Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ocena zużycia aminokwasów w hodowanych komórkach kostnych i izolowanych trzonach kostnych

1.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62995

⸱

13 kwietnia 2022

 , 
1Department of Internal Medicine, University of Texas Southwestern Medical Center, 2Charles and Jane Pak Center for Mineral Metabolism and Clinical Research, University of Texas Southwestern Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół przedstawia test wychwytu aminokwasów znakowany radioaktywnie, który jest przydatny do oceny zużycia aminokwasów zarówno w komórkach pierwotnych, jak i w izolowanych kościach.

Streszczenie

Rozwój i homeostaza kości zależy od różnicowania i aktywności kościotwórczych osteoblastów. Różnicowanie osteoblastów charakteryzuje się sekwencyjną proliferacją, po której następuje synteza białek i ostatecznie wydzielanie macierzy kostnej. Proliferacja i synteza białek wymagają stałego dostarczania aminokwasów. Mimo to bardzo niewiele wiadomo na temat zużycia aminokwasów w osteoblastach. Tutaj opisujemy bardzo czuły protokół, który ma na celu pomiar zużycia aminokwasów za pomocą aminokwasów znakowanych radioaktywnie. Metoda ta jest zoptymalizowana pod kątem ilościowego określania zmian w wychwytywaniu aminokwasów, które są związane z proliferacją lub różnicowaniem osteoblastów, leczeniem lekami lub czynnikami wzrostu lub różnymi manipulacjami genetycznymi. Co ważne, metoda ta może być stosowana zamiennie do ilościowego określania zużycia aminokwasów w hodowanych liniach komórkowych lub komórkach pierwotnych in vitro lub w izolowanych trzonach kostnych ex vivo. Wreszcie, naszą metodę można łatwo dostosować do pomiaru transportu dowolnego z aminokwasów, a także glukozy i innych składników odżywczych znakowanych radioaktywnie.

Wprowadzenie

Aminokwasy to związki organiczne, które zawierają grupy funkcyjne aminowe (-NH2) i karboksylowe (-COOH) ze zmiennym łańcuchem bocznym, który jest specyficzny dla każdego aminokwasu. Ogólnie rzecz biorąc, aminokwasy są dobrze znane jako podstawowy składnik białka. Niedawno wyjaśniono nowe zastosowania i funkcje aminokwasów. Na przykład poszczególne aminokwasy mogą być metabolizowane w celu wytworzenia metabolitów pośrednich, które przyczyniają się do bioenergetyki, działają jako kofaktory enzymatyczne, regulują reaktywne formy tlenu lub są wykorzystywane do syntezy innych aminokwasów1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Wiele badań pokazuje, że metabolizm aminokwasów ma kluczowe znaczenie dla pluripotencji, proliferacji i różnicowania komórek w różnych kontekstach3,6,11,12,13,14,15,16,17.

Osteoblasty to komórki wydzielnicze, które produkują i wydzielają bogatą w kolagen pozakomórkową matrycę kostną typu 1. Aby utrzymać wysokie tempo syntezy białek podczas tworzenia kości, osteoblasty wymagają stałego dopływu aminokwasów. Aby sprostać temu zapotrzebowaniu, osteoblasty muszą aktywnie pozyskiwać aminokwasy. W związku z tym, ostatnie badania ujawniają znaczenie wychwytu i metabolizmu aminokwasów w aktywności osteoblastów i tworzeniu kości15,16,17,18,19,20.

Osteoblasty pozyskują aminokwasy komórkowe z trzech głównych źródeł: środowiska zewnątrzkomórkowego, wewnątrzkomórkowej degradacji białek i biosyntezy aminokwasów de novo. Protokół ten skupi się na ocenie wychwytu aminokwasów ze środowiska zewnątrzkomórkowego. Najczęstsze metody pomiaru wychwytu aminokwasów opierają się na aminokwasach znakowanych radioaktywnie (np. 3H lub 14C) lub znakowanych ciężkimi izotopami (np. 13C). Ciężkie testy izotopomerowe mogą analizować wychwyt aminokwasów i metabolizm bardziej dokładnie i bezpieczniej, ale są bardziej czasochłonne, ponieważ przygotowanie i wyprowadzenie próbek zajmuje jeden dzień, a analiza na spektrometrze masowym zajmuje wiele dni, w zależności od liczby próbek21,22. Dla porównania, testy wychwytu aminokwasów znakowane radioaktywnie nie dostarczają informacji na temat dalszego metabolizmu, ale są tanie i stosunkowo szybkie, ponieważ można je wykonać w ciągu 2-3 godzin od rozpoczęcia eksperymentu23,24. W tym miejscu opisujemy łatwo modyfikowalny podstawowy protokół przeznaczony do oceny wychwytu aminokwasów znakowanych radioaktywnie w hodowanych komórkach pierwotnych lub liniach komórkowych in vitro lub pojedynczych trzonach kostnych ex vivo. Zastosowanie tych dwóch protokołów można rozszerzyć na inne znakowane radioaktywnie aminokwasy oraz inne typy komórek i tkanek związanych z kośćmi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury opisane tutaj na myszach zostały zatwierdzone przez Komitety Badań nad Zwierzętami w University of Texas Southwestern Medical Center w Dallas. Protokół radiacyjny został zatwierdzony przez Komitet Doradczy ds. Bezpieczeństwa Radiacyjnego przy University of Texas Southwestern Medical Center w Dallas.

1. Wychwyt aminokwasów w komórkach (Protokół I)

  1. Płytka 5 x 104 komórki ST2 w każdym dołku 12-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Komórki płytki w α-MEM zawierające 10% FBS, 100 U/ml penicyliny i 0,1 μg/ml streptomycyny (Pen/Strep). Umieść dodatkowe dołki komórek, aby określić ilościowo liczbę komórek na warunek dla normalizacji w kroku 1.12. Inkubować komórki w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  2. Hoduj komórki przez 2-3 dni, aż do zlewania się.
  3. W dniu doświadczenia przygotuj następujące roztwory: 1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), pH 7,4 i bufor Krebs Ringers HEPES (KRH), pH 8,0: (120 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, NaHCO3, 5 mM HEPES, 1 mM D-Glukoze). Podgrzać do 37 °C.
  4. Odessać pożywkę i dwukrotnie przemyć komórki 1 ml 1x PBS, pH 7,4,
    UWAGA: Ten protokół jest również odpowiedni dla szybko dzielących się komórek niezlewających się. W takim przypadku ważne jest, aby znormalizować radioaktywność do bezwzględnej liczby komórek lub zawartości DNA. Ponadto należy rozważyć zwiększenie rozmiaru płytki hodowlanej lub kolby, aby zwiększyć ogólną liczbę komórek i wartości cpm. Ważne jest, aby ustalić to empirycznie na podstawie indywidualnej.
  5. Odessać 1x PBS i przemyć komórki raz 1 ml KRH.
  6. Przygotować 4 μCi/ml L-[3,4-3 H]-Glutaminy roboczej, rozcieńczając 4 μL [1 μCi μL-1] L-[3,4-3 H]-Glutaminy na 1 ml KRH.
    UWAGA: Przed użyciem materiałów radioaktywnych należy skontaktować się z Biurem Bezpieczeństwa Radiologicznego w swojej instytucji macierzystej w celu uzyskania zgód. Wszystkie zabiegi związane z promieniowaniem muszą być wykonywane za osłoną z pleksi.
  7. Inkubować komórki z 0,5 ml KRH zawierającego 4 μCi/ml L-[3,4-3 H]-Glutamina robocza przez 5 minut.
  8. Zebrać pożywkę radioaktywną i przelać ją do pojemnika na odpady płynne. Umyj komórki trzy razy krótko lodowatym KH, aby zakończyć reakcję. Zebrać i wyrzucić wszystkie płyny do pojemnika na odpady cieczy radioaktywnej.
  9. Dodaj 1 ml 1% SDS do każdej studzienki i rozcieraj 10 razy, aby lizować i homogenizować komórki. Przenieś lizaty komórkowe do probówek o pojemności 1,5 ml. Wyrzuć płytki do hodowli komórkowych, pipety serologiczne i końcówki pipet do pojemnika na stałe odpady promieniotwórcze.
  10. Wirować przy >10 000 x g przez 10 min. Przenieść supernatanty do fiolek scyntylacyjnych zawierających 8 ml roztworu scyntylacyjnego. Wymieszać, energicznie potrząsając fiolkami scyntylacyjnymi. Wyrzuć probówki i końcówki pipet do pojemnika na stałe odpady radioaktywne.
  11. Odczyt radioaktywności w liczbach na minutę (cpm) za pomocą licznika scyntylacyjnego. Wyrzuć fiolki scyntylacyjne do pojemnika na odpady z fiolki scyntylacyjnej.
  12. Trypsynizować, ponownie zawiesić i policzyć komórki z pozostałych nieradioaktywnych płytek komórek (patrz krok 1.1), aby oszacować liczbę komórek w zlizowanych, radioaktywnych kulturach. Za pomocą hemocytometru policz liczbę komórek w nieradioaktywnym studzience dla każdego warunku doświadczalnego. Znormalizuj cpm od kroku 1.11 do szacowanej liczby komórek z nieradioaktywnych płytek.
  13. Po zakończeniu eksperymentu należy odkazić kaptur do hodowli komórkowej, stół i wszystkie instrumenty za pomocą sprayu odkażającego radioaktywność. Na koniec wykonaj testy wycierania, aby upewnić się, że obszar roboczy jest wolny od promieniowania.

2. Wychwyt aminokwasów w świeżo wyizolowanych tkankach kostnych (Protokół II)

  1. Podgrzej KRH do 37 °C.
  2. Poddaj eutanazji 3-dniową mysz i usuń skórę z ramion. Odłącz kość ramienną od ramienia za pomocą nożyczek i wypreparuj obie kości ramienne. Usuń wszystkie tkanki uczynku uczynnego za pomocą skalpela i kleszczy. Usuń nasady z kości.
    UWAGA: Oprócz kości ramiennych, protokół ten można dostosować do noworodków kości udowej, piszczelowej i kalwarii, a także kości ramiennych, udowych i piszczelowych wyizolowanych od myszy w wieku 2 i 4 miesięcy (dane niepublikowane).
  3. Wypłucz szpik z kości i zważ trzony kostne, aby znormalizować w kroku 2.14.
  4. Gotować jedną kość ramienną w 1x PBS w temperaturze 100 °C przez 10 minut, aby usunąć komórkę z kości. Pozbawiona komórek gotowana kość jest używana jako kontrola negatywna.
    UWAGA: W ramach kontroli jakości, parafina osadza gotowane i niegotowane kości w celu barwienia histologicznego, aby wizualnie potwierdzić, że gotowanie było skuteczne w decelularizacji kości.
  5. Równowaga obu kości ramiennych w 1 ml KRH przez 30 minut w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C.
  6. Przygotować roztwór roboczy 4 μCi/ml L-[2,3,4-3 H]-argininy w KRH, rozcieńczając 4 μL 1μCi/μL L-[2,3,4-3 H]-argininy na 1 ml KRH.
    UWAGA: Protokół ten jest odpowiedni do oceny wchłaniania dowolnego wybranego składnika odżywczego znakowanego radioaktywnie. L-[2,3,4-3 H]-glutamina, L-[14CU]-alanina i L-[2,3-3 H]-prolina zostały przetestowane z podobnymi wynikami. Dane dotyczące argininy są pokazane, aby podkreślić użyteczność tego protokołu.
    UWAGA: Wszystkie zabiegi z wykorzystaniem promieniowania muszą być wykonywane za osłoną z pleksi przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej (PPE).
  7. Inkubować oddzielnie zarówno doświadczalną, jak i gotowaną kość kontrolną w KRH zawierającą 4 μCi/ml L-[2,3,4-3H]-argininy przez okres do 90 minut w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Ważne jest, aby empirycznie określić czas inkubacji dla różnych warunków, w tym wieku myszy, różnych elementów szkieletowych i rodzajów aminokwasów znakowanych radioaktywnie, wykonując przebieg czasowy. Wysycenie następuje najczęściej po około 3-4 godzinach. Wychwyt powinien być oceniany w punkcie czasowym liniowego wychwytu.
  8. Usunąć podłoże radioaktywne i wyrzucić do pojemnika na ciekłe odpady promieniotwórcze. Umyj kość ramienną trzykrotnie za pomocą lodowatego 1 ml KRH w celu zakończenia reakcji. Wyrzuć wszystkie płyny do płukania pojemnika na ciekłe odpady promieniotwórcze.
  9. Przenieś każdą kość do probówki o pojemności 1,5 ml. Dodać 500 μl buforu RIPA [150 mM NaCl; 5 mM EDTA; 50 mM Tris (pH 8,0); 0,5% NP40 (v/v); 0,5% DOX (w/v); 0,1% SDS (w/v)]. Wyrzuć płytki hodowlane, pipety serologiczne i końcówki pipet do pojemnika na radioaktywne odpady stałe.
  10. Homogenizuj kość ramienną, siekając 100 razy nożyczkami w buforze RIPA.
  11. Sonikacja (amplituda: 35%, impuls 1 s) uzyskanej homogenizowanej kości przez 10 s.
    UWAGA: Wiadomo również, że sonikacja wytwarza aerozole. Etapy sonikacji można wykonywać w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Aby ograniczyć tworzenie się aerozolu, ważne jest, aby nie przepełniać probówek. Sonikacja małych objętości próbek może spowodować niepełną sonikację lub utratę próbki z powodu pienienia. Jeśli wystąpi pienienie, odwirować próbkę przez 5 minut, aby osiadła.
  12. Klarować lizat przez odwirowywanie przez 10 minut w temperaturze >10 000 x g w temperaturze pokojowej. Przenieść 200 μl supernatantu do fiolek scyntylacyjnych zawierających 8 ml roztworu scyntylacyjnego. Wymieszać, energicznie potrząsając fiolkami scyntylacyjnymi. Wyrzucić wszystkie stałe odpady promieniotwórcze (np. zużyte probówki, końcówki do pipet, płytki itp.) do pojemnika na stałe odpady promieniotwórcze.
  13. Odczyt radioaktywności (cpm) za pomocą licznika scyntylacyjnego. Zużyte fiolki scyntylacyjne należy wyrzucić do pojemnika na odpady promieniotwórcze przeznaczonego do stosowania fiolek scyntylacyjnych.
  14. Odejmij cpm gotowanej kości (wartość podstawowa) od cpm kości doświadczalnej. Znormalizować radioaktywność z masą kości od kroku 2.3.
  15. Spryskaj kaptur do hodowli komórkowej, narzędzia i stół środkiem odkażającym radioaktywność. Wykonaj testy wycierania, aby potwierdzić, że obszar roboczy jest wolny od promieniowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Transport aminokwasów jest regulowany przez wiele błonowych transporterów aminokwasów, które zostały podzielone na odrębne systemy transportowe na podstawie licznych cech, w tym specyficzności substratowej, kinetyki, a także zależności od jonów i pH25. Na przykład pobieranie glutaminy może być zapośredniczone przez Na+-zależne systemy transportowe A, ASC, γ+L i N lub Na+-niezależny System L. Systemy Na+-zależne odróżnia się zdolnością do zastąpienia Na+ ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisany tutaj protokół zapewnia szybkie i czułe podejście do oceny wychwytu aminokwasów w odpowiedzi na różne permutacje eksperymentalne, zarówno in vitro, jak i ex vivo. W porównaniu z dostępnymi na rynku zestawami (np. Glutamine and Glutamine Determination Kit), metoda ta jest znacznie bardziej czuła, szybsza i mniej pracochłonna 16,17,25. W naszym protokole oceniamy absorpcję w buforze Krebs Ringers HEPES. U...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie ujawnili żadnych informacji.

Podziękowania

Laboratorium Karnera jest wspierane przez granty R01 (AR076325 i AR071967) dla C.M.K.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,25% trypsynaGibco25200
12-dołkowa płytkaCorning3513
1 ml strzykawkaBD precyzyjna309628
30G IgłaBD precyzyjna305106
Monochlorowodorek argininy L-[2,3,4-3H]-, 1mCiPerkinElmerNET1123001MC
Beckman LS6500 licznik scyntylacyjny
Chlorek wapniaSigmaC1016
Chlorek cholinySigmaC7077
D-(+)-roztwór glukozySigmaG8769
NarzędzieKleszcze, nożyczki, scapele
DPBSGibco14190
Kwas etylenodiaminotetraoctowySigmaE9884
HEPES(1M)Gibco15630
L-[3,4-3H(N)]-GlutaminaPerkinElmerNET551250UC
Fiolki do płynnego odcinaniaSigmaZ190535
Roztwór chlorku litu, 8MSigmaL7026
Chlorek magnezuSigmaM8266
MEMαGibco12561
Probówka do mikrowirówek, 15 mlBiotix89511-256
NP-40Sigma492016
Chlorek potasuSigmaP3911
Wodorowęglan soduSigmaS6014
Chlorek soduSigmaS9888
Deoksycholan soduSigmaD6750
Dodecylosiarczan soduSigma436143
SonicatorSonic& MateriałyVCX130
Tris BaseSigma648311
Ultima Gold (roztwór scyntylacyjny)PerkinElmer6013329
&alfa;-(metyloamino)izomasłowykwas SigmaM2383
do preparacji

Bibliografia

  1. Xiao, M., et al. Inhibition of α-KG-dependent histone and DNA demethylases by fumarate and succinate that are accumulated in mutations of FH and SDH tumor suppressors. Genes & Development. 26 (12), 1326-1338 (2012).
  2. Altman, B. J., Stine, Z. E., Dang, C. V. From Krebs to clinic: glutamine metabolism to cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 16 (10), 619-634 (2016).
  3. Karner, C. M., Long, F. Wnt signaling and cellular metabolism in osteoblasts. Cell and Molecular Life Sciences. 74 (9), 1649-1657 (2017).
  4. Zarse, K., et al. Impaired insulin/IGF1 signaling extends life span by promoting mitochondrial L-proline catabolism to induce a transient ROS signal. Cell Metabolism. 15 (4), 451-465 (2012).
  5. Nagano, T., et al. Proline dehydrogenase promotes senescence through the generation of reactive oxygen species. Journal of Cell Science. 130 (8), 1413-1420 (2017).
  6. Comes, S., et al. L-Proline induces a mesenchymal-like invasive program in embryonic stem cells by remodeling H3K9 and H3K36 methylation. Stem Cell Reports. 1 (4), 307-321 (2013).
  7. Fan, J., et al. Glutamine-driven oxidative phosphorylation is a major ATP source in transformed mammalian cells in both normoxia and hypoxia. Molecular Systems Biology. 9, 712(2013).
  8. Hosios, A. M., et al. Amino acids rather than glucose account for the majority of cell mass in proliferating mammalian cells. Developmental Cell. 36 (5), 540-549 (2016).
  9. Welbourne, T. C. Ammonia production and glutamine incorporation into glutathione in the functioning rat kidney. Canadian Journal of Biochemistry. 57 (3), 233-237 (1979).
  10. Sullivan, L. B., et al. Supporting aspartate biosynthesis is an essential function of respiration in proliferating cells. Cell. 162 (3), 552-563 (2015).
  11. Nelsen, C. J., et al. Amino acids regulate hepatocyte proliferation through modulation of cyclin D1 expression. The Journal of Biological Chemistry. 278 (28), 25853-25858 (2003).
  12. Krall, A. S., Xu, S., Graeber, T. G., Braas, D., Christofk, H. R. Asparagine promotes cancer cell proliferation through use as an amino acid exchange factor. Nature Communications. 7, 11457(2016).
  13. Green, C. R., et al. Branched-chain amino acid catabolism fuels adipocyte differentiation and lipogenesis. Nature Chemical Biology. 12 (1), 15-21 (2016).
  14. Shiraki, N., et al. Methionine metabolism regulates maintenance and differentiation of human pluripotent stem cells. Cell Metabolism. 19 (5), 780-794 (2014).
  15. Yu, Y., et al. Glutamine metabolism regulates proliferation and lineage allocation in skeletal stem cells. Cell Metabolism. 29 (4), 966-978 (2019).
  16. Shen, L., Sharma, D., Yu, Y., Long, F., Karner, C. M. Biphasic regulation of glutamine consumption by WNT during osteoblast differentiation. Journal of Cell Science. 134 (1), (2021).
  17. Karner, C. M., Esen, E., Okunade, A. L., Patterson, B. W., Long, F. Increased glutamine catabolism mediates bone anabolism in response to WNT signaling. Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 551-562 (2015).
  18. Hu, G., et al. The amino acid sensor Eif2ak4/GCN2 is required for proliferation of osteoblast progenitors in mice. Journal of Bone and Mineral Research. 35 (10), 2004-2014 (2020).
  19. Rached, M. T., et al. FoxO1 is a positive regulator of bone formation by favoring protein synthesis and resistance to oxidative stress in osteoblasts. Cell Metabolism. 11 (2), 147-160 (2010).
  20. Elefteriou, F., et al. ATF4 mediation of NF1 functions in osteoblast reveals a nutritional basis for congenital skeletal dysplasiae. Cell Metabolism. 4 (6), 441-451 (2006).
  21. Maleknia, S. D., Johnson, R. Mass spectrometry of amino acids and proteins. Amino Acids, Peptides and Proteins in Organic Chemistry. , 1-50 (2011).
  22. Rennie, M. J. An introduction to the use of tracers in nutrition and metabolism. The Proceedings of the Nutrition Society. 58 (4), 935-944 (1999).
  23. Hahn, T. J., Downing, S. J., Phang, J. M. Amino acid transport in adult diaphyseal bone: contrast with amino acid transport mechanisms in fetal membranous bone. Biochimica Biophysica Acta. 183 (1), 194-203 (1969).
  24. Rosenbusch, J. P., Flanagan, B., Nichols, G. Active transport of amino acids into bone cells. Biochimica Biophysica Acta. 135 (4), 732-740 (1967).
  25. Kandasamy, P., Gyimesi, G., Kanai, Y., Hediger, M. A. Amino acid transporters revisited: New views in health and disease. Trends in Biochemical Sciences. 43 (10), 752-789 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wch anianie aminokwas wr nicowanie osteoblast wsekrecja macierzy kostnejaminokwasy znakowane promieniotw rczowch anianie glutaminywch anianie argininytest trzpienia kostnegoliczenie scyntylacyjneprotok hodowli kom rkowychtransport sk adnik w od ywczych
Ocena zużycia aminokwasów w hodowanych komórkach kostnych i izolowanych trzonach kostnych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.