Ten protokół przedstawia interferometryczne obrazowanie odbicia pojedynczej cząstki, które jest przeznaczone do wielopoziomowych i kompleksowych pomiarów wielkości pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV), liczby EV, fenotypu EV i kolokalizacji biomarkerów EV.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Obrazowanie interferometryczne pojedynczej cząstki: charakterystyka poszczególnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych i dynamiki populacji
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) to nanometrowe pęcherzyki z dwuwarstwą lipidową, które są wydzielane przez większość komórek. EV przenoszą wiele różnych cząsteczek biologicznych, w tym białka, lipidy, DNA i RNA, i postuluje się, że ułatwiają komunikację między komórkami w różnych tkankach i narządach. W ostatnim czasie pojazdy elektryczne cieszą się dużym zainteresowaniem jako biomarkery w diagnostyce i środkach terapeutycznych w różnych chorobach. Opracowano wiele metod charakteryzowania EV. Jednak obecne metody analizy EV mają różne ograniczenia. W związku z tym opracowanie wydajnych i skutecznych metod izolacji i charakterystyki pojazdów elektrycznych pozostaje jednym z kluczowych kroków w tej nowatorskiej dziedzinie badawczej w miarę jej dojrzewania. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół przedstawiający jednocząsteczkowy interferometryczny czujnik obrazowania odbicia (SP-IRIS), jako metodę, która jest w stanie wykryć i scharakteryzować EV z nieoczyszczonych źródeł biologicznych i oczyszczonych EV za pomocą innych metodologii. Ta zaawansowana technika może być wykorzystywana do wielopoziomowych i kompleksowych pomiarów do analizy wielkości EV, liczby EV, fenotypu EV i kolokalizacji biomarkerów.
Wprowadzenie
Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) to nanometrowe pęcherzyki błonowe pochodzenia komórkowego, które można wyizolować z wielu płynów biologicznych, w tym z krwi, mleka kobiecego, śliny, moczu, żółci, soku trzustkowego oraz płynu mózgowo-rdzeniowego i otrzewnowego. Powstawanie EVs zachodzi poprzez trzy główne mechanizmy: apoptoza, uwalnianie poprzez fuzja ciał wielopęcherzykowych z błoną komórkową oraz pęcherzykowanie błony komórkowej1Dowody na przekazywanie przez pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) komponentów komórek dawcy do komórek i tkanek sąsiednich lub odległych sugerują, że te zamknięte w błonie pakiety mogą odgrywać istot....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Próbki surowicy pobrano od myszy zgodnie z zatwierdzonym protokołem Instytucjonalnej Komisji Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w University of Kansas Medical Center (KUMC). Wykorzystanie tych próbek biologicznych w przeprowadzonych eksperymentach zostało również zatwierdzone przez KUMC.
1. Przygotowanie próbek (Dzień 1)
- Wyznacz stężenie EV, wykorzystując śledzenie nanocząsteczek lub równoważną technikę.
- Rozcieńcz próbkę w roztworze inkubacyjnym do stężenia 5 x 107-5 x 108 EVs/mL; wymagana jest objętość minimum 50 µL.
UWAGA: W przypadku próbek o nieznanym stężeniu EV, jako....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rycina 7 (panel lewy) przedstawia trójkolorowy obraz kompozytowy pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EVs) pochodzących z pożywki kondycjonowanej komórek HEK293, związanych z punktem CD63 na chipie i barwionych pod kątem CD81, CD63 oraz CD9 odpowiednio w kanałach zielonym, czerwonym i niebieskim. Rycina 7 (panel prawy górny) to powiększony obraz pokazujący, że każdy z wychwyconych EVs może wykazywać kooperację jednego lub więcej kolorów o różnej intensywności w każd.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Obecne metody charakteryzacji EV w dużej mierze opierają się na oczyszczonych EV, co jest ograniczone przez obecne ograniczenia eksperymentalne metod oczyszczania EV 9,10,11,12,13. Interferometryczne obrazowanie odbicia pojedynczej cząstki (SP-IRIS) to skuteczna technologia, która może wyeliminować etapy oczyszczania wymagane do analizy próbki, a tym samym zao.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Clayton Deighan i George Daaboul są pracownikami i udziałowcami NanoView Biosciences Inc.
Podziękowania
Ta praca była częściowo sponsorowana przez University of Kansas School of Medicine Research Equipment and Resource Procurement Award Program. PCG, LKC, FD i AR otrzymały wsparcie ze środków NIA R21 AG066488-01.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 10-centymetrowa sterylna szalka Petriego | Fisher | FB0875712 | |
| 15 ml sterylna probówka | bez | różnych | |
| 24-dołkowych płytek do hodowli komórkowych, płaskie dno | Fisher | 08-772-1 | |
| Roztwór blokujący | NanoView Biosciences | EV-TETRA-C | Można znaleźć w ExoView Human Tetraspanin Kit. |
| Pliki chipowe | NanoView Biosciences | EV-TETRA-C | można znaleźć w ExoView Human Tetraspanin Kit. |
| Chipy | NanoView Biosciences | EV-TETRA-C | można znaleźć w ExoView Human Tetraspanin Kit. |
| Chuck | NanoView Biosciences | EV-TETRA-C | można znaleźć w zestawie ExoView Human Tetraspanin Kit. |
| Corning Easy Grip Jednorazowe sterylne butelki polistyrenowe 250 ml | Fisher | 09-761-4 | |
| Corning Easy Grip Jednorazowe sterylne butelki polistyrenowe 500 ml | Fisher | 09-761-10 | |
| Woda dejonizowana (DI) | |||
| z końcówkami z włókna węglowego | Fisher | 50-193-0842 | |
| ExoView Zestaw | tetraspaniny dla ludziNanoView Biosciences | EV-TETRA-C | Capture dla hCD81, hCD9, hCD63, IgG Control + barwienia dla hEV-A (hEV-CD63-647, hEV-CD81-555, hEV-CD9-488) 16 chipów w zestawie |
| Imager ExoView R100 | NanoView Biosciences | EV-R100 | z kamerą o wysokiej specyfikacji, z 3 kolorowymi fluorescencyjnymi i bezznacznikowymi rozmiarami i liczeniem pęcherzyków zewnątrzkomórkowych |
| Przeciwciało IgG huma CD9 z fluorescencyjnymi etykietami | NanoView Biosciences | EV-TETRA-C | można znaleźć w zestawie ExoView Human Tetraspanin Kit. |
| Fluorescencyjnie labione ludzkie przeciwciało IgG CD63 | NanoView Biosciences | EV-TETRA-C | Można znaleźć w zestawie ExoView Human Tetraspanin Kit. |
| Fluorescencyjnie wykrywane ludzkie przeciwciało IgG CD81 | NanoView Biosciences | EV-TETRA-C | Można znaleźć w zestawie ExoView Human Tetraspanin Kit. |
| Roztwór do inkubacji | NanoView Biosciences | EV-TETRA-C | można znaleźć w ExoView Human Tetraspanin Kit. |
| Wytrząsarka orbitalna lub wytrząsarka do mikropłytek z ustawieniami cyfrowymi zdolna do wytrząsania z prędkością 500 obr./min | nie dotyczy | różnych | |
| Uszczelka płytkowa | NanoView Biosciences | EV-TETRA-C | Można znaleźć w ExoView Human Tetraspanin Kit. |
| Rozwiązanie NanoView | Biosciences | EV-TETRA-C | można znaleźć w zestawie ExoView Human Tetraspanin Kit. |
| Rozwiązanie B | NanoView Biosciences | EV-TETRA-C | można znaleźć w ExoView Human Tetraspanin Kit. |
| Rozwiązanie C | NanoView Biosciences | EV-TETRA-C | można znaleźć w zestawie ExoView Human Tetraspanin Kit. |
| Rozwiązanie D | NanoView Biosciences | EV-TETRA-C | można znaleźć w ExoView Human Tetraspanin Kit. |
| Pęseta z kwadratową/płaską końcówką | Fisher | 50-239-62 | |
| Pęseta typu Boley prosta | Fisher | 16-100-124 | |
| Thermo Scientific Samoprzylepne uszczelki płytkowe do PCR | Fisher | AB-0558 |
Bibliografia
- Maas, S. L. N., Breakefield, X. O., Weaver, A. M. Extracellular vesicles: Unique intercellular delivery vehicles. Trends in Cell Biology. 27 (3), 172-188 (2017).
- Shah, R., Patel, T., Freedman, J. E. Circulating extracellular vesicles in human disease. The New E....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
