Method Article

Przygotowanie próbki i względna ocena ilościowa przy użyciu redukcyjnej metylacji amin do badań peptydomicznych

DOI:

10.3791/62971

⸱

November 4th, 2021

 ,  ,  , 
1Department of Biological and Environmental Sciences, Bioscience Institute, Sao Paulo State University (UNESP), 2Biodiversity of Coastal Environments Postgraduate Program, Bioscience Institute, Sao Paulo State University (UNESP)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł opisuje metodę przygotowania próbki opartą na inaktywacji termicznej w celu zachowania endogennych peptydów unikających degradacji po śmierci, a następnie względnej kwantyfikacji za pomocą znakowania izotopowego plus LC-MS.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Peptydomika może być zdefiniowana jako jakościowa i ilościowa analiza peptydów w próbce biologicznej. Jego główne zastosowania obejmują identyfikację biomarkerów peptydowych chorób lub stresu środowiskowego, identyfikację neuropeptydów, hormonów i bioaktywnych peptydów wewnątrzkomórkowych, odkrywanie peptydów przeciwdrobnoustrojowych i nutraceutycznych z hydrolizatów białkowych i może być stosowany w badaniach w celu zrozumienia procesów proteolitycznych. Niedawny postęp w przygotowywaniu próbek, metodach separacji, technikach spektrometrii mas i narzędziach obliczeniowych związanych z sekwencjonowaniem białek przyczynił się do wzrostu liczby zidentyfikowanych peptydów i scharakteryzowanych peptydomów. Badania peptydomiczne często analizują peptydy, które są naturalnie wytwarzane w komórkach. W tym miejscu opisano protokół przygotowania próbki oparty na inaktywacji termicznej, który eliminuje aktywność proteazy i ekstrakcję w łagodnych warunkach, dzięki czemu nie dochodzi do rozszczepienia wiązań peptydowych. Ponadto pokazano również względną ilościowość peptydów przy użyciu znakowania stabilnymi izotopami przez redukcyjną metylację amin. Ta metoda etykietowania ma pewne zalety, ponieważ odczynniki są dostępne na rynku, niedrogie w porównaniu z innymi, stabilne chemicznie i umożliwiają analizę do pięciu próbek w jednym cyklu LC-MS.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

"Omika" charakteryzuje się głęboką analizą zestawu molekuł, takich jak DNA, RNA, białka, peptydy, metabolity itp. Wygenerowane w ten sposób zestawy danych na dużą skalę (genomika, transkryptomika, proteomika, peptydomika, metabolomika itp.) zrewolucjonizowały biologię i doprowadziły do zaawansowanego zrozumienia procesów biologicznych1. Termin peptydomika zaczął być wprowadzany na początku XX wieku, a niektórzy autorzy odnosili się do niego jako do gałęzi proteomiki2. Peptydomika ma jednak wyraźne cechy szczególne, gdzie głównym zainteresowaniem jest badanie zawartości naturalnie generowanych peptydów podczas ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poniższa procedura ekstrakcji peptydów i redukcyjnej metylacji została zaadaptowana z wcześniej opublikowanych procedur24,25,26,27. Protokół ten był zgodny z wytycznymi Krajowej Rady Kontroli Doświadczeń na Zwierzętach (CONCEA) i został zatwierdzony przez Komisję Etyki ds. Wykorzystywania Zwierząt (CEUA) w Instytucie Nauk Biologicznych Uniwersytetu Stanowego w Sao Paulo. Kroki protokołu są pokazane w Rysunek 1.

UWAGA: Przygotuj wszystkie roztwory wodne w ultraczystej wodzie.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wyniki uzyskane z testów przeprowadzonych na spektrometrze masowym są przechowywane w plikach z surowymi danymi, które można otworzyć w oprogramowaniu spektrometru masowego. W widmach MS można zaobserwować grupy pików reprezentujące znakowane peptydy zgodnie z zastosowanym schematem znakowania, w zakresie od 2 do 5 znaczników. Na przykład w Rysunek 2, pary pików wykrytych w czasie chromatograficznym są reprezentowane w eksperymencie, w którym użyto tylko dwóch znaczników izotopowych w dwóch .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W większości badań peptydomicznych jednym z krytycznych etapów jest bez wątpienia przygotowanie próbki, które powinno być starannie wykonane, aby uniknąć obecności fragmentów peptydów generowanych przez proteazy po kilku minutach pośmiertnych. Wstępne badania na ekstraktach mózgowych przygotowanych z próbek niepoddanych kuchence mikrofalowej wykazały obecność dużej liczby fragmentów białek w mikrofiltratach o masie 10 kDa. Opisano różne podejścia mające na celu uniknięcie degradacji widm peptydów w wyniku degradacji biał.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie istnieją konkurencyjne interesy finansowe.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozwój i wykorzystanie opisanych tutaj technik było wspierane przez grant Brazylijskiej Narodowej Rady ds. Badań Naukowych 420811/2018-4 (LMC); Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (www.fapesp.br) przyznaje dotacje 2019/16023-6 (LMC), 2019/17433-3 (LOF) i 21/01286-1 (MEME). Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu artykułu.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Filtry odcinające 10 kDaMerck MilliporeUFC801024Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membrana, 10 kDa
AcetonSigma-Aldrich179124
AcetonitrylSigma-Aldrich1000291000
Wodorowęglan amonuSigma-Aldrich11213
kolumna analityczna (EASY-Column)Kolumna EASY(SC200)  10 cm, ID75 i mikro; m, 3 i mikro; m, C18-A2
3-aminobenzoesan etylu metanosulfonianSigma-AldrichE10521MS-222
FluorescamineSigma-AldrichF9015
Roztwór formaldehyduSigma-Aldrich252549
Formaldehyd-13C, d2, roztwórSigma-Aldrich596388
Formaldehyde-d2 roztwórSigma-Aldrich492620
Kwas mrówkowySigma-Aldrich33015
WyciągQuimisQ216
Kwas solny - HClSigma-Aldrich258148
Rurki retencyjne LoBindEppendorfEP0030108116-100EA
LTQ-Orbitrap VelosThermo Fisher ScientificLTQ Velos
Kuchenka mikrofalowaPanasonicNN-ST67HSRU
n Easy-nLC II nanoHPLCThermo Fisher ScientificLC140
PEAKS StudioBioinformatics Solutions Inc.WERSJA 8.5
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiInvitrogen3002tabletki
prekolumna (EASY-Column)Thermo Fisher Scientific(SC001)2 cm, ID100 µ m, 5 i mikro; m, C18-A1
Wirówka z chłodzeniemHermleZ326Kdo rur stożkowych
Wirówka z chłodzeniemVisionVS15000CFNIIdo mikroprobówek
Kolumny czyszczące z odwróconymi fazami    (Kartridż Oasis HLB 1 cc)Waters186000383 Oasis HLB 1 cc Wkład
Cyjanoborodeuterek sodu - NaBD3CNSigma-Aldrich190020
Sicyjanoborowodorek sodu - NaBH3CNSigma-Aldrich156159
Fosforan sodu dwuzasadowySigma-AldrichS9763UWAGA: 0,2 M PB= 0,1 M bufor fosforanowy pH 6,8 (26,85 ml Na2HPO3 1M) plus 0,1 M bufor fosforanowy pH 6,8 (23,15 ml NaH2PO3 1M) do 250 ml wody
Fosforan sodu jednozasadowySigma-AldrichS3139
SonicatorQsonicaQ55-110
Standardowy peptydSekwencja aminokwasowa Proteimax: LTLRTKL
Bufor trietyloamoniowy - TEAB 1 MSigma-AldrichT7408
Kwas trifluorooctowy - TFASigma-AldrichT6508
Ultra oczyszczona wodaMilli-QDirect-Q 3UV
Wirówka próżniowaGeneVacMiVac Koncentrator
Łaźnia wodnaCientec266
Xcalibur OprogramowanieThermoFisher ScientificOPTON-30965
Kolumna analityczna DNA

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kandpal, R., Saviola, B., Felton, J. The era of 'omics unlimited. Biotechniques. 46 (5), 354-355 (2009).
  2. Farrokhi, N., Whitelegge, J. P., Brusslan, J. A. Plant peptides and peptidomics. Plant Biotechnology Journal. 6 (2), 105-134 (2008).
  3. Schulz-Knappe, P., Schrader, M., Zucht, H. D.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Peptidomics StudiesReductive MethylationIsotopic LabelingPeptide QuantitationSample PreparationMass SpectrometryPeptide ExtractionHeat InactivationNeuroblastoma CellsPeptide Biomarkers

Related Articles