Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przygotowanie próbki i względna ocena ilościowa przy użyciu redukcyjnej metylacji amin do badań peptydomicznych

2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62971

⸱

4 listopada 2021

 ,  ,  , 
1Department of Biological and Environmental Sciences, Bioscience Institute, Sao Paulo State University (UNESP), 2Biodiversity of Coastal Environments Postgraduate Program, Bioscience Institute, Sao Paulo State University (UNESP)

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje metodę przygotowania próbki opartą na inaktywacji termicznej w celu zachowania endogennych peptydów unikających degradacji po śmierci, a następnie względnej kwantyfikacji za pomocą znakowania izotopowego plus LC-MS.

Streszczenie

Peptydomika może być zdefiniowana jako jakościowa i ilościowa analiza peptydów w próbce biologicznej. Jego główne zastosowania obejmują identyfikację biomarkerów peptydowych chorób lub stresu środowiskowego, identyfikację neuropeptydów, hormonów i bioaktywnych peptydów wewnątrzkomórkowych, odkrywanie peptydów przeciwdrobnoustrojowych i nutraceutycznych z hydrolizatów białkowych i może być stosowany w badaniach w celu zrozumienia procesów proteolitycznych. Niedawny postęp w przygotowywaniu próbek, metodach separacji, technikach spektrometrii mas i narzędziach obliczeniowych związanych z sekwencjonowaniem białek przyczynił się do wzrostu liczby zidentyfikowanych peptydów i scharakteryzowanych peptydomów. Badania peptydomiczne często analizują peptydy, które są naturalnie wytwarzane w komórkach. W tym miejscu opisano protokół przygotowania próbki oparty na inaktywacji termicznej, który eliminuje aktywność proteazy i ekstrakcję w łagodnych warunkach, dzięki czemu nie dochodzi do rozszczepienia wiązań peptydowych. Ponadto pokazano również względną ilościowość peptydów przy użyciu znakowania stabilnymi izotopami przez redukcyjną metylację amin. Ta metoda etykietowania ma pewne zalety, ponieważ odczynniki są dostępne na rynku, niedrogie w porównaniu z innymi, stabilne chemicznie i umożliwiają analizę do pięciu próbek w jednym cyklu LC-MS.

Wprowadzenie

"Omika" charakteryzuje się głęboką analizą zestawu molekuł, takich jak DNA, RNA, białka, peptydy, metabolity itp. Wygenerowane w ten sposób zestawy danych na dużą skalę (genomika, transkryptomika, proteomika, peptydomika, metabolomika itp.) zrewolucjonizowały biologię i doprowadziły do zaawansowanego zrozumienia procesów biologicznych1. Termin peptydomika zaczął być wprowadzany na początku XX wieku, a niektórzy autorzy odnosili się do niego jako do gałęzi proteomiki2. Peptydomika ma jednak wyraźne cechy szczególne, gdzie głównym zainteresowaniem jest badanie zawartości naturalnie generowanych peptydów podczas procesów komórkowych, a także charakterystyka aktywności biologicznej tych cząsteczek3,4.

Początkowo badania nad peptydami bioaktywnymi były ograniczone do neuropeptydów i peptydów hormonalnych poprzez degradację Edmana i test radioimmunologiczny. Jednak techniki te nie pozwalają na globalną analizę, w zależności od izolacji każdego peptydu w wysokich stężeniach, czasu na wytworzenie przeciwciał, oprócz możliwości reaktywności krzyżowej5.

Analiza peptydomiki stała się możliwa dopiero po kilku postępach w spektrometrii mas sprzężonej z chromatografią cieczową (LC-MS) i projektach genomowych, które dostarczyły obszernych pul danych do badań proteomicznych/peptydomicznych6,7. Co więcej, konieczne było ustalenie specjalnego protokołu ekstrakcji peptydów dla peptydomów, ponieważ pierwsze badania, w których analizowano neuropeptydy globalnie w próbkach mózgu, wykazały, że na wykrywanie miała wpływ masowa degradacja białek, które zachodzą głównie w tej tkance po 1 minucie po sekcji zwłok. Obecność tych fragmentów peptydu maskowała sygnał neuropeptydu i nie reprezentowała peptydomu in vivo. Problem ten został rozwiązany głównie dzięki zastosowaniu szybkiej inaktywacji proteaz przez nagrzewanie za pomocą promieniowania mikrofalowego, co drastycznie zmniejszyło obecność tych fragmentów artefaktów i pozwoliło nie tylko na identyfikację fragmentów neuropeptydów, ale ujawniło obecność zestawu peptydów z białek cytozolowych, mitochondrialnych i jądrowych, różniących się od degradomu6,8,9.

Te procedury metodologiczne pozwoliły na rozszerzenie peptydomu poza dobrze znane neuropeptydy, gdzie setki wewnątrzkomórkowych peptydów generowanych głównie przez działanie proteasomów zostały zidentyfikowane w drożdżach10, danio pręgowany11, gryzonie tkanki12, oraz ludzkie komórki13. Wykazano, że dziesiątki tych wewnątrzkomórkowych peptydów mają zarówno aktywność biologiczną, jak i farmakologiczną14,15. Co więcej, peptydy te mogą być wykorzystywane jako biomarkery choroby i mogą mieć znaczenie kliniczne, jak wykazano w płynie mózgowo-rdzeniowym od pacjentów z tętniakami worka wewnątrzczaszkowego16.

Obecnie, oprócz identyfikacji sekwencji peptydowych, możliwe jest uzyskanie danych o bezwzględnej i względnej kwantymetrii za pomocą spektrometrii mas. W bezwzględnej kwantyfikacji poziomy peptydów w próbce biologicznej są porównywane ze standardami syntetycznymi, podczas gdy w względnej kwantyfikacji poziomy peptydów są porównywane między dwiema lub więcej próbkami17. Względną ocenę ilościową można przeprowadzić przy użyciu następujących metod: 1) "label free"18; 2) znakowanie metaboliczne in vivo lub 3) znakowanie chemiczne. Dwie ostatnie opierają się na wykorzystaniu stabilnych form izotopowych wbudowanych w peptydy19,20. W analizie bezznacznikowej poziomy peptydów są szacowane, biorąc pod uwagę siłę sygnału (liczbę widmową) podczas LC-MS18. Jednak znakowanie izotopowe może uzyskać dokładniejsze względne poziomy peptydów.

Wiele badań peptydomicznych używało odczynników do znakowania maślanu trimetyloamonu (TMAB) jako znakowania chemicznego, a ostatnio zastosowano redukcyjną metylację amin (RMA) z deuterowanymi i niedeuterowanymi formami formaldehydu oraz odczynniki cyjanoborowodorku sodu11,21,22. Etykiety TMAB nie są jednak dostępne na rynku, a proces syntezy jest bardzo pracochłonny. Z drugiej strony, w RMA odczynniki są dostępne na rynku, niedrogie w porównaniu z innymi etykietami, procedura jest prosta do wykonania, a znakowane peptydy są stabilne23,24.

Użycie RMA polega na tworzeniu zasady Schiffa poprzez umożliwienie peptydom reakcji z formaldehydem, po której następuje reakcja redukcyjna przez cyjanoborowodorek. Reakcja ta powoduje dimetylację wolnych grup aminowych na N-końcach i łańcuchach bocznych lizyny oraz monometylanów N-końcowych prolin. Ponieważ reszty proliny są często rzadkie na N-końcu, praktycznie wszystkie peptydy z wolnymi aminami na N-końcu są oznaczone dwiema grupami metylowymi23,24,25.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Poniższa procedura ekstrakcji peptydów i redukcyjnej metylacji została zaadaptowana z wcześniej opublikowanych procedur24,25,26,27. Protokół ten był zgodny z wytycznymi Krajowej Rady Kontroli Doświadczeń na Zwierzętach (CONCEA) i został zatwierdzony przez Komisję Etyki ds. Wykorzystywania Zwierząt (CEUA) w Instytucie Nauk Biologicznych Uniwersytetu Stanowego w Sao Paulo. Kroki protokołu są pokazane w Rysunek 1.

UWAGA: Przygotuj wszystkie roztwory wodne w ultraczystej wodzie.

1. Ekstrakcja peptydów

  1. Hodowla komórkowa
    1. Hodować komórki SHSY5Y w 15-centymetrowym naczyniu w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2 w zmodyfikowanej pożywce Eagle's firmy Dulbecco zawierającej 15% płodowej surowicy bydlęcej i 1% penicyliny-streptomycyny.
    2. Użyj 2-3 płytek na każdą próbkę. Wyhoduj komórki do 100% zbieżności.
    3. Po przewidzianym leczeniu należy dwukrotnie przemyć komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami. Następnie dodaj 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami, zeskrob komórki i zbierz do probówki o pojemności 15 ml.
    4. Odwirować przy 800 x g przez 5 minut i usunąć supernatant. Zawiesić osad w 1 ml ultra oczyszczonej wody dejonizowanej o temperaturze 80 °C.
    5. Przenieść zawartość probówki (lizat komórkowy) do probówki do mikrofuge o pojemności 2 ml.
  2. Tkanki zwierzęce (głównie tkanka nerwowa):
    1. Znieczulić dorosłego samca danio pręgowanego typu dzikiego śmiertelną dawką MS 222 (100 mg/L) i natychmiast poddać go 8-sekundowemu promieniowaniu mikrofalowemu w celu dezaktywacji peptydazy i proteazy.
      UWAGA: Można używać kuchenki mikrofalowej typu domowego. Kuchenka mikrofalowa o mocy 900 W była używana przez 8 do 10 s przy pełnej mocy. Używana kuchenka mikrofalowa musi być w stanie podnieść temperaturę mózgu do > 80 °C w ciągu 10 sekund. Odtwarzalność w ogrzewaniu między próbkami byłaby również korzystna dzięki umieszczeniu tkanki w tym samym miejscu w kuchence mikrofalowej.
    2. Po inaktywacji termicznej zebrać cały mózg do probówki do mikrofuge o pojemności 2 ml i zamrozić w temperaturze -80 °C do czasu analizy.
    3. Zawiesić próbkę tkanki w 1 ml ultra oczyszczonej wody dejonizowanej w temperaturze 80 °C. Sonikować tkankę za pomocą sondy za pomocą 30 impulsów (4 Hz) o s.
      UWAGI: W przypadku tkanek wątroby i nerek należy użyć homogenizatora mechanicznego przy 10 000-30 000 obr./min przez 20 s. W przypadku tkanek mięśniowych zmiel tkankę w ciekłym azocie za pomocą tygla porcelanowego i tłuczka. Poniższe kroki są takie same dla lizatu komórkowego lub tkanki homogenacyjnej.
  3. Inkubować lizat komórkowy lub homogenację tkanki w temperaturze 80 °C przez 20 minut. Następnie schładzamy na lodzie przez 10-30 minut.
  4. Dodać 10 μl 1 M roztworu podstawowego HCl na każdy 1 ml objętości próbki, aby uzyskać końcowe stężenie 10 mM. Mieszać przez wirowanie przez 20 s i dalej inkubować na lodzie przez 15 min.
    UWAGA: Przed zakwaszeniem upewnij się, że próbka jest całkowicie schłodzona, aby uniknąć zerwania wiązań peptydowych spowodowanych zakwaszeniem w podwyższonych temperaturach.
  5. Odwirować lizat komórkowy lub homogenatyczną tkankę w temperaturze 12 000 x g w temperaturze 4 °C przez 15 minut. Zebrać supernatant w probówkach do mikrowirówek o niskiej zawartości białka wiążącego i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  6. Wyczyść urządzenia ultrafiltracyjne (filtry odcinające 10 kDa) dodając wodę i odwirowując przy 2300 x g przez 3 min. Powtórz ten krok jeszcze dwa razy.
  7. Umieścić supernatant w wstępnie umytych filtrach odcinających o mocy 10 kDa i odwirować w temperaturze 2 300 x g w temperaturze 4 °C przez 50 minut w wirówce przechowywanej w lodówce. Przepływowy reprezentuje ekstrakt peptydowy.
  8. Odsalać próbki na kolumnach oczyszczających z odwróconymi fazami zgodnie z instrukcjami producenta przy użyciu roztworów acetonitrylu (ACN) i kwasu trifluorooctowego (TFA), jak opisano poniżej:
    1. Zrównoważyć kolumnę z 1 ml 100% ACN.
    2. Przemyć kolumnę 1 ml roztworu 5% ACN z 0,1% TFA.
    3. Załadować całą objętość próbki do kolumny.
    4. Przemyć kolumnę 1 ml roztworu 5% ACN z 0,1% TFA
    5. Eluować peptydy z kolumny za pomocą 1,8 ml roztworu 100% ACN z 0,15% TFA w probówkach do mikrowirówek o niskim poziomie wiązania białek.
  9. Całkowicie wysuszyć próbkę w wirówce próżniowej. Ustawić metodę zatężania rozpuszczalników organicznych i temperaturę na 30 °C. Czas koncentracji jest monitorowany na wyświetlaczu.
    1. Próbki należy przechowywać w temperaturze -80°C do następnego etapu.

2. Kwantyfikacja peptydów za pomocą fluoreskaminy

UWAGA: Ilość peptydu można oszacować za pomocą fluoreskaminy o pH 6,8, jak wcześniej opisano11,28. Metoda ta polega na przyłączeniu cząsteczki fluoreskaminy do pierwszorzędowych amin obecnych w resztach lizyny (K) i/lub N-końcu peptydów. Reakcję przeprowadza się przy pH 6,8, aby zagwarantować, że fluoreskamina reaguje tylko z grupami aminowymi peptydów, a nie z wolnymi aminokwasami. Fluorescamina jest mierzona za pomocą spektrofluorometru o długości fali wzbudzenia 370 nm i długości fali emisji 480 nm.

  1. Przygotować różne stężenia wzorcowego peptydu (0,05, 0,1, 0,15, 0,2, 0,3, 0,5 i 0,7 μg/μl) i przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: Peptyd 5A (LTLRTKL) jest sugerowany, ponieważ ma znany skład i stężenie.
  2. Przygotować roztwór podstawowy fluoreskaminy (0,3 mg/ml) w acetonie. Porcję szybko rozlać w probówkach do mikrowirówek (1 ml), zamknąć za pomocą parafilmu i przechowywać w temperaturze -20 °C w ciemności.
  3. Przygotować 0,2 M bufor fosforanowy (PB) o pH 6,8,
    UWAGA: Przygotować 0,2 M PB, dodając 0,1 M buforu fosforanowego o pH 6,8 (26,85 ml Na2HPO3 1M) i 0,1 M buforu fosforanowego o pH 6,8 (23,15 ml NaH2PO3 1M) do 250 ml wody
  4. Zawiesić próbki peptydów w 100-200 μl ultra oczyszczonej wody.
  5. Odpipetować 2,5 μl wzorcowych stężeń peptydów i próbek na białą 96-dołkową płytkę do trzykrotnych testów fluorescencyjnych. Dodać 25 μl 0,2 M buforu fosforanowego.
  6. Dodać 12,5 μl fluoreskaminy za pomocą pipety wielokanałowej. Delikatnie homogenizować przez 1 minutę na wytrząsarce rotatora orbitalnego.
  7. Następnie dodaj 110 μl wody za pomocą pipety wielokanałowej, aby zatrzymać reakcję.
    UWAGA: Przenieś roztwór podstawowy fluoreskaminy i ultraczystą wodę do dwóch zbiorników, aby pipetować te roztwory za pomocą pipety wielokanałowej.
  8. Dostosuj następujące parametry odczytu na spektrofluorometrze: Odczytaj próbki od góry, długość fali wzbudzenia przy 370 nm i długość fali emisji przy 480 nm.
  9. Odczytać tabliczkę na spektrofluorometrze.

3. Redukcyjna metylacja znakowania amin

UWAGA: Ta metoda znakowania izotopowego opiera się na dimetylacji grup aminowych za pomocą deuterowanych i niedeuterowanych form formaldehydu i odczynników cyjanoborowodorku sodu. Produkt końcowy tej reakcji dodaje 28 Da, 30 Da, 32 Da, 34 Da lub 36 Da do końcowej masy każdego peptydu w każdym dostępnym miejscu znakowania (lizyna lub N-koniec). Reakcja ta powoduje różnicę m/z w peptydach znakowanych różnymi formami obserwowanymi w widmie SM (Tabela 1).

UWAGA: Do obchodzenia się z tymi związkami powinien być używany odpowiedni sprzęt ochronny i należy zachować ostrożność, aby zminimalizować narażenie. Zabiegi z użyciem odczynników do stosowania formaldehydu i cyjanoborowodorku sodu powinny być wykonywane w dygestorium, ponieważ są one bardzo toksyczne (w tym ważenie cyjanoborowodorku sodu). Podczas reakcji hartowania i zakwaszania może powstać toksyczny gaz (cyjanowodór).

  1. W dniu zabiegu należy przygotować następujące świeże roztwory z podstaw lub odczynników w wodzie ultraczystej:
    1. Rozcieńczyć zapas 37% formaldehydu (CH2O) do 4%.
    2. Rozcieńczyć zapas 20% deuterowanego formaldehydu (CD2O) do 4%.
    3. Rozcieńczyć 20 % deuterowanego C13 formaldehydu (13CD2O) do 4%.
    4. Przygotować 0,6 M NaBH3CN.
    5. Przygotować 0,6 M NaBD3CN.
    6. Przygotować roztwór 1% wodorowęglanu amonu.
    7. Przygotuj roztwór 5% kwasu mrówkowego.
      UWAGA: Jeśli chodzi o względną ilościowość peptydów, ponieważ w zależności od liczby użytych etykiet można przeprowadzić różne schematy eksperymentalne, należy zachować ostrożność podczas procedury znakowania chemicznego. Zaleca się oddzielenie małych porcji etykiet w oddzielnych stojakach z odpowiednimi próbkami, które mają być etykietowane, aby zmniejszyć ryzyko błędu ludzkiego przy dodawaniu niewłaściwego odczynnika do probówek z próbkami.
  2. Przygotować każdą próbkę zawierającą do 25 μg peptydu. Próbki nie mogą zawierać trisu ani wodorowęglanu amonu.
    UWAGA: Ilości opisane poniżej są wystarczające dla każdej próbki o objętości 100 μl.
    Wykonaj kroki 3.3-3.8 w dygestorium.
  3. Dodać 1/10objętości 1 M TEAB do próbek (końcowe stężenie roztworu: 100 mM TEAB). Sprawdź pH za pomocą papierka wskaźnikowego pH; Musi wynosić od 5 do 8. W razie potrzeby wyregulować za pomocą HCl lub NaOH.
  4. Dodać 4 μl niedeuterowanego, deuterowanego formaldehydu lub deuterowanego formaldehydu C13 zgodnie z ustalonym schematem etykietowania. Mieszaj przez 5 sekund, wirując.
  5. Dodać 4 μl NaBH3CN (0,6 M) lub NaBD3CN (0,6 M) zgodnie z ustalonym schematem etykietowania. Mieszaj przez 5 sekund, wirując.
  6. Inkubować w dygestorium przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, mieszając co 30 minut.
  7. Powtórz kroki 3.4 i 3.5. Próbki należy inkubować przez noc pod wyciągiem w temperaturze pokojowej.
  8. Dodać 16 μl wodorowęglanu amonu (1%) i wymieszać przez wirowanie. Umieścić próbkę na lodzie, dodać 8 μl kwasu mrówkowego (5%) i mieszać wirowo przez 5 sekund.
  9. Połączyć próbki, dostosować pH do 2-4 i odsolić połączone próbki na kolumnach czyszczących z odwróconymi fazami, jak opisano wcześniej w kroku 1.8.
  10. Całkowicie wysuszyć próbkę w wirówce próżniowej. Ustawić metodę zatężania rozpuszczalników organicznych i temperaturę na 30 °C. Czas koncentracji jest monitorowany na wyświetlaczu.
  11. Próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C.

4. Chromatografia cieczowa i spektrometria mas

  1. Wykonaj analizę LC-MS przy użyciu systemu nanoHPLC sprzężonego z instrumentem MS kompatybilnym ze znacznikami metylowymi.
    UWAGA: Różne instrumenty MS są kompatybilne z oznaczeniem RMA. System nanoHPLC sprzężony z Orbitrap jest zwykle używany do przeprowadzania analizy LC-MS za pomocą źródła jonów nanoelektronatrysku. Najpierw próbkę ładuje się do kolumny wstępnej, a peptydy rozdziela się w kolumnie analitycznej. Elucję peptydów przeprowadza się przy użyciu gradientu liniowego 5%-45% acetonitrylu, w 0,1% kwasie mrówkowym, przez 90 minut, przy przepływie 200 nL/min. Spektrometr mas jest ustawiony tak, aby działał w trybie zależnym od danych. Każdy pełny skan jest rejestrowany z intensywnością 10-30 eV, 2,3 Kv, a następnie wybiera się dziesięć najwyższych pików do fragmentacji dysocjacji wywołanej kolizją (CID). Czas wtrysku jest ustawiony na pułapce jonowej na 100 ms, a wtrysk transformaty Fouriera (FT)-MS jest ustalany z rozdzielczością 1000 ms 30 000 przy m/z 300-1800. Do skanowania fragmentacyjnego używane jest minimum 5000 zliczeń i dynamiczne wykluczenie 70 s.

5. Względna ocena ilościowa peptydów

UWAGA: Widma MS są analizowane w oprogramowaniu spektrometru masowego. Grupy pików znakowanych peptydów z różnymi znacznikami są identyfikowane w widmach MS. Względną wartość ilościową oblicza się na podstawie intensywności każdego piku monoizotopowego. Każda leczona grupa jest porównywana z odpowiednią grupą kontrolną.

  1. Kliknij dwukrotnie prawym przyciskiem myszy plik surowej próbki, aby otworzyć oprogramowanie do analizy widma. Załaduj chromatogramy czasu retencji (RT) i widma MS (EM) na dwie zakładki, odpowiednio na górze i na dole.
  2. Kliknij prawym przyciskiem myszy sekwencyjnie ikony opcji Wyświetlanie i Masa na pasku narzędzi oprogramowania i ustaw dokładność masy na cztery miejsca po przecinku.
  3. Umieść kursor myszy w dowolnym miejscu na karcie RT. Poszukaj czasu przechowywania odpowiedniego jonu, który ma być analizowany, i kliknij prawym przyciskiem myszy. Widmo MS wybranego czasu zostanie automatycznie pokazane w zakładce EM.
  4. Umieść kursor myszy w dowolnym miejscu na karcie EM. Poszukaj jonów do analizy.
  5. Kliknij prawym przyciskiem myszy i przytrzymaj sąsiedni obszar po lewej stronie w pobliżu tych jonów. Następnie przeciągnij myszą w prawo w żądanym zakresie, aby powiększyć interesujący Cię obszar.
  6. Trzymaj mysz w pozycji na karcie EM i klikaj strzałki w prawo lub w lewo na klawiaturze, aby zdefiniować zakres jonów do analizy.
  7. Ustaw kursor myszy ponownie na karcie RT na początku żądanego interwału czasu.
  8. Kliknij prawym przyciskiem myszy i przeciągnij myszą do wybranej wartości czasu. Pozostaw przycisk. Skumulowana intensywność jonów zostanie automatycznie pokazana na karcie EM.
  9. Zbierz dane dotyczące m/z, z i intensywności jonów w arkuszu kalkulacyjnym.
    UWAGA: Masę monoizotopową każdego peptydu bez dodatku grup metylowych oblicza się według następującego wzoru:

    Masa niezmodyfikowanego peptydu = (m/z a x z) - (C a x T) - (1,008 x z)

    m/za     jest obserwowaną wartością masy do ładunku dla piku monoizotopowego dla każdego peptydu znakowanego różnymi kombinacjami znaczników (a = 1, 2, 3, 4 lub 5, odpowiadających numerowi próbki).
    z oznacza stan naładowania.
    Ca jest masą monoizotopową pary grup metylowych:
    Dla a=1, Ca = 28,0313 (dodatek netto dwóch grup CH3 do aminy pierwszorzędowej)
    Dla a=2, Ca = 30,0439 dla dwóch grup CHD2
    Dla a=3, Ca = 32,0564 dla dwóch grup CD2H
    Dla a=4, Ca= 34,0690 dla dwóch grup CD3
    Dla a=5, Ca = 36,0757 dla dwóch 13 grup CD3
    T to liczba par grup metylowych włączonych do peptydu. Można to obliczyć z następującego wzoru, gdy używanych jest pięć znaczników: T=z*(m/z5 - m/z1)/8. W przypadku peptydów, które zawierają pojedynczą aminę pierwszorzędową i dlatego są znakowane tylko dwiema grupami metylowymi, występują nakładanie się pików na widmach MS, gdy stosuje się sąsiednie znaczniki. Intensywność piku każdego znakowanego peptydu można skorygować za pomocą równań opisanych przez Tashima i Fricker25.

6. Identyfikacja peptydów

  1. Aby zidentyfikować peptydy, przeanalizuj dane MS/MS za pomocą wyszukiwarki bazy danych29,30.
  2. Aby obliczyć współczynnik fałszywych wykryć (FDR) przy użyciu metody fuzji wabiącej, przeszukaj bazę danych wabików.
    UWAGA: Powszechnie stosowane parametry wyszukiwania to brak swoistości enzymatycznej; zestaw tolerancji masy prekursora 15-50 ppm; tolerancja masy jonów fragmentacyjnych 0,5 Da; modyfikacje zmienne: aminy reaktywne z reszt Lys i N-końca peptydów izotopowych znaczników metylowych (L1 (+28), L2 (+30), L3 (+32), L4 (+34) i L5 (+36)), utlenionej metioniny (+15,99 Da) i acetylacji (+42,01 Da).
  3. Następnie posortuj peptydy według ich średniej lokalnej ufności, aby wybrać najlepsze widma do adnotacji i przefiltruj je według FDR ≤5%.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Przebieg badań peptydomowych. Etapy ekstrakcji peptydów i redukcyjnej metylacji amin. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wyniki uzyskane z testów przeprowadzonych na spektrometrze masowym są przechowywane w plikach z surowymi danymi, które można otworzyć w oprogramowaniu spektrometru masowego. W widmach MS można zaobserwować grupy pików reprezentujące znakowane peptydy zgodnie z zastosowanym schematem znakowania, w zakresie od 2 do 5 znaczników. Na przykład w Rysunek 2, pary pików wykrytych w czasie chromatograficznym są reprezentowane w eksperymencie, w którym użyto tylko dwóch znaczników izotopowych w dwóch ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W większości badań peptydomicznych jednym z krytycznych etapów jest bez wątpienia przygotowanie próbki, które powinno być starannie wykonane, aby uniknąć obecności fragmentów peptydów generowanych przez proteazy po kilku minutach pośmiertnych. Wstępne badania na ekstraktach mózgowych przygotowanych z próbek niepoddanych kuchence mikrofalowej wykazały obecność dużej liczby fragmentów białek w mikrofiltratach o masie 10 kDa. Opisano różne podejścia mające na celu uniknięcie degradacji widm peptydów w wyniku degradacji biał...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie istnieją konkurencyjne interesy finansowe.

Podziękowania

Rozwój i wykorzystanie opisanych tutaj technik było wspierane przez grant Brazylijskiej Narodowej Rady ds. Badań Naukowych 420811/2018-4 (LMC); Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (www.fapesp.br) przyznaje dotacje 2019/16023-6 (LMC), 2019/17433-3 (LOF) i 21/01286-1 (MEME). Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu artykułu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Filtry odcinające 10 kDaMerck MilliporeUFC801024Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membrana, 10 kDa
AcetonSigma-Aldrich179124
AcetonitrylSigma-Aldrich1000291000
Wodorowęglan amonuSigma-Aldrich11213
kolumna analityczna (EASY-Column)Kolumna EASY(SC200)  10 cm, ID75 i mikro; m, 3 i mikro; m, C18-A2
3-aminobenzoesan etylu metanosulfonianSigma-AldrichE10521MS-222
FluorescamineSigma-AldrichF9015
Roztwór formaldehyduSigma-Aldrich252549
Formaldehyd-13C, d2, roztwórSigma-Aldrich596388
Formaldehyde-d2 roztwórSigma-Aldrich492620
Kwas mrówkowySigma-Aldrich33015
WyciągQuimisQ216
Kwas solny - HClSigma-Aldrich258148
Rurki retencyjne LoBindEppendorfEP0030108116-100EA
LTQ-Orbitrap VelosThermo Fisher ScientificLTQ Velos
Kuchenka mikrofalowaPanasonicNN-ST67HSRU
n Easy-nLC II nanoHPLCThermo Fisher ScientificLC140
PEAKS StudioBioinformatics Solutions Inc.WERSJA 8.5
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiInvitrogen3002tabletki
prekolumna (EASY-Column)Thermo Fisher Scientific(SC001)2 cm, ID100 µ m, 5 i mikro; m, C18-A1
Wirówka z chłodzeniemHermleZ326Kdo rur stożkowych
Wirówka z chłodzeniemVisionVS15000CFNIIdo mikroprobówek
Kolumny czyszczące z odwróconymi fazami    (Kartridż Oasis HLB 1 cc)Waters186000383 Oasis HLB 1 cc Wkład
Cyjanoborodeuterek sodu - NaBD3CNSigma-Aldrich190020
Sicyjanoborowodorek sodu - NaBH3CNSigma-Aldrich156159
Fosforan sodu dwuzasadowySigma-AldrichS9763UWAGA: 0,2 M PB= 0,1 M bufor fosforanowy pH 6,8 (26,85 ml Na2HPO3 1M) plus 0,1 M bufor fosforanowy pH 6,8 (23,15 ml NaH2PO3 1M) do 250 ml wody
Fosforan sodu jednozasadowySigma-AldrichS3139
SonicatorQsonicaQ55-110
Standardowy peptydSekwencja aminokwasowa Proteimax: LTLRTKL
Bufor trietyloamoniowy - TEAB 1 MSigma-AldrichT7408
Kwas trifluorooctowy - TFASigma-AldrichT6508
Ultra oczyszczona wodaMilli-QDirect-Q 3UV
Wirówka próżniowaGeneVacMiVac Koncentrator
Łaźnia wodnaCientec266
Xcalibur OprogramowanieThermoFisher ScientificOPTON-30965
Kolumna analityczna DNA

Bibliografia

  1. Kandpal, R., Saviola, B., Felton, J. The era of 'omics unlimited. Biotechniques. 46 (5), 354-355 (2009).
  2. Farrokhi, N., Whitelegge, J. P., Brusslan, J. A. Plant peptides and peptidomics. Plant Biotechnology Journal. 6 (2), 105-134 (2008).
  3. Schulz-Knappe, P., Schrader, M., Zucht, H. D. The peptidomics concept. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 8 (8), 697-704 (2005).
  4. Dallas, D. C., et al. Current peptidomics: applications, purification, identification, quantification, and functional analysis. Proteomics. 15 (5-6), 1026-1038 (2015).
  5. Chard, T. An introduction to radioimmunoassay and related techniques (3rd Ed). FEBS Letters. 238 (1), 223(1988).
  6. Svensson, M., Sköld, K., Svenningsson, P., Andren, P. E. Peptidomics-based discovery of novel neuropeptides. Journal of Proteome Research. 2 (2), 213-219 (2003).
  7. Baggerman, G., et al. Peptidomics. Journal of Chromatography B. 803, 3-16 (2004).
  8. Theodorsson, E., Stenfors, C., Mathe, A. A. Microwave irradiation increases recovery of neuropeptides from brain tissues. Peptides. 11, 1191-1197 (1990).
  9. Che, F. Y., Lim, J., Pan, H., Biswas, R., Fricker, L. D. Quantitative neuropeptidomics of microwave-irradiated mouse brain and pituitary. Molecular & Cellular Proteomics. 4, 1391-1405 (2005).
  10. Dasgupta, S., et al. Analysis of the yeast peptidome and comparison with the human peptidome. PLoS One. 11 (9), 0163312(2016).
  11. Teixeira, C. M. M., Correa, C. N., Iwai, L. K., Ferro, E. S., Castro, L. M. Characterization of Intracellular Peptides from Zebrafish (Danio rerio) Brain. Zebrafish. 16 (3), 240-251 (2019).
  12. Fricker, L. D. Analysis of mouse brain peptides using mass spectrometry-based peptidomics: implications for novel functions ranging from non-classical neuropeptides to microproteins. Molecular BioSystems. 6 (8), 1355-1365 (2010).
  13. Gelman, J. S., Sironi, J., Castro, L. M., Ferro, E. S., Fricker, L. D. Peptidomic analysis of human cell lines. Journal of Proteome Research. 10 (4), 1583-1592 (2011).
  14. De Araujo, C. B., et al. Intracellular peptides in cell biology and pharmacology. Biomolecules. 9, 150(2019).
  15. Gewehr, M. C. F., Silverio, R., Rosa-Neto, J. C., Lira, F. S., Reckziegel, P., Ferro, E. S. Peptides from natural or rationally designed sources can be used in overweight, obesity, and type 2 diabetes therapies. Molecules. 25 (5), 1093(2020).
  16. Sakaya, G. R., et al. Peptidomic profiling of cerebrospinal fluid from patients with intracranial saccular aneurysms. Journal of Proteomics. 240 (3), 104188(2021).
  17. Fricker, L. Quantitative peptidomics: General considerations. Methods in Molecular Biology. 1719, 121-140 (2018).
  18. Southey, B. R., et al. Comparing label-free quantitative peptidomics approaches to characterize diurnal variation of peptides in the rat suprachiasmatic nucleus. Analytical Chemistry. 86 (1), 443-452 (2014).
  19. Chen, X., Wei, S., Ji, Y., Guo, X., Yang, F. Quantitative proteomics using SILAC: Principles, applications, and developments. Proteomics. 15 (18), 3175-3192 (2015).
  20. Boonen, K., et al. Quantitative peptidomics with isotopic and isobaric tags. Methods in Molecular Biology. 1719, 141-159 (2018).
  21. Gewehr, M. C. F., et al. The relevance of thimet oligopeptidase in the regulation of energy metabolism and diet-induced obesity. Biomolecules. 10 (2), 321(2020).
  22. Fiametti, L. O., Correa, C. N., Castro, L. M. Peptide profile of zebrafish brain in a 6-OHDA-induced Parkinson model. Zebrafish. 18 (1), 55-65 (2021).
  23. Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).
  24. Dasgupta, S., Castro, L. M., Tashima, A. K., Fricker, L. Quantitative peptidomics using reductive methylation of amines. Methods in Molecular Biology. 1719, 161-174 (2018).
  25. Tashima, A. K., Fricker, L. D. Quantitative peptidomics with five-plex reductive methylation labels. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (5), 866-878 (2018).
  26. Che, F. Y., et al. Optimization of neuropeptide extraction from the mouse hypothalamus. Journal of Proteome Research. 6 (12), 4667-4676 (2007).
  27. Lyons, P. J., Fricker, L. D. Peptidomic approaches to study proteolytic activity. Current Protocols in Protein Science. , Chapter 18 13(2011).
  28. Udenfriend, S., et al. Fluorescamine: a reagent for assay of amino acids, peptides, proteins, and primary amines in the picomole range. Science. 178 (4063), 871-872 (1972).
  29. Ma, B., et al. PEAKS: powerful software for peptide de novo sequencing by tandem mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 17 (20), 2337-2342 (2003).
  30. Zhang, J., et al. PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (4), 1-8 (2012).
  31. Sturm, R. M., Dowell, J. A., Li, L. Rat brain neuropeptidomics: tissue collection, protease inhibition, neuropeptide extraction, and mass spectrometric analysis. Methods in Molecular Biology. 615, 217-226 (2010).
  32. Fricker, L. D. Limitations of mass spectrometry-based peptidomic approaches. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (12), 1981-1991 (2015).
  33. Ross,, et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Molecular & Cellular Proteomics. 3, 1154-1169 (2004).
  34. Thompson, A., et al. Tandem mass tags: a novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75, 1895-1904 (2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Znakowanie izotopoweoznaczanie ilości peptydówspektrometria masekstrakcja peptydówinaktywacja termicznakomórki neuroblastomabiomarkery peptydowe
Przygotowanie próbki i względna ocena ilościowa przy użyciu redukcyjnej metylacji amin do badań peptydomicznych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.