Method Article

Obrazowanie interferometryczne pojedynczej cząstki: charakterystyka poszczególnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych i dynamiki populacji

DOI:

10.3791/62988

⸱

January 10th, 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Kansas Medical Center, 2NanoView Biosciences

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół przedstawia interferometryczne obrazowanie odbicia pojedynczej cząstki, które jest przeznaczone do wielopoziomowych i kompleksowych pomiarów wielkości pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV), liczby EV, fenotypu EV i kolokalizacji biomarkerów EV.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) to nanometrowe pęcherzyki z dwuwarstwą lipidową, które są wydzielane przez większość komórek. EV przenoszą wiele różnych cząsteczek biologicznych, w tym białka, lipidy, DNA i RNA, i postuluje się, że ułatwiają komunikację między komórkami w różnych tkankach i narządach. W ostatnim czasie pojazdy elektryczne cieszą się dużym zainteresowaniem jako biomarkery w diagnostyce i środkach terapeutycznych w różnych chorobach. Opracowano wiele metod charakteryzowania EV. Jednak obecne metody analizy EV mają różne ograniczenia. W związku z tym opracowanie wydajnych i skutecznych metod izolacji i charakterystyki pojazdów elektrycznych pozostaje jednym z kluczowych kroków w tej nowatorskiej dziedzinie badawczej w miarę jej dojrzewania. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół przedstawiający jednocząsteczkowy interferometryczny czujnik obrazowania odbicia (SP-IRIS), jako metodę, która jest w stanie wykryć i scharakteryzować EV z nieoczyszczonych źródeł biologicznych i oczyszczonych EV za pomocą innych metodologii. Ta zaawansowana technika może być wykorzystywana do wielopoziomowych i kompleksowych pomiarów do analizy wielkości EV, liczby EV, fenotypu EV i kolokalizacji biomarkerów.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) to nanometrowe pęcherzyki błonowe pochodzenia komórkowego, które mogą być izolowane z wielu płynów biologicznych, w tym krwi, mleka matki, śliny, moczu, żółci, soku trzustkowego oraz płynów mózgowo-rdzeniowych i otrzewnowych. Wyprowadzanie EV zachodzi za pomocą trzech głównych mechanizmów: apoptozy, uwalniania poprzez fuzję ciał wielopęcherzykowych z błoną plazmatyczną i blednienia błony plazmatycznej1. Dowody na przenoszenie EV składników komórek dawcy do sąsiednich lub odległych komórek i tkanek sugerują, że te zamknięte w błonie pakiety mogą odgrywać ważną rolę w kaskadach sygnalizacji parakrynnej, a także długodystansowej lub endokrynologicznej1,2,3. Ponieważ EV mogą dostarczyć migawki fenotypu komórki, potencjał ich wykorzystania jako narzędzi diagnostycznych i terapeutycznych w leczeniu różnych chorób stał się aktywnym obszarem badań4,5,6,7,8.

Opracowano wiele metod mających na celu charakterystykę EV9,10,11,12,13. Większość z tych metod dostarcza unikalnych i cennych informacji o populacjach pojazdów elektrycznych, głównie hurtowo. Podczas gdy podzbiór tych technik może dostarczyć szczegółowych informacji na temat substancji znajdujących się w pojedynczych pojazdach elektrycznych lub na ich powierzchni, mogą istnieć ograniczenia w charakterystyce pojazdów elektrycznych na poziomie pojedynczego pojazdu elektrycznego. Na przykład, mikroskopia immunoelektronowa może być wykorzystana do zrozumienia pojedynczych EV i ich składu, ale ta technika jest mało przepustowa, poważnie ograniczona w swoich możliwościach do wykorzystania do opisu dynamiki populacji i wymaga znacznych metod rozwoju14.

Niedawno, rozwój i komercjalizacja techniki interferometrycznego czujnika odbicia pojedynczej cząstki (SP-IRIS), za pośrednictwem platformy ExoView, umożliwiła indywidualną charakterystykę EV przy użyciu rutynowej i prostej metody automatycznego zbierania danych. Sercem tej technologii jest chip, czyli podwójna warstwa Si/SiO2 o wymiarach 1 cm x 1 cm, która umożliwia interferometryczny pomiar pojedynczych nanocząstek biologicznych. Chip jest wyposażony w mikromacierz pojedynczych funkcjonalizowanych plamek przeciwciał, co pozwala na multipleksowane wykrywanie do sześciu różnych typów wychwytywania. Standardowe chipy zawierają popularne markery tetraspaniny (CD81, CD63 i CD9) do wychwytywania podczas etapu inkubacji, a użytkownik może dodać dodatkowe niestandardowe miejsca wychwytywania, aby wyizolować odrębne populacje EV oddzielone od tetraspanin. Po etapie inkubacji każde miejsce schwytania wiąże z nim wiele EV, które wyrażają odpowiedni znacznik. Te przechwycone EV można następnie po prostu umyć, wysuszyć i zeskanować w czytniku, aby określić ilościowo rozmiar pęcherzyków związanych z miejscem przechwytywania w zakresie 50-200 nm, aby uzyskać liczbowy ważony rozkład wielkości za pomocą SP-IRIS15. System oferuje również trzy kanały detekcji fluorescencyjnej do znakowania immunologicznego wychwyconych EV i zapewnia zarówno średnią intensywność fluorescencji, która nie jest ograniczona rozmiarem, takim jak pomiary SP-IRIS, jak i aspekty kolokalizacji dla każdej barwie fluorescencyjnej. Dzięki temu użytkownik może definiować populacje pojedynczych EV na podstawie wyświetlania czterech różnych biomarkerów na EV (przechwytywanie plus trzy znaczniki immunofluorescencyjne). System może wykraczać poza pomiar białek powierzchniowych z immunofluorescencją, ponieważ opcjonalny protokół CARGO pozwala użytkownikowi na sondowanie wewnętrznych białek wychwyconych EV i epitopów luminalnych markerów powierzchniowych rozpiętych błonę, a także umożliwia użytkownikowi sprawdzenie integralności błony EV. W tym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół przedstawiający kroki niezbędne do uzyskania spójnych danych dotyczących wielkości i liczby pojazdów elektrycznych, z maksymalnie czterema różnymi biomarkerami na jednym poziomie pojazdów elektrycznych w dużych populacjach pojazdów elektrycznych. Technika ta może być stosowana zarówno do nieprzetworzonych płynów biologicznych, jak i EV wyizolowanych przy użyciu dowolnej liczby technik, takich jak ultrawirowanie, ultrafiltracja, środki strącające, wychwytywanie powinowactwa immunologicznego, mikrofluidyka i chromatografia wykluczania wielkości.

Protokół opisany poniżej wykorzystuje pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) pochodzące z pożywki do hodowli komórkowych HEK 293 oraz z surowicy myszy przy użyciu ustalonej metody izolacji16. Protokół został zastosowany do wielu innych płynów biologicznych, pożywki do hodowli komórkowych i oczyszczonych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wyizolowanych z płynów biologicznych. Protokół ten jest podzielony na dwudniową procedurę z przepływem pracy dla typowego eksperymentu pokazanym na Rysunek 1.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Przebieg testu. Proces oznaczania w celu wyboru rodzaju analizy, która ma zostać wykonana dla próbki, między wielkością a liczbą, liczbą wielkości i barwieniem powierzchni oraz liczbą wielkości i barwieniem ładunku. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Próbki surowicy zostały pobrane od myszy zgodnie z zatwierdzonym protokołem Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) przy University of Kansas Medical Center (KUMC). Wykorzystanie tych próbek biologicznych w tych eksperymentach zostało również zatwierdzone przez KUMC.

1. Przygotowanie próbki (Dzień 1)

  1. Określ stężenie EV za pomocą śledzenia nanocząstek lub równoważnej techniki.
  2. Rozcieńczyć próbkę roztworem do inkubacji do stężenia 5 x 107-5 x 108 EVs/ml; potrzeba co najmniej 50 μl.
    UWAGA: W przypadku próbek, w których stężenie EV jest nieznane, jako miarę zastępczą można zastosować białko całkowite o stężeniu 1 μg/ml. Jeżeli oczekuje się, że próbka będzie miała niskie stężenie, przed załadowaniem należy przeprowadzić rozcieńczenie w stosunku co najmniej 1:1 w roztworze inkubacyjnym.
  3. Umieść 24-dołkową płytkę na płaskiej powierzchni, wolnej od wibracji i gwałtownych ruchów.
    UWAGA: Aby zwiększyć kontrast, pod płytą można umieścić białą kartkę papieru.
  4. Dodaj wodę do obszarów otaczających studnie (Rysunek 2).

figure-protocol-1
Rysunek 2: Układ płytek 24-dołkowych. Pokazano miejsca, w których należy podwielokrotnić ddH2O (niebieski barwnik został dodany wyłącznie w celach wizualizacji) oraz dołki, w których będą przechowywane wióry. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Przygotowanie i wstępne skanowanie chipów

  1. Wyjmij szczelnie zamkniętą 48-dołkową płytkę zawierającą chipsy z lodówki o temperaturze 4-8 °C i pozwól im osiągnąć temperaturę pokojową (~15 min) przed otwarciem uszczelki.
    UWAGA: Jest to niezbędne, aby uniknąć kondensacji na wiórach, która może uszkodzić plamy. Jeśli po wyjęciu wióra z opakowania na powierzchni zaobserwuje się kondensację, poczekaj dłużej przed usunięciem pozostałych.
  2. Przejdź do kroku 8, aby pobrać uchwyt wiertarski i przygotować się do uruchomienia przed skanowaniem (Rysunek 3).
    UWAGA: Dane ze skanowania wstępnego zostaną wykorzystane do identyfikacji wszelkich cząstek, które są wykrywalne w miejscach wychwytywania przed inkubacją z próbką, tak aby można je było usunąć na etapie analizy.

figure-protocol-2
Rysunek 3: Obraz uchwytu używanego do załadunku chipa do maszyny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Za pomocą pęsety usuń żądaną liczbę wiórów (jeden wiór na próbkę) z płytki 48-dołkowej i załaduj wióry bezpośrednio do uchwytu w celu przeprowadzenia skanowania wstępnego. Po załadowaniu i wstępnym zeskanowaniu wszystkich chipów przeznaczonych do wykorzystania w eksperymencie zgodnie z opisem w kroku 8, przejdź do kroku 2.4.
    UWAGA: Podczas obchodzenia się z wiórami należy pamiętać, aby nie dotykać kwadratów pośrodku, ponieważ miejsca wychwytywania przeciwciał znajdują się w tym obszarze i ulegną uszkodzeniu, jeśli zostaną dotknięte pęsetą (Rysunek 4).

figure-protocol-3
Rysunek 4: Chip i prawidłowa obsługa chipów. (A) Żółta przerywana linia wskazuje lokalizację zauważonych przeciwciał, czyli funkcjonalną stronę chipa. Identyfikator chipa znajduje się poniżej linii ("58"). Rysunek przedstawia również prawidłową obsługę. (B) Wykazuje niewłaściwe obchodzenie się z chipem. (C) Niefunkcjonalna strona chipa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Umieść każdy wstępnie zeskanowany chip funkcjonalizowaną powierzchnią skierowaną do góry na wstępnie przygotowanej płytce 24-dołkowej. Funkcjonalizowaną powierzchnię można łatwo rozpoznać po wyraźnej numeracji, siatkach wyrównania i trzech czarnych polach pośrodku. Niefunkcjonalizowana strona to płaska, srebrna, jednolita powierzchnia.
  2. Użyj pęsety z drobnym czubkiem, aby upewnić się, że każdy wiór jest wyśrodkowany w studzience ( Rysunek 5).
    UWAGA: Wyśrodkowanie chipa w studzience ma kluczowe znaczenie, ponieważ jeśli wiór dotknie ścianki studzienki, próbka może zostać usunięta po załadowaniu.

figure-protocol-4
Rysunek 5: Demonstracja prawidłowego rozmieszczenia wiórów w studni. (A) Wióry powinny być umieszczone na środku studni, tak aby żadne rogi nie stykały się z bokami studni. (B) Przedstawienie niewłaściwego umieszczenia wióra w miejscu, w którym rogi stykają się z bokami studni. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Ładowanie i inkubacja chipa i próbki

  1. Odpipetować 35 μl przygotowanej próbki (z kroku 1) na chip.
    UWAGA: Należy uważać, aby nie dodawać pęcherzyków ani nie dotykać chipa końcówką pipety, ponieważ może to uniemożliwić równomierne rozprowadzenie próbki na chipie lub uszkodzić plamki przeciwciał na chipie. Próbka powinna rozprowadzić się na całej powierzchni wióra. W przypadku gdy próbka odchodzi od wióra podczas ładowania, należy dodać dodatkową próbkę do studzienki do objętości 250 μl lub dodać roztwór inkubacyjny do 250 μl i zanotować zmieniony współczynnik rozcieńczenia dla tej próbki.
  2. Uszczelnić płytkę za pomocą folii dołączonej do zestawu, aby zapobiec parowaniu próbki.
  3. Próbkę/chip inkubować przez noc (~16 h) w szczelnie zamkniętej płytce w temperaturze pokojowej w miejscu wolnym od wibracji i ruchu.
    UWAGA: Po całonocnej inkubacji użytkownik wybierze odpowiednią opcję Dnia 2 dla swojego pytania badawczego. Jeśli wymagany jest tylko rozmiar i liczba EV, przejdź do kroku 4 (Dzień 2). Jeśli wymagana jest analiza wielu znaczników powierzchni, przejdź do kroku 5 (Dzień 2).

4. Określanie wielkości i liczby EV (Dzień 2)

  1. Dodać 1 ml roztworu A na bok każdej studzienki zawierającej wiór, uważając, aby nie dodawać roztworu bezpośrednio na wiór ani nie drapać wióra końcówką pipety.
  2. Umieść płytkę na wytrząsarce orbitalnej obracającej się z prędkością ~500 obr./min przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Jeśli wiórki grzechoczą na talerzu, natychmiast zmniejsz prędkość, tak aby płyn wirował, ale nie było grzechotania.
  3. Usunąć 750 μl płynu. Unikaj przechylania płytki podczas usuwania płynu, aby zapobiec przypadkowemu wysuszeniu wióra.
  4. Dodać 750 μl roztworu B zgodnie z techniką opisaną w kroku 4.1 i wstrząsać z prędkością ~500 obr./min przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
  5. Powtórz kroki 4.3-4.4 jeszcze dwa razy, w sumie trzy razy przemyć roztworem B.
  6. Pod koniec ostatniego płukania usunąć 750 μl roztworu, pozostawiając 250 μl roztworu B w studzience.
  7. Dodać 750 μl podwójnie destylowanej wody (ddH2O) i wstrząsać z prędkością ~500 obr./min przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
  8. Napełnij 10-centymetrową szalkę Petriego 50 mlddH2O i przenieś po jednym chipsie ze studzienki do naczynia za pomocą pęsety.
    UWAGA: Uważaj, aby przenieść wiór poziomo i upewnić się, że nie wyschnie. Przed wymianą ddH2O można umyć do ośmiu wiórów.
  9. W ddH2O przytrzymaj wiór za krawędzie za pomocą pęsety i obracaj w naczyniu przez trzy obroty, aby usunąć zanieczyszczenia.
  10. Wyjmij wiór pod kątem 45° z wody i umieść go na chłonnym papierze z identyfikatorem chipa skierowanym do góry (Rysunek 6).
    UWAGA: Chipy są teraz gotowe do odczytu. Przejdź do kroku 8, aby zeskanować za pomocą czytnika SP-IRIS.

figure-protocol-5
Rysunek 6: Prawidłowy sposób na usunięcie wióra z wody ddH2O pod kątem 45°. (A) Widok z góry i (B) widok z boku pokazujący kąt, pod jakim należy usunąć chip. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

5. Przygotowanie roztworu przeciwciał (Dzień 2)

  1. Dodać 300 μl roztworu blokującego na chip do probówki o odpowiedniej wielkości (0,5 do 3 ml).
  2. Dodać 0,6 μl przeciwciała na 300 μl roztworu blokującego. Delikatnie wymieszaj, stukając w tubkę i szybko odwiruj.
    UWAGA: Przeciwciała dla ludzkich CD9, CD81 i CD63 lub mysich CD9, CD81 i CD63 są zawarte w odpowiednich zestawach. Jeśli pożądane są inne przeciwciała sprzężone fluorescencyjnie, należy określić optymalne stężenie barwienia, stosując typowe miareczkowanie w zakresie od 0,1 do 10 μg/ml przy stałym obciążeniu próbki, tak jak w przypadku cytometrii przepływowej.

6. Określanie wielkości, liczby i fenotypowania EV za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego

  1. Dodać 1 ml roztworu A na bok każdej studzienki zawierającej wiór, uważając, aby nie dodawać roztworu bezpośrednio na wiór ani nie zarysowywać wióra końcówką pipety.
  2. Umieść płytkę na wytrząsarce orbitalnej obracającej się z prędkością ~500 obr./min przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Jeśli wiórki grzechoczą na talerzu, natychmiast zmniejsz prędkość, tak aby płyn wirował, ale nie było grzechotania.
  3. Usunąć 750 μl płynu. Unikaj przechylania płytki podczas usuwania płynu, aby zapobiec przypadkowemu wysuszeniu wióra.
  4. Dodać 750 μl roztworu A zgodnie z techniką opisaną w kroku 6.1 i wstrząsać z prędkością ~500 obr./min przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
  5. Powtórzyć kroki 6.3 i 6.4 dwukrotnie, w sumie trzy razy przemyć roztworem A.
  6. Pod koniec ostatniego płukania usunąć 750 μl roztworu, pozostawiając 250 μl roztworu A w studzience.
    UWAGA: Jeśli użytkownik życzy sobie barwienia ładunku, przejdź w tym momencie do kroku 7. Jeśli nie, przejdź do kroku 6.7
  7. Dodać 250 μl roztworu przeciwciał (krok 5) do każdego chipa w studzience. Przykryj płytkę folią w celu ochrony przed światłem i potrząsaj przez 1 godzinę na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze pokojowej.
  8. Dodaj 500 μl roztworu A, aby całkowita objętość na studzienkę wynosiła ~1,000 μL.
  9. Natychmiast usunąć 750 μl i dodać 750 μl roztworu A i wstrząsnąć z prędkością ~500 obr./min na wytrząsarce orbitalnej przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
  10. Usuń 750 μl roztworu i dodaj 750 μl roztworu B i wstrząsaj z prędkością ~500 obr./min przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
  11. Powtórz krok 6.10 jeszcze dwa razy, w sumie trzy prania.
  12. Dodać 750 μl podwójnie destylowanej wody (ddH2O) i wstrząsać z prędkością ~500 obr./min przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
  13. Napełnij 10-centymetrową szalkę Petriego 50 ml ddH2O i przenieś jeden wiór z dołka do naczynia za pomocą pęsety.
    UWAGA: Uważaj, aby przenieść wiór poziomo i upewnić się, że nie wyschnie. Przed wymianą na świeże ddH2O można umyć do ośmiu wiórów.
  14. W ddH2O przytrzymaj wiór za krawędzie za pomocą pęsety i obracaj w naczyniu przez trzy obroty, aby usunąć zanieczyszczenia.
  15. Wyjmij wiór pod kątem 45° z wody i umieść go na chłonnym papierze z identyfikatorem chipa skierowanym do góry (Rysunek 6).
    UWAGA: Chipy są teraz gotowe do odczytu. Przejdź do kroku 8 (Gromadzenie danych), aby uzyskać instrukcje dotyczące konfiguracji chipów do skanowania na czytniku.

7. Opcjonalne barwienie ładunku

UWAGA: Ten protokół umożliwia jednoczesne etykietowanie znaczników wewnętrznych i powierzchniowych.

  1. Mając 250 μl roztworu A pozostającego w każdym dołku, dodaj 250 μl roztworu C do każdego dołka.
  2. Natychmiast umieścić na wytrząsarce orbitalnej i ustawić na ~200 obr./min dokładnie przez 10 min.
    UWAGA: W tym kroku i kroku 7.8 poniżej zarówno czas, jak i wolniejsza prędkość wytrząsania mają kluczowe znaczenie; Upewnij się, że prędkość daje tylko powolne wirowanie w studniach i użyj timera.
  3. Po 10 minutach inkubacji z roztworem C dodać 500 μl roztworu A do każdego dołka.
  4. Natychmiast usunąć 750 μl i dodać 750 μl roztworu A i wstrząsnąć z prędkością ~500 obr./min na wytrząsarce orbitalnej przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
  5. Powtórz krok 7.4 jeszcze dwa razy, co daje w sumie trzy prania.
  6. Pod koniec ostatniego płukania usuń 750 μl roztworu, pozostawiając ~250 μl roztworu w studzience z wiórem.
  7. Dodać 250 μl roztworu D do każdej studzienki.
  8. Natychmiast umieścić na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na ~200 obr./min dokładnie na 10 minut.
  9. Po 10 minutach inkubacji z roztworem C dodać 500 μl roztworu A do każdego dołka.
  10. Natychmiast usunąć 750 μl i dodać 750 μl roztworu A i wstrząsnąć z prędkością ~500 obr./min na wytrząsarce orbitalnej przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
  11. Powtórz krok 7.10 dwa razy, co daje w sumie trzy prania.
  12. Usunąć 750 μl roztworu po ostatnim płukaniu i powrócić do kroku 6.7 powyżej w celu barwienia i wypełnienia protokołu testu.

8. Zbieranie danych

UWAGA: Procedura zbierania danych z chipów za pomocą ExoView R100 jest zautomatyzowana i nie wymaga wprowadzania danych przez użytkownika. Szczegółowe instrukcje można znaleźć w Podręczniku użytkownika i odpowiednim filmie dotyczącym ładowania nośnika na chipy, czyli "uchwytu", oraz akwizycji danych17.

  1. Włącz platformę charakteryzacji EV za pomocą dwóch przełączników zasilania z tyłu przyrządu, a następnie uruchom oprogramowanie skanera, klikając dwukrotnie ikonę na pulpicie.
    UWAGA: Po uruchomieniu oprogramowania skanera czytnik automatycznie przełączy się na ekran główny, a następnie poprosi użytkownika o "Otwórz drzwi, aby załadować chipy".
  2. Otwórz drzwiczki z przodu czytnika, podnosząc srebrną rączkę. Spowoduje to wysunięcie stolika, umożliwiając użytkownikowi dostęp do uchwytu i skonfigurowanie nowego skanowania w oprogramowaniu.
  3. Zidentyfikuj lokalizację, w której użytkownik chce zapisać dane, klikając folder Zapisz i wybierając żądaną lokalizację dla danych do zapisania.
    UWAGA: Często przydatne jest nazwanie lokalizacji zapisu w sposób wnikliwy, taki jak nazwa eksperymentu, a następnie utworzenie dwóch podfolderów, jednego dla skanowania wstępnego i jednego dla skanowania po skanowaniu. Ułatwia to znajdowanie i dopasowywanie danych podczas analizy.
  4. Aby zeskanować chipy, zlokalizuj pliki chipów na komputerze sterującym.
    UWAGA: Pliki chipowe są mapami układu plamek przeciwciał na używanym chipie i pozwalają skanerowi wiedzieć, gdzie skanować na każdym chipie. W każdym zestawie znajduje się klucz USB z plikami chipowymi do znajdujących się w środku. Powinny one zostać zapisane w lokalizacji na komputerze sterującym po otrzymaniu zestawu, gdzie użytkownicy mogą je niezawodnie znaleźć.
  5. Załaduj chipy na uchwyt tak, aby numer na chipach był skierowany w stronę uchwytu na uchwycie, a następnie z menu rozwijanego Chip na komputerze wybierz każdy chip z listy chipfiles i umieść go w odpowiednim pasującym miejscu w wirtualnym uchwycie w oprogramowaniu skanera. Po zakończeniu na ekranie pojawi się monit z prośbą o umieszczenie uchwytu na stole montażowym.
  6. Umieść załadowany uchwyt na stoliku; wyrównanie magnetyczne na uchwycie automatycznie przesunie go we właściwe miejsce na stoliku, a następnie kliknij OK obok opcji Umieść uchwyt na stole montażowym. Następnie skaner rozpocznie procedurę automatycznego zbierania danych.
    UWAGA: Dane są gotowe do analizy, gdy oprogramowanie zgłosi stan skanowania każdego układu jako pomyślny.

9. Analiza danych

  1. Kliknij dwukrotnie ExoView Analyzer na pulpicie komputera sterującego. Po uruchomieniu oprogramowania kliknij przycisk Wstępne skanowanie danych i wybierz lokalizację folderu dla zestawu danych skanowania wstępnego w sekcji 8.3.
  2. Kliknij przycisk Postscan Data (Dane po skanowaniu) i wybierz lokalizację folderu dla zestawu danych Postscan w sekcji 8.3.
    UWAGA: Jeśli dane zostaną prawidłowo wykryte w obu folderach, dla przynajmniej niektórych chipów, oprogramowanie wyświetli "X" liczbę wykrytych chipów obok przycisku lokalizacji Chipfile. Po prawidłowym zapisaniu wykryte chipy powinny odpowiadać liczbie zeskanowanych chipów.
  3. Kliknij przycisk Next (Dalej) u dołu obszaru ładowania danych.
  4. W menu rozwijanym tabeli meta każdy żeton będzie miał komórkę. Wprowadź nazwy próbek, współczynniki rozcieńczenia i markery, które są barwione w każdym kanale wykrywania, klikając odpowiednie pole i wpisując informacje; po zakończeniu kliknij ponownie Dalej.
    UWAGA: Te metadane zostaną zapisane wraz z danymi.
  5. Kontrola jakości preform (QC), klikając zakładkę Wyłącz pod przyciskiem QC w lewym górnym rogu.
    UWAGA: Ta funkcja umożliwia wyłączenie określonych sond i chipów na czas analizy. Oprogramowanie dostarczy dwa różne ostrzeżenia dotyczące danych, jedno dla dużych liczb, które mogą wskazywać, że dane przechwytywanie jest nasycone, oraz wysoki współczynnik zmienności (CV), który określa, kiedy jedna z powtórzeń typu przechwytywania różni się od pozostałych.
    1. Kliknij na Miejsce Ostrzegawcze dla wysokiego CV, sprawdź miejsca, które są wywoływane przez oprogramowanie i zobacz, czy występują oczywiste uszkodzenia fizyczne; gdy uszkodzenie zostanie zidentyfikowane, kliknij Numer Punktu, aby wyłączyć to miejsce w analizie.
    2. Powtarzaj, aż wszystkie ostrzeżenia zostaną ocenione, a następnie kliknij Dalej.
  6. Analiza odcięcia preformy poprzez kliknięcie zakładki Odcięcie znajdującej się obok zakładki Wyłącz pod przyciskiem QC w lewym górnym rogu.
    UWAGA: Spowoduje to przedstawienie odpowiedzi fluorescencyjnej punktu kontrolnego na wykresie i zaoferuje użytkownikowi dwa ustawienia, minimum i maksimum dla każdego kanału koloru (czerwony/zielony/niebieski). Ustawienie wartości odcięcia dla każdego kanału detekcji fluorescencyjnej jest jedyną regulacją danych, którą należy wykonać i jest stosunkowo proste. Co ważne, ostateczny punkt odcięcia, który zostanie wybrany, powinien być spójny w całym eksperymencie i, jak wspomniano, powinien mieścić się w ogólnych zasadach dla 300-400 a.u. w kolorze czerwonym i zielonym oraz 400-700 a.u. dla niebieskiego w typowych eksperymentach; Oprogramowanie posiada przewodniki oznaczone kolorami dla użytkownika również dla tych zakresów.
    1. Kliknij zakładkę Kolor zielony, aby załadować dane dla tego kanału i wyświetlić bieżące odcięcia. Badając plamkę kontroli ujemnej izotypu, można zaobserwować zdarzenia detekcji o bardzo niskiej intensywności fluorescencji; W takim przypadku użytkownicy powinni zazwyczaj spodziewać się ustawienia koloru zielonego w zakresie 300-400 AU.
      1. Zwiększaj wartość minimalną dla każdego z kanałów detekcji, aż wartość "Avg % Inc" (średni % wykrytych cząstek w punkcie kontrolnym znajdującym się powyżej punktu odcięcia) pod wyświetlaczem danych nie będzie zawierała żadnych ostrzeżeń, jak wskazano czerwonym lub żółtym podświetleniem w tej komórce.
        UWAGA: Wartość maksymalna zazwyczaj nie musi być dostosowywana z domyślnej, ale można ją obniżyć, aby odfiltrować jasne cząstki lub ograniczyć wykrywanie fluorescencji do węższego zakresu.
      2. Kliknij przycisk Dalej.
    2. Kliknij zakładkę Kolor czerwony, aby załadować dane dla tego kanału i wyświetlić bieżące odcięcia. Ponownie, badając plamkę kontroli ujemnej izotypu, można zaobserwować zdarzenia detekcji o bardzo niskiej intensywności fluorescencji; W takim przypadku użytkownicy powinni zazwyczaj spodziewać się ustawienia koloru czerwonego w zakresie 300-400 AU. Postępuj zgodnie z tymi samymi procedurami, co w krokach 9.6.1.1-9.6.1.3.
    3. Kliknij zakładkę Kolor niebieski, aby załadować dane dla tego kanału i wyświetlić bieżące odcięcia. Ponownie, badając punkt kontroli ujemnej izotypu, postępuj zgodnie z tymi samymi procedurami, jak opisano w krokach 9.6.1.1-9.6.1.3.
      UWAGA: Niebieski kanał jest wyjątkowy, ponieważ przeciwciało w plamce jest autofluorescencyjne na wystarczającym poziomie, aby wymagać nieco wyższej wartości odcięcia 400-700 j.a., nawet w przypadku ślepych chipów.
  7. Po zakończeniu analizy odcięcia kliknij przycisk Dalej, a pojawi się wykres mapy cieplnej, który da przegląd wiązania cząstek w całym eksperymencie. Istnieje kilka narzędzi do wizualizacji, których użytkownik może użyć do wykreślenia danych. Te wykresy i powiązane z nimi dane surowe można dodać do raportu, klikając przycisk Dodaj raport wykresu.
    UWAGA: Mapa cieplna jest domyślnym wyświetlaczem danych, który pokazuje widok wszystkich próbek, wszystkich przechwytywań określonego wykrywania. Domyślnym wyświetlaczem jest suma, która określa ilościowo unikalne EV powiązane z każdym punktem przechwytywania.
  8. Kliknij przycisk Eksportuj raport i wybierz lokalizację zapisu raportu.
    UWAGA: Raport otworzy się w przeglądarce. Znajdź plik arkusza kalkulacyjnego Filtrowana lista cząstek dołączony do raportu; są to informacje, które należy przesłać do EVTRACK.
  9. Kontynuuj dodawanie raportów, korzystając z różnych opcji Próbki i Typy przechwytywania w menu rozwijanych u góry ekranu. Wyświetlane dane są kontrolowane za pomocą przycisków wykrywania kanałów w lewym górnym rogu. Ustaw konkretny fenotyp/wybór próbki/kanał przechwytywania, klikając każdy przycisk koloru, aby wyłączyć ten kanał wykrywania (wyszarzony) lub włączony (kolorowy).
  10. Kliknij przycisk Dodaj wykres do raportu, aby zagregować żądane wykresy w raporcie.
  11. Kliknij Eksportuj raport i zdefiniuj lokalizację zapisu raportu końcowego.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 7 (lewy panel) pokazuje trójkolorowy obraz kompozytowy EV pochodzących z nośników kondycjonowanych HEK293 związanych z miejscem CD63 na chipie i zabarwionych dla CD81, CD63 i CD9 w następujących kanałach odpowiednio na zielono, czerwono i niebiesko. Rysunek 7 (prawy górny panel) to powiększony obraz, który pokazuje, że każdy z przechwyconych EV może wyświetlać kolokalizację jednego lub więcej kolorów o różnej intensywności w każdym kanale. Różnica w barw...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecne metody charakteryzacji EV w dużej mierze opierają się na oczyszczonych EV, co jest ograniczone przez obecne ograniczenia eksperymentalne metod oczyszczania EV 9,10,11,12,13. Interferometryczne obrazowanie odbicia pojedynczej cząstki (SP-IRIS) to skuteczna technologia, która może wyeliminować etapy oczyszczania wymagane do analizy próbki, a tym samym zao...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Clayton Deighan i George Daaboul są pracownikami i udziałowcami NanoView Biosciences Inc.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była częściowo sponsorowana przez University of Kansas School of Medicine Research Equipment and Resource Procurement Award Program. PCG, LKC, FD i AR otrzymały wsparcie ze środków NIA R21 AG066488-01.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10-centymetrowa sterylna szalka PetriegoFisherFB0875712
15 ml sterylna probówkabezróżnych
24-dołkowych płytek do hodowli komórkowych, płaskie dnoFisher08-772-1
Roztwór blokującyNanoView BiosciencesEV-TETRA-CMożna znaleźć w ExoView Human Tetraspanin Kit.
Pliki chipoweNanoView BiosciencesEV-TETRA-Cmożna znaleźć w ExoView Human Tetraspanin Kit.
ChipyNanoView BiosciencesEV-TETRA-Cmożna znaleźć w ExoView Human Tetraspanin Kit.
ChuckNanoView BiosciencesEV-TETRA-Cmożna znaleźć w zestawie ExoView Human Tetraspanin Kit.
Corning Easy Grip Jednorazowe sterylne butelki polistyrenowe 250 mlFisher09-761-4
Corning Easy Grip Jednorazowe sterylne butelki polistyrenowe 500 mlFisher09-761-10
Woda dejonizowana (DI)
z końcówkami z włókna węglowegoFisher50-193-0842
ExoView Zestawtetraspaniny dla ludziNanoView BiosciencesEV-TETRA-CCapture dla hCD81, hCD9, hCD63, IgG Control
 + barwienia dla hEV-A (hEV-CD63-647, hEV-CD81-555, hEV-CD9-488) 16 chipów w zestawie
Imager ExoView R100NanoView BiosciencesEV-R100z kamerą o wysokiej specyfikacji, z 3 kolorowymi fluorescencyjnymi i bezznacznikowymi rozmiarami i liczeniem pęcherzyków zewnątrzkomórkowych
Przeciwciało IgG huma CD9 z fluorescencyjnymi etykietamiNanoView BiosciencesEV-TETRA-Cmożna znaleźć w zestawie ExoView Human Tetraspanin Kit.
Fluorescencyjnie labione ludzkie przeciwciało IgG CD63NanoView BiosciencesEV-TETRA-CMożna znaleźć w zestawie ExoView Human Tetraspanin Kit.
Fluorescencyjnie wykrywane ludzkie przeciwciało IgG CD81NanoView BiosciencesEV-TETRA-CMożna znaleźć w zestawie ExoView Human Tetraspanin Kit.
Roztwór do inkubacjiNanoView BiosciencesEV-TETRA-Cmożna znaleźć w ExoView Human Tetraspanin Kit.
Wytrząsarka orbitalna lub wytrząsarka do mikropłytek z ustawieniami cyfrowymi zdolna do wytrząsania z prędkością 500 obr./minnie dotyczyróżnych
Uszczelka płytkowaNanoView BiosciencesEV-TETRA-CMożna znaleźć w ExoView Human Tetraspanin Kit.
Rozwiązanie NanoViewBiosciencesEV-TETRA-Cmożna znaleźć w zestawie ExoView Human Tetraspanin Kit.
Rozwiązanie BNanoView BiosciencesEV-TETRA-Cmożna znaleźć w ExoView Human Tetraspanin Kit.
Rozwiązanie CNanoView BiosciencesEV-TETRA-Cmożna znaleźć w zestawie ExoView Human Tetraspanin Kit.
Rozwiązanie DNanoView BiosciencesEV-TETRA-Cmożna znaleźć w ExoView Human Tetraspanin Kit.
Pęseta z kwadratową/płaską końcówkąFisher50-239-62
Pęseta typu Boley prostaFisher16-100-124
Thermo Scientific Samoprzylepne uszczelki płytkowe do PCRFisherAB-0558
Pęseta w stylu EMS Fisher LC267404 Mikroskop interferometryczny

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Maas, S. L. N., Breakefield, X. O., Weaver, A. M. Extracellular vesicles: Unique intercellular delivery vehicles. Trends in Cell Biology. 27 (3), 172-188 (2017).
  2. Shah, R., Patel, T., Freedman, J. E. Circulating extracellular vesicles in human disease. The New England Journal of Medicine. 379 (10), 958-966 (2018).
  3. Deng, F., Miller, J. A review on protein markers of exosome from different bio-resources and the antibodies used for characterization. Journal of Histotechnology. 42 (4), 226-239 (2019).
  4. Cohen, O., et al. ’Golden’ exosomes as delivery vehicles to target tumors and overcome intratumoral barriers: in vivo tracking in a model for head and neck cancer. Biomaterials Science. 9 (6), 2103-2114 (2021).
  5. Han, Y., et al. Overview and update on methods for cargo loading into extracellular vesicles. Processes (Basel). 9 (2), 356(2021).
  6. Lee, M., Im, W., Kim, M. Exosomes as a potential messenger unit during heterochronic parabiosis for amelioration of Huntington's disease. Neurobiology of Disease. 155, 105374(2021).
  7. Sun, B., et al. Characterization and biomarker analyses of post-COVID-19 complications and neurological manifestations. Cells. 10 (2), 386(2021).
  8. Jiang, L., Gu, Y., Du, Y., Liu, J. Exosomes: Diagnostic biomarkers and therapeutic delivery vehicles for cancer. Molecular Pharmaceutics. 16 (8), 3333-3349 (2019).
  9. Bachurski, D., et al. Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis - An accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1596016(2019).
  10. Carmicheal, J., et al. Label-free characterization of exosome via surface enhanced Raman spectroscopy for the early detection of pancreatic cancer. Nanomedicine. 16, 88-96 (2019).
  11. Greening, D. W., Xu, R., Ji, H., Tauro, B. J., Simpson, R. J. A protocol for exosome isolation and characterization: evaluation of ultracentrifugation, density-gradient separation, and immunoaffinity capture methods. Methods in Molecular Biology. 1295, 179-209 (2015).
  12. Wu, Y., Deng, W., Klinke, D. J. Exosomes: improved methods to characterize their morphology, RNA content, and surface protein biomarkers. The Analyst. 140 (19), 6631-6642 (2015).
  13. van de Vlekkert, D., Qiu, X., Annunziata, I., d'Azzo, A. Isolation and characterization of exosomes from skeletal muscle fibroblasts. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), (2020).
  14. Ayala-Mar, S., Donoso-Quezada, J., Gallo-Villanueva, R. C., Perez-Gonzalez, V. H., Gonzalez-Valdez, J. Recent advances and challenges in the recovery and purification of cellular exosomes. Electrophoresis. 40 (23-24), 3036-3049 (2019).
  15. Daaboul, G. G., et al. Digital detection of exosomes by interferometric imaging. Scientific Reports. 6, 37246(2016).
  16. Pohler, K. G., et al. Circulating microRNA as candidates for early embryonic viability in cattle. NMolecular Reproduction and Development. 84 (8), 731-743 (2017).
  17. NanoView Biosciences. ExoView R100 User Guide. v240.4. NanoView Biosciences. , 202(2021).
  18. Daaboul, G. G., et al. Enhanced light microscopy visualization of virus particles from Zika virus to filamentous ebolaviruses. PLoS One. 12, 0179728(2017).
  19. ET Consortium. EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research. Nature Methods. 14, 228-232 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Extracellular VesiclesEV CharacterizationSingle Particle ImagingInterferometric ReflectanceEV Population DynamicsEV BiomarkersEV Size AnalysisEV PhenotypingLipid Bilayer VesiclesCell Communication
Video Coming Soon

Related Articles