Ten protokół przedstawia test wychwytu aminokwasów znakowany radioaktywnie, który jest przydatny do oceny zużycia aminokwasów zarówno w komórkach pierwotnych, jak i w izolowanych kościach.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ocena zużycia aminokwasów w hodowanych komórkach kostnych i izolowanych trzonach kostnych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Rozwój i homeostaza kości zależy od różnicowania i aktywności kościotwórczych osteoblastów. Różnicowanie osteoblastów charakteryzuje się sekwencyjną proliferacją, po której następuje synteza białek i ostatecznie wydzielanie macierzy kostnej. Proliferacja i synteza białek wymagają stałego dostarczania aminokwasów. Mimo to bardzo niewiele wiadomo na temat zużycia aminokwasów w osteoblastach. Tutaj opisujemy bardzo czuły protokół, który ma na celu pomiar zużycia aminokwasów za pomocą aminokwasów znakowanych radioaktywnie. Metoda ta jest zoptymalizowana pod kątem ilościowego określania zmian w wychwytywaniu aminokwasów, które są związane z proliferacją lub różnicowaniem osteoblastów, leczeniem lekami lub czynnikami wzrostu lub różnymi manipulacjami genetycznymi. Co ważne, metoda ta może być stosowana zamiennie do ilościowego określania zużycia aminokwasów w hodowanych liniach komórkowych lub komórkach pierwotnych in vitro lub w izolowanych trzonach kostnych ex vivo. Wreszcie, naszą metodę można łatwo dostosować do pomiaru transportu dowolnego z aminokwasów, a także glukozy i innych składników odżywczych znakowanych radioaktywnie.
Wprowadzenie
Aminokwasy to związki organiczne, które zawierają grupy funkcyjne aminowe (-NH2) i karboksylowe (-COOH) ze zmiennym łańcuchem bocznym, który jest specyficzny dla każdego aminokwasu. Ogólnie rzecz biorąc, aminokwasy są dobrze znane jako podstawowy składnik białka. Niedawno wyjaśniono nowe zastosowania i funkcje aminokwasów. Na przykład poszczególne aminokwasy mogą być metabolizowane w celu wytworzenia metabolitów pośrednich, które przyczyniają się do bioenergetyki, działają jako kofaktory enzymatyczne, regulują reaktywne formy tlenu lub są wykorzystywane do syntezy innych aminokwasów1,2,
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury opisane tutaj na myszach zostały zatwierdzone przez Komitety Badań nad Zwierzętami w University of Texas Southwestern Medical Center w Dallas. Protokół radiacyjny został zatwierdzony przez Komitet Doradczy ds. Bezpieczeństwa Radiacyjnego przy University of Texas Southwestern Medical Center w Dallas.
1. Wychwyt aminokwasów w komórkach (Protokół I)
- Płytka 5 x 104 komórki ST2 w każdym dołku 12-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Komórki płytki w α-MEM zawierające 10% FBS, 100 U/ml penicyliny i 0,1 μg/ml streptomycyny (Pen/Strep). Umieść dodatkowe dołki komórek, aby określić ilościow....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Transport aminokwasów jest regulowany przez wiele błonowych transporterów aminokwasów, które zostały podzielone na odrębne systemy transportowe na podstawie licznych cech, w tym specyficzności substratowej, kinetyki, a także zależności od jonów i pH25. Na przykład pobieranie glutaminy może być zapośredniczone przez Na+-zależne systemy transportowe A, ASC, γ+L i N lub Na+-niezależny System L. Systemy Na+-zależne odróżnia się zdolnością do zastąpienia Na+ .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisany tutaj protokół zapewnia szybkie i czułe podejście do oceny wychwytu aminokwasów w odpowiedzi na różne permutacje eksperymentalne, zarówno in vitro, jak i ex vivo. W porównaniu z dostępnymi na rynku zestawami (np. Glutamine and Glutamine Determination Kit), metoda ta jest znacznie bardziej czuła, szybsza i mniej pracochłonna 16,17,25. W naszym protokole oceniamy absorpcję w buforze Krebs Ringers HEPES. U.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie ujawnili żadnych informacji.
Podziękowania
Laboratorium Karnera jest wspierane przez granty R01 (AR076325 i AR071967) dla C.M.K.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,25% trypsyna | Gibco | 25200 | |
| 12-dołkowa płytka | Corning | 3513 | |
| 1 ml strzykawka | BD precyzyjna | 309628 | |
| 30G Igła | BD precyzyjna | 305106 | |
| Monochlorowodorek argininy L-[2,3,4-3H]-, 1mCi | PerkinElmer | NET1123001MC | |
| Beckman LS6500 licznik scyntylacyjny | |||
| Chlorek wapnia | Sigma | C1016 | |
| Chlorek choliny | Sigma | C7077 | |
| D-(+)-roztwór glukozy | Sigma | G8769 | |
| Narzędzie | Kleszcze, nożyczki, scapele | ||
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| Kwas etylenodiaminotetraoctowy | Sigma | E9884 | |
| HEPES(1M) | Gibco | 15630 | |
| L-[3,4-3H(N)]-Glutamina | PerkinElmer | NET551250UC | |
| Fiolki do płynnego odcinania | Sigma | Z190535 | |
| Roztwór chlorku litu, 8M | Sigma | L7026 | |
| Chlorek magnezu | Sigma | M8266 | |
| MEMα | Gibco | 12561 | |
| Probówka do mikrowirówek, 15 ml | Biotix | 89511-256 | |
| NP-40 | Sigma | 492016 | |
| Chlorek potasu | Sigma | P3911 | |
| Wodorowęglan sodu | Sigma | S6014 | |
| Chlorek sodu | Sigma | S9888 | |
| Deoksycholan sodu | Sigma | D6750 | |
| Dodecylosiarczan sodu | Sigma | 436143 | |
| Sonicator | Sonic& Materiały | VCX130 | |
| Tris Base | Sigma | 648311 | |
| Ultima Gold (roztwór scyntylacyjny) | PerkinElmer | 6013329 | |
| &alfa;-(metyloamino)izomasłowy | kwas Sigma | M2383 |
Bibliografia
- Xiao, M., et al. Inhibition of α-KG-dependent histone and DNA demethylases by fumarate and succinate that are accumulated in mutations of FH and SDH tumor suppressors. Genes & Development. 26 (12), 1326-1338 (2012).
- Altman, B. J., Stine, Z. E., Dang, C. V.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
