Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Obrazowanie interferometryczne pojedynczej cząstki: charakterystyka poszczególnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych i dynamiki populacji

1.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62988

⸱

10 stycznia 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Kansas Medical Center, 2NanoView Biosciences

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół przedstawia interferometryczne obrazowanie odbicia pojedynczej cząstki, które jest przeznaczone do wielopoziomowych i kompleksowych pomiarów wielkości pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV), liczby EV, fenotypu EV i kolokalizacji biomarkerów EV.

Streszczenie

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) to nanometrowe pęcherzyki z dwuwarstwą lipidową, które są wydzielane przez większość komórek. EV przenoszą wiele różnych cząsteczek biologicznych, w tym białka, lipidy, DNA i RNA, i postuluje się, że ułatwiają komunikację między komórkami w różnych tkankach i narządach. W ostatnim czasie pojazdy elektryczne cieszą się dużym zainteresowaniem jako biomarkery w diagnostyce i środkach terapeutycznych w różnych chorobach. Opracowano wiele metod charakteryzowania EV. Jednak obecne metody analizy EV mają różne ograniczenia. W związku z tym opracowanie wydajnych i skutecznych metod izolacji i charakterystyki pojazdów elektrycznych pozostaje jednym z kluczowych kroków w tej nowatorskiej dziedzinie badawczej w miarę jej dojrzewania. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół przedstawiający jednocząsteczkowy interferometryczny czujnik obrazowania odbicia (SP-IRIS), jako metodę, która jest w stanie wykryć i scharakteryzować EV z nieoczyszczonych źródeł biologicznych i oczyszczonych EV za pomocą innych metodologii. Ta zaawansowana technika może być wykorzystywana do wielopoziomowych i kompleksowych pomiarów do analizy wielkości EV, liczby EV, fenotypu EV i kolokalizacji biomarkerów.

Wprowadzenie

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) to nanometrowe pęcherzyki błonowe pochodzenia komórkowego, które można wyizolować z wielu płynów biologicznych, w tym z krwi, mleka kobiecego, śliny, moczu, żółci, soku trzustkowego oraz płynu mózgowo-rdzeniowego i otrzewnowego. Powstawanie EVs zachodzi poprzez trzy główne mechanizmy: apoptoza, uwalnianie poprzez fuzja ciał wielopęcherzykowych z błoną komórkową oraz pęcherzykowanie błony komórkowej1Dowody na przekazywanie przez pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) komponentów komórek dawcy do komórek i tkanek sąsiednich lub odległych sugerują, że te zamknięte w błonie pakiety mogą odgrywać istotną rolę w kaskadach sygnalizacyjnych parakrynnych, a także w sygnalizacji długodystansowej lub endokrynnej.1,2,3Ponieważ pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) mogą dostarczać obrazu fenotypu komórki, potencjał ich wykorzystania jako narzędzi diagnostycznych i terapeutycznych w leczeniu różnych chorób stał się aktywnym obszarem badań4,5,6,7,8.

Opracowano wiele metod mających na celu charakterystykę EV9,10,11,12,13. Większość z tych metod dostarcza unikalnych i cennych informacji o populacjach EV przede wszystkim w analizie zbiorczej. Chociaż część tych technik pozwala na uzyskanie szczegółowych danych na temat substancji wewnątrz lub na pojedynczych EV, charakterystyka na poziomie pojedynczego EV może wiązać się z pewnymi ograniczeniami. Na przykład immunomikroskopia elektronowa może być wykorzystana do badania pojedynczych EV i ich składu, jednak technika ta charakteryzuje się niską przepustowością, jest poważnie ograniczona w możliwości opisywania dynamiki populacji i wymaga znaczącego rozwoju metodologicznego14.

W ostatnim czasie rozwój i komercjalizacja techniki czujnika obrazowania interferencyjnego odblasku pojedynczych cząsteczek (SP-IRIS), poprzez platforma ExoView umożliwiła indywidualną charakterystykę pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) dzięki zastosowaniu rutynowej i prostej zautomatyzowanej metody gromadzenia danych. Rdzeniem tej technologii jest chip, czyli płytka krzemowa Si/SiO o wymiarach 1 cm x 1 cm2 warstwa podwójna, która umożliwia interferometryczny pomiar pojedynczych nanopartykuł biologicznych. Chip jest wypełniony mikroprzewodnią macierzą pojedynczych, funkcjonalizowanych plamek przeciwciał, co pozwala na multipleksową detekcję do sześciu różnych typów wychwytu. Standardowe chipy zawierają powszechne markery tetraspaniny (CD81, CD63 i CD9) służące do wychwytu podczas etapu inkubacji, a użytkownik może dodać dodatkowe, niestandardowe plamki wychwytujące w celu izolacji odrębnych populacji EV poza tetraspaninami. Po etapie inkubacji każda plamka wychwytująca wiąże wiele EV wykazujących ekspresję odpowiedniego markera. Tak uchwycone EV mogą zostać następnie poddane prostemu przemyciu, wysuszeniu i przeskanowaniu w czytniku w celu ilościowego oznaczenia rozmiaru pęcherzyków związanych z plamką wychwytującą w zakresie 50–200 nm, co pozwala uzyskać rozkład wielkości ważony liczbą cząstek. poprzez SP-IRIS15System oferuje również trzy kanały detekcji fluorescencyjnej do immunoznakowania wychwyconych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV), dostarczając zarówno średniej intensywności fluorescencji, która – w przeciwieństwie do pomiarów SP-IRIS – nie jest ograniczona rozmiarem, jak i informacji o kolokalizacji dla każdego barwnika fluorescencyjnego. Pozwala to użytkownikowi na definiowanie populacji pojedynczych EV na podstawie obecności czterech różnych biomarkerów w każdym pęcherzyku (wychwyt oraz trzy znaczniki immunofluorescencyjne). Możliwości systemu wykraczają poza pomiar białek powierzchniowych za pomocą immunofluorescencji, ponieważ opcjonalny protokół analizy ładunku (cargo) pozwala użytkownikowi na badanie białek wewnętrznych wychwyconych EV oraz epitopów luminalnych powierzchniowych markerów błonowych, a także na sprawdzenie integralności błony EV. W niniejszym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół opisujący kroki niezbędne do uzyskania spójnych danych dotyczących wielkości i liczby EV, z uwzględnieniem do czterech różnych biomarkerów na poziomie pojedynczego EV w dużych populacjach pęcherzyków. Technika ta może być stosowana zarówno w przypadku nieprzetworzonych płynów biologicznych, jak i EV izolowanych za pomocą dowolnej liczby technik, takich jak ultrawirowanie, ultrafiltracja, środki wytrącające, wychwyt immunoafinicyjny, mikroprzepływy oraz chromatografia wykluczania.

Opisany poniżej protokół wykorzystuje pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) pochodzące z pośrodka hodowli komórek HEK 293 oraz z surowicy mysiej, z zastosowaniem uznanej metody izolacji16. Protokół ten był stosowany w przypadku wielu innych płynów biologicznych, pośrodków hodowli komórkowych oraz oczyszczonych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych izolowanych z płynów biologicznych. Protokół ten jest podzielony na dwudniową procedurę, a schemat typowego eksperymentu przedstawiono na Rysunku 1.

Schemat inkubacji próbek, barwienia IF i płukania chipa; diagram procesu dla technik znakowania.
Rysunek 1: Schemat analizy. Schemat analizy w celu wyboru rodzaju analizy do przeprowadzenia dla próbki spośród: wielkości i liczebności, wielkości, liczebności i barwienia powierzchniowego oraz wielkości, liczebności i barwienia ładunku. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Próbki surowicy pobrano od myszy zgodnie z zatwierdzonym protokołem Instytucjonalnej Komisji Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w University of Kansas Medical Center (KUMC). Wykorzystanie tych próbek biologicznych w przeprowadzonych eksperymentach zostało również zatwierdzone przez KUMC.

1. Przygotowanie próbek (Dzień 1)

  1. Wyznacz stężenie EV, wykorzystując śledzenie nanocząsteczek lub równoważną technikę.
  2. Rozcieńcz próbkę w roztworze inkubacyjnym do stężenia 5 x 107-5 x 108 EVs/mL; wymagana jest objętość minimum 50 µL.
    UWAGA: W przypadku próbek o nieznanym stężeniu EV, jako miarę zastępczą można zastosować całkowitą zawartość białka na poziomie 1 µg/mL. Jeśli spodziewane jest niskie stężenie próbki, przed nałożeniem należy wykonać rozcieńczenie w roztworze inkubacyjnym w stosunku co najmniej 1:1.
  3. Umieść płytkę 24-dołkową na płaskiej powierzchni, wolnej od wibracji i gwałtownych ruchów.
    UWAGA: Aby zwiększyć kontrast, pod płytką można położyć białą kartkę papieru.
  4. Dodaj wodę w obszarach wokół dołków (Rycyna 2).

Schemat płytki mikrotitracyjnej z niebieskim barwnikiem wizualizującym rozkład ddH2O w konfiguracji eksperymentu z hodowlą tkankową.
Rysunek 2: Układ płytki 24-dołkowej. Przedstawiono miejsca odpipowania ddH2O (niebieski barwnik dodano wyłącznie w celu wizualizacji) oraz dołki, w których będą umieszczone chipy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

2. Przygotowanie i wstępne skanowanie płytek

  1. Wyjmij zapieczętowaną płytkę 48-dołkową zawierającą chipy z lodówki o temperaturze 4-8 °C i pozwól im osiągnąć temperaturę pokojową (~15 min) przed zdjęciem zapieczętowania.
    UWAGA: Jest to niezbędne, aby uniknąć kondensacji pary wodnej na chipach, co mogłoby uszkodzić plamki. Jeśli po wyjęciu chipu z opakowania na jego powierzchni zostanie zauważona kondensacja, odczekaj dłużej przed wyjmowaniem pozostałych płytek.
  2. Przejdź do kroku 8, aby pobrać uchwyt w celu przygotowania do skanowania wstępnego (Rysunek 3).
    UWAGA: Dane ze skanowania wstępnego zostaną wykorzystane do identyfikacji wszelkich cząsteczek wykrywalnych na plamkach wychwytujących przed inkubacją z próbką, aby można było je usunąć podczas etapu analizy.

Taca do odlewania żelu elektroforetycznego; przygotowanie do rozdziału DNA; technika laboratoryjna; schemat edukacyjny.
Rysunek 3: Zdjęcie uchwytu służącego do ładowania chipa do urządzenia. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

  1. Za pomocą pęsety wyjmij z płytki 48-dołkowej odpowiednią liczbę chipów (jeden chip na próbkę) i załaduj je bezpośrednio do uchwytu do skanowania wstępnego. Gdy wszystkie chipy przeznaczone do eksperymentu zostaną załadowane i przeskanowane zgodnie z opisem w kroku 8, przejdź do kroku 2.4.
    UWAGA: Podczas manipulowania chipami należy uważać, aby nie dotykać kwadratów w centrum, ponieważ w tym obszarze znajdują się punkty wychwytywania przeciwciał, które mogą zostać uszkodzone przez pęsetę (Rysunek 4).

Obraz mikroskopowy procesu wyrównywania komponentów optycznych za pomocą pęsety, pokazujący prawidłowe ustawienie.
Rysunek 4: Chip i prawidłowa obsługa chipa. (A) Żółta przerywana linia wskazuje miejsce naniesienia przeciwciał, czyli funkcjonalną stronę chipa. Identyfikator chipa znajduje się poniżej linii („58”). Rysunek przedstawia również prawidłowy sposób obchodzenia się z chipem. (B>) Przedstawia niewłaściwą obsługę chipa. (C) Niefunkcjonalna strona chipa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Umieść każdy wcześniej przeskanowany chip powierzchnią funkcjonalizowaną do góry w odpowiednio przygotowanej płytce 24-dołkowej. Powierzchnia funkcjonalizowana jest łatwo rozpoznawalna dzięki charakterystycznemu numerowaniu, siatkom wyrównawczym oraz trzem czarnym polom w środku. Strona niefunkcjonalizowana to płaska, srebrna, jednolita powierzchnia.
  2. Użyj pęsety z cienkimi końcówkami, aby upewnić się, że każdy chip znajduje się w centrum dołka (Rysunek 5).
    UWAGA: Centrowanie chipa w dołku jest kluczowe, ponieważ jeśli chip dotknie ścianki dołka, próbka może zostać odciągnięta po nałożeniu.

Analiza chipa mikroprzepływowego; obraz A pokazuje prawidłowe wyrównanie z markerami, obraz B pokazuje brak wyrównania.
Rycina 5: Demonstracja prawidłowego umieszczenia chipa w dołku. (A) Chipy powinny być umieszczone na środku dołka, tak aby ich rogi nie dotykały ścianek dołka. (B) Przedstawienie nieprawidłowego umieszczenia chipa, w którym rogi dotykają ścianek dołka. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

3. Załadowanie i inkubacja chipa oraz próbki

  1. Pipeta 35 µL przygotowanej próbki (z kroku 1) na chip.
    UWAGA: Należy uważać, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza i nie dotknąć końcówką pipety chipa, ponieważ może to uniemożliwić równomierną dystrybucję próbki na chipie lub uszkodzić naniesione na niego plamki przeciwciał. Próbka powinna rozprzestrzenić się na całej powierzchni chipa. W przypadku odpłynięcia próbki z chipa podczas ładowania należy dodać do dołka dodatkową próbkę, aż do osiągnięcia objętości 250 µL lub dodać roztwór inkubacyjny do poziomu 250 µL i zanotuj zmieniony czynnik rozcieńczenia dla tej próbki.
  2. Uszczelnij płytkę, używając dołączonej do zestawu folii ochronnej, aby zapobiec odparowywaniu próbki.
  3. Inkubować próbkę/chip przez noc (~16 h) w szczelnie zamkniętej płytce w temperaturze pokojowej, w miejscu wolnym od wibracji i ruchu.
    UWAGA: Po inkubacji przez noc użytkownik wybierze odpowiednią opcję dla drugiego dnia (Day 2), zależnie od celu badawczego. Jeśli pożądane jest wyznaczenie jedynie wielkości i liczby EV, należy przejść do krok 4 (dzień 2)Jeśli pożądana jest analiza wielu markerów powierzchniowych, należy przejść do krok 5 (dzień 2).

4. Oznaczanie wielkości i liczby EV (Dzień 2)

  1. Dodaj 1 mL roztworu A na ściankę każdego dołka zawierającego chip, uważając, aby nie wlewać roztworu bezpośrednio na chip i nie zarysować go końcówką pipety.
  2. Umieść płytkę na inkubatorze orbitalnym obracającym się z prędkością ~500 rpm przez 3 min w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Jeśli chipy grzechoczą na płytce, natychmiast zmniejsz prędkość tak, aby ciecz wirowała, ale nie dochodziło do grzechotania.
  3. Odbierz 750 µL cieczy. Unikaj przechylania płytki podczas usuwania cieczy, aby zapobiec przypadkowemu wyschnięciu chipa.
  4. Dodaj 750 µL roztworu B, stosując technikę opisaną w kroku 4.1, i mieszaj przy ~500 rpm przez 3 min w temperaturze pokojowej.
  5. Powtórz kroki 4.3-4.4 jeszcze dwukrotnie, aby w sumie przeprowadzić trzy przemycia roztworem B.
  6. Po zakończeniu ostatniego przemycia odbierz 750 µL roztworu, pozostawiając w dołku 250 µL roztworu B.
  7. Dodaj 750 µL podwójnie destylowanej wody (ddH2O) i mieszaj przy ~500 rpm przez 3 min w temperaturze pokojowej.
  8. Napełnij szalkę Petriego o średnicy 10 cm 50 mL ddH2O i przenoś po jednym chipie z dołka do szalki za pomocą pęsety.
    UWAGA: Należy przenieść chip poziomo i dopilnować, aby nie wyschnął. Przed wymianą ddH2O można przemyć do ośmiu chipów.
  9. W ddH2O trzymaj chip za krawędzie pęsetą i obracaj w szalce przez trzy pełne obroty, aby usunąć zanieczyszczenia.
  10. Wyjmij chip z wody pod kątem 45° i połóż go na papierze chłonnym identyfikatorem chipa skierowanym do góry (Rysunek 6).
    UWAGA: Chipy są teraz gotowe do odczytu. Przejdź do kroku 8 w celu skanowania czytnikiem SP-IRIS.

Układ do badania szalki Petriego z pęsetą; proces manipulacji materiałem i obserwacji próbki.
Rysunek 6: Prawidłowy sposób wyjmowania chipa z wody ddH2O pod kątem 45°. (A) Widok z góry oraz (B) widok z boku demonstrujący kąt, pod którym należy wyjąć chip. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

5. Przygotowanie roztworu przeciwciał (Dzień 2)

  1. Do probówki o odpowiedniej pojemności (od 0,5 do 3 mL) wlej 300 µL roztworu blokującego na jeden chip.
  2. Dodaj 0,6 µL przeciwciała na każde 300 µL roztworu blokującego. Delikatnie wymieszaj, opukując probówkę, a następnie krótko wiruj.
    UWAGA: Przeciwciała przeciw ludzkim antygenom CD9, CD81 i CD63 lub mysim CD9, CD81 i CD63 są zawarte w odpowiednich zestawach. W przypadku chęci użycia innych przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie, należy określić optymalne stężenie barwienia, wykonując typową miareczkę w zakresie od 0,1 do 10 µg/mL przy stałym obciążeniu próbki, analogicznie do procedury dla cytometrii przepłyewowej.

6. Wyznaczanie wielkości i liczby EV oraz ich fenotypowanie za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego

  1. Do ścianki każdego dołka zawierającego chip dodaj 1 mL Roztworu A, uważając, aby nie wlewać roztworu bezpośrednio na chip i nie zarysować go końcówką pipety.
  2. Umieść płytkę na wytrząsarce orbitalnej przy prędkości ~500 rpm przez 3 min w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Jeśli chipy grzechoczą na płytce, natychmiast zmniejsz prędkość tak, aby ciecz wirowała, ale nie dochodziło do grzechotania.
  3. Odsącz 750 µL cieczy. Unikaj przechylania płytki podczas usuwania cieczy, aby zapobiec przypadkowemu wyschnięciu chipa.
  4. Dodaj 750 µL Roztworu A, stosując technikę opisaną w kroku 6.1, i wytrząsaj przy ~500 rpm przez 3 min w temperaturze pokojowej.
  5. Powtórz kroki 6.3 i 6.4 dwukrotnie, aby uzyskać łącznie trzy płukania Roztworem A.
  6. Po ostatnim płukaniu usuń 750 µL roztworu, pozostawiając w dołku 250 µL Roztworu A.
    UWAGA: Jeśli użytkownik chce wykonać barwienie ładunku (Cargo Staining), należy przejść do kroku 7. W przeciwnym razie należy przejść do kroku 6.7.
  7. Do każdego chipa w dołku dodaj 250 µL roztworu przeciwciał (krok 5). Przykryj płytkę folią w celu ochrony przed światłem i wytrząsaj przez 1 h na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze pokojowej.
  8. Dodaj 500 µL Roztworu A, tak aby całkowita objętość w dołku wynosiła ~1 000 µL.
  9. Natychmiast usuń 750 µL, dodaj 750 µL roztworu A i wytrząsaj przy ~500 rpm na wytrząsarce orbitalnej przez 3 min w temperaturze pokojowej.
  10. Usuń 750 µL roztworu, dodaj 750 µL Roztworu B i wytrząsaj przy ~500 rpm przez 3 min w temperaturze pokojowej.
  11. Powtórz krok 6.10 jeszcze dwukrotnie, aby uzyskać łącznie trzy płukania.
  12. Dodaj 750 µL podwójnie destylowanej wody (ddH2O) i wytrząsaj przy ~500 rpm przez 3 min w temperaturze pokojowej.
  13. Napełnij 10 cm szalkę Petriego 50 mL ddH2O i za pomocą pęsety przenieś jeden chip z dołka do szalki.
    UWAGA: Należy przenieść chip poziomo i dopilnować, aby nie wyschł. Przed wymianą na świeżą ddH2O można wypłukać do ośmiu chipów.
  14. W ddH2O trzymając chip za krawędzie pęsetą, wykonaj w szalce trzy obroty, aby usunąć zanieczyszczenia.
  15. Wyjmij chip z wody pod kątem 45° i połóż go na papierze chłonnym identyfikatorem chipa skierowanym do góry (Rysunek 6).
    UWAGA: Chipy są teraz gotowe do odczytu. Przejdź do kroku 8 (Gromadzenie danych), aby zapoznać się z instrukcjami dotyczącymi przygotowania chipów do skanowania w czytniku.

7. Opcjonalne barwienie ładunku

UWAGA: Niniejszy protokół umożliwia jednoczesne znakowanie markerów wewnątrzkomórkowych i powierzchniowych.

  1. Pozostawiając 250 µL Roztworu A w każdym dołku, dodać 250 µL Roztworu C do każdego dołka.
  2. Natychmiast umieścić na wytrząsaniu orbitalnym i ustawić prędkość na ~200 rpm dokładnie na 10 min.
    UWAGA: W tym kroku oraz w kroku 7.8 poniżej kluczowe są zarówno czas, jak i wolniejsza prędkość wytrząsania; należy upewnić się, że prędkość ta powoduje jedynie powolne wirowanie cieczy w dołkach i korzystać z czasomierza.
  3. Po 10 min inkubacji z Roztworem C dodać 500 µL Roztworu A do każdego dołka.
  4. Natychmiast usunąć 750 µL i dodać 750 µL Roztworu A, a następnie wytrząsać na wytrząsarce orbitalnej z prędkością ~500 rpm przez 3 min w temperaturze pokojowej.
  5. Powtórzyć krok 7.4 dwukrotnie, aby przeprowadzić łącznie trzy płukania.
  6. Po ostatnim płukaniu usunąć 750 µL roztworu, pozostawiając ~250 µL roztworu w dołku z chipem.
  7. Dodać 250 µL Roztworu D do każdego dołka.
  8. Natychmiast umieścić na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na ~200 rpm dokładnie na 10 min.
  9. Po 10 min inkubacji z Roztworem C dodać 500 µL Roztworu A do każdego dołka.
  10. Natychmiast usunąć 750 µL i dodać 750 µL roztworu A, a następnie wytrząsać na wytrząsarce orbitalnej z prędkością ~500 rpm przez 3 min w temperaturze pokojowej.
  11. Powtórzyć krok 7.10 dwukrotnie, aby przeprowadzić łącznie trzy płukania.
  12. Po ostatnim płukaniu usunąć 750 µL roztworu i wrócić do punktu 6.7 powyżej w celu przeprowadzenia barwienia i ukończenia protokołu analizy.

8. Gromadzenie danych

UWAGA: Procedura zbierania danych z chipów za pomocą urządzenia ExoView R100 jest zautomatyzowana i nie wymaga wprowadzania danych przez użytkownika. Szczegółowe instrukcje dotyczące ładowania nośnika chipów, tzw. „chucka”, oraz akwizycji danych znajdują się w Instrukcji Obsługi oraz w odpowiednim filmie instruktażowym17.

  1. Włącz platformę do charakteryzacji EV za pomocą dwóch przełączników zasilania znajdujących się z tyłu urządzenia, a następnie uruchom oprogramowanie skanera, klikając dwukrotnie ikonę na pulpicie.
    UWAGA: Po uruchomieniu oprogramowania skanera czytnik automatycznie przełączy się na ekran główny, a następnie wyświetli komunikat „Open the door to load chips” (Otwórz drzwiczki, aby załadować chipy).
  2. Otwórz drzwiczki z przodu czytnika, podnosząc srebrny uchwyt. Spowoduje to wysunięcie stolika, umożliwiając użytkownikowi dostęp do uchwytu oraz konfigurację nowego skanowania w oprogramowaniu.
  3. Wskaż lokalizację, w której użytkownik chce zapisać dane, klikając w Zapisz folderu i wybranie pożądanej lokalizacji zapisu danych.
    UWAGA: Często przydatne jest nadanie lokalizacji zapisu sugestywnej nazwy, na przykład nazwy eksperymentu, a następnie utworzenie dwóch podfolderów: jednego dla skanów wstępnych i jednego dla skanów końcowych. Ułatwia to odnajdywanie i dopasowywanie danych podczas analizy.
  4. Aby zeskanować chipy, należy zlokalizować pliki chipów na komputerze sterującym.
    UWAGA: Pliki chipfiles są mapami rozmieszczenia plamek przeciwciał na używanym chipie i pozwalają skanerowi określić obszary skanowania na każdym chipie. W każdym zestawie znajduje się klucz USB z plikami chipfiles dla dołączonych chipów. Po otrzymaniu zestawu należy zapisać je w lokalizacji na komputerze sterującym, w której użytkownicy będą mogli je łatwo odnaleźć.
  5. Załaduj chipy na uchwycie tak, aby numery na chipach były skierowane w stronę rączki uchwytu, a następnie z menu rozwijanego „Chip” w komputerze wybierz każdy chip z listy plików chipów i umieść go w odpowiednim, pasującym miejscu w wirtualnym uchwycie w oprogramowaniu skanera. Po zakończeniu tej czynności na ekranie pojawi się komunikat z prośbą o umieszczenie uchwytu na stole (Place the Chuck on Stage).
  6. Umieść załadowany uchwyt na stole; dzięki magnesom wyrównującym uchwyt zostanie automatycznie przesunięty w odpowiednie miejsce na stole, a następnie kliknij OK Następnie należy umieścić uchwyt na stole. Skaner rozpocznie wówczas zautomatyzowaną procedurę zbierania danych.
    UWAGA: Dane są gotowe do analizy, gdy oprogramowanie zgłosi pomyślne zakończenie skanowania każdego chipa.

9. Analiza danych

  1. Kliknij dwukrotnie ikonę ExoView Analyzer na pulpicie komputera sterującego. Po uruchomieniu oprogramowania kliknij przycisk Prescan Data i wybierz folder z zestawem danych przeskanowania wstępnego zgodnie z sekcją 8.3.
  2. Kliknij przycisk Postscan Data i wybierz folder z zestawem danych po skanowaniu zgodnie z sekcją 8.3.
    UWAGA: Jeśli dane zostaną prawidłowo wykryte w obu folderach, przynajmniej dla części chipów, oprogramowanie wyświetli liczbę „X” wykrytych chipów obok przycisku lokalizacji pliku chipa. Po prawidłowym zapisaniu liczba wykrytych chipów powinna odpowiadać liczbie chipów poddanych skanowaniu.
  3. Kliknij Next na dole obszaru ładowania danych.
  4. W rozwijanym menu tabeli meta dla każdego chipa przypisana będzie komórka. Wprowadź nazwy próbek, czynniki rozcieńczenia oraz informacje o markerach barwionych w każdym kanale detekcji, klikając w odpowiednim polu i wpisując dane; po zakończeniu ponownie kliknij Next.
    UWAGA: Te metadane zostaną zapisane wraz z danymi.
  5. Przeprowadź kontrolę jakości (QC), klikając kartę Disable pod przyciskiem QC w górnym lewym rogu.
    UWAGA: Ta funkcja pozwala na wyłączenie konkretnych sond i chipów z analizy. Oprogramowanie wyświetli dwa rodzaje ostrzeżeń dotyczących danych: jedno dla wysokich wartości zliczeń, co może wskazywać na nasycenie konkretnego przechwycenia, oraz dla wysokiego współczynnika zmienności (CV), który identyfikuje różnice między powtórzeniami danego typu przechwycenia a pozostałymi.
    1. Kliknij Warning Spot dla wysokiego CV, sprawdź punkty wskazane przez oprogramowanie i oceń, czy występuje widoczne uszkodzenie fizyczne; po zidentyfikowaniu uszkodzenia kliknij Spot Number, aby wyłączyć ten punkt w analizie.
    2. Powtarzaj czynność, aż wszystkie ostrzeżenia zostaną ocenione, a następnie kliknij Next.
  6. Przeprowadź analizę punktów odcięcia, klikając kartę Cutoff znajdującą się obok karty Disable pod przyciskiem QC w górnym lewym rogu.
    UWAGA: Funkcja ta wyświetli odpowiedź fluorescencyjną punktu kontrolnego na wykresie i zaoferuje użytkownikowi dwa ustawienia: minimum i maksimum dla każdego kanału kolorystycznego (czerwony/zielony/niebieski). Ustawienie wartości odcięcia dla każdego kanału detekcji fluorescencyjnej jest jedyną konieczną korektą danych i jest stosunkowo proste. Co istotne, wybrany końcowy punkt odcięcia powinien być spójny w obrębie całego eksperymentu i, jak wspomniano, powinien mieścić się w przybliżonych zakresach 300-400 a.u. dla koloru czerwonego i zielonego oraz 400-700 a.u. dla niebieskiego w typowych eksperymentach; oprogramowanie posiada również kolorowe wskazówki dla użytkownika dla tych zakresów.
    1. Kliknij kartę Green Color, aby załadować dane dla tego kanału i wyświetlić aktualne punkty odcięcia. Analizując punkt kontrolny negatywny izotypowy, można zauważyć zdarzenia detekcyjne o bardzo niskiej intensywności fluorescencji; w takim przypadku użytkownicy zazwyczaj powinni ustawić wartość dla koloru zielonego w zakresie 300-400 a.u.
      1. Zwiększaj wartość minimalną dla każdego z kanałów detekcji, aż parametr „Avg % Inc” (średni % wykrytych cząstek w punkcie kontrolnym powyżej punktu odcięcia) pod wyświetlaczem danych nie będzie zawierał ostrzeżeń wskazanych czerwonym lub żółtym podświetleniem w danej komórce.
        UWAGA: Wartości maksymalnej zazwyczaj nie trzeba zmieniać w stosunku do ustawień domyślnych, ale można ją obniżyć, aby odfiltrować jasne cząstki lub ograniczyć detekcję fluorescencyjną do węższego zakresu.
      2. Kliknij przycisk Next.
    2. Kliknij kartę Red Color, aby załadować dane dla tego kanału i wyświetlić aktualne punkty odcięcia. Ponownie, analizując punkt kontrolny negatywny izotypowy, można zauważyć zdarzenia detekcyjne o bardzo niskiej intensywności fluorescencji; w takim przypadku użytkownicy zazwyczaj powinni ustawić wartość dla koloru czerwonego w zakresie 300-400 a.u. Postępuj zgodnie z procedurami opisanymi w krokach 9.6.1.1-9.6.1.3.
    3. Kliknij kartę Blue Color, aby załadować dane dla tego kanału i wyświetlić aktualne punkty odcięcia. Ponownie, analizując punkt kontrolny negatywny izotypowy, postępuj zgodnie z procedurami opisanymi w krokach 9.6.1.1-9.6.1.3.
      UWAGA: Kanał niebieski jest specyficzny, ponieważ przeciwciało w punkcie wykazuje autofluorescencję na poziomie wymagającym nieco wyższego punktu odcięcia 400-700 a.u., nawet w przypadku chipów pustych.
  7. Po zakończeniu analizy punktów odcięcia kliknij Next; pojawi się mapa ciepła (heatmap), która zapewni ogólny wgląd w wiązanie cząstek w całym eksperymencie. Dostępnych jest kilka narzędzi wizualizacji, których użytkownik może użyć do wykreślenia danych. Wykresy te oraz powiązane surowe dane można dodać do raportu, klikając przycisk Add Plot Report.
    UWAGA: Mapa ciepła jest domyślnym sposobem wyświetlania danych, który pokazuje widok wszystkich próbek i wszystkich przechwyceń dla konkretnej detekcji. Domyślnym wyświetlaczem jest wartość całkowita, która kwantyfikuje unikalne EV związane z każdym punktem przechwycenia.
  8. Kliknij przycisk Export Report i wybierz lokalizację zapisu raportu.
    UWAGA: Raport zostanie otwarty w przeglądarce. Znajdź dołączony do raportu arkusz kalkulacyjny Filtered Particle List; są to informacje, które należy przesłać do EVTRACK.
  9. Kontynuuj dodawanie raportów, korzystając z różnych selekcji próbek (Samples) i typów przechwycenia (Capture types) w rozwijanych menu na górze ekranu. Wyświetlane dane są sterowane za pomocą przycisków detekcji kanałów w górnym lewym rogu. Ustaw konkretny fenotyp/wybór próbki/kanał przechwycenia, klikając w odpowiedni przycisk koloru, aby wyłączyć dany kanał detekcji (szary) lub go włączyć (kolorowy).
  10. Kliknij przycisk Add Plot to Report, aby zgromadzić żądane wykresy w raporcie.
  11. Kliknij Export Report i określ lokalizację zapisu końcowego raportu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rycina 7 (panel lewy) przedstawia trójkolorowy obraz kompozytowy pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EVs) pochodzących z pożywki kondycjonowanej komórek HEK293, związanych z punktem CD63 na chipie i barwionych pod kątem CD81, CD63 oraz CD9 odpowiednio w kanałach zielonym, czerwonym i niebieskim. Rycina 7 (panel prawy górny) to powiększony obraz pokazujący, że każdy z wychwyconych EVs może wykazywać kooperację jednego lub więcej kolorów o różnej intensywności w każd...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Obecne metody charakteryzacji EV w dużej mierze opierają się na oczyszczonych EV, co jest ograniczone przez obecne ograniczenia eksperymentalne metod oczyszczania EV 9,10,11,12,13. Interferometryczne obrazowanie odbicia pojedynczej cząstki (SP-IRIS) to skuteczna technologia, która może wyeliminować etapy oczyszczania wymagane do analizy próbki, a tym samym zao...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Clayton Deighan i George Daaboul są pracownikami i udziałowcami NanoView Biosciences Inc.

Podziękowania

Ta praca była częściowo sponsorowana przez University of Kansas School of Medicine Research Equipment and Resource Procurement Award Program. PCG, LKC, FD i AR otrzymały wsparcie ze środków NIA R21 AG066488-01.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10-centymetrowa sterylna szalka PetriegoFisherFB0875712
15 ml sterylna probówkabezróżnych
24-dołkowych płytek do hodowli komórkowych, płaskie dnoFisher08-772-1
Roztwór blokującyNanoView BiosciencesEV-TETRA-CMożna znaleźć w ExoView Human Tetraspanin Kit.
Pliki chipoweNanoView BiosciencesEV-TETRA-Cmożna znaleźć w ExoView Human Tetraspanin Kit.
ChipyNanoView BiosciencesEV-TETRA-Cmożna znaleźć w ExoView Human Tetraspanin Kit.
ChuckNanoView BiosciencesEV-TETRA-Cmożna znaleźć w zestawie ExoView Human Tetraspanin Kit.
Corning Easy Grip Jednorazowe sterylne butelki polistyrenowe 250 mlFisher09-761-4
Corning Easy Grip Jednorazowe sterylne butelki polistyrenowe 500 mlFisher09-761-10
Woda dejonizowana (DI)
z końcówkami z włókna węglowegoFisher50-193-0842
ExoView Zestawtetraspaniny dla ludziNanoView BiosciencesEV-TETRA-CCapture dla hCD81, hCD9, hCD63, IgG Control
 + barwienia dla hEV-A (hEV-CD63-647, hEV-CD81-555, hEV-CD9-488) 16 chipów w zestawie
Imager ExoView R100NanoView BiosciencesEV-R100z kamerą o wysokiej specyfikacji, z 3 kolorowymi fluorescencyjnymi i bezznacznikowymi rozmiarami i liczeniem pęcherzyków zewnątrzkomórkowych
Przeciwciało IgG huma CD9 z fluorescencyjnymi etykietamiNanoView BiosciencesEV-TETRA-Cmożna znaleźć w zestawie ExoView Human Tetraspanin Kit.
Fluorescencyjnie labione ludzkie przeciwciało IgG CD63NanoView BiosciencesEV-TETRA-CMożna znaleźć w zestawie ExoView Human Tetraspanin Kit.
Fluorescencyjnie wykrywane ludzkie przeciwciało IgG CD81NanoView BiosciencesEV-TETRA-CMożna znaleźć w zestawie ExoView Human Tetraspanin Kit.
Roztwór do inkubacjiNanoView BiosciencesEV-TETRA-Cmożna znaleźć w ExoView Human Tetraspanin Kit.
Wytrząsarka orbitalna lub wytrząsarka do mikropłytek z ustawieniami cyfrowymi zdolna do wytrząsania z prędkością 500 obr./minnie dotyczyróżnych
Uszczelka płytkowaNanoView BiosciencesEV-TETRA-CMożna znaleźć w ExoView Human Tetraspanin Kit.
Rozwiązanie NanoViewBiosciencesEV-TETRA-Cmożna znaleźć w zestawie ExoView Human Tetraspanin Kit.
Rozwiązanie BNanoView BiosciencesEV-TETRA-Cmożna znaleźć w ExoView Human Tetraspanin Kit.
Rozwiązanie CNanoView BiosciencesEV-TETRA-Cmożna znaleźć w zestawie ExoView Human Tetraspanin Kit.
Rozwiązanie DNanoView BiosciencesEV-TETRA-Cmożna znaleźć w ExoView Human Tetraspanin Kit.
Pęseta z kwadratową/płaską końcówkąFisher50-239-62
Pęseta typu Boley prostaFisher16-100-124
Thermo Scientific Samoprzylepne uszczelki płytkowe do PCRFisherAB-0558
Pęseta w stylu EMS Fisher LC267404 Mikroskop interferometryczny

Bibliografia

  1. Maas, S. L. N., Breakefield, X. O., Weaver, A. M. Extracellular vesicles: Unique intercellular delivery vehicles. Trends in Cell Biology. 27 (3), 172-188 (2017).
  2. Shah, R., Patel, T., Freedman, J. E. Circulating extracellular vesicles in human disease. The New England Journal of Medicine. 379 (10), 958-966 (2018).
  3. Deng, F., Miller, J. A review on protein markers of exosome from different bio-resources and the antibodies used for characterization. Journal of Histotechnology. 42 (4), 226-239 (2019).
  4. Cohen, O., et al. ’Golden’ exosomes as delivery vehicles to target tumors and overcome intratumoral barriers: in vivo tracking in a model for head and neck cancer. Biomaterials Science. 9 (6), 2103-2114 (2021).
  5. Han, Y., et al. Overview and update on methods for cargo loading into extracellular vesicles. Processes (Basel). 9 (2), 356(2021).
  6. Lee, M., Im, W., Kim, M. Exosomes as a potential messenger unit during heterochronic parabiosis for amelioration of Huntington's disease. Neurobiology of Disease. 155, 105374(2021).
  7. Sun, B., et al. Characterization and biomarker analyses of post-COVID-19 complications and neurological manifestations. Cells. 10 (2), 386(2021).
  8. Jiang, L., Gu, Y., Du, Y., Liu, J. Exosomes: Diagnostic biomarkers and therapeutic delivery vehicles for cancer. Molecular Pharmaceutics. 16 (8), 3333-3349 (2019).
  9. Bachurski, D., et al. Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis - An accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1596016(2019).
  10. Carmicheal, J., et al. Label-free characterization of exosome via surface enhanced Raman spectroscopy for the early detection of pancreatic cancer. Nanomedicine. 16, 88-96 (2019).
  11. Greening, D. W., Xu, R., Ji, H., Tauro, B. J., Simpson, R. J. A protocol for exosome isolation and characterization: evaluation of ultracentrifugation, density-gradient separation, and immunoaffinity capture methods. Methods in Molecular Biology. 1295, 179-209 (2015).
  12. Wu, Y., Deng, W., Klinke, D. J. Exosomes: improved methods to characterize their morphology, RNA content, and surface protein biomarkers. The Analyst. 140 (19), 6631-6642 (2015).
  13. van de Vlekkert, D., Qiu, X., Annunziata, I., d'Azzo, A. Isolation and characterization of exosomes from skeletal muscle fibroblasts. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), (2020).
  14. Ayala-Mar, S., Donoso-Quezada, J., Gallo-Villanueva, R. C., Perez-Gonzalez, V. H., Gonzalez-Valdez, J. Recent advances and challenges in the recovery and purification of cellular exosomes. Electrophoresis. 40 (23-24), 3036-3049 (2019).
  15. Daaboul, G. G., et al. Digital detection of exosomes by interferometric imaging. Scientific Reports. 6, 37246(2016).
  16. Pohler, K. G., et al. Circulating microRNA as candidates for early embryonic viability in cattle. NMolecular Reproduction and Development. 84 (8), 731-743 (2017).
  17. NanoView Biosciences. ExoView R100 User Guide. v240.4. NanoView Biosciences. , 202(2021).
  18. Daaboul, G. G., et al. Enhanced light microscopy visualization of virus particles from Zika virus to filamentous ebolaviruses. PLoS One. 12, 0179728(2017).
  19. ET Consortium. EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research. Nature Methods. 14, 228-232 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Charakterystyka EVobrazowanie pojedynczych cząsteczekdynamika populacji EVbiomarkery EVanaliza wielkości EVfenotypowanie EVpęcherzyki z lipidowej dwuwarstwykomunikacja komórkowa

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.