrożnie z każdej strony do oczu (Rysunek 1D,E).
  4. Przeciąć między oczami małymi nożyczkami, aby oddzielić czaszkę i mózg od głowy (Ryc. 1F).
  5. Za pomocą dwóch kleszczy chwyć czaszkę blisko opuszki węchowej i ostrożnie rozerwij czaszkę, uważając, aby nie uszkodzić leżącego pod nią mózgu (Ryc. 1G-I).
  6. Usuń móżdżek i opuszkę węchową za pomocą żyletki i pokrój mózg na dwie części (Rysunek 1J).
  7. Umieść fragmenty mózgu na szalce Petriego zawierającej 30-40 ml HBSS-/- (Ryc. 1K).

3. Dysocjacja mózgu i magnetyczna izolacja mikrogleju

UWAGA: Wszystkie manipulacje komórkami i ponowne zawieszanie muszą być wykonywane za pomocą pipety 1,000 μL z dużą ostrożnością. Zastosowanie silnego działania mechanicznego może aktywować lub zabić komórki mikrogleju.

  1. Przenieś 12 kawałków mózgu (~1,2 g) na probówkę dysocjacyjną zawierającą mieszaninę dysocjacyjną zgodnie z tabelą 1. Na 24 szczenięta potrzebne były cztery rurki C (Rysunek 2A-B).
  2. Umieść rurki C na dysocjatorze (z trybem grzania). Uruchom zoptymalizowany program NTDK w sprzęcie zgodnie z instrukcją producenta (Rysunek 2D).
  3. Wirować przy 300 x g przez 20 s (w temperaturze 4 °C) w celu zebrania wszystkich komórek. Zakończ dysocjację mechaniczną, pipetując trzy razy w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl (Rysunek 2E).
  4. Przenieś komórki do czterech probówek o pojemności 15 ml + sitka. Przepłucz sitka 10 ml HBSS+/+ (Rysunek 2F).
  5. Wirować przy 300 x g przez 10 minut (w temperaturze 4 °C) i usunąć supernatant. Ostrożnie ponownie zawiesić osad z 10 ml HBSS+/+ (Rysunek 2G).
  6. Wirować przy 300 x g przez 10 minut (w temperaturze 4 °C) i usunąć supernatant. Ostrożnie ponownie zawiesić osad za pomocą 6 ml buforu sortującego (krok 1.4) (Rysunek 2H).
  7. Wirować przy 300 x g przez 10 minut (w temperaturze 4 °C) i usunąć supernatant. Dodać 200 μl roztworu mikrogranulek CD11b (krok 1.5) do probówki i ostrożnie zawiesić (Rysunek 2I).
  8. Inkubować probówki przez 15-20 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie zawiesić osad z 6 ml buforu sortującego (Rysunek 2I-J).
  9. Wirować przy 300 x g przez 10 minut (w temperaturze 4 °C) i usunąć supernatant. Ostrożnie ponownie zawiesić osad z 8 ml buforu sortującego (Rysunek 2K).
  10. Postępuj zgodnie z programem POSSEL na separatorze (patrz Tabela materiałów), aby przygotować osiem kolumn. Przenieść komórki 1 ml na 1 ml na kolumnę. Poczekaj, aż wszystkie komórki przejdą przed dodaniem kolejnego ml. Eluować komórki CD11b+ na sterylnej płytce elucyjnej z 1 ml buforu sortującego (Rysunek 2L).
  11. Umieść komórki CD11b+ w nowej probówce o pojemności 50 ml (Rysunek 2M).
  12. Wirować przy 300 x g przez 10 minut (w temperaturze 4 °C) i usunąć supernatant. Ostrożnie ponownie zawiesić osad z 10 ml zimnej pożywki dla mikrogleju (krok 1.6) (Rysunek 2N).
  13. Policz komórki CD11b+. W P8 należy uzyskać ~650 000 komórek na mózg.
    UWAGA: W niniejszym protokole komórki zostały zliczone za pomocą automatycznego licznika komórek (patrz Tabela materiałów).
  14. Zawiesić komórki w zimnej pożywce mikrogleju do końcowego stężenia 650 000-700 000 komórek/ml i dozować na płytkach do hodowli komórkowych.
    UWAGA: Płytki 6-dołkowe są przeznaczone do Western Blot (2 ml na studzienkę); płytki 12-dołkowe służą do analizy RT-qPCR (1 ml na dołek), a płytki 96-dołkowe służą do oznaczania fagocytarnego (250 μl na dołek); Wszystkie trzy zostały wykorzystane do tej pracy. Jednak w tym manuskrypcie wyniki analizy Western Blot nie są pokazane, ale możliwe jest przeprowadzenie za pomocą tego protokołu.
  15. Umieść płytki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez noc. Ostrożnie zmienić pożywkę za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl z podgrzaną pożywką dla mikrogleju.
  16. Umieścić płytki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 na noc przed stymulacją.
    UWAGA: Nie zaleca się izolowania mikrogleju od więcej niż 36 szczeniąt i po P9. Zwiększy to ryzyko zanieczyszczenia i akumulacji szczątków komórkowych w celu aktywacji mikrogleju.

4. Stymulacja komórek

  1. Przygotować odczynniki do stymulacji zgodnie z tabelą 3, używając dostępnych w handlu odczynników (patrz tabela materiałów).
  2. Dodaj odpowiednią objętość do każdej stymulowanej studzienki.
    UWAGA: Odpowiednia objętość zależy od stężenia bodźca i wielkości studni.
  3. Umieścić płytki w temperaturze 37 °C z 5% CO2do końca stymulacji po 6 godzinach, 24 godzinach lub 48 godzinach.
  4. W przypadku analizy Western Blot należy odessać supernatant i dodać 50 μl buforu do lizy białek (patrz tabela materiałów) za pomocą pipety. Za pomocą końcówek zdrap spód płytki, aby odłączyć zlizowane komórki i przenieść je do probówek o pojemności 1,5 ml. Przechowywać w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Płytki hodowlane mogą być przechowywane przez lata w temperaturze -80 °C, jeśli supernatant jest prawidłowo zasysany.
  5. Do analizy RT-qPCR6,31, odessać supernatant i przechowywać płytki hodowlane bezpośrednio w temperaturze -80 °C do ekstrakcji mRNA (krok 5).
  6. Aby uzyskać informacje na temat testu fagocytarnego, zobacz krok 6.

5. ekstrakcja mRNA i analiza RT-qPCR

  1. Wykonaj ekstrakcję RNA, RT-PCR i RT-qPCR zgodnie z protokołem producenta (patrz Tabela materiałów). Zapoznaj się z Tabelą 4, aby zapoznać się z sekwencjami starterów5,6,31.
  2. Wykonaj analizę RT-qPCR, postępując zgodnie z wcześniej opublikowanym raportem5.

6. Test fagocytarny

  1. Stymuluj komórki i wykonaj test fagocytarny w ciągu ostatnich 3 godzin stymulacji. Na przykład w przypadku stymulacji trwającej 6 godzin rozpocznij test fagocytarny po 3 godzinach stymulacji; a w przypadku stymulacji trwającej 12 godzin rozpocznij test fagocytarny 9 godzin po rozpoczęciu stymulacji.
  2. Oblicz liczbę koralików potrzebnych do przygotowania, biorąc pod uwagę stosunek (1 komórka: 50 koralików). Do jednego dołka z płytki 96-dołkowej wymagane jest 8,1 x 106 koralików. Przygotować mieszaninę kulek zgodnie z tabelą 5.
    UWAGA: Ostrożnie wymieszać fiolkę z kulkami przed dodaniem do mieszaniny PBS/FBS.
  3. Inkubować przez 1 godzinę w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C. Wirować co 10 minut.
  4. Oblicz objętość roztworu, który należy dodać do każdej studzienki. Dodać roztwór i inkubować przez 3 godziny.
  5. Przepłucz studzienki trzy razy 1x PBS. Odczytaj emisję fluorescencji przy 550 nm (długość fali emisji Cy3).

7. Kontrola jakości czystości

  1. Oceń czystość izolacji magnetycznej CD11b za pomocą cytometrii przepływowej (FACS) (przed i po sortowaniu komórek), a następnie wykonaj RT-qPCR.
    1. Policz komórki i ponownie zawieś w buforze FACS (PBS + 2 mM EDTA + 0,5% albuminy surowicy bydlęcej) w celu uzyskania rozcieńczenia 10 x 106 komórek/ml po kroku 3.5 i kroku 3.14.
    2. Po 15 minutach konwencjonalnego blokowania Fc32,33, inkubuj komórki przez 15 minut z sondą żywotności (FVS780) i przeciwciałami sprzężonymi z fluoroforem przeciwko mysim CD45, CD11b, CX3CR1, ACSA-2, O4 lub odpowiadającym im izotypom kontrolnym32,33 w stężeniu zalecanym przez producentów (patrz Tabela materiałów).
    3. Umyj komórki buforem FACS, utrwal i przepuśćcie za pomocą dostępnego w handlu zestawu do przepuszczalności (patrz tabela materiałów).
    4. Ponownie wykonać blokowanie Fc na permeabilizowanych komórkach, a następnie inkubować z przeciwciałem sprzężonym z fluoroforem przeciwko NeuN (patrz tabela materiałów) lub jego izotypowi kontrolnemu przez 15 minut.
    5. Wykonaj analizę FACS po umyciu buforem FACS.
    6. Po wykluczeniu dubletów i martwych komórek na podstawie parametrów morfologicznych i barwienia FVS780, odpowiednio, wybierz strategię bramkowania dla powierzchniowej ekspresji CX3CR1 (mikroglej), ACSA-2 (astrocyty), O4 (oligodendrocyty) i wewnątrzkomórkową obecność NeuN (neurony) w celu analizy procentu komórek dodatnich.
  2. Po kroku 5 wyekstrahuj mRNA i wykonaj RT-qPCR w celu ilościowego określenia Itgam (CD11b), Cx3cr1, Olig2, synaptofizyny i mRNA Gfap. Normalizuj Cq za pomocą mRNA Rpl13a jako reportera i wykonaj względną ekspresję do mRNA Itgam.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Mikrogleja to rezydujące w OUN makrofagi, które ulegają aktywacji pod wpływem czynników środowiskowych (urazy, cząsteczek toksycznych, stanu zapalnego)4,5,6,34 (Rycina 3A). Badania in vitro nad mikrogleją są powszechnie stosowane do oceny autonomicznych mechanizmów komórkowych związanych z tymi czynnikami środowiskowymi oraz do charakterystyki stanu aktyw...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Obecna praca przedstawia pierwotną hodowlę komórek mikrogleju przy użyciu magnetycznie posortowanych komórek CD11b+. Oprócz oceny funkcjonalnej mikrogleju (RT-qPCR i testy fagocytarne) określono również czystość kultur mikrogleju.

Klasyczne hodowle komórek mikrogleju są zwykle generowane z mózgu noworodków gryzoni P1 lub P2 i hodowane wspólnie z astrocytami przez co najmniej 10 dni. Mikroglej jest następnie oddzielany mechanicznie za pomocą wytrząsarki orbitalnej. Metoda izolacji i hodowli mik...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Figurki zostały stworzone przy użyciu BioRender. Badania są finansowane przez Inserm, Université de Paris, Horyzont 2020 (PREMSTEM-874721), Fondation de France, Fondation ARSEP, Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, Fondation Grace de Monaco oraz dodatkowy grant z Investissement d'Avenir -ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS i Investissement d'Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Anty myszy ACSA-2 PE Vio 615Miltenyi Biotec130-116-246
Anti Mouse CD11b BV421Sony Biotechnology1106255
Anti mouse CD45 BV510Sony Biotechnology1115690
Anti mouse CX3CR1 PE Cy7Sony Biotechnology1345075
Anti mouse NeuN PEMilli-MarkFCMAB317PE
przeciw myszom O4 Vio Bright B515Miltenyi Biotec130-120-016
Zestaw do permeabilizacji BD Cytofix/CytopermBD Biosciences554655
Albumina surowicy bydlęcejMiltenyi Biotec130-091-376
CD11b (Microglej) MicroBeads, h, mMiltenyi Biotec130-093-634
Mikroskop konfokalnyLeica TCS SP8
D-PBS (10x)Thermo Scientific14200067
EDTASigma-AldrichE1644
Falcon Cell culture 12-dołkowa płytka, płaskie dno + pokrywkaDutscher353043
Falcon Cell culture 96-dołkowa płytka, płaskie dno + pokrywkaDutscher353072
Falcon probówki 50 mlDutscher352098
Odczynnik blokujący Fc (mysz CD16/32)BD Biosciences553142
Mikroskop fluorescencyjnyNikon ECLIPSE TE300
gentleMACS C Tubes (4 x 25 probówek)Miltenyi Biotec130-096-334
gentleMACS Octo Disocjator z grzałkamiMiltenyi Biotec130-096-427
Zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10xThermo Scientific14065049
Zbilansowany roztwór soli Hanksa (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10xThermo Scientific14185045
iQ SYBR  Green SupermixBio-rad1725006CUST
Iscript Synteza c-DNABio-rad1708890
Koraliki lateksowe, polistyren modyfikowany aminami, fluorescencyjna czerwieńSigma-AldrichL2776-1mL
Lipopolisacharydy (LPS) z  Escherichia coli  O55:B5Sigma-AldrichL2880
Pożywka bez surowicyThermo Scientific12065074
MACS BSA Roztwór podstawowyMiltenyi Biotec130-091-376
Filtry siatkowe MACS SmartStrainers (70 μ m), 4 x 25 sztMiltenyi Biotec130-110-916
Mysz IgG1 PEMilliporeMABC002H
Mysz IgG2a PE Cy7Mysz 2601265
IL1 betaMiltenyi Biotec130-101-684
Bloki kolumnowe Multi-24Miltenyi Biotec130-095-691
Separator MultiMACS Cell24Miltenyi Zestaw
- PapainaMiltenyi Biotec130-092-628
Licznik nukleologiczny NC-200Chemometec
Nucleospin RNA Plus XSMacherey Nagel740990.5
Zakonnica EZFlip Stożkowe probówki wirówkoweThermo Scientific362694
OPTILUX szalka Petriego - 100 x 20 mmDutscher
Pé nicylina-streptomycyna (10 000 U/ml)Thermo Scientific15140122
Rat IgG2b, k BV421BD Biosciences562603
Rat IgG2b, k BV510Sony Biotechnology2603230
REA control (S) PE vio 615Miltenyi Biotec130-104-616
REA control (S) Vio Bright B515Miltenyi Biotec130-113-445
Rekombinowane mysie białko IFN-gamma R& D System485-MI
Rekombinowane białko myszy IL-10 R& D System417-ML
Rekombinowane białko IL-4 myszyR& D System404-ML
RIPA BuforSigma-AldrichR0278
Sonda żywotności (FVS780)BD Biosciences565388
Sony Biotechnology do dysocjacji tkanek nerwowych Biotec 353003

Bibliografia

  1. Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).
  2. Wright-Jin, E. C., Gutmann, D. H. Microglia as dynamic cellular mediators of brain function. Trends in Molecular Medicine. 25 (11), 967-979 (2019).
  3. Hellstrom Erkenstam, N., et al. Temporal characterization of microglia/macrophage phenotypes in a mouse model of neonatal hypoxic-ischemic brain injury. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 286(2016).
  4. Chhor, V., et al. Role of microglia in a mouse model of paediatric traumatic brain injury. Brain, Behavior, and Immunity. 63, 197-209 (2017).
  5. Van Steenwinckel, J., et al. Decreased microglial Wnt/beta-catenin signalling drives microglial pro-inflammatory activation in the developing brain. Brain. 142 (12), 3806-3833 (2019).
  6. Chhor, V., et al. Characterization of phenotype markers and neuronotoxic potential of polarised primary microglia in vitro. Brain, Behavior, and Immunity. 32, 70-85 (2013).
  7. Di Pietro, P., et al. Bisphenol A induces DNA damage in cells exerting immune surveillance functions at peripheral and central level. Chemosphere. 254, 126819(2020).
  8. Roque, P. J., Dao, K., Costa, L. G. Microglia mediate diesel exhaust particle-induced cerebellar neuronal toxicity through neuroinflammatory mechanisms. Neurotoxicology. 56, 204-214 (2016).
  9. Yun, H. S., Oh, J., Lim, J. S., Kim, H. J., Kim, J. S. Anti-inflammatory effect of wasp venom in BV-2 microglial cells in comparison with bee venom. Insects. 12 (4), 297(2021).
  10. Nair, S., et al. Lipopolysaccharide-induced alteration of mitochondrial morphology induces a metabolic shift in microglia modulating the inflammatory response in vitro and in vivo. Glia. 67 (6), 1047-1061 (2019).
  11. Fleiss, B., et al. The anti-inflammatory effects of the small molecule pifithrin-micro on BV2 microglia. Developmental Neuroscience. 37 (4-5), 363-375 (2015).
  12. Dean, J. M., et al. Microglial MyD88 signaling regulates acute neuronal toxicity of LPS-stimulated microglia in vitro. Brain, Behavior, and Immunity. 24 (5), 776-783 (2010).
  13. Tang, Y., Wolk, B., Nolan, R., Scott, C. E., Kendall, D. A. Characterization of subtype selective cannabinoid CB2 receptor agonists as potential anti-inflammatory agents. Pharmaceuticals (Basel). 14 (4), 378(2021).
  14. Liu, C. P., et al. miR146a reduces depressive behavior by inhibiting microglial activation. Molecular Medicine Reports. 23 (6), 463(2021).
  15. Aquino, G. V., Dabi, A., Odom, G. J., Zhang, F., Bruce, E. D. Evaluating the endothelial-microglial interaction and comprehensive inflammatory marker profiles under acute exposure to ultrafine diesel exhaust particles in vitro. Toxicology. 454, 152748(2021).
  16. You, J. E., Jung, S. H., Kim, P. H. The effect of Annexin A1 as a potential new therapeutic target on neuronal damage by activated microglia. Molecules and Cells. 44 (4), 195-206 (2021).
  17. Xie, Z., et al. By regulating the NLRP3 inflammasome can reduce the release of inflammatory factors in the co-culture model of tuberculosis H37Ra strain and rat microglia. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 637769(2021).
  18. Ogunrinade, F. A., et al. Zanthoxylum zanthoxyloides inhibits lipopolysaccharide- and synthetic hemozoin-induced neuroinflammation in BV-2 microglia: roles of NF-kappaB transcription factor and NLRP3 inflammasome activation. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 73 (1), 118-134 (2021).
  19. Fernandez-Arjona, M. D. M., Leon-Rodriguez, A., Lopez-Avalos, M. D., Grondona, J. M. Microglia activated by microbial neuraminidase contributes to ependymal cell death. Fluids Barriers CNS. 18 (1), 15(2021).
  20. Du, S., et al. Primary microglia isolation from postnatal mouse brains. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e62237(2021).
  21. Boccazzi, M., et al. The immune-inflammatory response of oligodendrocytes in a murine model of preterm white matter injury: the role of TLR3 activation. Cell Death & Disease. 12 (2), 166(2021).
  22. Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. An overview of in vitro methods to study microglia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 242(2018).
  23. Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147(2012).
  24. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
  25. Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. Isolation and culture of microglia. Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70(2019).
  26. Schroeter, C. B., et al. One brain-all cells: A comprehensive protocol to isolate all principal CNS-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 651(2021).
  27. Harms, A. S., Tansey, M. G. Isolation of murine postnatal brain microglia for phenotypic characterization using magnetic cell separation technology. Methods in Molecular Biology. 1041, 33-39 (2013).
  28. Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. Journal of Immunological Methods. 486, 112834(2020).
  29. Montilla, A., Zabala, A., Matute, C., Domercq, M. Functional and metabolic characterization of microglia culture in a defined medium. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 22(2020).
  30. Krishnan, M. L., et al. Integrative genomics of microglia implicates DLG4 (PSD95) in the white matter development of preterm infants. Nature Communications. 8 (1), 428(2017).
  31. Bokobza, C., et al. miR-146b protects the perinatal brain against microglia-induced hypomyelination. Annals of Neurology. 91 (1), 48-65 (2021).
  32. Villapol, S., et al. Early sex differences in the immune-inflammatory responses to neonatal ischemic stroke. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 3809(2019).
  33. Rosiewicz, K. S., et al. Comparison of RNA isolation procedures for analysis of adult murine brain and spinal cord astrocytes. Journal of Neuroscience Methods. 333, 108545(2020).
  34. Fleiss, B., et al. Microglia-mediated neurodegeneration in perinatal brain injuries. Biomolecules. 11 (1), 99(2021).
  35. Pawelec, P., Ziemka-Nalecz, M., Sypecka, J., Zalewska, T. The Impact of the CX3CL1/CX3CR1 axis in neurological disorders. Cells. 9 (10), 2277(2020).
  36. Reynolds, R., Cenci di Bello, I., Dawson, M., Levine, J. The response of adult oligodendrocyte progenitors to demyelination in EAE. Progress in Brain Research. 132, 165-174 (2001).
  37. Duan, W., et al. Novel insights into NeuN: From neuronal marker to splicing regulator. Molecular Neurobiology. 53 (3), 1637-1647 (2016).
  38. Kantzer, C. G., et al. Anti-ACSA-2 defines a novel monoclonal antibody for prospective isolation of living neonatal and adult astrocytes. Glia. 65 (6), 990-1004 (2017).
  39. Lee, S., Lee, D. K. What is the proper way to apply the multiple comparison test. Korean Journal of Anesthesiology. 71 (5), 353-360 (2018).
  40. Chao, C. C., Hu, S., Molitor, T. W., Shaskan, E. G., Peterson, P. K. Activated microglia mediate neuronal cell injury via a nitric oxide mechanism. Journal of Immunology. 149 (8), 2736-2741 (1992).
  41. Boje, K. M., Arora, P. K. Microglial-produced nitric oxide and reactive nitrogen oxides mediate neuronal cell death. Brain Research. 587 (2), 250-256 (1992).
  42. Biber, K., Owens, T., Boddeke, E. What is microglia neurotoxicity (Not). Glia. 62 (6), 841-854 (2014).
  43. Biber, K., Neumann, H., Inoue, K., Boddeke, H. W. Neuronal 'On' and 'Off' signals control microglia. Trends in Neurosciences. 30 (11), 596-602 (2007).
  44. Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).
  45. Boucsein, C., Kettenmann, H., Nolte, C. Electrophysiological properties of microglial cells in normal and pathologic rat brain slices. European Journal of Neuroscience. 12 (6), 2049-2058 (2000).
  46. Beutner, C., et al. Unique transcriptome signature of mouse microglia. Glia. 61 (9), 1429-1442 (2013).
  47. Schmid, C. D., et al. Differential gene expression in LPS/IFNgamma activated microglia and macrophages: in vitro versus in vivo. Journal of Neurochemistry. 109, Suppl. 1 117-125 (2009).
  48. Srivastava, P. K., et al. A systems-level framework for drug discovery identifies Csf1R as an anti-epileptic drug target. Nature Communications. 9 (1), 3561(2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja mikroglejumagnetyczna separacja kom rekhodowla pierwotna mikroglejum zg noworodka myszymikrokulki CD11btest fagocytozycytometria przep ywowamikroskopia konfokalnaaktywacja mikroglejuanaliza RT qPCR

Powiązane artykuły