Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Rozwarstwienie i barwienie immunologiczne larw ślinowych komarów z rodzaju Anopheles gambiae

4.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62989

⸱

30 września 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, The Johns Hopkins University School of Medicine, 2Tufts School of Medicine, 3Department of Biomedical Sciences, Idaho College of Osteopathic Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Dorosły gruczoł ślinowy komara (SG) jest niezbędny do przenoszenia wszystkich patogenów przenoszonych przez komary na ich ludzkich gospodarzy, w tym wirusów i pasożytów. Film ten pokazuje skuteczną izolację SG od stadium larwalnego (L4) komarów Anopheles gambiae i przygotowanie SG L4 do dalszej analizy.

Streszczenie

Gruczoły ślinowe komarów (SG) są niezbędnym organem bramnym do przenoszenia patogenów przenoszonych przez owady. Czynniki chorobotwórcze, w tym wirusy i pasożyty Plasmodium wywołujące malarię, gromadzą się w jamach wydzielniczych komórek SG. Tutaj są gotowe do przeniesienia się na swoich kręgowców gospodarzy podczas kolejnego posiłku z krwi. Ponieważ dorosłe gruczoły tworzą się jako rozwinięcie resztek pączków przewodu SG larw, które utrzymują się po wczesnej histolizie SG poczwarki, larwa SG jest idealnym celem dla interwencji ograniczających przenoszenie choroby. Zrozumienie rozwoju larw SG może pomóc w lepszym zrozumieniu ich morfologii i adaptacji funkcjonalnych oraz pomóc w ocenie nowych interwencji ukierunkowanych na ten narząd. Ten protokół wideo demonstruje skuteczną technikę izolowania, mocowania i barwienia larw SG komarów Anopheles gambiae. Gruczoły wycięte z larw w 25% roztworze etanolu utrwala się w mieszaninie metanolu i lodowatego kwasu octowego, a następnie przemywania zimnym acetonem. Po kilku płukaniach w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), SG mogą być barwione szeroką gamą barwników markerowych i/lub surowic odpornościowych przeciwko białkom ulegającym ekspresji SG. Ta metoda izolacji larw SG może być również stosowana do pobierania tkanek do analizy hybrydyzacji in situ, innych zastosowań transkryptomicznych i badań proteomicznych.

Wprowadzenie

Malaria jest głównym zagrożeniem dla zdrowia publicznego, powodując prawie 230 milionów infekcji i szacunkowo 409 000 zgonów w 2019 roku1. Większość zgonów ma miejsce w Afryce Subsaharyjskiej i jest spowodowana przez pasożyta Plasmodium falciparum, którego wektorem owadów jest Anopheles gambiae, który jest przedmiotem tej demonstracji wideo. Chociaż liczby wskazują na znaczny spadek rocznej śmiertelności od przełomu wieków (>300 000 mniej zgonów rocznie), obiecujące spadki wskaźników zachorowań obserwowane od 2000 do 2015 r. postępują krótko, co sugeruje potrzebę nowego podejścia do ograniczania przenoszenia chorób2. Wśród obiecujących dodatkowych strategii kontrolowania i możliwego eliminowania malarii jest ukierunkowanie zdolności wektorów komarów za pomocą edycji genów i napędu genów opartego na CRISPR/Cas93,4,5. Rzeczywiście, to właśnie ukierunkowanie na wektora komarów (poprzez rozszerzone zastosowanie długotrwałych moskitier nasączonych środkami owadobójczymi) miało największy wpływ na ograniczenie przenoszenia chorób6.

Samice komarów nabywają gametocyty Plasmodium od zarażonego człowieka podczas posiłku krwi. Po zapłodnieniu, dojrzewaniu, przechodzeniu nabłonka jelita środkowego, ekspansji populacji i nawigacji hemocoelów w ich obowiązkowych żywicielach komarów, setki do dziesiątek tysięcy sporozoitów Plasmodium atakują SG komarów i wypełniają jamy wydzielnicze składowych komórek wydzielniczych. Po dostaniu się do jam wydzielniczych pasożyty mają bezpośredni dostęp do przewodu ślinowego i są w ten sposób gotowe do przeniesienia się na nowego żywiciela kręgowców przy następnym posiłku z krwi. Ponieważ SG mają kluczowe znaczenie dla przenoszenia sporozoitów powodujących malarię na ich ludzkich gospodarzy, a badania laboratoryjne sugerują, że SG nie są niezbędne do odżywiania krwi, przeżywalności komarów lub płodności7,8,9, stanowią idealne miejsce dla środków blokujących transmisję. Dorosłe komary SG powstają jako rozwinięcie resztek "pączków przewodowych" w larwach SG, które utrzymują się po wczesnej histolizie SG poczwarki10, co czyni larwę SG idealnym celem dla interwencji mających na celu ograniczenie przenoszenia choroby w stadium dorosłym.

Scharakteryzowanie larwalnego stadium rozwoju SG może pomóc nie tylko w lepszym zrozumieniu jego morfologii i adaptacji funkcjonalnych, ale może również pomóc w ocenie nowych interwencji, które są ukierunkowane na ten narząd poprzez edycję genów kluczowych regulatorów SG. Ponieważ wszystkie dotychczasowe badania nad architekturą gruczołów ślinowych larw poprzedzają barwienie immunologiczne i nowoczesne techniki obrazowania10,11, opracowaliśmy protokół izolowania i barwienia gruczołów ślinowych różnymi przeciwciałami i markerami komórkowymi12. Ten film pokazuje to podejście do ekstrakcji, utrwalania i barwienia larw SG z larw Anopheles gambiae L4 do obrazowania konfokalnego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie rozwiązań i narzędzi

  1. Przygotowanie roztworu preparacyjnego
    1. Aby przygotować roztwór preparacyjny, dodaj 2,5 ml 100% etanolu do 7,5 ml destylowanego H2O w 15 plastikowej probówce. Odwróć rurkę 3 razy, aby wymieszać.
      UWAGA: Ten roztwór można przechowywać w temperaturze pokojowej przez kilka tygodni.
  2. Przygotowanie 10 razy wywaru z soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)
    1. Aby przygotować 10x PBS bulionu, dodaj 17,8 g Na2HPO4• 2H2O, 2,4 g KH2PO4, 80 g NaCl i 2 g KCl do 800 ml wody dejonizowanej. Mieszaj z mieszadłem na talerzu mieszającym, aż ciała stałe całkowicie się rozpuszczą. Uzupełnij końcową objętość do 1 l oczyszczoną wodą.
      UWAGA: Roztwór ten można przechowywać w temperaturze pokojowej przez kilka miesięcy.
  3. Przygotowanie 1x PBS
    1. Dodaj 10 ml 10x PBS do 90 mlH2Ow sterylnej szklanej butelce. Zamknij szczelnie pokrywkę i odwróć 3x, aby wymieszać.
      UWAGA: Roztwór można przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni.
  4. Przygotowanie utrwalacza.
    1. Dodać 600 μl metanolu do 200 μl lodowatego kwasu octowego. Spraw, aby roztwór był świeży za każdym razem.
  5. Budowa płyty szpachlowej (naczynie do hodowli tkankowych wypełnione gumą silikonową)
    1. Wymieszać składniki (1:50) żywicy epoksydowej (1 g) i wody (50 ml) i wlać mieszaninę na szalkę Petriego. Poczekaj, aż komponenty wyschną przed użyciem.
      UWAGA: Raz zbudowana płyta szpachlowa może być używana przez lata.

2. Rozwarstwienie gruczołów (Rysunek 1A)

  1. Zbierz larwy L4 w późnym stadium (~10 dni po wykluciu; Rysunek 2) z tacek do karmienia za pomocą plastikowej pipety transferowej.
    UWAGA: Zapoznaj się z tym pomocnym podręcznikiem online dotyczącym standardowej hodowli komarów i hodowli larw13.
    1. Umieść płytkę szpachlową na stoliku mikroskopu preparacyjnego i przenieś larwy na płytkę szpachlową.
      UWAGA: Podczas porcjowania larw do wstępnego rozbioru pomocne jest przeniesienie ~10 larw na szkiełko jednorazowo za pomocą plastikowej pipety transferowej.
  2. Umieścić kroplę roztworu preparacyjnego (1:3 EtOH:H2O) na płytce szpachlowej, oddzielnie od 10 larw.
  3. Użyj plastikowej pipety transferowej lub jednorazowej szklanej pipety, aby umieścić jedną larwę L4 w kropli 25% EtOH.
  4. Weź kleszcze (#4), po jednym w każdą rękę, i ręką niedominującą chwyć głowę larwy. Używając dominującej ręki, chwyć larwę kleszczami tuż pod głową i delikatnie pociągnij z minimalną stałą siłą, tak aby głowa oderwała się od reszty ciała, a gruczoły pozostały przyczepione do głowy. Wyrzuć część ciała tuszy larwy.
    UWAGA: Podczas sekcji ustaw w pobliżu ręcznik papierowy, aby zebrać tusze larw.
  5. Zebrać głowę/gruczoły do 1 ml 1x PBS w 1,5 ml probówki do mikrowirówki. Użyj 1 ml PBS na ~40 wypreparowanych gruczołów z dołączonymi główkami. Poczekaj, aż głowice/SG opadną na dno bufora.

3. Utrwalenie do barwienia przeciwciał (Rysunek 1B)

  1. Opróżnij PBS, zaczynając od góry probówki mikrowirówki za pomocą szklanej pipety transferowej, unikając lepkich tkanek komara i usuwając jak najwięcej roztworu PBS bez uszkadzania tkanek. Zastąp roztwór 800 μl mieszaniny metanolu z lodowatym kwasem octowym w stosunku 3:1. Umieść probówkę w temperaturze 4 °C na noc (zalecane 12-24 godziny; preferowane 19 godzin).
  2. Następnego dnia odcedź roztwór i zastąp go 1 ml zimnego 100% acetonu. Pozostaw na 90 sekund.
  3. Usuń aceton i delikatnie spłucz chusteczki trzy razy 1 ml 1x PBS za każdym razem.
    UWAGA: Próbki powinny powoli unosić się w górę wraz z przepływem, a następnie opaść z powrotem na dno probówki do czasu zakończenia każdego dodawania PBS.

4. Barwienie immunologiczne (Rysunek 1B)

  1. Dodać przeciwciało pierwszorzędowe (np. Rab11) w odpowiednim rozcieńczeniu (1:100) w 200 μl całkowitej objętości 1x PBS. Delikatnie zamieszaj zawartość probówki za pomocą końcówki do pipety. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
  2. Usunąć roztwór przeciwciała pierwszorzędowego i przemyć trzykrotnie 1 ml 1x PBS (delikatnie pipetując roztwór do i z pipety).
  3. Dodać przeciwciało drugorzędowe (Alex Fluor 488 Goat anti-Rabbit) w odpowiednim rozcieńczeniu (1:200) w 200 μl całkowitej objętości. Delikatnie zamieszaj zawartość probówki za pomocą końcówki do pipety. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 90 minut.
  4. Na tym etapie do 200 μl PBS dodać barwniki, takie jak czerwień nilowa (lipidy, 5 μl z 1 μg/μl) i/lub Hoechst (DNA, 3 μl z 1 μg/μl). Inkubować w temperaturze pokojowej przez dodatkowe 60 minut. Umyj delikatnie trzy razy za pomocą 1x PBS.

5. Montaż barwionych dławnic do mikroskopii (Rysunek 1C)

  1. Odpipetować 200 μl 100% glicerolu na szkiełko mikroskopowe.
    UWAGA: Ponieważ glicerol jest lepki, pozostaw końcówkę pipety w płynie, aż osiągnie odpowiednią objętość. Nie zaobserwowano kurczenia się tkanek po przejściu bezpośrednio do 100% glicerolu. Jednak naukowcy mogą przejść przez 30% i 50% płukanie glicerolem w probówkach przed przeniesieniem próbek do 100% glicerolu.
  2. Przenieś wybarwione głowy (do 20 na szkiełko) wraz z dołączonymi dławnicami (wraz z innymi strukturami wewnętrznymi) na szkiełko mikroskopowe za pomocą miękkiej szczoteczki (Rysunek 3A). Rozłóż próbki tak, aby były równomiernie rozłożone wzdłuż szkiełka podstawowego.
    UWAGA: Podczas osadzania dławików na szkiełku nakrywkowym za pomocą pędzla, kleszcze mogą być używane do delikatnego zorientowania SG tak, aby wszystkie były zorientowane w tym samym kierunku.
  3. Oglądając pod mikroskopem preparacyjnym, oddziel głowę larwy od gruczołów za pomocą dwóch par kleszczy i ostrożnie ciągnąc dwie tkanki w przeciwnych kierunkach.
    UWAGA: Ponieważ całkowite odizolowanie SG jest trudne, po prostu usuń głowice, pozostawiając SG i związane z nimi struktury wewnętrzne. Nawet jeśli SG pozostają związane z innymi tkankami, można je łatwo rozpoznać po zabarwieniu Hoechst i innymi markerami (Rysunek 3B, C).
  4. Wyjmij i wyrzuć głowice i powtórz proces separacji dla każdego SG.
    UWAGA: Podczas zdejmowania głów ustaw w pobliżu ręcznik papierowy, aby je zebrać.
  5. Delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe o grubości 1,5 mm na wierzchu (unikając pęcherzyków powietrza) i uszczelnij przezroczystym lakierem do paznokci.
  6. Przechowywać w temperaturze 4 °C w światłoszczelnym opakowaniu.
    UWAGA: Przygotowane szkiełka z barwionych gruczołów można przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności przez okres do sześciu miesięcy do jednego roku bez zauważalnych zmian jakości. Jeśli glicerol zacznie przeciekać w miarę upływu miesięcy, delikatnie podnieś szkiełko nakrywkowe i odpipetuj więcej glicerolu, aby wypełnić otwory.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Gruczoły ślinowe są stosunkowo łatwe do wypreparowania ze wszystkich larw w stadium L4. Samce i samice larw można rozróżnić w późnym stadium L4 po czerwonym pasie wzdłuż grzbietowej części klatki piersiowej u samic, który nie występuje u samców (Rycina 2). Zaobserwowaliśmy również, że morfologia czułków jest znacznie bardziej rozbudowana u samców niż u samic w stadium L4 (Rycina 2), co odpowiada różnicom obserwowanym w tej strukturze u dorosłych komarów. Równole...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisany w niniejszym dokumencie protokół został zaadaptowany z protokołu sekcji Drosophila SG i protokołu sekcji dorosłych komarów 14,15,16. Jednak większość markerów nie przeniknęła przez błonę podstawną (dane nie pokazano) podczas stosowania metod preparacji dorosłych i barwienia SG. Adaptacje protokołu dla dorosłych obejmowały wypreparowanie gruczołów w 25% roztworze EtOH, przemycie gruczołów kombinacją MeOH i lodowatego kwas...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Johns Hopkins Malaria Research Institute za dostęp i hodowlę larw An. gambiae.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
  KH2PO4Millipore SigmaP9791
  Na2HPO4 • 2H2OMillipore Sigma71643
  NaClMillipore SigmaS7653
AcetonMillipore Sigma179124
Pędzel z miękkim włosiemAmazon (SN NJDF) Zestaw pędzli do detaliB08LH63D89
Szkiełka nakrywkowe (22 x 50 mm)VWR48393-195
DAPI (DNA)ThermoFisher ScientificD1306
Alkohol etylowy 200 proofMillipore SigmaEX0276
Gilson Pipetman P200 PipetaGilsonP200
Glacial Octe AcidSigma Aldrich695092
Kleszcze jubilerskie, Dumont No. 5Millipore SigmaF6521
KClMillipore Sigma58221
MetanolMillipore Sigma1414209
Lakier do paznokciAmazonka (Sally Hansen)B08148YH9M
Czerwień Nilowa (lipid)ThermoFisher ScientificN1142
Ręczniki/chusteczki papieroweULINES-7128
Płytka Petriego (do wykonania płyty szpachlowej)KońcówkiScientific FB0875712
GilsonTips E200ST
Fisher NaukoweS304671
Przeciwciała pierwszorzędowe (np. Crb, Rab11)Badania rozwojowe Hybridoma Bank (DSHB); Andrew LabMouse anty-Crb (Cq4) lub Rabbit anty-Rab11
Przeciwciała drugorzędowe ze znacznikami fluorescencyjnymi (np. Alexa Fluor 488 Goat-anti Rabbit)ThermoFisher ScientificA11008
Żywica silikonowa i utwardzacz do szpachliDow Chemicals - Ximeter SiliconePMX-200
Szkiełka, matowe na jednym końcu do etykietowaniaVWR  20 X 50 mm48393-195
Aglutynina z kiełków pszenicyThermoFisher ScientificW834
do pipet ThermoFisher Plastikowa pipeta transferowa

Bibliografia

  1. World malaria report 2020: 20 years of global progress and challenges. World Health Organization. , Available from: https://apps.who.int/iris/handle/10665/337660 (2020).
  2. Feachem, R. G. A., et al. Malaria eradication within a generation: ambitious, achievable, and necessary. Lancet. 394 (10203), 1056-1112 (2019).
  3. Adolfi, A., et al. Efficient population modification gene-drive rescue system in the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature Communications. 11, 5553(2020).
  4. Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
  5. Rostami, M. N. CRISPR/Cas9 gene drive technology to control transmission of vector-borne parasitic infections. Parasite Immunology. 42 (9), 12762(2020).
  6. Bhatt, S., et al. Coverage and system efficiencies of insecticide-treated nets in Africa from 2000 to 2017. Elife. 4, 09672(2015).
  7. Mellink, J. J., Vanden Bovenkamp, W. Functional aspects of mosquito salivation in blood feeding of Aedes aegypti. Mosquito News. 41 (1), 115(1981).
  8. Ribeiro, J. M., Rossignol, P. A., Spielman, A. Role of mosquito saliva in blood vessel location. Journal of Experimental Biology. 108, 1-7 (1984).
  9. Yamamoto, D. S., Sumitani, M., Kasashima, K., Sezutsu, H., Matsuoka, H. Inhibition of malaria infection in transgenic Anopheline mosquitoes lacking salivary gland cells. PLoS Pathogens. 12 (9), 1005872(2016).
  10. Rishikesh, N. Morphology and development of the salivary glands and their chromosomes in the larvae of Anopheles stephensi sensu stricto. Bulletin of the World Health Organization. 20 (1), 47-61 (1959).
  11. Jensen, D. V., Jones, J. C. The development of the salivary glands in Anopheles albimanus Wiedemann (Diptera, Culicidae). Annals of the Entomological Society of America. 50 (5), 40824(1957).
  12. Chiu, M., Trigg, B., Taracena, M., Wells, M. Diverse cellular morphologies during lumen maturation in Anopheles gambiae larval salivary glands. Insect Molecular Biology. 30 (2), 210-230 (2021).
  13. Benedict, M. Q. MR4. Methods in Anopheles research. Center for Disease Control. , Available from: https://www.beiresources.org/Portals/2/ VectorResources/2016%20Methods%20in%20Anopheles%20Research%20full%20manual.pdf (2015).
  14. Wells, M. B., Andrew, D. J. Salivary gland cellular architecture in the Asian malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Parasites & Vectors. 8, 617(2015).
  15. Wells, M. B., Villamor, J., Andrew, D. J. Salivary gland maturation and duct formation in the African malaria mosquito Anopheles gambiae. Scientific Reports. 7 (1), 601(2017).
  16. Wells, M. B., Andrew, D. J. Anopheles salivary gland architecture shapes plasmodium sporozoite availability for transmission. mBio. 10 (4), 01238(2019).
  17. Clements, A. N. The physiology of mosquitoes. , Pergamon Press. Paris. (1963).
  18. Imms, A. D. On the larval and pupal stages of Anopheles maculipennis, meigen. Parasitology. 1 (2), 103-133 (1908).
  19. Favia, G., et al. Bacteria of the genus Asaia stably associate with Anopheles stephensi, an Asian malarial mosquito vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (21), 9047-9051 (2007).
  20. Neira Oviedo, M., et al. The salivary transcriptome of Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) larvae: A microarray-based analysis. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 39 (5-6), 382-394 (2009).
  21. Linser, P. J., Smith, K. E., Seron, T. J., Neira Oviedo, M. Carbonic anhydrases and anion transport in mosquito midgut pH regulation. Journal of Experimental Biology. 212 (11), 1662-1671 (2009).
  22. Linser, P. J., et al. Slc4-like anion transporters of the larval mosquito alimentary canal. Journal of Insect Physiology. 58 (4), 551-562 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Disekcja komar wtechnika immunobarwieniaizolacja gruczo w linowychtransmisja chor bbarwienie przeciwcia amimikroskop stereoskopowybufor fosforanowy PBSfiksacja acetonem
Rozwarstwienie i barwienie immunologiczne larw ślinowych komarów z rodzaju Anopheles gambiae
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.