Pęseta magnetyczna w formacie mikropłytki

Podsumowanie

Tutaj opisujemy użycie nowatorskiego testu mikropłytki, który umożliwia mechaniczną manipulację biomolekułami podczas wykonywania zespołowych testów biochemicznych. Osiąga się to za pomocą pokrywki mikropłytki zmodyfikowanej za pomocą magnesów w celu wytworzenia wielu statycznych pęset magnetycznych na mikropłytce.

Streszczenie

Mechanobiologia opisuje, jak siły fizyczne i właściwości mechaniczne materiału biologicznego przyczyniają się do fizjologii i choroby. Zazwyczaj podejścia te są ograniczonymi metodami jednocząsteczkowymi, co ogranicza ich dostępność. Aby zaspokoić tę potrzebę, opracowano test mikropłytkowy, który umożliwia mechaniczną manipulację podczas wykonywania standardowych testów biochemicznych. Osiąga się to za pomocą magnesów wbudowanych w pokrywkę mikropłytki w celu stworzenia wielu pęset magnetycznych. W tym formacie siła jest wywierana na biomolekuły połączone z kulkami paramagnetycznymi, co odpowiada typowej pęsetie magnetycznej. Badanie demonstruje zastosowanie tego narzędzia w testach opartych na FRET do monitorowania konformacji białek. Jednak podejście to ma szerokie zastosowanie w różnych systemach biologicznych, począwszy od pomiaru aktywności enzymatycznej, a skończywszy na aktywacji szlaków sygnałowych w żywych komórkach.

Wprowadzenie

Mechanobiologia skupia się na zrozumieniu, w jaki sposób rozchodzenie się sił fizycznych wewnątrz i pomiędzy komórkami reguluje aktywność komórkową^1,2 i jak to koreluje z organizacją i dynamiką zarówno białek, jak i komórek.

Pomiary siły pojedynczej cząsteczki ujawniły, jak siła jest wykorzystywana w systemach biologicznych, od pojedynczych białek do całych komórek i tkanek^3,4,5^,6,7. Te trudne eksperymenty wymagają specjalistycznego sprzętu i wiedzy technicznej. I odwrotnie, standardowe testy biochemiczne można wykonywać z większą przepustowością w łatwo dostępnym sprzęcie komercyjnym.

Tutaj badanie opisuje test mechanobiologiczny, który umożliwia jednoczesne manipulowanie i testy biochemiczne oparte na pęsetach magnetycznych⁸. Magnesy są umieszczane na wydrukowanej w 3D pokrywie mikropłytki (Rysunek 1A-D), umożliwiając korzystanie z komercyjnych czytników płytek do testów. Siła jest przykładana do biocząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania poprzez sprzężenie cząsteczki z cząstkami paramagnetycznymi. Następnie magnesy wywierają napięcie na cząsteczkę. Zmiana odległości między cząstkami a magnesami dostosowuje siłę wywieraną na biomolekułę (Rysunek 1E).

Przedstawiamy użycie tego testu za pomocą silnika molekularnego opartego na aktynie, Myosin VI. Miozyna VI jest regulowana przez wewnątrzcząsteczkowe fałdowanie wsteczne⁹. Wykazano, że miozyna VI istnieje w stanie autohamowania, w którym wiązanie białek partnerskich, takich jak NDP52, wyzwala rozwijanie miozyny VI^10,11. Aby wykonać te testy, użyjemy podwójnie znakowanego konstruktu domeny ogona miozyny VI z N-końcowym GFP i C-końcowym RFP, w którym odwrotne fałdowanie białka generuje transfer energii rezonansu fluorescencji (FRET) między GFP a RFP. N-koniec zawiera również znacznik biotynylacji, który unieruchamia białko na powierzchni. Używamy tego testu w połączeniu z pomiarami FRET, aby pokazać, jak siła może wpływać na fałdowanie wsteczne miozyny VI.

Protokół

Białka wzorcowe wymagane do tego eksperymentu oraz lista odczynników znajdują się w Tabeli materiałów. W celu pomiaru zmian konformacyjnych należy wytworzyć odpowiednie białka dla badanego przez użytkownika układu.

1. Magnetyczna pokrywka wydrukowana w technologii 3D

1. Zaprojektuj pokrywę do mikropłytki, która pomieści magnesy w mikropłytce 24-dołkowej. Przykładowy plik CAD można pobrać z serwisu GitHub¹². Wymiary przedstawiono na Rysunku 1.
   UWAGA: Wysokość podstawy może zostać zmieniona w celu zmodyfikowania odległości między magnesami a powierzchnią, aby zmienić przyłożoną siłę. Ponadto końcowa siła działająca na cząstkę zależy od rozmiaru cząstki oraz przerwy między parą magnesów. Równania do obliczenia przyłożonej siły dla cząstek 1 µm i 2,8 µm przy przerwach 0,5 mm, 1 mm i 2 mm podano w pracy Dos Santos et al.⁸. Dla opisanych tutaj eksperymentów z cząstkami 2,8 µm i przerwą 2 mm należy zastosować równanie 1.
   Równanie 1:
2. Wydrukuj pokrywę do mikropłytki w technologii druku 3D, używając glikolu politereftalanu etylenu (PETG) na systemie drukarki 3D.
   UWAGA: Użyj drukarki z rozdzielczością warstwy 0,02 mm, aby zapewnić dokładność i powtarzalność. Wpływ dokładności drukarki został omówiony w pracy Dos Santos et al.⁸.
3. Przymocuj za pomocą kleju pary magnesów neodymowych N42 w kształcie sześcianów o boku 5 mm do podstaw, orientując bieguny magnetyczne tak, aby pole było skierowane w stronę dna mikropłytki.
4. Pozostaw co najmniej jedną pozycję pustą, aby służyła jako kontrola bez magnesu.
5. Przechowuj w szczelnym pojemniku o wystarczającym rozmiarze, aby można było łatwo nakładać i zdejmować pokrywę.

2. Modyfikacja powierzchni mikropłytki

1. Należy przygotować czystą, niepoddaną obróbce mikropłytkę 24-dołkową z szklanym dnem.
2. Dołki należy przemyć 3 razy 500 µL buforu do mycia (50 mM Tris-HCl (pH 7.5) i 50 mM NaCl) w temperaturze pokojowej.
3. Należy dodać 200 µL biotynylowanego BSA (0.2 mg/mL) w buforze do mycia i pozostawić na 15 min w temperaturze pokojowej.
   UWAGA: Biotin-BSA jest stosowany zarówno do pasywacji, jak i do przyłączania. Można zastosować inne strategie pasywacji i przyłączania do powierzchni. Przy pierwszym użyciu i w celu optymalizacji stężenie biotin-BSA można zmieniać do 1 mg/mL.
4. Dołki należy przemyć 3 razy 500 µL buforu do mycia.
5. Należy dodać 200 µL streptawidyny (20 µg/mL) w buforze do mycia i pozostawić na 15 min w temperaturze pokojowej.
   UWAGA: Przy pierwszym użyciu stężenie streptawidyny można zmieniać do 1 mg/mL.
6. Należy usunąć roztwór, a następnie przemyć dołki 3 razy buforem do mycia.
7. Dołki należy przykryć 500 µL buforu do mycia.
8. Przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia. Płytki powinny zostać wykorzystane w tym samym dniu.

3. Przygotowanie próbek: Immobilizacja białek

1. Pozostaw zmodyfikowaną powierzchniowo mikropłytkę do osiągnięcia temperatury pokojowej.
2. Przemyj studzienki 500 µL buforu do płukania.
3. Dodaj 100 nM biotin-eGFP-Myosin VI Tail-mRFP (białko z próbki zapasowej) i inkubuj przez 15 min w temperaturze pokojowej w buforze do płukania.
   UWAGA: To przykładowe białko jest otrzymywane zgodnie z opisem Dos Santos et al.⁸. Stężenia i czasy inkubacji mogą się różnić w zależności od białka.
4. Przemyj studzienki 3x 500 µL buforu do płukania.
5. Skonfiguruj czytnik płytek do rejestracji widm fluorescencji dla GFP (wzbudzenie 490 nm i emisja 510-600 nm) oraz RFP (wzbudzenie 560 nm i emisja 580-650 nm), aby potwierdzić obecność białek fuzyjnych.
6. W przypadku braku białka zwiększ stężenie w kroku 3.3.
   UWAGA: Słabe wiązanie może wynikać z niewystarczającego wiązania biotyny-BSA i/lub streptawidyny, w związku z czym ilości te można zwiększyć 10-krotnie.
7. Jeśli to możliwe, wykonaj pomiar skanowania studzienki, aby ustalić, czy białko fuzyjne jest związane w całej mikropłytce (Rycina 2).
   UWAGA: Pomiar ten zarejestruje intensywność fluorescencji w określonych punktach studzienki mikropłytki. Pozwoli to stwierdzić, czy białko jest związane w obrębie całej studzienki.
8. Upewnij się, że sygnał jest jednorodny (w granicach 5%) w centrum studzienki, w którym odbywa się pomiar analizy.

4. Przygotowanie kulek magnetycznych

1. Wiadomość z 2,8 µm kulkami paramagnetycznymi z rekombinowanym białkiem A (Tabela materiałów) wymieszać w wstrząsarku typu vortex przez 30 s, aby resuspender kulki.
2. Przenieść objętość odpowiadającą 1 mg kulek paramagnetycznych do probówki 1,5 mL.
3. Umieścić probówkę w izolatorze magnetycznym (Tabela materiałów), a następnie usunąć nadsącz.
4. Resuspender kulki w 200 µL PBS, delikatnie pipetując roztwór w górę i w dół.
5. Umieścić probówkę w izolatorze magnetycznym, a następnie usunąć nadsącz.
6. Powtórzyć etap płukania 3x.
7. Rozcieńczyć 10 µg przeciwciała Anti-RFP w 200 µL PBS.
8. Wyizolować kulki w izolatorze magnetycznym, a następnie resuspender je w roztworze przeciwciał.
9. Rotować z prędkością 20 rpm przez 10 min w temperaturze pokojowej na rotatorze laboratoryjnym.
10. Umieścić probówkę w izolatorze magnetycznym i usunąć nadsącz.
11. Przepłukać 3x w PBS.
12. Resuspender kulki w 200 µL buforu płuczącego.
13. Aby potwierdzić unieruchomienie przeciwciał na kulkach, inkubować kulki z obciążonymi przeciwciałami z roztworem białka fuzyjnego RFP o stężeniu >1 µM.
    UWAGA: Potwierdzić wizualnie, czy białko zostało wyizolowane przez kulki.
14. Alternatywnie, zmierzyć natężenie fluorescencji nadsączu (wzbudzenie 560 nm i emisja 580-650nm) dla RFP w spektrometrze fluorescencyjnym.

5. Przygotowanie próbek: Przyłączanie kulek

1. Do studzienek mikropłytki z związanym białkiem dodać 10 µg fuzji kulek paramagnetycznych z przeciwciałem rozcieńczonej w buforze do płukania (200 µL).
2. W jednej studzience kontrolnej nie umieszczać kulek, aby sprawdzić wpływ kulek na sygnał fluorescencyjny. Przygotować próbkę kontrolną bez przeciwciał w celu określenia wszelkich nieswoistych oddziaływań z kulkami.
3. Inkubować mikropłytkę w temperaturze pokojowej przez 30 min.
4. Przepłukać studzienki 3x za pomocą 500 µL buforu do płukania.
5. Jeśli jest to możliwe, sprawdzić pod mikroskopem w świetle przechodzącym, czy kulki są związane z powierzchnią. W przypadku braku kulek zwiększyć stężenie w kroku 5.1 do 500 µg/mL.

6. Pozyskiwanie danych

1. Umieść mikropłytkę, bez pokrywki, w fluorescencyjnym czytniku płytek w temperaturze 25 °C.
2. Skonfiguruj czytnik płytek do zapisu widm fluorescencji dla GFP (wzbudzenie 490 nm i emisja 510-600 nm) oraz RFP (wzbudzenie 560 nm i emisja 580-650 nm), aby potwierdzić obecność białek fuzyjnych.
   UWAGA: Pomiar/zapis widm fluorescencji należy przeprowadzić przez dno mikropłytki, co umożliwi nałożenie pokrywki od góry. W związku z tym należy dobrać odpowiedni czytnik mikropłytek.
3. Zapisz widmo fluorescencji FRET (wzbudzenie 490 nm i emisja 510-650nm) lub monitoruj fluorescencję przy 510 nm i 610 nm przy wzbudzeniu 490 nm. Konfigurację należy przeprowadzić zgodnie z instrukcją producenta.
4. Wyjmij mikropłytkę z czytnika i nałóż magnetyczną pokrywkę.
5. Ponownie umieść płytkę w czytniku i pozostaw próbkę na 2 min.
6. Powtórz pomiar FRET, zgodnie z krokiem 6.3.

7. Analiza danych

1. Wyeksportuj dane w celu ich importu do arkusza kalkulacyjnego (np. Excel).
2. Ręcznie wyodrębnij dane dla donora GFP przy 510 nm i akceptora RFP przy 610 nm.
3. Oblicz względny FRET, korzystając z równania 2 dla każdego stanu.
   Równanie 2:
   A: intensywność akceptora (RFP 610 nm), D: intensywność donora (GFP 510 nm).
   UWAGA: Użyj rekombinowanego RFP w tych samych warunkach wzbudzenia i emisji, aby kontrolować tło wzbudzenia akceptora.

Wyniki

Rysunek 2 przedstawia przykład pomiaru skanowania dołka, w którym natężenie fluorescencji GFP zostało zarejestrowane w odstępach 1 mm w obrębie dołka mikropłytki. Typowe pomiary fluorescencji są wykonywane w pozycji centralnej dołka mikropłytki (pozycja 8,8 na Rysunku 2); dlatego ważne jest, aby w tym miejscu znajdowało się związane białko. Jak pokazano na Rysunku 2, natężenie jest najwyższe w centrum dołka w promieniu kilku milimet...

Dyskusja

Takie podejście umożliwia łatwe zastosowanie pomiarów opartych na sile w mikropłytce za pomocą czytników płytek fluorescencyjnych. Co ważne, ten format testu zakłada, że białko funkcjonalne jest związane, gdy jest związane z powierzchnią. Dlatego przed przystąpieniem do tych pomiarów wymagana jest wcześniejsza wiedza, aby upewnić się, że występuje aktywność białka. Korzystne jest również upewnienie się, że wiązanie cząsteczek z kulkami paramagnetycznymi i powierzchnią jest zoptymalizowane dla każdego systemu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
24-dołkowa mikropłytka ze szklanym dnem	Cellvis	P24-1.5H-N	Dostępnych jest wiele źródeł. O ile nie jest to konieczne, najlepiej unikać powierzchni poddanych obróbce i używamy szkła klasy obrazowania N1.5.
Przeciwciało anty-RFP	Abcam	ab290	Dostępnych jest wiele źródeł, ale należy zapewnić minimalną reaktywność z GFP.
Mikroskop laboratoryjny	Optika	IM-3
Rotator laboratoryjny	Cole-Palmer-Stuart	SB3
Biotin-BSA	Sigma Aldrich	A8549
Oprogramowanie CAD - Sketch Up Educator	Sketch Up		Można korzystać z alternatywnych programów CAD. Użytkownicy powinni upewnić się, że formaty plików są kompatybilne z ich drukarką 3D.
Dynabeads Protein A	Fisher Scientific	10746713	2,8 & mikro; m Koraliki paramagnetyczne z rekombinowanym białkiem A
Udarowy klej kontaktowy	EVO-STIK
MagnaRack magnetyczny stojak separacyjny	ThermoFisher Scientific	CS15000	Izolator magnetyczny
NaCl	Fisher Scientific	10316943
Neodymium N42 kostka 5mm Magnesy	Supermagnete	W-05-N
Czytnik płytek - ClarioStar	BMG Labtech		Wszystkie systemy czytników płytek mogą być stosowane tam, gdzie możliwe są pomiary spod mikropłytki. Pokrywa magnesu wyklucza standardowe pomiary od góry
Streptavidin	Sigma Aldrich	189730
Tris-HCl	Fisher Scientific	10142400
Ultimaker PETG Filament	Ultimaker Ultimaker
S3 - drukarka 3D	Ultimaker