Pęseta magnetyczna w formacie mikropłytki

Podsumowanie

Tutaj opisujemy użycie nowatorskiego testu mikropłytki, który umożliwia mechaniczną manipulację biomolekułami podczas wykonywania zespołowych testów biochemicznych. Osiąga się to za pomocą pokrywki mikropłytki zmodyfikowanej za pomocą magnesów w celu wytworzenia wielu statycznych pęset magnetycznych na mikropłytce.

Streszczenie

Mechanobiologia opisuje, jak siły fizyczne i właściwości mechaniczne materiału biologicznego przyczyniają się do fizjologii i choroby. Zazwyczaj podejścia te są ograniczonymi metodami jednocząsteczkowymi, co ogranicza ich dostępność. Aby zaspokoić tę potrzebę, opracowano test mikropłytkowy, który umożliwia mechaniczną manipulację podczas wykonywania standardowych testów biochemicznych. Osiąga się to za pomocą magnesów wbudowanych w pokrywkę mikropłytki w celu stworzenia wielu pęset magnetycznych. W tym formacie siła jest wywierana na biomolekuły połączone z kulkami paramagnetycznymi, co odpowiada typowej pęsetie magnetycznej. Badanie demonstruje zastosowanie tego narzędzia w testach opartych na FRET do monitorowania konformacji białek. Jednak podejście to ma szerokie zastosowanie w różnych systemach biologicznych, począwszy od pomiaru aktywności enzymatycznej, a skończywszy na aktywacji szlaków sygnałowych w żywych komórkach.

Wprowadzenie

Mechanobiologia skupia się na zrozumieniu, w jaki sposób rozchodzenie się sił fizycznych wewnątrz i pomiędzy komórkami reguluje aktywność komórkową^1,2 i jak to koreluje z organizacją i dynamiką zarówno białek, jak i komórek.

Pomiary siły pojedynczej cząsteczki ujawniły, jak siła jest wykorzystywana w systemach biologicznych, od pojedynczych białek do całych komórek i tkanek^3,4,5^,6,7. Te trudne eksperymenty wymagają specjalistycznego sprzętu i wiedzy technicznej. I odwrotnie, standardowe testy biochemiczne można wykonywać z większą przepustowością w łatwo dostępnym sprzęcie komercyjnym.

Tutaj badanie opisuje test mechanobiologiczny, który umożliwia jednoczesne manipulowanie i testy biochemiczne oparte na pęsetach magnetycznych⁸. Magnesy są umieszczane na wydrukowanej w 3D pokrywie mikropłytki (Rysunek 1A-D), umożliwiając korzystanie z komercyjnych czytników płytek do testów. Siła jest przykładana do biocząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania poprzez sprzężenie cząsteczki z cząstkami paramagnetycznymi. Następnie magnesy wywierają napięcie na cząsteczkę. Zmiana odległości między cząstkami a magnesami dostosowuje siłę wywieraną na biomolekułę (Rysunek 1E).

Przedstawiamy użycie tego testu za pomocą silnika molekularnego opartego na aktynie, Myosin VI. Miozyna VI jest regulowana przez wewnątrzcząsteczkowe fałdowanie wsteczne⁹. Wykazano, że miozyna VI istnieje w stanie autohamowania, w którym wiązanie białek partnerskich, takich jak NDP52, wyzwala rozwijanie miozyny VI^10,11. Aby wykonać te testy, użyjemy podwójnie znakowanego konstruktu domeny ogona miozyny VI z N-końcowym GFP i C-końcowym RFP, w którym odwrotne fałdowanie białka generuje transfer energii rezonansu fluorescencji (FRET) między GFP a RFP. N-koniec zawiera również znacznik biotynylacji, który unieruchamia białko na powierzchni. Używamy tego testu w połączeniu z pomiarami FRET, aby pokazać, jak siła może wpływać na fałdowanie wsteczne miozyny VI.

Protokół

Białka wzorcowe wymagane do tego eksperymentu oraz lista odczynników znajdują się w Tabeli materiałów. W celu pomiaru zmian konformacyjnych w badanym systemie użytkownika należy przygotować odpowiednie białka.

1. Drukowana w 3D pokrywa magnetyczna

1. Zaprojektuj pokrywkę do mikropłytki, która pomieści magnesy wewnątrz mikropłytki 24-dołkowej. Przykładowy plik CAD można pobrać z serwisu GitHub¹². Wymiary przedstawiono na Rysunku 1.
   UWAGA: Wysokość podstawy można zmieniać, aby zmodyfikować odległość między magnesami a powierzchnią, co pozwala na zmianę przyłożonej siły. Ponadto końcowa siła działająca na cząstkę zależy od rozmiaru cząstki oraz przerwy między parą magnesów. Równania do obliczenia przyłożonej siły dla cząstek o rozmiarach 1 µm i 2,8 µm przy przerwach wynoszących 0,5 mm, 1 mm i 2 mm podano w pracy Dos Santos et al.⁸. W przypadku opisanych tutaj eksperymentów z cząstkami 2,8 µm i przerwą 2 mm, należy zastosować Równanie 1.
   Równanie 1:
2. Wydrukuj pokrywkę do mikropłytki w technologii druku 3D, używając glikolu polietylenotereftalanowego (PETG) w systemie drukarki 3D.
   UWAGA: Użyj drukarki z rozdzielczością warstw 0,02 mm, aby zapewnić dokładność i powtarzalność. Wpływ dokładności drukarki omówiono w pracy Dos Santos et al.⁸.
3. Przymocuj pary neodymowych magnesów N42 w kształcie sześcianu o boku 5 mm do podstaw za pomocą kleju, orientując bieguny magnetyczne tak, aby pole było skierowane w stronę dna mikropłytki.
4. Pozostaw co najmniej jedną pozycję pustą, aby służyła jako kontrola bez magnesu.
5. Przechowuj w szczelnym pojemniku o wystarczającym rozmiarze, aby umożliwić łatwe zakładanie i zdejmowanie pokrywki.

2. Modyfikacja powierzchni mikropłytki

1. Należy przygotować czystą, niepoddaną obróbce mikropłytkę 24-dołkową z szklanym dnem.
2. Dołki należy przemyć 3 razy 500 µL buforu do mycia (50 mM Tris-HCl (pH 7.5) i 50 mM NaCl) w temperaturze pokojowej.
3. Należy dodać 200 µL biotynylowanego BSA (0.2 mg/mL) w buforze do mycia i pozostawić na 15 min w temperaturze pokojowej.
   UWAGA: Biotynylowane BSA służy zarówno do pasywacji, jak i do przyłączania. Można zastosować inne strategie pasywacji i przyłączania do powierzchni. Przy pierwszym użyciu i podczas optymalizacji stężenie biotynylowanego BSA można zwiększyć do 1 mg/mL.
4. Dołki należy przemyć 3 razy 500 µL buforu do mycia.
5. Należy dodać 200 µL streptawidyny (20 µg/mL) w buforze do mycia i pozostawić na 15 min w temperaturze pokojowej.
   UWAGA: Przy pierwszym użyciu stężenie streptawidyny można zwiększyć do 1 mg/mL.
6. Należy usunąć roztwór, a następnie przemyć dołki 3 razy buforem do mycia.
7. Dołki należy przykryć 500 µL buforu do mycia.
8. Przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia. Płytki należy wykorzystać w tym samym dniu.

3. Przygotowanie próbki: Immobilizacja białka

1. Pozostaw zmodyfikowaną powierzchniowo mikropłytkę do osiągnięcia temperatury pokojowej.
2. Przemyj dołki 500 µL buforu do mycia.
3. Dodaj 100 nM białka biotin-eGFP-Myosin VI Tail-mRFP (roztwór białka zapasowego) i inkubuj przez 15 min w temperaturze pokojowej w buforze do mycia.
   UWAGA: Przykład tego białka został przygotowany zgodnie z opisem Dos Santos et al.⁸. Stężenia i czasy inkubacji mogą się różnić w zależności od rodzaju białka.
4. Przemyj dołki 3x 500 µL buforu do mycia.
5. Skonfiguruj czytnik płytek do rejestracji widm fluorescencji dla GFP (wzbudzenie 490 nm i emisja 510-600 nm) oraz RFP (wzbudzenie 560 nm i emisja 580-650nm), aby potwierdzić obecność białek fuzyjnych.
6. W przypadku braku białka zwiększ stężenie w kroku 3.3.
   UWAGA: Słabe wiązanie może wynikać z niewystarczającego wiązania biotynyl化した BSA i/lub streptawidyny, w związku z czym ilości te można zwiększyć 10-krotnie.
7. Jeśli to możliwe, przeprowadź pomiar skanowania dołka, aby sprawdzić, czy białko fuzyjne jest związane w obrębie mikropłytki (Rysunek 2).
   UWAGA: Pomiar ten zarejestruje intensywność fluorescencji w określonych punktach dołka mikropłytki. Pozwoli to ustalić, czy białko jest związane w całym dołku.
8. Upewnij się, że sygnał jest jednorodny (w granicach 5%) w centrum dołka, w którym odbywa się pomiar analizy.

4. Przygotowanie kulek magnetycznych

1. Wymieszaj w vorteksie fiolkę z 2,8 µm paramagnetycznymi kuleczkami z rekombinowaną Proteiną A (Tabela materiałów) przez 30 s, aby resuspender kuleczki.
2. Przenieś objętość odpowiadającą 1 mg kuleczek paramagnetycznych do probówki 1,5 mL.
3. Umieść probówkę w izolatorze magnetycznym (Tabela materiałów), a następnie usuń nadsącz.
4. Resuspender kuleczki w 200 µL PBS, delikatnie pipetując roztwór w górę i w dół.
5. Umieść probówkę w izolatorze magnetycznym, a następnie usuń nadsącz.
6. Powtórz etap płukania 3x.
7. Rozcieńcz 10 µg przeciwciała Anti-RFP w 200 µL PBS.
8. Wyizoluj kuleczki w izolatorze magnetycznym, a następnie resuspender je w roztworze przeciwciał.
9. Inkubuj przy 20 rpm przez 10 min w temperaturze pokojowej na rotatorze laboratoryjnym.
10. Umieść probówkę w izolatorze magnetycznym i usuń nadsącz.
11. Przepłucz 3x w PBS.
12. Resuspender kuleczki w 200 µL buforu do płukania.
13. Aby potwierdzić immobilizację przeciwciał na kuleczkach, inkubuj kuleczki obciążone przeciwciałami z roztworem białka fuzyjnego RFP o stężeniu >1 µM.
    UWAGA: Potwierdź wizualnie, czy białko zostało wyizolowane przez kuleczki.
14. Alternatywnie, zmierz intensywność fluorescencji nadsączu (wzbudzenie 560 nm i emisja 580-650nm) dla RFP w spektrometrze fluorescencyjnym.

5. Przygotowanie próbek: Przyłączanie kulek

1. Do dołków mikropłytki z unieruchomionym białkiem dodać 10 µg fuzji kuleczek paramagnetycznych z przeciwciałem rozcieńczonej w buforze do płukania (200 µL).
2. W jednym dołku kontrolnym nie umieszczać kuleczek, aby sprawdzić wpływ kuleczek na sygnał fluorescencyjny. Przygotować próbkę kontrolną bez przeciwciał w celu określenia ewentualnych nieswoistych oddziaływań z kuleczkami.
3. Inkubować mikropłytkę w temperaturze pokojowej przez 30 min.
4. Przepłukać dołki 3x przy użyciu 500 µL buforu do płukania.
5. Jeśli jest to możliwe, sprawdzić pod mikroskopem w świetle przechodzącym, czy kuleczki są związane z powierzchnią. W przypadku braku kuleczek zwiększyć stężenie w kroku 5.1 do 500 µg/mL.

6. Pozyskiwanie danych

1. Umieść mikropłytkę, bez pokrywki, w czytniku płytek fluorescencyjnych w temperaturze 25 °C.
2. Skonfiguruj czytnik płytek do rejestracji widm fluorescencji dla GFP (wzbudzenie 490 nm i emisja 510-600 nm) oraz RFP (wzbudzenie 560 nm i emisja 580-650 nm), aby potwierdzić obecność białek fuzyjnych.
   UWAGA: Pomiar/rejestrację widm fluorescencji należy przeprowadzić przez dno mikropłytki, aby móc nałożyć na nią pokrywkę. W związku z tym należy wybrać odpowiedni czytnik mikropłytek.
3. Zarejestruj widmo fluorescencji FRET (wzbudzenie 490 nm i emisja 510-650nm) lub monitoruj fluorescencję przy 510 nm i 610 nm przy wzbudzeniu 490 nm. Konfigurację przeprowadź zgodnie z wytycznymi producenta.
4. Wyjmij mikropłytkę z czytnika i nałóż magnetyczną pokrywkę.
5. Umieść płytkę z powrotem w czytniku i pozostaw próbkę na 2 min.
6. Powtórz pomiar FRET, zgodnie z krokiem 6.3.

7. Analiza danych

1. Wyeksportuj dane w celu ich importu do arkusza kalkulacyjnego (np. Excel).
2. Ręcznie wyodrębnij dane dla donora GFP przy 510 nm oraz akceptora RFP przy 610 nm.
3. Oblicz względny FRET dla każdego stanu, korzystając z równania 2.
   Równanie 2:
   A: intensywność akceptora (RFP 610 nm), D: intensywność donora (GFP 510 nm).
   UWAGA: Użyj rekombinowanego RFP w tych samych warunkach wzbudzenia i emisji, aby skontrolować tło wzbudzenia akceptora.

Wyniki

Rysunek 2 przedstawia przykład pomiaru skanowania dołka, w którym natężenie fluorescencji GFP zostało zarejestrowane w odstępach 1 mm w obrębie dołka mikropłytki. Typowe pomiary fluorescencji są wykonywane w pozycji centralnej dołka mikropłytki (pozycja 8,8 na Rysunku 2); dlatego ważne jest, aby w tym miejscu znajdowało się związane białko. Jak pokazano na Rysunku 2, natężenie jest najwyższe w centrum dołka w promieniu kilku milimet...

Dyskusja

Takie podejście umożliwia łatwe zastosowanie pomiarów opartych na sile w mikropłytce za pomocą czytników płytek fluorescencyjnych. Co ważne, ten format testu zakłada, że białko funkcjonalne jest związane, gdy jest związane z powierzchnią. Dlatego przed przystąpieniem do tych pomiarów wymagana jest wcześniejsza wiedza, aby upewnić się, że występuje aktywność białka. Korzystne jest również upewnienie się, że wiązanie cząsteczek z kulkami paramagnetycznymi i powierzchnią jest zoptymalizowane dla każdego systemu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
24-dołkowa mikropłytka ze szklanym dnem	Cellvis	P24-1.5H-N	Dostępnych jest wiele źródeł. O ile nie jest to konieczne, najlepiej unikać powierzchni poddanych obróbce i używamy szkła klasy obrazowania N1.5.
Przeciwciało anty-RFP	Abcam	ab290	Dostępnych jest wiele źródeł, ale należy zapewnić minimalną reaktywność z GFP.
Mikroskop laboratoryjny	Optika	IM-3
Rotator laboratoryjny	Cole-Palmer-Stuart	SB3
Biotin-BSA	Sigma Aldrich	A8549
Oprogramowanie CAD - Sketch Up Educator	Sketch Up		Można korzystać z alternatywnych programów CAD. Użytkownicy powinni upewnić się, że formaty plików są kompatybilne z ich drukarką 3D.
Dynabeads Protein A	Fisher Scientific	10746713	2,8 & mikro; m Koraliki paramagnetyczne z rekombinowanym białkiem A
Udarowy klej kontaktowy	EVO-STIK
MagnaRack magnetyczny stojak separacyjny	ThermoFisher Scientific	CS15000	Izolator magnetyczny
NaCl	Fisher Scientific	10316943
Neodymium N42 kostka 5mm Magnesy	Supermagnete	W-05-N
Czytnik płytek - ClarioStar	BMG Labtech		Wszystkie systemy czytników płytek mogą być stosowane tam, gdzie możliwe są pomiary spod mikropłytki. Pokrywa magnesu wyklucza standardowe pomiary od góry
Streptavidin	Sigma Aldrich	189730
Tris-HCl	Fisher Scientific	10142400
Ultimaker PETG Filament	Ultimaker Ultimaker
S3 - drukarka 3D	Ultimaker