Artykuł metodologiczny

Izolacja i hodowla pierwotnych ludzkich komórek nabłonka dziąseł przy użyciu Y-27632

5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62978

⸱

6 listopada 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Tissue Engineering and Regeneration, School and Hospital of Stomatology, Cheeloo College of Medicine, Shandong University & Shandong Key Laboratory of Oral Tissue Regeneration & Shandong Engineering Laboratory for Dental Materials and Oral Tissue Regeneration, 2Department of Orthodontics, School and Hospital of Stomatology, Cheeloo College of Medicine, Shandong University & Shandong Key Laboratory of Oral Tissue Regeneration & Shandong Engineering Laboratory for Dental Materials and Oral Tissue Regeneration, 3Department of Stomatology, Shengli Oilfield Central Hospital, 4Department of Pediatric Surgery, Shengli Oilfield Central Hospital, 5Ningbo Stomatology Hospital of Savaid Stomatology School, Hangzhou Medical College

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy zmodyfikowaną metodę izolacji i hodowli ludzkich komórek nabłonka dziąseł poprzez dodanie inhibitora Rocka, Y-27632, do metody tradycyjnej. Metoda ta jest łatwiejsza, mniej czasochłonna, poprawia właściwości komórek macierzystych i wytwarza większą liczbę komórek nabłonkowych o wysokim potencjale zarówno do zastosowań laboratoryjnych, jak i klinicznych.

Streszczenie

Tkanka dziąseł jest pierwszą strukturą, która chroni tkanki przyzębia i odgrywa znaczącą rolę w wielu funkcjach jamy ustnej. Nabłonek dziąsła jest ważną strukturą tkanki dziąseł, szczególnie w naprawie i regeneracji tkanki przyzębia. Badanie funkcji komórek nabłonka dziąseł ma kluczową wartość naukową, taką jak naprawa wad jamy ustnej i wykrywanie kompatybilności biomateriałów. Ponieważ ludzkie komórki nabłonka dziąseł są wysoce zróżnicowanymi komórkami zrogowaciałymi, ich żywotność jest krótka i są trudne do przejścia. Jak dotąd istnieją tylko dwa sposoby izolacji i hodowli komórek nabłonka dziąseł: metoda bezpośredniego eksplantatu i metoda enzymatyczna. Jednak czas potrzebny do uzyskania komórek nabłonkowych metodą bezpośredniego eksplantatu jest dłuższy, a przeżywalność komórek metodą enzymatyczną jest niższa. Klinicznie pozyskiwanie tkanki dziąsła jest ograniczone, dlatego potrzebny jest stabilny, wydajny i prosty system izolacji i hodowli in vitro. Ulepszyliśmy tradycyjną metodę enzymatyczną, dodając Y-27632, inhibitor kinazy związanej z Rho (ROCK), który może selektywnie promować wzrost komórek nabłonka. Nasza zmodyfikowana metoda enzymatyczna upraszcza etapy tradycyjnej metody enzymatycznej i zwiększa efektywność hodowli komórek nabłonkowych, co ma znaczące zalety w porównaniu z metodą bezpośredniego eksplantatu i metodą enzymatyczną.

Wprowadzenie

Ludzkie dziąsło, pierwsza linia obrony chroniąca tkankę przyzębia, jest nie tylko fizyczną i chemiczną barierą1, ale także wydziela różne klasy mediatorów stanu zapalnego, które uczestniczą w odpowiedziach immunologicznych i stanowią barierę immunologiczną2,3. Nabłonek dziąseł odgrywa ważną rolę w naprawie i regeneracji tkanki przyzębia. Dlatego badanie obrony i odporności nabłonka dziąseł ma ogromne znaczenie dla zrozumienia występowania, diagnozowania i leczenia zapalenia przyzębia. Izolacja i hodowla komórek nabłonka dziąseł z ludzkiej tkanki dziąsła jest pierwszym krokiem wymaganym do zbadania nabłonka dziąseł. Taka procedura wymaga podstawowych operacji, takich jak produkcja komórek nasiennych do inżynierii tkankowej, modeli in vitro chorób związanych z przyzębiem oraz materiałów do naprawy wad przyzębia.

Pierwotne komórki nabłonka dziąseł charakteryzują się niskim współczynnikiem podziału in vitro4, naukowcy od dziesięcioleci poszukują optymalnej metody izolacji i hodowli. Do tej pory dwie różne techniki, metoda bezpośredniego eksplantatu i metoda enzymatyczna, są powszechnie stosowane w laboratoriach do uzyskiwania pierwotnych komórek nabłonka dziąseł in vitro4,5. Metoda bezpośredniego eksplantatu ma zalety, takie jak wymóg mniejszej ilości próbek tkanek i prosta procedura izolacji, ale ma wady w postaci dłuższego czasu hodowli i podatności na zanieczyszczenie5. Chociaż metoda enzymatyczna skraca wymagany czas hodowli, wydajność jest stosunkowo niska i różni się w zależności od użytych enzymów i pożywki. Kedjarune et al.6 wykazali, że metoda bezpośredniego eksplantatu, która wymaga więcej czasu przed subkulturą (2 tygodnie), okazała się bardziej skuteczna w hodowli komórek nabłonka dziąseł w porównaniu z metodą enzymatyczną. Jednak porównując te dwie metody, Klingbeil i wsp.7 stwierdzili, że metoda enzymatyczna dała najlepsze wyniki dla pierwotnych hodowli komórek nabłonka jamy ustnej i możliwe było uzyskanie optymalnej wydajności komórek w najkrótszym czasie (11,9 dnia w porównaniu z 14,2 dnia).

Dlatego ważne było opracowanie wygodniejszej i skuteczniejszej metody izolacji i hodowli komórek nabłonka jamy ustnej4. Wcześniej informowaliśmy, że dodanie Y-27632, inhibitora kinazy białkowej związanej z Rho (ROCK), upraszcza procedurę izolacji ludzkich pierwotnych komórek naskórka i keratynocytów z dorosłych tkanek skóry8,9,10. Opracowaliśmy G-pożywkę, nową kondycjonowaną pożywkę do inokulacji, która spontanicznie oddziela komórki naskórka od komórek skóry właściwej oraz wspomaga wzrost i wydajność pierwotnych komórek naskórka8,9,10. W niniejszym badaniu opracowaliśmy nową technikę izolacji i hodowli komórek nabłonka dziąseł bez surowicy poprzez połączenie G-medium z Y-27632. Zasadniczo nasza metoda opiera się na uproszczeniu tradycyjnej dwuetapowej metody enzymatycznej, dlatego porównaliśmy naszą nową metodę z metodą bezpośredniego eksplantatu. Ta zmodyfikowana metoda enzymatyczna znacznie skraca czas potrzebny do oddzielenia komórek nabłonka dziąseł od tkanki dziąsła i zwiększa efektywność hodowli komórek nabłonka dziąseł.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Ludzkie tkanki użyte w tym protokole to świeże dorosłe tkanki dziąseł, wyrzucone z ekstrakcji zębów zatrzymanych na Oddziale Chirurgii Szczękowo-Twarzowej zgodnie z wytycznymi Komisji Etyki Badań Naukowych Instytucji (Protokół No. GR201711, z dnia: 27.02.2017).

1. Przygotowania

  1. Zebrać świeże dorosłe tkanki dziąseł do probówek o pojemności 15 ml zawierających 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) uzupełnionej 3% penicyliną/streptomycyną (P/S) i utrzymywać tkanki w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Traktuj tkanki zgodnie z opisem poniżej w ciągu 24 godzin po wycięciu.

2. Przygotuj odczynniki i pożywkę hodowlaną

  1. Przygotuj roztwór myjący: 3% P/S. Zmieszaj 50 ml PBS z 1,5 ml penicyliny (100 U/ml) i 1,5 ml streptomycyny (100 mg/l).
  2. Przygotować 500 ml pożywki zawierającej czynnik wzrostu (zwanej pożywką G): pożywki DMEM/F12 (3:1) zawierającej 1% P/S, 2% suplementu B27, 20 ng/ml naskórkowego czynnika wzrostu (EGF), 40 ng/ml czynnika wzrostu fibroblastów 2 (FGF2) i 40 μg/ml fungizonu.
  3. Przygotować roztwory trawienia enzymatycznego dla nowej metody: Rozpuścić 125 mg proszku Dispazy i 125 mg proszku kolagenazy typu I w 50 ml DMEM.
    UWAGA: Przefiltruj wszystkie roztwory enzymów przez sitko 0,22 μm i przechowuj w temperaturze 4 °C.
  4. Przygotuj 500 ml pożywki, aby zneutralizować trawienie enzymatyczne: 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% P/S w pożywce DMEM.

3. Metoda bezpośredniego eksplantatu

  1. Wstępne leczenie tkanki dziąseł
    1. Myj tkankę dziąseł 5 ml 75% etanolu przez 30 s. Następnie spłukać dwukrotnie 5 ml roztworu myjącego (krok 2.1) przez 5 min.
      UWAGA: Wszystkie mycia należy wykonywać w naczyniach do hodowli komórkowych o średnicy 50 mm.
  2. Hodowla komórek nabłonka dziąseł
    1. Pokrój tkankę dziąsła na 1 mm3 kawałki i rozsyp je w naczyniu do hodowli komórkowych o średnicy 100 mm. Do operacji cięcia używaj cienkich spiczastych kleszczy i nożyczek okulistycznych.
    2. Dodaj G-pożywkę (krok 2.2) do naczynia hodowlanego. Następnie inkubować szalkę hodowlaną w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Za pomocą mikroskopu odwróconego (40x) badać tkanki co 24 godziny.
    3. Usuń kawałki tkanki dziąseł, gdy komórki nabłonka rozpropagują się do średnicy 2-5 mm wokół kawałków tkanki. Zmieniaj G-medium co 2-4 dni.

4. Nowa zmodyfikowana metoda enzymatyczna

  1. Wstępne leczenie tkanki dziąseł
    1. W tym celu należy wykonać te same czynności, które opisano dla metody bezpośredniego eksplantatu, krok 3.1.1.
  2. Trawienie tkanki dziąsłowej
    1. Pokrój tkankę dziąsła na drobne kawałki o wielkości około <1 mm za pomocą dwóch wysterylizowanych ostrzy. Powtórz proces rozdrabniania za pomocą dwóch ostrzy chirurgicznych.
    2. Dodać 1 ml roztworu 2,5 mg/ml dispazy + kolagenazy do 1,5 ml probówki wirówkowej zawierającej fragmenty tkanki dziąsła, a następnie inkubować probówkę przez 15-20 minut w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
    3. Gdy tkanka stanie się przezroczysta i kłaczkowata, dodaj 1 ml roztworu neutralizującego, aby zakończyć trawienie. Dokładnie wymieszaj roztwór, pipetując w górę i w dół 10-15 razy. Przepuścić roztwór przez filtr siatkowy o wielkości 100 μm.
    4. Wirować przy 200 x g przez 5 min.
    5. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy na dnie w 10 ml pożywki zawierającej czynnik wzrostu (krok 2.2). Przenieść zawiesinę komórkową do naczynia do hodowli komórkowej o średnicy 100 mm. Dodać 10 μM Y-27632 do naczynia do hodowli komórkowej.
    6. Hodować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 . Wymieniaj starą pożywkę G-medium na świeżą pożywkę G-pożywkę co 2 dni. Obserwuj komórki w dniu 1 i dniu 3.

5. Przekazywanie komórek

  1. Wyjmij naczynie z inkubatora, usuń zużyte podłoże i umyj dwukrotnie PBS. Dodaj 2 ml 0,05% trypsyny na każde naczynie 100 mm.
    UWAGA: Wstrząśnij naczyniem, aby upewnić się, że roztwór trypsyny ma wystarczający kontakt z dnem naczynia.
  2. Pozostawić naczynie w inkubatorze na około 5 minut w temperaturze 37 °C w celu przeprowadzenia procesu trawienia.
  3. Użyj mikroskopu (40x), aby zbadać komórki i upewnij się, że większość komórek oddzieliła się od dna naczynia.
  4. Dodać 2 ml roztworu neutralizującego, aby zatrzymać trawienie i przenieść komórki do probówki o pojemności 15 ml. Pipetę w górę i w dół 10-15 razy. Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut.
  5. Usunąć sklarowany osad powoli. Ponownie zawiesić komórki w 10 ml pożywki G i policzyć liczbę komórek.
  6. Dodaj około 1 x 106 komórek w 10 ml G-pożywki i 10 μM Y-27632 do każdej 100 mm szalki.
  7. Odnawiaj G-medium i Y-27632 co 2 dni. Wyświetl komórki w dniu 1 i dniu 5.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia schemat ideowy metody bezpośredniego eksplantatu i zmodyfikowanej metody enzymatycznej. Metoda bezpośredniego eksplantatu nie wymaga żadnego enzymu trawiennego podczas całego procesu. W przeciwieństwie do tego, tradycyjna metoda enzymatyczna zwykle wymaga dwóch zestawów enzymów trawiennych, dyspazy i kolagenazy, aby oddzielić warstwę nabłonka od leżącej poniżej warstwy fibroblastów, a następnie trypsyny do uwolnienia komórek nabłonka do zawiesiny. Nasza nowa metoda pomi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Tkanka dziąseł jest kluczową strukturą, która utrzymuje integralność i zdrowie przyzębia. Komórki nabłonka dziąseł odgrywają znaczącą rolę w naprawie i regeneracji tkanki przyzębia i mogą być wykorzystywane w badaniach naukowych i zastosowaniach klinicznych oraz w dziedzinach pokrewnych, w tym w biologii jamy ustnej, farmakologii, toksykologii i niedoborach błony śluzowej jamy ustnej18. Dlatego konieczne jest opracowanie stabilnej i skutecznej metody pobierania komórek nabłonka jamy ustnej

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Wszyscy autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Kluczowy Program Fundacji Nauk Przyrodniczych Prowincji Shandong (ZR2019ZD36) oraz Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Prowincji Shandong (2019GSF108107) do X.W.; Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Prowincji Shandong (2018GSF118240) do J.G.; Projekt Rozwoju Nauk i Technologii Medycznych i Zdrowotnych w prowincji Shandong (2018WS163) do ZX oraz Projekt Rozwoju Nauk i Technologii Medycznych i Zdrowotnych w Prowincji Shandong (2019WS045) do JS

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
NazwySkróty & Komentarze
Hrabina automatyczny licznik komórekShanghai Ruiyu Bio-science& Technologia Co.Ltd.BBA0218ACAutomatyczne zliczanie komórek
Inkubator CO2Thermo Scientific51026333Do inkubacji komórek
Wirówka Sorvall ST 16RThermo Scientific75004380Wirówka komórkowa
Naczynie do hodowli komórkowychEppendorf30702115Do hodowli komórkowych
50 ml Probówka wirówkowaKIRGEN171003Do wirowania komórek
Probówki do mikrowirówek 1,5 mlKIRGEN190691JDo trawienia komórek
Sitko komórkoweCorning wbudowane431792Filtracja komórkowa
Roztwór buforowany fosforanamiSolarbio Life ScienceP1020-500Roztwór myjący
DMEMThermo ScientificC11995500Składnik pożywki neutralizacyjnej
Zdefiniowany K-SFMŻywotność Technologie10785-012Nabłonek dziąseł  pożywka do hodowli komórek
Penicylina StreptomycynaThermo Scientific15140-122Antybiotyki
Surowica bydlęcaPrzemysł biologiczny04-001-1AC5Składnik pożywki neutralizującej
0,05% TrypsinLife Technologies25300-062Do dysocjacji HGGEPC
Podłoże rozcieńczająceLife Technologies50-9701Do powlekania matrycy
DispaseGibco17105-041Do izolacji HGGEPCs
Kolagenaza typu ILife Technologies17100-017Do izolacji HGGEPCs
F12 Mieszanka składników odżywczych, HamsLife Technologies31765035Składnik G-medium
B27 SuplementLife Technologies17504044Czynnik wzrostu w G-pożywce
FGF-2 MilliporeMerck Biosciences341595Czynnik wzrostu w G-pożywce
Operacja genuY-27632IAD1011inhibitor ROCK
FungizoneGibco15290026Preparat do G-medium
Rekombinowane białko ludzkieGibcoPHG0311Czynnik wzrostu w G-medium
Cell Counting Kit-8Dojindo Molecular TechnologiesCK04Do testu proliferacji komórek
Królik anty-ludzki CK18Abcamab82254Do barwienia immunofluorescencyjnego w celu sprawdzenia markera różnicowania HGGEPC
Króliczej anty-ludzkiej cytokeratyny10Abcamab76318Do barwienia immunofluorescencyjnego w celu sprawdzenia markera różnicowania HGGEPC
Mysz anty-ludzka technologiasygnalizacji komórkowej3390Do barwienia immunofluorescencyjnego fibroblastów dziąseł
Królik Anti-Human pan-ckBD 550951Do barwienia immunofluorescencyjnego w celu sprawdzenia markera różnicowania HGGEPC
królika anty-Ki67Abcam15580Do barwienia immunofluorescencyjnego w celu sprawdzenia markera różnicowania HGGEPC
królika anty-p63Biolegend619002Do barwienia immunofluorescencyjnego w celu sprawdzenia markera różnicowania HGGEPC
królik anty-p75NGFRAbcamab52987Do barwienia immunofluorescencyjnego w celu sprawdzenia markera różnicowania HGGEPC
płodu wimentyny

Bibliografia

  1. Takahashi, N., et al. Gingival barrier: regulation by beneficial and harmful microbes. Tissue Barriers. 7, 1651158(2019).
  2. Michea, P., et al. Epithelial control of the human pDC response to extracellular bacteria. European Journal of Immunology. 43, 1264-1273 (2013).
  3. Bedran, T. B., Mayer, M. P., Spolidorio, D. P., Grenier, D. Synergistic anti-inflammatory activity of the antimicrobial peptides human beta-defensin-3 (hBD-3) and cathelicidin (LL-37) in a three-dimensional co-culture model of gingival epithelial cells and fibroblasts. PloS one. 9, 106766(2014).
  4. Sciezynska, A., et al. Isolation and culture of human primary keratinocytes-a methods review. Experimental Dermatology. 28, 107-112 (2019).
  5. Bryja, A., et al. Overview of the different methods used in the primary culture of oral mucosa cells. Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents. 33, 397-401 (2019).
  6. Kedjarune, U., Pongprerachok, S., Arpornmaeklong, P., Ungkusonmongkhon, K. Culturing primary human gingival epithelial cells: comparison of two isolation techniques. Journal of Cranio-Maxillo-Facial Surgery: Official Publication of the European Association for Cranio-Maxillo-Facial Surgery. 29, 224-231 (2001).
  7. Klingbeil, M. F., et al. Comparison of two cellular harvesting methods for primary human oral culture of keratinocytes. Cell and Tissue Banking. 10, 197-204 (2009).
  8. Qian, H., et al. One-step simple isolation method to obtain both epidermal and dermal stem cells from human skin specimen. Methods in Molecular Biology. 1879, 139-148 (2019).
  9. Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12, 1251-1255 (2018).
  10. Liu, Z., et al. A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2018).
  11. Lauer, G., Wiedmann-Al-Ahmad, M., Otten, J. E., Hubner, U. Immunohistochemical study during healing of free palatal mucosa grafts on plastic-embedded samples. Journal of Oral Pathology & Medicine: Official Publication of the International Association of Oral Pathologists and the American Academy of Oral Pathology. 30, 104-112 (2001).
  12. Locke, M., Hyland, P. L., Irwin, C. R., Mackenzie, I. C. Modulation of gingival epithelial phenotypes by interactions with regionally defined populations of fibroblasts. Journal of Periodontal Research. 43, 279-289 (2008).
  13. Shabana, A. H., Ouhayoun, J. P., Sawaf, M. H., Forest, N. Cytokeratin patterns of human oral mucosae in histiotypic culture. Archives of Oral Biology. 36, 747-758 (1991).
  14. Kasai, Y., et al. biopsy of human oral mucosal epithelial cells as a quality control of the cell source for fabrication of transplantable epithelial cell sheets for regenerative medicine. Regenerative Therapy. 4, 71-77 (2016).
  15. Oda, D., Dale, B. A., Bourekis, G. Human oral epithelial cell culture. II. Keratin expression in fetal and adult gingival cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology: Journal of the Tissue Culture Association. 26, 596-603 (1990).
  16. Guarino, M., Tosoni, A., Nebuloni, M. Direct contribution of epithelium to organ fibrosis: epithelial-mesenchymal transition. Human Pathology. 40, 1365-1376 (2009).
  17. Hatakeyama, S., Yaegashi, T., Takeda, Y., Kunimatsu, K. Localization of bromodeoxyuridine-incorporating, p63- and p75(NGFR)- expressing cells in the human gingival epithelium. Journal of Oral Science. 49, 287-291 (2007).
  18. Bayar, G. R., Aydintug, Y. S., Gunhan, O., Ozturk, K., Gulses, A. Ex vivo produced oral mucosa equivalent by using the direct explant cell culture technique. Balkan Medical Journal. 29, 295-300 (2012).
  19. Daniels, J. T., Kearney, J. N., Ingham, E. Human keratinocyte isolation and cell culture: a survey of current practices in the UK. Burns: Journal of the International Society for Burn Injuries. 22, 35-39 (1996).
  20. Carrel, A., Burrows, M. Cultivation of adult tissues and organs outside the body. Journal of the American Medical Association. 55, 1379-1381 (1910).
  21. Rheinwald, J. G., Green, H. Formation of a keratinizing epithelium in culture by a cloned cell line derived from a teratoma. Cell. 6, 317-330 (1975).
  22. Oda, D., Watson, E. Human oral epithelial cell culture I. Improved conditions for reproducible culture in serum-free medium. In Vitro Cellular & Developmental Biology: Journal of the Tissue Culture Association. 26, 589-595 (1990).
  23. Boyce, S. T., Ham, R. G. Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture. The Journal of Investigative Dermatology. 81, 33-40 (1983).
  24. Guo, A., Jahoda, C. A. An improved method of human keratinocyte culture from skin explants: cell expansion is linked to markers of activated progenitor cells. Experimental Dermatology. 18, 720-726 (2009).
  25. Smola, H., Krieg, T. The keratinocyte handbook. Irene, M., Leigh, E., Lane, B., Watt, F. M. 375, Cambridge University Press. FEBS Letters 311(1994).
  26. Shwetha, H. R., et al. Ex vivo culture of oral keratinocytes using direct explant cell culture technique. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology: JOMFP. 23, 243-247 (2019).
  27. Yin, J., Yu, F. S. Rho kinases regulate corneal epithelial wound healing. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 295, 378-387 (2008).
  28. Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. The Journal of Clinical Investigation. 120, 2619-2626 (2010).
  29. Strudwick, X. L., Lang, D. L., Smith, L. E., Cowin, A. J. Combination of low calcium with Y-27632 rock inhibitor increases the proliferative capacity, expansion potential and lifespan of primary human keratinocytes while retaining their capacity to differentiate into stratified epidermis in a 3D skin model. PloS One. 10, 0123651(2015).
  30. Orazizadeh, M., Hashemitabar, M., Bahramzadeh, S., Dehbashi, F. N., Saremy, S. Comparison of the enzymatic and explant methods for the culture of keratinocytes isolated from human foreskin. Biomedical Reports. 3, 304-308 (2015).
  31. Rosin, F. C. P., et al. Keratin expression in gingival tissue and primary cultured gingival keratinocytes: Are there differences. Archives of Oral Biology. 117, 104780(2020).
  32. Wang, T., Kang, W., Du, L., Ge, S. Rho-kinase inhibitor Y-27632 facilitates the proliferation, migration and pluripotency of human periodontal ligament stem cells. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21, 3100-3112 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja pierwotnych kom rekmetoda enzymatycznainhibitor ROCKtkanka dzi s owahodowla kom rkowatrawienie tkankitrawienie kolagenazregeneracja jamy ustnej

Powiązane artykuły