Tutaj opisujemy protokół generowania organoidów mózgowych z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Aby uzyskać organoidy mózgowe w dużych ilościach i wysokiej jakości, używamy domowych mini bioreaktorów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wytwarzanie organoidów mózgowych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w domowych mini bioreaktorach
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Organoid mózgowy pochodzący z iPSC jest obiecującą technologią do modelowania in vitro patologii układu nerwowego i badań przesiewowych leków. Ta technologia pojawiła się niedawno. Jest wciąż w powijakach i ma pewne ograniczenia, które nie zostały jeszcze rozwiązane. Obecne protokoły nie pozwalają na uzyskanie organoidów wystarczająco spójnych dla odkrywania leków i badań przedklinicznych. Dojrzewanie organoidów może trwać nawet rok, co zmusza naukowców do uruchomienia wielu procesów różnicowania jednocześnie. Nakłada to na laboratorium dodatkowe koszty w zakresie powierzchni i wyposażenia. Ponadto organoidy mózgowe często mają w środku strefę martwiczą, która cierpi z powodu niedoboru składników odżywczych i tlenu. W związku z tym większość obecnych protokołów wykorzystuje system krążenia pożywki hodowlanej w celu poprawy odżywiania.
Tymczasem, nie ma tanich systemów dynamicznych ani bioreaktorów do hodowli organoidów. W artykule opisano protokół produkcji organoidów mózgowych w kompaktowych i niedrogich mini bioreaktorach domowej roboty. Protokół ten pozwala na uzyskanie wysokiej jakości organoidów w dużych ilościach.
Wprowadzenie
Modele pochodzące z ludzkiego iPSC są szeroko stosowane w badaniach nad zaburzeniami neurorozwojowymi i neurodegeneracyjnymi1. W ciągu ostatniej dekady trójwymiarowe modele tkanki mózgowej, tak zwane organoidy mózgowe, zasadniczo uzupełniały tradycyjne hodowle neuronów 2D2. Organoidy do pewnego stopnia podsumowują architekturę 3D embrionalnego mózgu i umożliwiają bardziej precyzyjne modelowanie. Opublikowano wiele protokołów generowania organoidów reprezentujących różne obszary mózgu: kora mózgowa3,4,5, móżdżek....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA : Używaj sterylnej techniki w całym protokole, z wyjątkiem kroków 1.2 i 1.3. Podgrzać wszystkie pożywki i roztwory do 37 °C przed zastosowaniem na komórkach lub organoidach. Hodować komórki w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przy wilgotności 80%. Schemat protokołu jest pokazany w Rysunek 1.
1. Przekształcanie szalek Petriego w mini bioreaktory
- Pociąć sterylne probówki wirówkowe o pojemności 15 ml w pierścienie o wysokości 7-8 mm; umieścić je w autoklawie.
- Rozbij szalki Petriego o niskiej przyczepności, niepoddane obróbce lub mikrobi....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Schemat protokołu przedstawiono na Rysunku 1. Protokół obejmował pięć pośrodków, w których iPSC różnicowały się w organoidy mózgu przez co najmniej miesiąc. Różnicowanie rozpoczęto, gdy iPSC osiągnęły 75-90% konfluencji (Rysunek 2A,B). Pierwsze oznaki różnicowania w kierunku neuronów zaobserwowano w 10-11 dniu hodowli iPSC w pośrodku A, gdy komórki zaczęły skupiać się w tzw. „rozetki” (Rysunek 2C). W dniach 14-15 iP.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisany protokół składa się z dwóch kluczowych etapów, które pozwalają na wygenerowanie wysokiej jakości organoidów o jednolitej wielkości. Po pierwsze, organoidy wyrastają ze sferoidów, które są prawie identyczne pod względem liczby komórek i dojrzałości komórek. Po drugie, domowe bioreaktory zapewniają każdemu organoidowi jednolite środowisko, w którym organoidy nie tłoczą się ani nie sklejają ze sobą.
Jakość komórki i stan dojrzewania komórki są niezbędne do wykonania protokołu. Bardzo ważn.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez grant 075-15-2019-1669 z Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego Federacji Rosyjskiej (analiza RT-PCR) oraz przez grant nr 19-15-00425 z Rosyjskiej Fundacji Naukowej (na wszystkie inne prace). Autorzy dziękują również Pavlowi Belikovowi za pomoc w montażu wideo. Figury w rękopisie zostały stworzone przy użyciu BioRender.com.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Zaawansowany DMEM/F-12 | Gibco | 12634010 | DMEM/F-12 |
| AggreWell400 | STEMCELL Technologies Inc | 34425 | 24-dołkowa płytka hodowlana z mikrodołkami |
| Suplement B-27 | Gibco | 17504044 | Suplement neuronalny B |
| GlutaMAX Suplement | Gibco | 35050061 | 200 mM L-alanylo-L-glutamina |
| Ludzki BDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-285 | |
| Ludzki FGF-2 | Miltenyi Biotec | 130-093-839 | |
| Ludzki GDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-290 | |
| Zamiennik surowicy KnockOut | Gibco | 10828028 | Zamiennik surowicy |
| mTESR1 | STEMCELL Technologies Inc | 85850 | Pliripotencjalne podłoże z komórek macierzystych |
| N2 Suplement | Gibco | ||
| Pożywka neuropodstawowa | Gibco | 21103049 | Podstawowa pożywka do utrzymania komórek nerwowych |
| Roztwór penicyliny-streptomycyny | Gibco | 15140130 | |
| Plasmocin | InvivoGen | ant-mpt-1 | Środki przeciwdrobnoustrojowe |
| Purmorphamine | EMD Millipore | 540220 | |
| StemMACS Y27632 | Miltenyi Biotec | 130-106-538 | Y27632 |
| StemMACS Dorsomorphin | Miltenyi Biotec | 130-104-466 | Dorsomorphin |
| StemMACS LDN-193189 | Miltenyi Biotec | 130-106-540 | LDN-193189 |
| StemMACS | SB431542 Miltenyi Biotec | 130-106-543 | SB431542 |
| Roztwór błękitu trypanowego | Gibco | 15250061 | |
| Versen roztwór | Gibco | 15040066 | 0,48 mM EDTA w PBS |
| β-merkaptoetanolu | Gibco | 31350010 |
Bibliografia
- Marchetto, M. C., Winner, B., Gage, F. H. Pluripotent stem cells in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases. Human Molecular Genetics. 19, 71-76 (2010).
- Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
