Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie organoidów mózgowych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w domowych mini bioreaktorach

5.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62987

⸱

11 grudnia 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine, Federal Medical Biological Agency, 2Faculty of Bioengineering and Bioinformatics, Lomonosov Moscow State University, 3Center for Precision Genome Editing and Genetic Technologies for Biomedicine, Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine, Federal Medical Biological Agency, 4Department of Pathological Anatomy, North-Western State Medical University, 5Department of Biology, Lomonosov State University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy protokół generowania organoidów mózgowych z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Aby uzyskać organoidy mózgowe w dużych ilościach i wysokiej jakości, używamy domowych mini bioreaktorów.

Streszczenie

Organoid mózgowy pochodzący z iPSC jest obiecującą technologią do modelowania in vitro patologii układu nerwowego i badań przesiewowych leków. Ta technologia pojawiła się niedawno. Jest wciąż w powijakach i ma pewne ograniczenia, które nie zostały jeszcze rozwiązane. Obecne protokoły nie pozwalają na uzyskanie organoidów wystarczająco spójnych dla odkrywania leków i badań przedklinicznych. Dojrzewanie organoidów może trwać nawet rok, co zmusza naukowców do uruchomienia wielu procesów różnicowania jednocześnie. Nakłada to na laboratorium dodatkowe koszty w zakresie powierzchni i wyposażenia. Ponadto organoidy mózgowe często mają w środku strefę martwiczą, która cierpi z powodu niedoboru składników odżywczych i tlenu. W związku z tym większość obecnych protokołów wykorzystuje system krążenia pożywki hodowlanej w celu poprawy odżywiania.

Tymczasem, nie ma tanich systemów dynamicznych ani bioreaktorów do hodowli organoidów. W artykule opisano protokół produkcji organoidów mózgowych w kompaktowych i niedrogich mini bioreaktorach domowej roboty. Protokół ten pozwala na uzyskanie wysokiej jakości organoidów w dużych ilościach.

Wprowadzenie

Modele pochodzące z ludzkiego iPSC są szeroko stosowane w badaniach nad zaburzeniami neurorozwojowymi i neurodegeneracyjnymi1. W ciągu ostatniej dekady trójwymiarowe modele tkanki mózgowej, tak zwane organoidy mózgowe, zasadniczo uzupełniały tradycyjne hodowle neuronów 2D2. Organoidy do pewnego stopnia podsumowują architekturę 3D embrionalnego mózgu i umożliwiają bardziej precyzyjne modelowanie. Opublikowano wiele protokołów generowania organoidów reprezentujących różne obszary mózgu: kora mózgowa3,4,5, móżdżek6, śródmózgowie, przodomózgowie, podwzgórze7,8,9, oraz hippocampus10. Istnieje wiele przykładów wykorzystania organoidów do badania chorób ludzkiego układu nerwowego11. Ponadto organoidy zostały zaimplementowane w odkrywaniu leków12 i wykorzystane w badaniach chorób zakaźnych, w tym SARS-Cov-213,14.

Organoidy mózgowe mogą osiągać do kilku milimetrów średnicy. Tak więc wewnętrzna strefa organoidu może cierpieć z powodu niedotlenienia lub niedożywienia i ostatecznie stać się martwicza. Dlatego wiele protokołów zawiera specjalne bioreaktory8, shakery lub systemy mikroprzepływowe15. Urządzenia te mogą wymagać dużych ilości drogich pożywek do hodowli komórkowych. Ponadto koszt takiego sprzętu jest zwykle wysoki. Niektóre bioreaktory składają się z wielu części mechanicznych, co utrudnia ich sterylizację w celu ponownego użycia.

Większość protokołów cierpi na "efekt wsadowy"16, co generuje znaczną zmienność wśród organoidów uzyskanych z identycznych iPSC. Ta zmienność utrudnia testowanie leków lub badania przedkliniczne wymagające jednolitości. Wysoka wydajność organoidów wystarczająca do wyselekcjonowania organoidów o jednolitej wielkości może częściowo rozwiązać ten problem.

Czynnikiem czasu jest również istotny problem. Matsui i in. (2018) wykazali, że organoidy mózgowe potrzebują co najmniej sześciu miesięcy, aby osiągnąć dojrzałość17. Trujillo i in. (2019) wykazali również, że aktywność elektrofizjologiczna występuje w organoidach dopiero po sześciu miesiącach uprawy18. Ze względu na długi czas dojrzewania organoidów, naukowcy często wprowadzają nowe różnicowanie przed zakończeniem poprzedniego. Wiele równoległych procesów różnicowania wymaga dodatkowych wydatków, sprzętu i przestrzeni laboratoryjnej.

Niedawno opracowaliśmy mini bioreaktor, który głównie rozwiązuje wyżej wymienione problemy19. Ten domowy bioreaktor składa się z szalki Petriego o bardzo niskiej przyczepności lub nieobrobionej z plastikowym pokrętłem pośrodku. To plastikowe pokrętło zapobiega stłoczeniu organoidów i ich sklejaniu się w środku szalki Petriego, co jest spowodowane obracaniem się shakera. W artykule opisano, w jaki sposób ten niedrogi i prosty mini bioreaktor domowej roboty umożliwia generowanie wysokiej jakości organoidów mózgowych w dużych ilościach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA : Używaj sterylnej techniki w całym protokole, z wyjątkiem kroków 1.2 i 1.3. Podgrzać wszystkie pożywki i roztwory do 37 °C przed zastosowaniem na komórkach lub organoidach. Hodować komórki w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przy wilgotności 80%. Schemat protokołu jest pokazany w Rysunek 1.

1. Przekształcanie szalek Petriego w mini bioreaktory

  1. Pociąć sterylne probówki wirówkowe o pojemności 15 ml w pierścienie o wysokości 7-8 mm; umieścić je w autoklawie.
  2. Rozbij szalki Petriego o niskiej przyczepności, niepoddane obróbce lub mikrobiologiczne na okruchy. Rozpuść około 1 g okruchów plastiku w 10 ml chloroformu przez noc, aby przygotować płynny plastik.
    UWAGA: Pracować w dygestorium.
  3. Sprawdź, czy powstały w ten sposób płynny plastik jest wystarczająco lepki do pipetowania; jego kropla zachowuje kulistą formę i nie rozprzestrzenia się po powierzchni. Jeśli jest bardzo płynny, dodaj więcej okruchów plastiku. Jeśli jest gęsty, dodaj chloroform.
  4. Zrób plastikową gałkę na środku sterylnej 6-centymetrowej szalki Petriego o bardzo niskiej przyczepności. Istnieją dwa równie odpowiednie sposoby, jak opisano poniżej.
    1. Umieść autoklawowany plastikowy pierścień na środku i upuść płynny plastik do wnętrza pierścienia.
    2. Bez żadnego plastikowego pierścienia upuść płynny plastik na środek szalki Petriego.
  5. Pozostaw naczynia otwarte na 2-3 godziny w okapie z przepływem laminarnym, aż do całkowitego wyschnięcia. Suszone naczynia należy traktować promieniowaniem ultrafioletowym przez 15-20 minut.

2. Indukcja różnicowania neuronalnego iPSC

  1. Hoduj iPSC w pożywce dla pluripotencjalnych komórek macierzystych do 75-90% konfluencji na 35-milimetrowych szalkach Petriego, wstępnie pokrytych macierzą składającą się z białek zewnątrzkomórkowych.
  2. Przygotować podłoże A-SR. Szczegółowe informacje znajdują się w tabeli 1.
  3. Odessać podłoże hodowlane i dodać 2 ml pożywki A-SR w dniu 0 różnicowania.
  4. Przygotować podłoże A (patrz Tabela 2).
  5. Hoduj komórki w pożywce A przez dwa tygodnie od 2 do 14 dni, odświeżając podłoże na szalkach Petriego co drugi dzień.

3. Tworzenie sferoid z neuroepitelialnych komórek prekursorowych w dniu 14

  1. W dniu 14 wykonaj sferoidy z neuroepitelialnych komórek prekursorowych, używając specjalnej 24-dołkowej płytki hodowlanej zawierającej około 1200 mikrodołków w każdym dołku (Rysunek 2C). Postępuj zgodnie z procedurą podaną poniżej.
    UWAGA: Na tym etapie różnicowania szalka Petriego o średnicy 35 mm zwykle zawiera 3 - 3,5 x 106 neuroepitelialnych komórek prekursorowych. Tak więc jedna szalka Petriego o średnicy 35 mm z neuronapicelialnymi komórkami prekursorowymi wystarcza na 3 - 4 dołki 24-dołkowej płytki hodowlanej z mikrodołkami.
  2. Przygotuj 24-dołkową płytkę hodowlaną z mikrostudzienkami: Do każdej studzienki dodaj 1 ml pożywki A. Krótko odwirować przy 1,300 x g przez 5 minut w wahadłowym wirniku kubełkowym wyposażonym w uchwyt na płytkę. Sprawdź, pod mikroskopem, czy w mikrostudzienkach nie ma pęcherzyków.
  3. Przygotuj podłoże B (Tabela 3).
  4. Usunąć pożywkę z płytki Petriego z komórkami prekursorowymi nabłonka nerwowego; przemyć komórki 2 ml DMEM/F12. W celu oderwania komórek potraktuj komórki 1,5 ml 0,48 mM roztworu EDTA przygotowanego w PBS. Kontroluj oderwanie komórek pod mikroskopem.
  5. Zbierz komórki do probówki o pojemności 15 ml. Dodaj 5 ml DMEM/F12 do probówki, aby umyć komórki. Wirować przy 200 x g przez 5 min. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 2 ml pożywki B.
  6. Sprawdź stężenie i żywotność komórek za pomocą barwienia błękitem trypanowym i hemocytometrem. Obliczyć objętość zawiesiny potrzebną do zawarcia łącznie 1 x 106 żywotnych komórek.
  7. Przenieść zawiesinę komórek zawierającą 1 x 106 komórek do każdej studzienki 24-dołkowej płytki z mikrodołkami. Dodaj pożywkę B do 2 ml do każdej studzienki, delikatnie pipetuj komórki w górę i w dół kilka razy i krótko odwiruj 100 x g przez 1 minutę, aby uchwycić komórki w mikrostudzienkach.
    UWAGA: Liczba komórek w studzience nie powinna przekraczać 1 x 106. W przeciwnym razie sferoidy z sąsiednich mikrostudzienek łączą się.
  8. Sprawdź pod mikroskopem, czy komórki są równomiernie rozmieszczone w mikrostudzienkach. Powtórzyć pipetowanie i odwirowanie, jeśli komórki są rozmieszczone nierównomiernie.
  9. Inkubować płytkę przez noc, aby komórki mogły się zagregować w sferoidy.

4. Pozyskiwanie i uprawa organoidów

  1. Następnego ranka (dzień 15) sprawdź jakość sferoid pod mikroskopem. Upewnij się, że są przezroczyste i gładkie, jeśli są zdrowe (Rysunek 2A,B). Ostrożnie zbierz sferoidy z każdej studzienki do probówki o pojemności 15 ml, pozostaw sferoidy do wytrącenia się grawitacyjnie na 2-3 minuty, a następnie usuń supernatant.
  2. Dodać do sferoid 2 ml matrycy rozmrożonej w tym samym czasie na lodzie. Delikatnie wymieszać pipetując i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
  3. Aby zmyć nadmiar matrycy, dodać do probówki 8 ml pożywki B. Delikatnie odpipetować, a następnie odwirować probówkę przez 1 minutę przy 100 x g.
    UWAGA: Nie należy przekraczać czasu i prędkości wirowania, aby uniknąć nieodwracalnej agregacji sferoid.
  4. Usunąć supernatant. Dodać do probówki 2 ml pożywki B, delikatnie odpipetować. Podziel zawiesinę sferoidalną na dwa mini bioreaktory, z których każdy zawiera 4 ml pożywki B. Umieść mini bioreaktory na 15-centymetrowej szalce Petriego, aby zapobiec parowaniu wody i uniknąć zanieczyszczenia.
  5. Umieść szalkę Petriego z mini bioreaktorami na wytrząsarce orbitalnej. Uprawiaj organoidy z prędkością obrotową 70-75 obr./min.
  6. W dniu 16 przygotować pożywkę C (Tabela 4).
  7. Przenieść organoidy do probówki o pojemności 15 ml. Przez 5 minut pozwól im opaść na dno, odessać supernatant, dodać 5 ml pożywki C. Włóż organoidy z powrotem do mini bioreaktorów.
    UWAGA: Uważaj, aby nie zgubić sferoid, które są przezroczyste i ledwo widoczne.
  8. Kuluj sferoidy w podłożu C przez dwa tygodnie, odświeżając podłoże co dwa dni. Pod koniec tych dwóch tygodni pozostaw około 100 sferoid na mini bioreaktor do następnej uprawy. Zamrozić nadmiar sferoid w podłożu zamrażającym w ciekłym azocie.
  9. W 30 dniu przygotować pożywkę D (Tabela 5).
  10. Zmień podłoże uprawowe na podłoże D, które jest podłożem do dojrzewania. Odświeżaj podłoże uprawowe co 2-3 dni przez trzy tygodnie, a następnie użyj podłoża D bez BDNF i GDNF.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Schemat protokołu przedstawiono na Rysunku 1. Protokół obejmował pięć pośrodków, w których iPSC różnicowały się w organoidy mózgu przez co najmniej miesiąc. Różnicowanie rozpoczęto, gdy iPSC osiągnęły 75-90% konfluencji (Rysunek 2A,B). Pierwsze oznaki różnicowania w kierunku neuronów zaobserwowano w 10-11 dniu hodowli iPSC w pośrodku A, gdy komórki zaczęły skupiać się w tzw. „rozetki” (Rysunek 2C). W dniach 14-15 iP...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisany protokół składa się z dwóch kluczowych etapów, które pozwalają na wygenerowanie wysokiej jakości organoidów o jednolitej wielkości. Po pierwsze, organoidy wyrastają ze sferoidów, które są prawie identyczne pod względem liczby komórek i dojrzałości komórek. Po drugie, domowe bioreaktory zapewniają każdemu organoidowi jednolite środowisko, w którym organoidy nie tłoczą się ani nie sklejają ze sobą.

Jakość komórki i stan dojrzewania komórki są niezbędne do wykonania protokołu. Bardzo ważn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez grant 075-15-2019-1669 z Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego Federacji Rosyjskiej (analiza RT-PCR) oraz przez grant nr 19-15-00425 z Rosyjskiej Fundacji Naukowej (na wszystkie inne prace). Autorzy dziękują również Pavlowi Belikovowi za pomoc w montażu wideo. Figury w rękopisie zostały stworzone przy użyciu BioRender.com.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zaawansowany DMEM/F-12Gibco12634010DMEM/F-12
AggreWell400STEMCELL Technologies Inc3442524-dołkowa płytka hodowlana z mikrodołkami
Suplement B-27Gibco17504044Suplement neuronalny B
GlutaMAX SuplementGibco35050061200 mM L-alanylo-L-glutamina
Ludzki BDNFMiltenyi Biotec130-096-285
Ludzki FGF-2Miltenyi Biotec130-093-839
Ludzki GDNFMiltenyi Biotec130-096-290
Zamiennik surowicy KnockOutGibco10828028Zamiennik surowicy
mTESR1STEMCELL Technologies Inc85850Pliripotencjalne podłoże z komórek macierzystych
N2 SuplementGibco
Pożywka neuropodstawowaGibco21103049Podstawowa pożywka do utrzymania komórek nerwowych
Roztwór penicyliny-streptomycynyGibco15140130
PlasmocinInvivoGenant-mpt-1Środki przeciwdrobnoustrojowe
PurmorphamineEMD Millipore540220
StemMACS Y27632Miltenyi Biotec130-106-538Y27632
StemMACS DorsomorphinMiltenyi Biotec130-104-466Dorsomorphin
StemMACS LDN-193189Miltenyi Biotec130-106-540LDN-193189
StemMACSSB431542 Miltenyi Biotec130-106-543SB431542
Roztwór błękitu trypanowegoGibco15250061
Versen roztwórGibco150400660,48 mM EDTA w PBS
β-merkaptoetanoluGibco31350010
17502001

Bibliografia

  1. Marchetto, M. C., Winner, B., Gage, F. H. Pluripotent stem cells in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases. Human Molecular Genetics. 19, 71-76 (2010).
  2. Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F. 3D brain Organoids derived from pluripotent stem cells: promising experimental models for brain development and neurodegenerative disorders. Journal of Biomedical Science. 24 (1), 1-12 (2017).
  3. Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 110 (50), 20284(2013).
  4. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  5. Xiang, Y., et al. Fusion of regionally specified hPSC derived organoids models human brain development and interneuron migration. Cell Stem Cell. 21, 383-398 (2017).
  6. Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells. Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).
  7. Qian, X., et al. Brain region specific organoids using mini bioreactors for modeling ZIKV exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  8. Qian, X., et al. Generation of human brain region specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).
  9. Jo, J., et al. Midbrain like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuro melanin producing neurons. Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).
  10. Sakaguchi, H., et al. Generation of functional hippocampal neurons from self-organizing human embryonic stem cell derived dorsomedial telencephalic tissue. Nature Communication. 6 (1), 8896(2015).
  11. Di Lullo, E., Kriegstein, A. R. The use of brain organoids to investigate neural development and disease. Nature Reviews Neuroscience. 18 (10), 573-584 (2017).
  12. Chen, K. G., et al. Pluripotent stem cell platforms for drug discovery. Trends in Molecular Medicine. 24 (9), 805-820 (2018).
  13. Dang, J., et al. Zika virus depletes neural progenitors in human cerebral organoids through activation of the innate immune receptor TLR3. Cell Stem Cell. 19 (2), 258-265 (2016).
  14. Tiwari, S. K., Wang, S., Smith, D., Carlin, A. F., Rana, T. M. Revealing tissue-specific SARS-CoV-2 infection and host responses using human stem cell-derived lung and cerebral organoids. Stem Cell Reports. 16 (3), 437-445 (2021).
  15. Ao, Z., et al. One-stop microfluidic assembly of human brain organoids to model prenatal cannabis exposure. Analytical Chemistry. 92 (6), 4630-4638 (2020).
  16. Di Nardo, P., Parker, G. C. Stem cell standardization. Stem Cells Development. 20 (3), 375-377 (2011).
  17. Jo, J., Xiao, Y., et al. Midbrain like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuro melanin producing neurons. Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).
  18. Matsui, T. K., et al. Six-month cultured cerebral organoids from human ES cells contain matured neural cells. Neuroscience Letters. 670, 75-82 (2018).
  19. Trujillo, C. A., et al. Complex oscillatory waves emerging from cortical organoids model early human brain network development. Cell Stem Cell. 25 (4), 558-569 (2019).
  20. Eremeev, A. V., et al. Necessity Is the mother of invention” or inexpensive, reliable, and reproducible protocol for generating organoids. Biochemistry (Moscow). 84 (3), 321-328 (2019).
  21. Qian, X., et al. Generation of human brain region–specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13, 565-580 (2018).
  22. Matsui, T. K., Tsuru, Y., Hasegawa, K., Kuwako, K. I. Vascularization of human brain organoids. Stem Cells. 39 (8), 1017-1024 (2021).
  23. Hall, G. N., et al. Patterned, organoid-based cartilaginous implants exhibit zone specific functionality forming osteochondral-like tissues in vivo. Biomaterials. 273, 120820(2021).
  24. Zachos, N. C., et al. Human enteroids/colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology. Journal of Biological Chemistry. 291, 3759-3766 (2016).
  25. Eremeev, A., et al. Cerebral organoids—challenges to establish a brain prototype. Cells. 10 (7), 1790(2021).
  26. Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES Cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 110, 20284-20289 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Organoidy m zgur nicowanie organoid wtr jwymiarowy model m zgudojrzewanie organoid wformowanie sferoid wanaliza immunohistochemicznamodelowanie o rodkowego uk adu nerwowego
Wytwarzanie organoidów mózgowych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w domowych mini bioreaktorach
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.