Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Obrazowanie pojedynczych cząsteczek kondensatów EWS-FLI1 składających się na DNA

2.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62974

⸱

8 września 2021

 ,  , 
1Center for Quantitative Biology, Peking-Tsinghua Center for Life Sciences, Academy for Advanced Interdisciplinary Studies, Peking University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy użycie metody obrazowania pojedynczych cząsteczek, Zasłon DNA, do badania biofizycznego mechanizmu gromadzenia się kondensatów EWS-FLI1 na DNA.

Streszczenie

Geny fuzyjne wynikające z translokacji chromosomów zostały znalezione w wielu guzach litych lub białaczce. EWS-FLI1, który należy do rodziny onkoprotein fuzyjnych FUS/EWS/TAF15 (FET), jest jednym z najczęściej zaangażowanych genów fuzyjnych w mięsaku Ewinga. Te białka fuzyjne z rodziny FET zazwyczaj zawierają domenę o niskiej złożoności (LCD) białka FET na swoim N-końcu i domenę wiążącą DNA (DBD) na C-końcu. Potwierdzono, że EWS-FLI1 tworzy kondensaty biomolekularne w docelowych loci wiązania w wyniku interakcji LCD-LCD i LCD-DBD, a kondensaty te mogą rekrutować polimerazę RNA II w celu zwiększenia transkrypcji genów. Jednak sposób, w jaki te kondensaty są gromadzone w miejscach wiązania, pozostaje niejasny. Niedawno zastosowano metodę biofizyki pojedynczej cząsteczki - DNA Curtains - do wizualizacji tych procesów składania kondensatów EWS-FLI1. W tym miejscu omówiono szczegółowy protokół eksperymentalny i podejścia do analizy danych w celu zastosowania kurtyn DNA w badaniu kondensatów biomolekularnych gromadzących się na docelowym DNA.

Wprowadzenie

Regulacja transkrypcji jest kluczowym krokiem dla precyzyjnej ekspresji genów w żywych komórkach. W tym skomplikowanym procesie uczestniczy wiele czynników, takich jak modyfikacja chromosomów, czynniki transkrypcyjne (TF) i niekodujące RNA1,2,3. Wśród tych czynników, TF przyczyniają się do specyficzności regulacji transkrypcji poprzez rozpoznawanie i wiązanie się z określonymi sekwencjami DNA znanymi jako promotory lub wzmacniacze, a następnie rekrutację innych funkcjonalnych białek do aktywacji lub tłumienia transkrypcji4,5,6,7. Sposób, w jaki te TF udaje się szukać swoich docelowych miejsc w ludzkim genomie i wchodzić w interakcje z DNA pokrytym histonami i białkami niewiążącymi histonów DNA, od dziesięcioleci wprawia naukowców w zakłopotanie. W ciągu ostatnich kilku lat zbudowano kilka klasycznych modeli docelowego mechanizmu wyszukiwania TF, aby opisać, w jaki sposób "ślizgają się", "przeskakują", "skaczą" lub "przeskakują między segmentami" wzdłuż łańcucha DNA8,9,10,11. Modele te koncentrują się na zachowaniach poszukiwawczych w DNA pojedynczej cząsteczki TF. Jednak ostatnie badania pokazują, że niektóre TF przechodzą separację faz ciecz-ciecz (LLPS) samodzielnie w jądrze lub z kompleksem Mediator12. Obserwowane kropelki TF są związane z regionami promotora lub wzmacniacza, co podkreśla rolę tworzenia kondensatu biomolekularnego w transkrypcji i trójwymiarowym genomie13,14,15. Te biomolekularne kondensaty są połączone z przedziałami pozbawionymi błony in vivo i in vitro. Są one tworzone przez LLPS, w których modułowe biomakrocząsteczki i wewnętrznie nieuporządkowane regiony (IDR) białek są dwiema głównymi siłami napędowymi oddziaływań wielowartościowych16. W ten sposób TF nie tylko przeszukują DNA, ale także działają synergistycznie w tych kondensatach4,17,18. Do tej pory biofizyczna właściwość tych kondensatów transkrypcyjnych na DNA pozostaje niejasna.

Dlatego to badanie miało na celu zastosowanie metody jednocząsteczkowej - Zasłony DNA - do bezpośredniego zobrazowania powstawania i dynamiki kondensatów transkrypcyjnych tworzonych przez TF na DNA in vitro. DNA Curtains, wysokoprzepustowa platforma obrazowania in vitro do badania interakcji między białkami a DNA, została zastosowana w naprawie DNA19,20,21, target search22, and LLPS17,23,24. Komórka przepływowa kurtyn DNA jest pokryta biotynylowanymi dwuwarstwami lipidowymi, które pasywują powierzchnię i umożliwiają dyfuzję biomolekuł na powierzchni. Nanowytworzone zygzakowate wzory ograniczają ruch DNA. Biotynylowane substraty DNA Lambda mogą ułożyć się wzdłuż krawędzi bariery i zostać rozciągnięte przez zorientowany przepływ buforowy. Te same sekwencje początkowe i końcowe wszystkich cząsteczek umożliwiają śledzenie białka na DNA i opisują rozkład pozycji zdarzeń wiązania25,26. Co więcej, połączenie kurtyn DNA z mikroskopią fluorescencyjną z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM) pomaga zminimalizować szum tła i wykrywać sygnały na poziomie pojedynczej cząsteczki. W związku z tym DNA Curtains może być obiecującą metodą badania dynamiki tworzenia się kondensatu transkrypcyjnego na motywach DNA. W artykule opisano przykład onkoproteiny fuzyjnej z rodziny FUS/EWS/TAF15 (FET), EWS-FLI1, generowanej przez translokację chromosomową. DNA Lambda zawierające 25× GGAA - sekwencję wiążącą EWS-FLI127- zostało użyte jako substrat DNA w eksperymentach DNA Curtains w celu obserwacji, jak cząsteczki EWS-FLI1 przechodzą LLPS na DNA. W niniejszym manuskrypcie szczegółowo omówiono protokół eksperymentalny i metody analizy danych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie dwuwarstwowej mieszanki głównej lipidów

  1. Przepłukać szklane fiolki wodą podwójnie destylowaną (ddH2O) i 99% etanolem i wysuszyć je w suszarce o temperaturze 60 °C.
  2. Główną mieszaninę lipidów należy sporządzić, rozpuszczając 1 g 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny (DOPC), 100 mg lipidów (PEGylowanych) reagujących z glikolem polietylenowym (18:1 z 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloaminy-N-[metoksy(glikolu polietylenowego)-2000] (soli amonowej) (PEG2000 DOPE) i 25 mg biotynylowanych lipidów (18:1 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloaminy-N-(kap biotynyl) (sól sodowa) (Biotinyl Cap DOPE)) w 10 ml chloroformu.
  3. Przygotować 1 ml porcji głównej mieszanki lipidów na fiolkę i przechowywać je w temperaturze -20 °C w fiolkach z czystego szkła.
    UWAGA: Rozpuszczony lipid należy przechowywać w szklanych fiolkach i przykrywać wieczko fiolki parafilmem podczas przechowywania.

2. Przygotowanie roztworu liposomowego

  1. Wypłukać szklaną fiolkę o pojemności 2 ml zddH2O i 99% etanolem i dokładnie wysuszyć w suszarce o temperaturze 60 °C.
  2. Przepłukać szklaną strzykawkę o pojemności 250 μl chloroformem, a następnie przenieść 200 μl głównej mieszanki lipidów do fiolki z suchego szkła.
  3. Użyj pistoletu do natryskiwania azotu, aby delikatnie przepuścić N2, jednocześnie ciągle obracając fiolkę w jednym kierunku.
    UWAGA: N2 pomoże odparować chloroform, a resztkowe lipidy utworzą cienką warstwę na ściance szklanej fiolki. Na początku należy dostosować strumień azotu tak, aby był bardzo delikatny i zwiększyć przepływ, gdy w fiolce pojawi się biały film; Zakończ ten proces parowania w ciągu 5 minut.
  4. Przenieść szklaną fiolkę do pieca do suszenia próżniowego w temperaturze pokojowej (RT) na 16-24 godziny w celu całkowitego usunięcia chloroformu z lipidów.
  5. Dodać 2 ml świeżego buforu lipidowego (10 mM Tris-HCl (pH 7,5) i 100 mM NaCl) do szklanej fiolki i rozpuścić lipidy w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Kilkakrotnie przemieszać roztwór i przenieść go do probówki z polipropylenu o pojemności 5 ml.
  6. Sonikuj roztwór lipidowy na lodzie za pomocą sonikatora z mikrokońcówką, aby utworzyć małe pęcherzyki jednopłytkowe, używając następujących ustawień: 6 s włączenia-12 s wyłączenia (20% amplitudy) przez 6 cykli, następnie 6 s włączenia-6 s wyłączenia (30% amplitudy) przez 3 cykle, wreszcie 10 s włączone (40% amplitudy).
    UWAGA: Wzrost temperatury podczas sonikacji może spowodować pęknięcie piany i zniszczenie liposomów. Dlatego sprawdzaj stan piany i temperaturę oraz często uzupełniaj lód.
  7. Przefiltruj liposomy przez nylonowy filtr strzykawkowy 0,22 μm, podwielokrotność, i przechowuj go w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Ponieważ ich ruchliwość zmniejsza się wraz z długotrwałym przechowywaniem, liposomy należy zużyć w ciągu 2-3 miesięcy lub przygotować świeżo przed użyciem.

3. Klonowanie sekwencji i biotynylacja DNA Lambda

  1. Wprowadzenie motywów wiążących do DNA Lambda
    1. Strawić fragment docelowy zawierający motywy wiążące i DNA Lambda za pomocą NheI i XhoI. Liżować docelowy fragment za pomocą DNA Lambda za pomocą ligazy T4 przez noc w RT.
    2. Hoduj komórki E.coli VCS257 w pożywce LB wolnej od antybiotyków, aż OD600 osiągnie 0,6. Przechowywać bakterie w temperaturze 4 °C do późniejszego wykorzystania.
    3. Podgrzewać roztwór do ligacji w temperaturze 65 °C przez 20 minut w celu denaturacji ligazy T4.
    4. Rozmrozić ekstrakt z faga Lambda, delikatnie wymieszać go z ligowanym produktem, pipetując końcówkami, a następnie inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
    5. Dodać 500 μl buforu SM (50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM NaCl i 8 mM MgCl2, przefiltrowane przez filtr 0,22 μm) i 20 μl chloroformu do mieszaniny opakowaniowej z kroku 3.1.4, dobrze wymieszać i odwirować roztwór.
      UWAGA: Aktywność ekstraktu z opakowania może być utrzymywana w temperaturze 4 °C przez dłuższy czas.
    6. Przygotować mieszaninę reakcyjną, mieszając razem 10 μl ekstraktu opakowaniowego z 90 μl buforu SM i 100 μl komórek VCS257 (z kroku 3.1.2) i inkubować mieszaninę w temperaturze 37 °C przez 15 min.
      UWAGA: Stężenie roztworu opakowaniowego zależy od gęstości blaszek fagowych następnego dnia; Można go rozcieńczyć lub dodać w zależności od potrzeb.
    7. Weź ~ 5 ml stopionego górnego agaru (22 g / L bulionu NZCYM z 15 g / L agaru) w probówce o pojemności 15 ml. Gdy tylko górny agar ostygnie do ~42 °C, powoli dodać mieszaninę reakcyjną (z kroku 3.1.6) za pomocą pipety końcowej i wylać płyn na wolną od antybiotyków płytkę agarową LB. Płytkę należy przechowywać przez noc w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
    8. Potwierdzić dodatnie blaszki wśród przezroczystych blaszek fagowych na górnej płytce agarowej za pomocą PCR. Przenieść dodatnie blaszki na nową górną płytkę agarową za pomocą pipety i przechowywać płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez noc.
    9. Dodać 400 μl komórek VCS257 do 400 μl buforu zawierającego 10 mM MgCl2 i 10 mM CaCl2, zaszczepić jedną płytkę miażdżycową do tej mieszaniny komórek i inkubować ją w wytrząsarce o temperaturze 37 °C przy 250 obr./min przez 15 min.
    10. Dodać 800 μl tej zawiesiny zawierającej blaszkę fagową do 200 ml bulionu NZCYM w kolbie o pojemności 2 l i inkubować w wytrząsarce o temperaturze 37 °C przy 125 obr./min.
    11. Zmierzyć OD600 zawiesiny bakteryjnej po ~4 godzinach uprawy. Należy pamiętać, że wartość OD600 najpierw wzrośnie, a następnie spadnie do dołka na poziomie ~0,2. Przerwij inkubację, gdy wartość OD600 ma ponownie wzrosnąć, dodaj 500 μl chloroformu i wstrząsaj z prędkością 80 obr./min przez kolejne 5 minut.
      UWAGA: Wzrost OD600 po dołku nastąpi szybko; w związku z tym wartość OD600 musi być mierzona częściej, gdy spada do 0,3, aby uniknąć nadmiernego wzrostu komórek VCS257 w hodowli.
    12. Przenieś kulturę fagową do butelki o pojemności 500 ml, dodaj 11,7 g NaCl i wstrząśnij butelką. Inkubować butelkę na lodzie przez 10 minut.
    13. Przenieść zawiesinę równomiernie do czterech probówek o pojemności 50 ml. Odwirować probówki o stężeniu 12 000 x g przez 10 min.
      UWAGA: Wszystkie etapy wirowania opisane w sekcji 3.1 muszą być wykonane w temperaturze 4 °C.
    14. Przenieść supernatanty do czterech nowych probówek o pojemności 50 ml i ponownie odwirować z tą samą prędkością przez 5 minut.
    15. Zebrać supernatanty, dodać 10% (w/v) PEG8000 proszku i obracać w temperaturze 4 °C do inkubacji przez 30 minut.
    16. Odwirować zawiesiny z kroku 3.1.15 przy 12 000 x g przez 15 minut w celu uzyskania granulek fagowych.
    17. Zawiesić osady w 1 ml buforu rozcieńczającego fagi (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM NaCl i 10 mM MgCl2) w czterech probówkach i wlać wszystkie 4 ml tych mieszanin do probówki o pojemności 50 ml.
    18. Dodać RNazę A (10 mg/ml) i DNazę I (4 mg/ml) do końcowych stężeń 20 μg/ml i 5 μg/ml i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut w celu rozkładu nadmiaru kwasów nukleinowych.
    19. Dodać 4,5 ml 300 ml 300 mM Tris-HCl (pH 7,5), 2,76 ml 0,5 M kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), 1,67 ml 10% dodecylosiarczanu sodu (SDS) i 75 μl proteinazy K (10 mg/ml) do probówki i inkubować w temperaturze 65 °C przez 10 minut.
    20. Dodać 4,5 ml wstępnie schłodzonego 3 M octanu potasu i inkubować na lodzie przez 10 minut.
    21. Wirować przy 8 000 x g przez 10 minut i wirować supernatant przez dodatkowe 5 minut przy 10 000 x g.
    22. Dodać 70% objętości izopropanolu do zebranego supernatantu (z kroku 3.1.21) po odpowiednim wymieszaniu, inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty, a następnie odwirować przy 8 000 x g przez 10 minut. Odrzucić izopropanol i ponownie wirować przez 5 min.
      UWAGA: Osad DNA zostanie rozmazany przed pierwszym 10-minutowym wirowaniem; Osad zostanie skoncentrowany na dnie probówki po drugim 5-minutowym odwirowaniu.
    23. Przepłukać wytrącone DNA 2-3 ml 70% etanolu i ponownie odwirowywać przez 1 minutę. Wysuszyć osad w temperaturze 4 °C przez 2 godziny, a następnie ponownie zawiesić DNA w 500 μl buforu TE (10 mM Tris-HCl (pH 8,0) i 1 mM EDTA) przez noc w temperaturze pokojowej.
    24. Przenieś DNA do probówki o pojemności 1,5 ml i wiruj w temperaturze 18 000 x g przez 3 minuty. Przenieś DNA do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Podwielokrotnić oczyszczone DNA Lambda i przechowywać je w temperaturze -20 °C.
  2. Preparat Biotyna-Lambda DNA
    1. Rozpuść 50 μl oczyszczonego DNA Lambda ze sklonowanymi motywami w temperaturze 65 °C przez 10 min.
      UWAGA: Ponieważ DNA Lambda ma długość ~48 kbp, należy je podgrzać przed pipetowaniem, aby uniknąć pęknięć DNA.
    2. Wymieszać ze sobą 50 μL Lambda DNA, 1 μL startera Biotyny (5' - (Phos) - AGG TCG CCG CCC - BIOTEG - 3') (100 μM) i 54 μL ddH2O. Mieszaninę należy współinkubować w temperaturze 65 °C przez 5 minut i pozostawić na stole do ostygnięcia do temperatury ciekłej.
    3. Dodać 12 μl 10x buforu ligazy T4 i 3 μl ligazy T4 i inkubować w temperaturze pokojowej przez kilka godzin lub noc.
    4. Dodać równą objętość mieszaniny fenolu i chloroformu (1:1) do produktu ligacji, natychmiast dobrze wymieszać i odwirować przy 12 000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
    5. Ostrożnie przenieść górną fazę wodną zawierającą DNA do nowej probówki, dodać równą objętość chloroformu, dobrze wymieszać, a następnie odwirować przy 12 000 x g przez 2 minuty.
    6. Przenieść górną fazę wodną do nowej probówki, dodać równą objętość izopropanolu i 10% objętości 3 M octanu sodu i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty. Odwirować mieszaninę przy 12 000 x g przez 5 minut.
    7. Usunąć supernatant, przemyć osad 75% etanolem, a następnie odwirować przy 12 000 x g przez 5 minut.
    8. Usuń 75% etanol, wysusz DNA na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 10 minut i użyj 120 μl buforu TE do rozpuszczenia DNA.
    9. Dodać 60 μl buforu A (30% (w/v) PEG8000 i 30 mM MgCl2) do 120 μl roztworu z kroku 3.2.8 i obracać w temperaturze 4 °C przez 20-24 godziny.
    10. Odwirować mieszaninę o masie 18 000 g przez 5 minut i usunąć supernatant.
    11. Użyj 180 μl wstępnie schłodzonego 75% etanolu do umycia granulatu i powtórz krok 3.2.10.
    12. Wysuszyć osad w temperaturze pokojowej i użyć 100 μl buforu TE150 do rozpuszczenia DNA.

4. Nanofabrykowane bariery zygzakowate

  1. Czyścić szkiełka w acetonie przez 20 minut za pomocą sonikacji i przenieść je do nowego szklanego pojemnika z 1 M NaOH w celu sonikacji przez kolejne 20 minut. Zmieszać 90 mlH2SO4z 30 ml H2O2i zanurzyć szkiełka w tej mieszaninie na 30 minut. Przepłukać szkiełka acetonem i izopropanolem i osuszyć szkiełka N2,
    UWAGA: MieszanieH2SO4 iH2O2jest procesem egzotermicznym; Podejmij odpowiednie środki ostrożności podczas operacji.
  2. Oczyszczony szkiełko pokryć kolejno polimetakrylanem metylu (PMMA) 25 kDa, PMMA 49,5 kDa i kolejno wierzchnią warstwą przewodzącej powłoki ochronnej. Użyj litografii wiązką elektronów, aby zapisać bariery zygzakowate (Rysunek 1A).
  3. Umyć szkiełka za pomocą ddH2O, aby usunąć przewodzącą powłokę ochronną i osuszyć szkiełka za pomocą N2.
  4. Osadzać warstwę chromu (Cr) o długości fali 30 nm za pomocą rozpylarki magnetronowej i usuwać pozostałe warstwy PMMA za pomocą acetonu.
    UWAGA: Jedna komórka przepływowa może być ponownie wykorzystana do ponad 20 eksperymentów z zasłonami DNA. Aby ponownie użyć komory przepływowej, umyj ją etanolem, detergentem i NaOH.

5. Oczyszczanie białka EWS-FLI1

UWAGA: Obserwacja 500 nM EWS-FLI1 na DNA Lambda z 25× motywami GGAA służy jako dobry przykład zastosowania kurtyn DNA do tworzenia kondensatu. EWS-FLI1 jest białkiem fuzyjnym łączącym N-koniec EWSR1 (1-265) i C-koniec FLI1 (220-453). Znacznik mCherry został połączony z N-końcem białka fuzyjnego EWS-FLI1 w celu wizualizacji.

  1. Sklonuj gen EWS-FLI1 do odtworzonego wektora pRSF lub innego odpowiedniego wektora ekspresji prokariotów.
  2. Przekształć plazmid kodujący 7x His-mCherry-EWSFLI1 w szczep E.coli BL21(DE3); hoduj pojedynczą kolonię w 5 ml pożywki LB w temperaturze 37 °C przez noc. Gdy wartość OD600 osiągnie 0,6-0,8 po przeniesieniu do 2 l pożywki LB, dodaj 0,5 mM IPTG i wstrząsaj kulturą komórkową w temperaturze 18 °C przez 16-18 godzin.
  3. Odwirować kulturę w celu usunięcia supernatantu i ponownie zawiesić komórki za pomocą buforu do lizy (50 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 M KCl; 1 M mocznik; 10 mM imidazolu; 1,5 mM beta-merkaptoetanol (β-ME); i 5% glicerolu).
  4. Po sonikacji i odwirowaniu w temperaturze 18000 × g przez ~30 min, załadować supernatant na żywicę Ni-NTA zrównoważoną w 5-krotnej objętości buforu do lizy, a następnie przepłukać żywicę 10-krotną objętością buforu płuczącego (50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 M KCl, 1 M mocznik, 40 mM imidazol, 1,5 mM β-ME, i 5% glicerolu).
  5. Eluować związane białko za pomocą 15 ml buforu elucyjnego (50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 M KCl, 1 M mocznik, 500 mM imidazolu, 1,5 mM β-ME i 5% glicerolu) i zagęścić elucję do ~500 μL.
  6. Załadować stężony roztwór białka do żelowej kolumny filtracyjnej i przeanalizować produkty za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym SDS. Oczyszczone białko należy szybko zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.

6. Przygotowanie komory przepływowej DNA Curtains

  1. Przygotuj komórkę przepływową z zygzakowatymi nanofabrykowanymi barierami do eksperymentu z kurtynami DNA i określ kierunek przepływu. Aby to zrobić, podłącz rurki wejściowe i wyjściowe we właściwym kierunku.
  2. Przemyć komorę flowką 2,5 ml buforu lipidowego za pomocą dwóch strzykawek o pojemności 3 ml. Upewnij się, że w komorze przepływowej nie ma pęcherzyków.
  3. Wyjąć strzykawkę z wyjścia i wstrzyknąć 1 ml roztworu liposomu (40 μl wywaru liposomowego z sekcji 2 i 960 μl buforu lipidowego) trzy razy w 5-minutowej inkubacji po każdym wstrzyknięciu.
  4. Na etapie gojenia należy powoli przemyć komorę flowcell 2,5 ml buforu lipidowego i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 min.
    UWAGA: W razie potrzeby czas gojenia może się wydłużyć; Jeśli pojawią się jakiekolwiek bąbelki, wykonaj podwójne leczenie, powtarzając kroki 5.3 i 5.4, aby usunąć bąbelki.
  5. Przygotować 30 ml buforu albuminy surowicy bydlęcej (BSA) (40 mM Tris-HCl (pH 7,5), 2 mM MgCl2, 1 mM ditiotreitol i 0,5 mg/ml BSA do pasywacji powierzchniowej). Po 30 minutach gojenia przemyć komorę przepływową 2,5 ml buforu BSA od strony wyjściowej.
    UWAGA: Bulion BSA jest roztworem o stężeniu 20 mg/ml przechowywanym w temperaturze 4 °C i należy go zużyć w ciągu 1-2 tygodni. Stężenie BSA w buforze można regulować w zależności od stanu powierzchni.
  6. Wstrzyknąć 800 μl buforu streptawidyny (10 μl 1 mg/ml bulionu streptawidyny, 790 μl buforu BSA) do komory przepływowej od strony wejściowej w dwóch etapach z 10 minutami inkubacji po każdym etapie.
    UWAGA: Streptawidyna zakotwicza DNA w lipidach ze względu na swoją wielowartościowość poprzez mostek między biotynylowanymi lipidami a biotynylowanym DNA.
  7. Przemyć komorę przepływową 2,5 ml buforu BSA, aby usunąć wszystkie wolne cząsteczki streptawidyny.
  8. Rozcieńczyć DNA biotyny-lambdy sklonowanymi motywami z sekcji 3 za pomocą buforu BSA (2,5 μl DNA i 998 μl buforu BSA). Wstrzyknij DNA Lambda 4 razy powoli w odstępach 5-minutowych.
  9. Podczas wstrzykiwania należy włączyć mikroskop i naukowy system komplementarnego półprzewodnika z tlenkiem metalu (sCMOS). Umyj rurkę 10 ml ddH2O. Wypłucz pryzmat i złącze rurki wodą, 2% płynnym środkiem do czyszczenia kuwet i 99% etanolem. Przygotować bufor do obrazowania, dodając KCl i dwuniciowy barwnik DNA do buforu BSA w celu uzyskania końcowych stężeń odpowiednio 150 mM i 0,5 nM, a następnie pobrać co najmniej 20 ml buforu do obrazowania do strzykawki o pojemności 30 ml.
  10. Ustaw komorę przepływową na stoliku mikroskopu i podłącz ją do systemu mikroprzepływowego.
  11. Użyj natężenia przepływu 0,03 ml/min, aby przepłukać cząsteczki DNA do bariery przez 10 minut, inkubować przez 30 minut z zatrzymanym przepływem, a następnie wyłącz go, aby DNA mogło dyfundować na boki.
    UWAGA: Celem tej 30-minutowej inkubacji jest umożliwienie cząsteczki DNA bardziej równomiernego rozprowadzenia przed barierą poprzez prostą dyfuzję, ponieważ cząsteczki DNA mają tendencję do gromadzenia się po stronie bariery, która jest zamknięta do wejścia, gdzie są spłukiwane. Czas inkubacji można dostosować w razie potrzeby.

7. Obrazowanie powstawania kondensacji EWS-FLI1 na zasłonach DNA

  1. Otwórz oprogramowanie do obrazowania, znajdź i zaznacz pozycje 3 × 3 zygzakowatych wzorów w jasnym polu.
  2. Włącz przepływ przy 0,2 ml/min, aby wybarwić DNA dwuniciowym barwnikiem DNA przez 10 minut.
  3. Rozcieńczyć mCherry-EWS-FLI1 buforem obrazującym do stężenia 100 nM w 100 μl w probówce.
  4. Załadować próbkę białka przez zawór za pomocą szklanej strzykawki o pojemności 100 μl i zmienić natężenie przepływu na 0,4 ml/min.
  5. Włącz laser o długości fali 488 nm i wstępnie zeskanuj każdy region, aby sprawdzić stan dystrybucji DNA; wybierz region, w którym cząsteczki DNA rozmieszczają się równomiernie. Ustaw moc lasera na 10% dla lasera 488 nm i 20% dla lasera 561 nm. Użyj miernika mocy, aby zmierzyć rzeczywistą moc lasera w pobliżu pryzmatu: 4.5 mW dla lasera 488 nm i 16.0 mW dla lasera 561 nm.
  6. Akwizycja obrazu
    1. Rozpocznij rejestrowanie obrazów w odstępach 2 s za pomocą jednocześnie laserów 488 nm i 561 nm.
    2. Zmień zawór z trybu ręcznego na tryb wtrysku, aby bufor obrazowania przepłukał próbkę białka do komory przepływowej po 60 s.
      UWAGA: Proces ten potrwa ~30 s, a pole widzenia zostanie pokryte sygnałami mCherry, gdy tylko białka EWS-FLI1 dotrą do komory przepływowej.
    3. Aby usunąć wolny EWS-FLI1, należy myć komorę przepływową buforem obrazowania przez 5 minut, gdy włączony jest tylko laser 561 nm. Zatrzymać przepływ i inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
    4. Włącz przepływ z prędkością 0,4 ml/min, aby DNA się rozszerzyło, i uzyskuj obrazy w odstępach 2 s między różnymi ramkami, aby uzyskać wysokoprzepustowe dane dotyczące tworzenia kondensatu EWS-FLI1.

8. Analiza intensywności dla mCherry-EWS-FLI1

  1. Zaimportuj dane jako sekwencje obrazów do oprogramowania ImageJ, wybierz puncta w 25× witrynach GGAA w kwadracie o wymiarach 8× 8 pikseli i zapisz obraz w .tif formacie.
  2. Oblicz intensywność jako sumę intensywności w kwadracie 8×8 pikseli, w tym całego punktu, i usuń tło, odejmując intensywność tła w obszarze o tym samym rozmiarze w pobliżu kwadratu 8 x 8 pikseli.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Schemat DNA Curtains przedstawiono na Rysunku 1A, Rysunku 1B oraz Rysunku 1D. Sklonowana sekwencja docelowa zawierająca 25 nieprzerwanych powtórzeń GGAA znajduje się w promotorze NORB1 w mięsakowi Ewinga. Ta sekwencja docelowa jest kluczowa dla rekrutacji EWS-FLI128. Cząsteczki EWS-FLI1 wizualizowano poprzez wykrywanie sygnałów mCherry-EWS-FLI1 uzyskanych za pomocą lasera 561 nm (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ponieważ podejścia jednocząsteczkowe są niezwykle wrażliwe na zawartość układu reakcyjnego, należy dołożyć dodatkowych starań, aby zapewnić dobrą jakość wszystkich materiałów i roztworów podczas eksperymentów z kurtynami DNA, zwłaszcza lipidów przygotowanych w sekcjach 1 i 2 oraz użytych w sekcji 5. Do przygotowania należy użyć odczynników o wyższej czystości, a muszą być świeżo przygotowane do oznaczania pojedynczych cząsteczek

Kiedy EWS-FLI1 znakowany mCherry o wartości 500 nM został przepłu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez NSFC Grants No. 31670762 (Z.Q.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Laser półprzewodnikowy pompowany diodą 488 nm Laser półprzewodnikowyKoherentnyOBIS488LS
561 nm Laser półprzewodnikowy pompowany diodąKoherentnyOBIS561LS
agarowyRhawnR003215-50g
biotynylowany DOPEAvanti870273P
Albumina surowicy bydlęcejSigmaA7030
ChloroformAmresco1595C027
Powłoka Electra 92Allresist GmbHAR-PC 5090.02Przewodząca powłoka ochronna
Deoksyrybonukleaza I bydlęcaSigmaD5139-2MG
DOPCAvanti850375P
DTTSigmaD9779
Szkiełko nakrywkoweszklane Fisher Scientific12-544-7
Hellmanex IIISigmaZ805939-1EA
KClSigma60130
Lambda DNANEBN3013S Ekstrakty
z upakowania lambdaEpicentrumMP5120
MgCl2SigmaM2670
NaClSigmas3014
NanoportIdexN-333-01
NheI-HFNEBR3131S
Mikroskop odwrócony NikonEclipseTi
NZCYM BulionSigmaN3643-250G
PEG-2000 DOPEAvanti880130P-1G
PEG-8000Amresco25322-68-3
PMMA 200K, MLECZAN ETYLU 4%Allresist GmbHAR-P 649.04
PMMA 950K, ANIZOL 2%Allresist GmbHAR-P 672.02
Prime 95B Naukowa kamera CMOSFOTOMETRIAProteinaza Prime95B
KNEBP8107S
Szkiełko ze szkła krzemionkowegoG.Finkenbeiner
Sześciodrogowy zawór wtryskowyIdexMXP9900-000
StreptawidynaThermoS888Rozcieńczony ddH2O
Pompa strzykawkowaPompa do aparaturyHarvard11 Ligaza DNA Elite
T4NEBM0202S
Baza TrisSigmaT6066
XhoINEBR0146V
Jodek YOYO-1 (491/509)InvitrogenY3601Rozcieńczony DMSO

Bibliografia

  1. Cramer, P. Organization and regulation of gene transcription. Nature. 573 (7772), 45-54 (2019).
  2. Zhang, Y., Reinberg, D. Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails. Genes & Development. 15 (18), 2343-2360 (2001).
  3. Wang, X., et al. Induced ncRNAs allosterically modify RNA-binding proteins in cis to inhibit transcription. Nature. 454 (7200), 126-130 (2008).
  4. Alexander, K. A., et al. p53 mediates target gene association with nuclear speckles for amplified RNA expression. Molecular Cell. 81 (8), 1666-1681 (2021).
  5. Matsui, T., Segall, J., Weil, P. A., Roeder, R. G. Multiple factors required for accurate initiation of transcription by purified RNA polymerase-II. Journal of Biological Chemistry. 255 (24), 1992-1996 (1980).
  6. Stadhouders, R., Filion, G. J., Graf, T. Transcription factors and 3D genome conformation in cell-fate decisions. Nature. 569 (7756), 345-354 (2019).
  7. Peng, Y., Zhang, Y. Enhancer and super-enhancer: Positive regulators in gene transcription. Animal Models and Experimental Medicine. 1 (3), 169-179 (2018).
  8. Lambert, S. A., et al. The human transcription factors. Cell. 172 (4), 650-665 (2018).
  9. Normanno, D., Dahan, M., Darzacq, X. Intra-nuclear mobility and target search mechanisms of transcription factors: a single-molecule perspective on gene expression. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (6), 482-493 (2012).
  10. Berg, O. G., Winter, R. B., von Hippel, P. H. Diffusion-driven mechanisms of protein translocation on nucleic acids. Biochemistry. 20 (24), 6929-6948 (1981).
  11. Loverdo, C., et al. Quantifying hopping and jumping in facilitated diffusion of DNA-binding proteins. Physical Review Letters. 102 (18), 188101(2009).
  12. Boija, A., et al. Transcription factors activate genes through the phase-separation capacity of their activation domains. Cell. 175 (7), 1842-1855 (2018).
  13. Sabari, B. R., et al. Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control. Science. 361 (6400), (2018).
  14. Kim, S., Shendure, J. Mechanisms of interplay between transcription factors and the 3D genome. Molecular Cell. 76 (2), 306-319 (2019).
  15. Shrinivas, K., et al. Enhancer features that drive formation of transcriptional condensates. Molecular Cell. 75 (3), 549-561 (2019).
  16. Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (5), 285-298 (2017).
  17. Zhou, H., et al. Mechanism of DNA-induced phase separation for transcriptional repressor VRN1. Angewandte Chemie International Edition. 58 (15), 4858-4862 (2019).
  18. Rao, S., Ahmad, K., Ramachandran, S. Cooperative binding between distant transcription factors is a hallmark of active enhancers. Molecular Cell. 81 (8), 1651-1665 (2021).
  19. Qi, Z., et al. DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination. Cell. 160 (5), 856-869 (2015).
  20. Qi, Z., Greene, E. C. Visualizing recombination intermediates with single-stranded DNA curtains. Methods. 105, 62-74 (2016).
  21. Ma, C. J., Gibb, B., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. Protein dynamics of human RPA and RAD51 on ssDNA during assembly and disassembly of the RAD51 filament. Nucleic Acids Research. 45 (2), 749-761 (2017).
  22. Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature. 507 (7490), 62-67 (2014).
  23. Larson, A. G., et al. Liquid droplet formation by HP1 alpha suggests a role for phase separation in heterochromatin. Nature. 547, 236-240 (2017).
  24. Zuo, L., et al. Loci-specific phase separation of FET fusion oncoproteins promotes gene transcription. Nature Communications. 12 (1), 1491(2021).
  25. Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. DNA curtains: novel tools for imaging protein-nucleic acid interactions at the single-molecule level. Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).
  26. Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. -L. DNA curtains for high-throughput single-molecule optical imaging. Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).
  27. Gangwal, K., Close, D., Enriquez, C. A., Hill, C. P., Lessnick, S. L. Emergent properties of EWS/FLI regulation via GGAA microsatellites in Ewing's sarcoma. Genes & Cancer. 1 (2), 177-187 (2010).
  28. Sizemore, G. M., Pitarresi, J. R., Balakrishnan, S., Ostrowski, M. C. The ETS family of oncogenic transcription factors in solid tumours. Nature Reviews. Cancer. 17 (6), 337-351 (2017).
  29. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
  30. Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. W. Super-resolution fluorescence microscopy. Annual Review of Biochemistry. 78, 993-1016 (2009).
  31. Bustamante, C., Bryant, Z., Smith, S. B. Ten years of tension: single-molecule DNA mechanics. Nature. 421 (6921), 423-427 (2003).
  32. Bustamante, C., Chemla, Y. R., Moffitt, J. R. High-resolution dual-trap optical tweezers with differential detection. Single-Molecule Techniques: A Laboratory Manual. Selvin, P. R., Ha, T. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).
  33. Zhao, Y. L., Jiang, Y. Z., Qi, Z. Visualizing biological reaction intermediates with DNA curtains. Journal of Physics D: Applied Physics. 50 (15), 153001(2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Kurtyny DNAseparacja fazonkoproteiny fuzyjnekondensaty czynników transkrypcyjnychkondensaty biomolekularneprzesunięcie mobilności elektroforetycznejmikrofluidyczna komora przepływowaznakowanie mCherry
Obrazowanie pojedynczych cząsteczek kondensatów EWS-FLI1 składających się na DNA
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.