Artykuł metodologiczny

Respirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny bioenergetyki w komórkach i tkankach za pomocą respirometrów komorowych i płytkowych

5.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63000

⸱

26 października 2021

 , 
1Department of Biochemistry and Developmental Biology, Faculty of Medicine, University of Helsinki

W tym artykule

Podsumowanie

Ocena fosforylacji oksydacyjnej za pomocą respirometrów o wysokiej rozdzielczości stała się integralną częścią analizy funkcjonalnej mitochondriów i metabolizmu energii komórkowej. W tym miejscu przedstawiamy protokoły analizy metabolizmu energii komórkowej za pomocą respirometrów komorowych i mikropłytkowych o wysokiej rozdzielczości oraz omawiamy kluczowe zalety każdego urządzenia.

Streszczenie

Respirometria o wysokiej rozdzielczości (HRR) umożliwia monitorowanie fosforylacji oksydacyjnej w czasie rzeczywistym w celu analizy indywidualnych stanów energetycznych komórek i oceny kompleksów oddechowych przy użyciu zróżnicowanych protokołów miareczkowania substrat-rozprzęgacz-inhibitor (SUIT). Zademonstrowano tutaj zastosowanie dwóch urządzeń do respirometrii o wysokiej rozdzielczości oraz przedstawiono podstawowy zbiór protokołów mających zastosowanie do analizy hodowanych komórek, włókien mięśnia szkieletowego i mięśnia sercowego oraz tkanek miękkich, takich jak mózg i wątroba. Protokoły dla hodowanych komórek i tkanek są dostępne dla respirometru komorowego i hodowanych komórek dla respirometru opartego na mikropłytkach, przy czym oba obejmują standardowe protokoły oddychania. Do celów porównawczych z obydwoma urządzeniami wykorzystuje się komórki HEK293 z niedoborem translacji mitochondrialnej powodujące wieloraki niewydolność układu oddechowego, aby wykazać defekty komórkowe w oddychaniu. Oba respirometry pozwalają na kompleksowy pomiar oddychania komórkowego wraz z ich odpowiednimi zaletami technicznymi i przydatnością w zależności od pytania badawczego i badanego modelu.

Wprowadzenie

Mitochondria pełnią kluczową rolę w dostarczaniu energii i są organellami przedziałowymi uczestniczącymi w niezbędnych komórkowych procesach bioenergetycznych i metabolicznych, takich jak anabolizm nukleotydów, lipidów i aminokwasów oraz biogeneza klastrów żelazo-siarka, a także biorą udział w sygnalizacji, m.in. w kontrolowanej śmierci komórki1,2,3. Bioenergetyka mitochondrialna oparta na fosforylacji oksydacyjnej zasila niemal wszystkie procesy wewnątrzkomórkowe, w związku z czym dysfunkcje mitochondriów pochodzenia pierwotnego lub wtórnego są powiązane z szerokim spektrum stanów chorobowych4,5. Dysfunkcja mitochondrialna obejmuje nie tylko zmiany w strukturze lub gęstości mitochondriów, ale także w jakości i regulacji układu oddechowego6. Ten element jakościowy obejmuje kontrolę substratową, charakterystykę sprzęgania, modyfikacje potranslacyjne, dynamikę grzebieni oraz superkompleksy oddechowe7,8. Dlatego też dokładna analiza bioenergetyki mitochondrialnej w podejściach eksperymentalnych i diagnostycznych do oceny metabolizmu energetycznego komórki jest istotna zarówno w stanach zdrowia, jak i choroby.

Mitochondrialna fosforylacja oksydacyjna (OXPHOS) to sekwencja reakcji w obrębie łańcucha oddechowego lub systemu transportu elektronów (ETS), służąca do generowania energii komórkowej w postaci trifosforanu adenozyny (ATP)9. Wieloenzymatyczny etap pozyskiwania energii z przepływu elektronów przez kompleksy I i II do kompleksu IV generuje elektrochemiczny gradient protonowy przez wewnętrzną błonę mitochondrialną, który jest następnie wykorzystywany do fosforylacji difosforanu adenozyny (ADP) do ATP za pośrednictwem kompleksu V (syntazy ATP F1FO) (Rysunek 1A).

Po pierwsze, podczas cyklu kwasu cytrynowego (TCA), glikolizy i utleniania pirogronianu generowane są dwa przenośniki elektronów: nikotynamidoadeninowy dinukleotyd (NADH) oraz dihydroflawinoadeninowy dinukleotyd (FADH2). NADH jest utleniany w kompleksie I (dehydrogenaza NADH), podczas czego dwa elektrony są przekazywane do koenzymu Q (chinon zostaje zredukowany do chinolu), a protony są pompowane do przestrzeni międzybłonowej (IMS). Po drugie, kompleks II (dehydrogenaza bursztynianu) utlenia FADH2 i przekazuje elektrony do koenzymu Q bez pompowania protonów. Po trzecie, w kompleksie III (cytochrom c reduktaza), elektrony z koenzymu Q są przenoszone na cytochrom c, podczas gdy protony są pompowane do IMS. Po czwarte, cytochrom c przenosi elektrony do kompleksu IV (oksydaza cytochromu c), który jest ostatnim kompleksem pompującym protony i w którym tlen pełni funkcję akceptora elektronów w celu asymilacji protonów, co ostatecznie prowadzi do powstania wody. To właśnie ten tlen jest zużywany przez mitochondria, co można zmierzyć za pomocą oksygrafu. Na koniec, protony generowane przez kompleks I, kompleks III i kompleks IV są wykorzystywane do napędzania rotacji kompleksu V, co prowadzi do syntezy ATP9.

Co istotne, transport elektronów nie odbywa się wyłącznie w sposób liniowy, określany mianem łańcucha transportu elektronów. Zamiast tego elektrony mogą być przekazywane do puli koenzymu Q poprzez wiele szlaków oddechowych, co umożliwia zbieżny przepływ elektronów. Na przykład substraty NADH oraz bursztynian mogą wchodzić w proces odpowiednio poprzez kompleks I i kompleks II. Elektrony pochodzące z utleniania kwasów tłuszczowych mogą być przekazywane za pośrednictwem kompleksu białka przenoszącego elektrony (etf). W rzeczywistości kompleksowa analiza OXPHOS wymaga holistycznego podejścia z zastosowaniem odpowiednich substratów energetycznych (Rysunek 1A).

Schemat mitochondrialnego OXPHOS z wykresami zużycia tlenu w eksperymentach komórkowych.
Rycina 1: Mitochondrialna fosforylacja oksydacyjna oraz specyficzne protokoły dla substratów i inhibitorów. (A) Mitochondrium i schemat systemu transportu elektronów (CI-CIV) oraz mitochondrialnej syntazy ATP F1F0 (CV). Wszystkie struktury pochodzą z PDB. Na rysunkach przedstawiono wyłącznie substraty i inhibitory opisane w niniejszym badaniu). (B) Przykładowy zapis przepływu tlenu w nienaruszonych komórkach HEK293 z zastosowaniem standardowego protokołu w urządzeniu mHRR. (C) Przykładowy zapis przepływu tlenu w nienaruszonych komórkach HEK293 z zastosowaniem standardowego protokołu w urządzeniu cHRR. (D) Przykładowy zapis przepływu tlenu w permeabilizowanych fibroblastach ludzkich od zdrowego dawcy z odpowiednim protokołem SUIT. Skróty: 1 = respiracja rutynowa nienaruszonych komórek; 2 = stan 2; 3 = stan 3(I); 4 = stan 3(I) z cytC; 5 = stan 3 (I+II); 6 = przeciek(OM); 7 = wydajność ETS; 8 = S(ROT); 9 = ROX; 10 = TMPD; 11 = Az. ROT = rotenon, AM = antymycyna, ATP = trifosforan adenozyny, Az = azydek, OM = oligomycyna, FCCP = karbonylocyjanid p-trifluorometoksyfenylohydrazon; Asc = askorbinian, TMPD = N,N,N′,N′-tetrametylop-fenylendiamina, Succ = bursztynian, M = jabłczan, P = pirogronian, ADP = difosforan adenozyny, NAD = nikotynamidoadeninowy dinukleotyd, IMS = przestrzeń międzybłonastowa, FAD = flawinoadeninowy dinukleotyd. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza wydajności mitochondrialnego OXPHOS za pomocą HRR stała się kluczową metodą biochemiczną o wartości diagnostycznej nie tylko w przypadku pierwotnych wad mitochondrialnych10,11, ale także w innych obszarach biologii, takich jak nowotwory i procesy starzenia12. HRR umożliwia oznaczenie oddychania komórkowego poprzez analizę wydajności mitochondrialnego OXPHOS, co bezpośrednio odzwierciedla niedobory poszczególnych lub połączonych kompleksów oddechowych mitochondriów, a pośrednio wiąże się z dysfunkcją komórkową i zaburzeniami metabolizmu energetycznego9. Metodologicznie pomiary oddychania przeprowadza się z wykorzystaniem komórek, tkanek lub izolowanych mitochondriów11,13,14, podczas gdy materiał zamrożony jest tylko częściowo odpowiedni15,16. Wykazano, że tkanka zamrożona posiada nienaruszony ETS z zachowaną stabilnością superkompleksów15. W związku z tym, w przeciwieństwie do tradycyjnych produktów pośrednich TCA, odpowiednie substraty są dostarczane bezpośrednio do ETS. Jednakże sprzężenie między ETS a syntezą ATP zostaje utracone, ponieważ integralność błony zostaje naruszona w wyniku uszkodzeń mroźniczych (tworzenia się kryształków lodu).

Doświadczenia dotyczące oddychania zazwyczaj przeprowadzane są w temperaturze fizjologicznej 37 °C dla organizmów endotermicznych, z wykorzystaniem komórek lub tkanek niepermeabilizowanych lub permeabilizowanych. Podczas gdy pierwsze uwzględniają metaboliczny kontekst cytozolowy, drugie pozwalają na określenie wkładu energetycznego poszczególnych kompleksów OXPHOS orazt ATPase poprzez dodawanie specyficznych substratów (i inhibitorów). Sekwencja i zmienność substratów oraz inhibitorów doprowadziły do opracowania szerokiego wachlarza protokołów SUIT17 i testów18 służących do odpowiedzi na różne pytania naukowe dotyczące funkcji OXPHOS (przegląd w12). Podstawowy protokół oddychania komórkowego ocenia cztery różne stany: i) oddychanie rutynowe – oddychanie w odpowiednim medium oddechowym bez dodatku substratów lub inhibitorów, z wykorzystaniem wyłącznie substratów endogennych. Stan ten może ujawnić ogólne defekty OXPHOS lub wtórnie indukowane defekty oddychania spowodowane na przykład zmienionymi profilami metabolitów. Następnie dodanie oligomycyny, inhibitora ATPase, pozwala określić przepuszczalność wewnętrznej błony mitochondrialnej dla protonów, co definiuje się jako ii) oddychanie przeciekowe (leak respiration). Kolejna miareczkowanie protonofora, takiego jak odsprzęgacz karbonylowy cyjanek p-trifluorometoksyfenylohydrazona (FCCP), pozwala wyznaczyć stan, w którym pojemność ETS jest maksymalna w trybie otwartego obwodu protonowego przez błonę, definiowany jako iii) oddychanie odsprzęgane. Co ważne, stan odsprzęgany może również wystąpić w wyniku interwencji eksperymentalnych poprzez nadmierne uszkodzenia mechaniczne błon mitochondrialnych. Z kolei stan niesprzęgany odnosi się do odsprzęgania oddechowego przez mechanizm wewnętrzny, który jest kontrolowany fizjologicznie. Na koniec, całkowite zahamowanie ETS poprzez dodanie antymycyny (inhibitora kompleksu III) oraz rotenonu (inhibitora kompleksu I) pozwala wyznaczyć pozostałe zużycie tlenu (ROX) pochodzące z niemitochondrialnych procesów zużywających tlen (Rysunek 1A-C).

Bioenergetyka mitochondrialna składa się z pięciu odrębnych stanów oddychania19,20. Oddychanie w stanie 1 odbywa się bez dodatkowych substratów lub ADP, poza tymi, które są dostępne endogennie. Po dodaniu ADP, ale wciąż bez substratów, osiągane jest oddychanie w stanie 2. Po dodaniu substratów, umożliwiających transfer elektronów i syntezę ATP, następuje oddychanie w stanie 3. W tym stanie można zdefiniować wydajność OXPHOS przy nasycających stężeniach ADP, fosforanu nieorganicznego, tlenu oraz substratów związanych z NADH i bursztynianem. Oddychanie w stanie 4 lub oddychanie LEAK można zdefiniować jako stan bez ADP lub z chemicznie zahamowaną syntazą ATP przy jednoczesnej dostępności odpowiedniej ilości substratów. Na koniec, gdy cały tlen zostanie wyczerpany (warunki anoksyczne) w układzie z zamkniętą komorą, obserwuje się oddychanie w stanie 5.

Istnieje kilka metod oceny stanów energetycznych komórek14, przy czym w aktualnej ocenie OXPHOS w czasie rzeczywistym dominują dwa urządzenia analizujące zużycie tlenu, mierzone jako funkcja spadku zawartości tlenu w czasie w systemie z zamkniętą komorą, których zastosowanie zależy od modelu eksperymentalnego i pytania badawczego: respirometr wysokiej rozdzielczości Oroboros 2k oraz analizator strumieni zewnątrzkomórkowych Seahorse XF. Oba urządzenia rejestrują szybkość zużycia tlenu jako spadek w pikomolach (pmol) tlenu (O2) na sekundę jako wartość bezwzględną wewnątrz komory lub dołka mikropłytki. Specyficzne zużycie tlenu w przeliczeniu na masę uzyskuje się poprzez normalizację odpowiedniego zużycia tlenu w konkretnym buforze w stosunku do liczby komórek (miliony), masy tkanki (mg) lub ilości białka.

O2k (Oroboros Instruments) to zamknięty system dwukomorowy wyposażony w polarygraficzny czujnik tlenu (skrótowo określany jako komorowy respirometr wysokiej rozdzielczości: cHRR). Każda komora eksperymentalna mieści 2 mL cieczy, która jest utrzymywana w stanie jednorodnym za pomocą mieszadeł magnetycznych. Polarygraficzny czujnik tlenu wykorzystuje metodę amperometryczną do pomiaru tlenu: zawiera on złotą katodę, anodę srebrowo-chlorkową, a pomiędzy nimi roztwór KCl, tworząc ogniwo elektrochemiczne, do którego przyłożone jest napięcie (0.8 V). Tlen z medium assay dyfunduje przez 25 µm membranę z fluorowanego etylenu propylenu (przepuszczalną dla O2) i ulega redukcji na katodzie, tworząc nadtlenek wodoru. Na anodzie srebro utlenia się pod wpływem nadtlenku wodoru, generując prąd elektryczny. Prąd elektryczny (ampery) jest liniowo powiązany z ciśnieniem parcjalnym tlenu. Do obliczenia stężenia tlenu wykorzystuje się ciśnienie parcjalne tlenu oraz współczynnik rozpuszczalności tlenu w medium assay. Ponieważ ciśnienie parcjalne tlenu zależy od temperatury eksperymentalnej, a pomiary polarygraficzne są wrażliwe na temperaturę, wahania temperatury wymagają precyzyjnej regulacji (±0.002 °C) za pomocą bloku grzewczego Peltiera. Temperaturę można kontrolować w zakresie od 4 °C do 47 °C.

Analizator przepływu zewnątrzkomórkowego Seahorse XF (Agilent) jest systemem opartym na płytkach w formacie mikropłytek 24- lub 96-dołkowych, w którym trzy elektrody fluorescencyjne mierzą zużycie tlenu w czasie w każdym dołku (skrótowo określany jako respirometr wysokiej rozdzielczości oparty na mikropłytkach: mHRR). W kasecie analitycznej dostępnych jest maksymalnie cztery porty do zautomatyzowanego wtryskiwania podczas analizy. Analiza składa się z wielu cykli, z których każdy obejmuje trzy fazy: 1) mieszania, 2) oczekiwania oraz 3) pomiaru. W fazie pomiaru sondy czujników są opuszczane do mikropłytki, tworząc tymczasowo zamkniętą komorę o objętości 7-10 µL w celu pomiaru emitowanego światła. Światło to jest emitowane przez fluorofory zatopione w polimerze na końcówkach sond czujników, które wykrywają O2 na podstawie wygaszania fosforescencji. Intensywność sygnału fluorescencyjnego jest proporcjonalna do poziomu O2 i zależy od temperatury czujnika oraz medium analitycznego. W związku z tym dokładna ocena poziomu tlenu wymaga podejścia względnego z wykorzystaniem dołka kontrolnego (tła) bez próbki. Przywracanie stężenia tlenu następuje w fazie mieszania, gdy czujnik porusza się w górę i w dół, aby wymieszać objętość nad tymczasową komorą. Każdy cykl oblicza jedną wartość szybkości zużycia tlenu. Temperaturę można kontrolować w zakresie od 16 °C do 42 °C.

HRR jest złotym standardem w ocenie bioenergetyki komórkowej w pierwotnych chorobach związanych z mitochondriami oraz w ogólnym metabolizmie komórkowym. W niniejszym badaniu przedstawiono podstawowe protokoły HRR służące do oceny funkcji OXPHOS w komórkach i tkankach.

Schemat protokołu z diagramem chHRR i mHRR, komórkami ssaków, etapami przygotowania tkanek i konfiguracją płytki.
Rysunek 2: Schemat przygotowania komórek i tkanek do respirometrii cHRR oraz przygotowania komórek do respirometrii mHRR. (A) Przegląd dostarczonych protokołów. (B) Komórki ssaków (krok 1.2): osad komórek HEK293 odpowiadający 3 x 106 komórkom (lewy panel). Tkanka niefibryczna (krok 1.3): przygotowanie lizatu móżdżku mysiego w teflonowym homogenizatorze pottera o pojemności 2 mL (środkowy panel). Permeabilizacja mięśni szkieletowych indukowana saponiną (krok 1.4, prawy panel) do respirometrii cHRR. (C) Standardowy układ wysiewu na mikro płytkę (krok 2.4) i kontrola konfluencji dla analizy komórek eukariotycznych (HEK293) do respirometrii mHRR. (D, E) Schemat ładowania portu wtryskowego do respirometrii mHRR (krok 2.4). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach są przeprowadzane zgodnie z Krajową Komisją Rewizyjną ds. Eksperymentów na Zwierzętach i Regionalną Państwową Agencją Administracyjną dla Południowej Finlandii. W tym badaniu wykorzystano samce myszy C57BL/6JOlaHsd (w wieku 4-6 miesięcy). Zgodę na wykorzystanie ludzkich linii komórkowych uzyskano od instytucjonalnej komisji etycznej Uniwersytetu w Helsinkach.

1. Respirometria o wysokiej rozdzielczości: Respirometr komorowy (cHRR)

UWAGA: Eksperymenty w tej sekcji protokołu zostały przeprowadzone przy użyciu Oroboros O2k-Core: Oxygraph-2k (Tabela Materiałów)

  1. Kalibracja czujników tlenu
    1. Uruchom respirometry w temperaturze 37 °C w 2,1 ml mitochondrialnego podłoża oddechowego (MiR05, tabela 1, współczynnik rozpuszczalności: 0,92) przez >45 min i wykonaj kalibrację tlenu zgodnie z opisem21. Kontynuuj, jeśli odchylenie początkowe mieści się w zakresie ± 4 pmol/s.
      UWAGA: Duże wahania sygnału tła mogą wskazywać na konieczność konserwacji membrany czujnika lub ślady inhibitorów pozostające w komorze z poprzednich eksperymentów. Zalecana jest instrumentalna korekta strumienia tlenu w tle przed serią eksperymentów25.
    2. Rejestruj wartości kalibracji tlenu, aby monitorować działanie membrany czujnika w czasie.
      UWAGA: Ujawnia funkcję czujnika, stabilność sygnału do szumu oraz kiedy wymagana jest konserwacja membrany czujnika. W zależności od ciśnienia otoczenia, w MiR05 rozpuszcza się od 180 do 200 μmol tlenu.
    3. Usunąć cały płyn z komory przed dodaniem jakiejkolwiek próbki do medium oddechowego.
      UWAGA: Regularnie oceniaj objętość komór oddechowych na dokładnie 2 ml.
  2. Przygotowanie komórek do respirometrii o wysokiej rozdzielczości
    1. Hodowla komórek HEK293 w szalkach o średnicy 10 cmi średnicy 2 w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco Eagle's (DMEM) z wysoką glukozą uzupełnioną 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS), GlutaMax, aminokwasami endogennymi i Na-Pyruvate22 i uridine23 w celu wsparcia metabolizmu z defektem OXPHOS w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO2,
      UWAGA: Hodowlę można wyhodować każdy rodzaj komórki eukariotycznej. W przypadku większości typów komórek hodowla w naczyniu o długości 10 cm2 prowadzi do uzyskania wystarczającej liczby komórek (zwykle >3 x 106 komórek). Rutynowo sprawdzaj, czy nie ma zakażenia mykoplazmą, aby uniknąć wpływu na metabolizm komórkowy i oddychanie.
    2. Hoduj komórki bez przekraczania 90% konfluencji (Rysunek 2C).
      UWAGA: Komórki z konfluencją >90% mogą wykazywać zależne od wzrostu działanie hamujące oddychanie (jeśli nie jest zsynchronizowane lub postmitotyczny).
    3. Umyj komórki 1x PBS, odłącz 1 ml ciepłej 0,25% trypsyny, dezaktywuj trypsynę, dodając ciepły DMEM (5 ml / 10 cm2 płytka) i policz komórki za pomocą hemocytometru.
    4. Delikatnie odwirować roztwór komórek równy 2,5 x 106 komórek przy 300 x g przez 5 minut, całkowicie usunąć supernatant i ponownie zawiesić w 2,5 ml ciepłego MiR05 (1 x 106 komórek/ml) (Rysunek 2A).
    5. W przypadku komórek zawiesinowych należy policzyć i usunąć roztwór równy 2,5 x 106 komórek, osadzać i kontynuować zgodnie z opisem w kroku 1.2.4.
    6. Uruchom protokół SUIT w celu optymalizacji przepuszczalności (krok 1.6), przepuszczalnej komórki lub tkanki (krok 1.5) lub nienaruszonych komórek (krok 1.7)
      UWAGA: Aby uzyskać spójne wyniki, zaleca się utrzymywanie stałego stężenia komórek (np. 1 x 106 komórek/ml). Chociaż oddychanie jest niezależne od gęstości komórek w respirometrze24, substraty i inhibitory są w porównywalnym stężeniu podczas eksperymentów, jeśli liczba komórek jest utrzymywana na stałym poziomie.
  3. Przygotowanie tkanki niewłóknistej (np. mózgu, wątroby) do respirometrii o wysokiej rozdzielczości
    1. Wytnij jednorodny fragment tkanki o wadze 30-40 mg lub użyj całego narządu (w tym przypadku móżdżku myszy).
      UWAGA: Jeśli tkanka nie zostanie natychmiast użyta, należy przechowywać w 2 ml lodowatego MiR05, co pozwala na przechowywanie do 2 godzin dla większości tkanek. Poszczególne czasy przechowywania tkanek muszą być oceniane w szeregach czasowych.
    2. Osusz tkankę bibułą filtracyjną Whatman (ostrożnie: tkanka miękka ma tendencję do przywierania).
    3. Umieść kawałek tkanki o wielkości 30-40 mg w chłodzonym lodem homogenizatorze z politetrafluoroetylenu o pojemności 2 ml.
    4. Dodać odpowiednią ilość MiR05, aby uzyskać 20 mg/ml w celu utrzymania stosunku tkanki do buforu. Zachowaj całkowitą ilość >1,5 ml i <2 ml, aby uniknąć niewystarczającej lub nadmiernej ilości płynu do odpowiedniej przepuszczalności mechanicznej.
    5. Włóż tłuczek, powoli lizaj tkankę, ostrożnie chowając tłuczek, unikając wytwarzania próżni powodującej nadmierne uszkodzenie tkanek.
    6. Wykonaj łącznie 7 ruchów (1x zdefiniowany jako jeden ruch w górę i w dół), aż do lizy (widocznej jako mętna ciecz bez większych zanieczyszczeń) (Rysunek 2B).
      UWAGA: Liczba uderzeń w celu odpowiedniej lizy musi być przetestowana dla każdej tkanki, oceniając integralność zewnętrznej błony mitochondrialnej poprzez odpowiedź cytochromu C (krok 1.5.11). Mogą pozostać trudne do lizy części tkanki łącznej lub naczyń.
    7. Zdekantowaną tkankę przelać do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
    8. Umyj wnętrze garnka równą ilością MiR05 użytego na etapie lizy (np. 1,5 ml) i dodaj do probówki o pojemności 15 ml zawierającej teraz 3-4 ml MiR05 przy 10 mg/ml lizatu tkankowego.
    9. Dodać 2 ml zwykłego MiR05 na komorę, aby ogrzać się do 37 °C.
    10. Zakręć probówką w celu równomiernego rozprowadzenia przed powolnym pipetowaniem 500 μl (co odpowiada 5 mg) każdego lizatu na komorę, aby zminimalizować naprężenia spowodowane zimnem do 37 °C.
    11. Odczekaj >3 minuty, aż zawartość komory ogrzeje się do 37 °C przed zamknięciem komory. Usunąć nadmiar płynu z korka (ilość na komorę po zamknięciu: 4 mg).
    12. Uruchom protokół SUIT dla standardu permeabilized (krok 1.5).
  4. Przygotowanie tkanki włóknistej (mięśnie szkieletowe, mięsień sercowy) do respirometrii o wysokiej rozdzielczości
    1. Wyodrębnij twardą tkankę, usuń tkankę łączną i tłuszcz z mięśni za pomocą ostrych kleszczy w 2 ml lodowatego BIOPS (Tabela 2) pod mikroskopem preparacyjnym.
    2. Oddziel wiązki włókien (~4 mg) wzdłuż osi podłużnej za pomocą ostrych kleszczy. Usuń włókna na tyle, aby uzyskać strukturę przypominającą siatkę (Rysunek 2B).
      UWAGA: Prawidłowe mechaniczne oddzielanie i przepuszczalność włókien jest wskazywane przez utratę mioglobiny czerwonego pigmentu i zwiększoną przezierność.
    3. Przemyj i przepuszczaj wiązkę włókien w saponinie (50 μg/ml w BIOPS, przygotowanym na świeżo) przez 20 minut w temperaturze 4 °C (włókna stają się przezroczyste, co wskazuje na całkowitą przepuszczalność, Rysunek 2B).
    4. Umyć włókna dwukrotnie w MiR05 przez 5 minut na pranie w temperaturze 4 °C.
    5. Osuszyć bibułą filtracyjną i zważyć przed dodaniem do komory wypełnionej 2,1 ml MiR05.
    6. Wprowadzić korki bez całkowitego zamykania, następnie natlenić komory 2 ml czystegoO2 za pomocą strzykawki o pojemności 20 ml i zamknąć komory, przekręcając korki ruchem obrotowym. Podczas eksperymentu utrzymuj stężenieO2 w zakresie 300-500 μM, aby uniknąć ograniczenia dyfuzji tlenu.
  5. Protokół oceny rutynowego oddychania w komórkach lub tkankach
    1. Dodać próbkę do komory, jak wspomniano w krokach 1.5.2-1.5.3.
    2. Dodać 2,3 ml ciepłej zawiesiny komórek MiR05 (standardowe wejście: 1 x 106 komórek/ml jak w kroku 1.2 lub 2 mg tkanki/ml jak w kroku 1.3)
    3. Mięsień szkieletowy i mięsień sercowy (krok 1.4): Dodaj ~ 4 mg włókien przepuszczalnych saponiny do wstępnie podgrzanych 2,3 ml ciepłego MiR05, biorąc pod uwagę kroki 1.4.4-1.4.6
    4. Komory pracować w temperaturze 37 °C i prędkości mieszania 700 obr./min. Odczekaj >3 minuty, aby media mogły się odgazować i zamknij komory, przekręcając korek ruchem obrotowym. Stabilizacja klocka Peltiera sygnalizuje osiągnięcie zadanej temperatury.
    5. (OPCJONALNIE) Zmień prędkość mieszadła na 300 obr./min, aby umożliwić wydostanie się pozostałych pęcherzyków przez kapilarnę korka.
    6. Odessać nadmiar płynu na wierzchu korka. Odczekaj 10 minut, aż zostanie osiągnięty stabilny sygnał strumienia tlenu dla dowolnego typu próbki, aby zarejestrować oddychanie rutynowe/stan 1, Rysunek 1B).
    7. W przypadku pomiarów oddychania w przepuszczalnych komórkach i tkance przejdź do kroku 1.6. Dla nienaruszonych komórek z krokiem 1.8.
  6. Protokół analizy OXPHOS w przepuszczalnych komórkach lub tkankach
    1. Użyj lizowanej (przepuszczalnej) próbki tkanki lub przepuszczalnych komórek, dodając 1 μl digitoniny (8,1 mM zapasu digitoniny w dimetylosulfotlenku (DMSO)) dla końcowego stężenia 5 μg/ml w celu przepuszczalności komórek. Strumień spadnie i powinien ustabilizować się na poziomie >5 min.
      UWAGA: Digitonina jest silnie toksyczna dla dróg oddechowych, w kontakcie ze skórą lub po połknięciu.
      UWAGA: Wstrzykiwanie wszystkich chemikaliów odbywa się za pomocą precyzyjnych szklanych strzykawek. Używaj strzykawek tylko do wskazanych chemikaliów, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego, a po użyciu dokładnie umyj w wodzie i EtOH. Zablokowane strzykawki mogą wymagać ultradźwięków w ciepłym ddH2O lub drutu czyszczącego w celu usunięcia wszelkich zatorów chemicznych. Nadmiar odpowiedniego roztworu podstawowego należy zawsze wciągnąć do strzykawki, aby uniknąć wprowadzania powietrza do komór. Sprawdzić wnętrze komór pod kątem wprowadzenia powietrza po każdym wstrzyknięciu. Rejestruj każdy krok, aż strumień się ustabilizuje.
    2. Dodać w krótkich odstępach czasu: 5 μl 0,4 M jabłczanu (M) dla końcowego stężenia 1 mM, 5 μl 2,0 M pirogronianu (P; przygotowanego na świeżo), dla końcowego stężenia 5 mM, 4 μl 2,5 M glutaminianu (G) dla końcowego stężenia 5 mM.
    3. Po ustabilizowaniu się poprzedniego strumienia dodać 5 μl (10 μl dla tkanki mięśniowej) 0,5 M difosforanu adenozyny (ADP, podwielokrotności przechowywane w temperaturze -80 °C) dla końcowego stężenia 1,25 mM.
      UWAGA: Tkanki, takie jak mięśnie, mogą wymagać innego stężenia, aby osiągnąć nasycenie.
    4. Dodać 5 μl 4 mM cytochromu C (cytC) dla końcowego stężenia 10 μM.
      UWAGA: Opcjonalne dla komórek do oceny jakości przepuszczalności.
    5. Dodać 16 μl 1,25 M bursztynianu (S), aby uzyskać końcowe stężenie 10 mM. (OPCJONALNIE) Dodać 3 μl 0,5 M ADP, aby uzyskać końcowe stężenie 2 mM, aby kontrolować nasycenie stężenia ADP.
    6. W przypadku komórek i tkanek niewłóknistych dodać 2 μl oligomycyny (OM) o stężeniu 1 μg/ml.
      UWAGA: Wszystkie stosowane inhibitory ETS są wysoce toksyczne.
      UWAGA: Oligomycyna może wymagać miareczkowania w celu uzyskania optymalnego stężenia, ponieważ może hamować pojemność ETS i jest pomijana w tkance mięśniowej. Dotlenij się tutaj, gdy badana jest tkanka mięśniowa i jeśliO2 jest poniżej 300 μM.
    7. Miareczkować FCCP z 2 mM zapasu, dodawać 0,6 μl z kolejnymi krokami po 0,2 μl, aż do momentu, gdy nie nastąpi zwiększenie oddychania i oddychanie zostanie maksymalnie rozłączone (teoretycznie: niesprzężone).
    8. Dodać 1 μl 1 mM rotenonu (ROT) dla końcowego stężenia 0,5 μM. Dodać 2 μl 1 mg/ml antymycyny (AM) dla końcowego stężenia 1 μg/ml.
    9. Ponownie natlenić komory, aby osiągnąć podobny poziom tlenu (~150 μM) we wszystkich komorach, powoli podnosząc tłok ruchem skręcającym.
    10. Dodać 5 μl 0,8 M askorbinianu dla końcowego stężenia 2 mM, a następnie 5 μL 0,2 M n,n,n′,n′-tetrametylo-p-fenylenodiaminy (TMPD) dla końcowego stężenia 0,5 mM w celu oceny złożonej aktywności dożylnej (opcjonalnie).
    11. Dodać 5 μl 4 M azydku dla końcowego stężenia 10 mM natychmiast po osiągnięciu szczytowego strumieniaO2 za pomocą TMPD. Kontynuuj bieg przez >5 minuty, aby oznaczyć autoutlenianie TMPD w celu obliczenia złożonego dożylnego poziomu podstawowego.
    12. Ponownie przelicz komórki, aby potwierdzić wstępne zliczanie komórek i kontynuuj krok 1.9.
      UWAGA: Permeabilizacja digitoniny (tylko dla komórek) musi być miareczkowana w eksperymentach próbnych, aby osiągnąć maksymalny strumień i nie wpływać na integralność błony mitochondrialnej (patrz krok 1.7). Próbki przepuszczalne (zwłaszcza tkanka mięśniowa) o wzroście częstości oddechów o >10% po dodaniu cytochromu c powinny być wyłączone z dalszej analizy ze względu na uszkodzenie zewnętrznej błony mitochondrialnej. Oczekuje się krótkotrwałego spadku strumienia po dodaniu substancji chemicznych rozpuszczonych w EtOH.
  7. Protokół określający optymalne warunki przepuszczalności komórek
    1. Dodaj komórki zgodnie z opisem w krokach 1.2 i 1.5.2.
    2. Weź 10 μl 10 mg/ml digitoniny i dodaj 10 μl DMSO, aby rozcieńczyć do 5 mg/ml.
    3. Dodać 1 μl rotenonu (1 mM bulionu). Dodać 10 μl bursztynianu (2 mM bulionu) i 5 μl ADP (0,5 M bulionu).
    4. Miareczkować 1 μl digitoniny (2,5 mg na krok) wielokrotnie, aż oddychanie nie zwiększy się dalej i osiągnie maksimum.
      UWAGA: Zmniejszenie oddychania wskazuje na nadmierne stężenie digitoniny.
  8. Protokół analizy OXPHOS w nienaruszonych komórkach
    1. Po rutynowym oddychaniu (etap 1.6.1-1.6.6) dodać 2 μl oligomycyny 0,01 mM do końcowego stężenia 10 nM.
    2. Miareczkować FCCP z 2 mM zapasów, dodawać 0,6 μl z kolejnymi krokami 0,2 μl, aż do momentu, gdy dalszy wzrost oddychania i oddychanie zostanie maksymalnie rozłączone (teoretycznie: niesprzężone)
    3. Dodać 1 μl 1 mM rotenonu, aby uzyskać końcowe stężenie 0,5 μM. Dodać 2 μl 1 mg/ml zapasu antymycyny, aby uzyskać końcowe stężenie 1 μg/ml.
    4. Dotlenić komorę do tego samego poziomu tlenu (~150 μM), powoli podnosząc tłok ruchem skręcającym.
    5. Dodać 5 μl 0,8 M askorbinianu, aby uzyskać końcowe stężenie 2 mM. Natychmiast dodać 5 μl 0,2 M TMPD, aby uzyskać końcowe stężenie 0,5 mM, aby ocenić aktywność kompleksu dożylnego.
      UWAGA: Przygotuj nową partię przed jakimkolwiek większym zestawem eksperymentów, ponieważ TMPD jest podatny na autoutlenianie. Aktywność może z czasem spadać, gdy jest przechowywana w temperaturze -20 °C.
    6. Dodać 5 μl 4 M azydku dla końcowego stężenia 10 mM natychmiast po osiągnięciu szczytowego strumieniaO2 za pomocą TMPD. Kontynuuj bieg przez >5 minuty, aby oznaczyć autoutlenianie TMPD w celu obliczenia złożonego dożylnego poziomu podstawowego.
    7. Ponownie przelicz komórki, aby potwierdzić wstępne zliczanie komórek, a następnie przejdź do kroku 1.9.
  9. Pobieranie próbek po uruchomieniu
    1. Zebrać dokładnie 1 ml zawiesiny MiR05 z każdej komory (z włączonymi mieszadłami) do probówki o pojemności 1,5 ml i pojemności 1,5 ml.
    2. Odwirować przy 1000 x g dla komórek przepuszczalnych lub przy 20 000 x g dla lizatu tkankowego. Usunąć supernatant i zamrozić osad w temperaturze -80 °C w celu dalszego przetwarzania (sekcja 3).
  10. Analiza protokołów SUIT
    1. Analizuj strumień tlenu (pmol/s, znormalizowany do wejścia) na każdym plateau po dodaniu substratu lub inhibitora ( Rysunek 1C i Rysunek 3A). Wyeksportuj wartości do arkusza kalkulacyjnego.
    2. Odejmij wartość zużycia tlenu resztkowego (ROX, Rysunek 1C i Rysunek 3C) od wszystkich wartości każdej serii doświadczalnej. Odejmij oddychanie resztkowe azydku od TMPD, aby uzyskać złożone oddychanie dożylne.
    3. Wykreśl wartości bezwzględne znormalizowane dla komórki ( Rysunek 3A, B) lub danych wejściowych tkanek ( Rysunek 5A, B). Oblicz współczynniki kontroli strumienia (krok 1.11) lub znormalizuj je do wejściowego białka (Rysunek 3C).
  11. Obliczanie współczynnika regulacji strumienia
    1. Uzyskaj indeks funkcji oddechowych i kontroli sprzężenia za pomocą współczynników kontroli strumienia (FCR)9,26.
      UWAGA: Pozwala to na ocenę wewnętrznej jakości mitochondriów, niezależnie od ilości mitochondriów. Ponadto współczynniki kontroli strumienia (FCR) są porównywalne w obrębie tych samych linii komórkowych, co pozwala na kontrolę jakości odczynnika (odpowiednie FCR uzyskuje się za pomocą wskazanych ponumerowanych wartości referencyjnych w Rysunek 1B-D i Rysunek 3C).
    2. Obliczyć współczynnik kontroli oddychania dla sprzężenia OXPHOS z LEAK, korzystając z równania 1.
      równanie 1: FCRADP = 5/6 = Stan 3 / Stan 4
    3. Oblicz FCR, aby ocenić oddychanie zależne od NADH, korzystając z równania 2
      Równanie 2: Stan FCR3 (I) = 3/5 = Stan 3 (I) / Stan 3 (I+II)
    4. Oblicz FCR, aby ocenić oddychanie zależne od bursztynianu za pomocą równania 3.
      Równanie 3: Stan FCR3 (II) = 8/7 =S rot /pojemność ETS
    5. Oblicz FCR, aby ocenić sprzężone z niesprzężonym, korzystając z równania 4.
      Równanie 4: FCRsprzężony/niesprzężony = 5/7 = stan 3 (I+II) /zdolność ETS
    6. Aby przetestować integralność zewnętrznej błony mitochondrialnej, użyj równania 5.
      Równanie 5: % uszkodzenia zewnętrznej błony mitochondrialnej = 3/4 = stan 3 (I) / stan 3 (I) z cyt c

2. Respirometria o wysokiej rozdzielczości: respirometr oparty na mikropłytkach (mHRR)

UWAGA: Eksperymenty w tej sekcji protokołu zostały przeprowadzone przy użyciu analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego Seahorse XFe96 (tabela materiałów)

  1. Hodowla komórkowa
    1. Hoduj dowolny typ komórki. Przylegacze (np. kolagen, laminina) mogą być stosowane w celu ułatwienia przyczepiania komórek. W tym przypadku komórki HEK293 są hodowane jak poprzednio (krok 1.3).
    2. Dzień przed eksperymentem odłącz komórki i przenieś je do wyznaczonej 96-dołkowej mikropłytki mHRR, aby uzyskać idealną konfluencję w dniu eksperymentu (80%-100%) (Rysunek 2C).
      UWAGA: W przypadku mHRR gęstość komórek mikropłytek ma kluczowe znaczenie. Indywidualne właściwości wzrostu linii komórkowych lub zabiegów wpływających na wzrost muszą być uwzględnione, aby zapewnić porównywalną zbieżność w dniu eksperymentu.
  2. Przygotowanie komórek do respirometrii o wysokiej rozdzielczości
    1. Zebrać i ponownie zawiesić komórki w wystarczającym stopniu przed siewem
      UWAGA: Zaleca się wysiewanie komórek z tego samego rozcieńczenia dla kontrprób.
    2. Wysiewać komórki zgodnie z szybkością wzrostu poszczególnych linii komórkowych lub właściwościami wzrostu poddawanymi działaniu substancji.
      UWAGA: Zoptymalizuj na standardowej 96-dołkowej mikropłytce i ekstrapoluj gęstość komórek na 96-dołkową mikropłytkę specyficzną dla testu. W tej konfiguracji 7 x 104 komórek HEK293 WT wysiewano na dołek 96-dołkowy. Pierwsza i ostatnia kolumna 96-dołkowej płytki są używane do oznaczania białka (Rysunek 2C). Cztery studzienki narożne nie powinny zawierać żadnych komórek i służą do eksperymentalnej korekcji tła. Idealnie byłoby, gdyby studzienki blisko krawędzi były puste, aby zminimalizować efekt krawędzi (np. komórki wykazują zmienione tempo wzrostu spowodowane wpływem temperatury) (Rysunek 2C, D).
  3. Przygotowanie płytek czujnikowych, ładowanie inhibitorów
    1. W dniu testu uzupełnij 38,8 ml pożywki 0,4 ml 1 M glukozy, 0,4 ml 200 mM glutaminy i 0,4 ml 100 ml Na-pirogronianu.
      UWAGA: Oddychanie mHRR wymaga specjalistycznej niebuforowanej pożywki DMEM o pH 7,4. Ogólnie rzecz biorąc, 40 ml powinno wystarczyć na jeden eksperyment z jedną 96-dołkową mikropłytką.
    2. Podgrzać pożywkę do oznaczania oddechów do 37 °C i wymienić pożywkę do hodowli komórkowych na pożywkę do oznaczania oddychania, przemłukując dwukrotnie 80 μl na studzienkę.
    3. Umieścić płytkę z komórkami w inkubatorze o temperaturze 37 °C bez CO2 na 60 minut przed badaniem.
      UWAGA: Ten krok jest niezbędny do odgazowania płytki, ponieważ CO2 może wpływać na wyniki oddychania, a surowica w pożywce może wytwarzać pęcherzyki podczas testu.
    4. Podgrzej podwielokrotności inhibitora dla OM, FCCP, ROT i AM do temperatury 37 °C i wyjmij płytkę czujnika z inkubatora.
    5. Rozcieńczyć OM, FCCP, ROT i AM w 3 ml pożywki testowej do końcowego stężenia studzienki odpowiednio 1,5 μM, 1,125 μM i 1 μM. Wypełnij oddzielne porty, jak wskazano w Rysunek 2E.
      UWAGA: Do napełnienia wkładu czujnika zalecana jest pipeta wielokanałowa. Ponieważ do wstrzykiwania związków używa się sprężonego powietrza, wszystkie porty muszą być wypełnione równą objętością cieczy za każdym razem, gdy port jest wypełniony związkiem. ROT i AM można łączyć w jednym porcie. Inhibitory można rozpuścić w EtOH lub DMSO.
    6. Sprawdź porty wtryskowe i sprawdź równomierną objętość ładowania dla każdego portu.
      UWAGA: Wszystkie porty zawierają na dole otwór do wstrzykiwania. Należy zachować ostrożność podczas przesuwania płytki czujnika. Pęcherzyki powietrza można usunąć za pomocą igły.
  4. Protokół oceny tlenu w nienaruszonych komórkach
    1. W dniu poprzedzającym badanie należy wykonać czynności 2.4.2–2.4.7.
    2. Podwielokrotność 20 ml roztworu kalibru rozlać do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
    3. Otwórz zestaw do oznaczania strumienia zewnątrzkomórkowego i usuń zawartość.
    4. Umieść wkład czujnika odwrócony obok tabliczki narzędziowej. Odpipetować pipetą 200 μl roztworu kalibru do każdego dołka płytki użytkowej.
    5. Przymocuj wkład czujnika do tabliczki narzędziowej, zwracając uwagę, aby wszystkie czujniki były zanurzone.
    6. Umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C bez emisji CO2 na noc lub co najmniej 12 godzin. Sprawdzić, czy wilgotność wewnątrz inkubatora jest wystarczająca, aby zapobiec parowaniu kalibru.
    7. Włącz system oparty na mikropłytkach i komputer, aby były gotowe do użycia następnego dnia (maszyna potrzebuje co najmniej 3 godzin, aby zrównoważyć temperaturę do 37 °C przed przeprowadzeniem testu).
      UWAGA: Aby zapewnić stabilność sygnału, zwiększ liczbę punktów pomiarowych do 6 zamiast 3 cykli pomiarowych na stan oddechowy. Każdy cykl składa się z 3 minut mieszania i 3 minut odmierzania.
    8. W dniu testu XF wykonaj kroki 2.4.9-2.4.20.
    9. Sprawdź zbieżność płytki hodowli komórkowej, morfologię komórek i czy studzienki tła są puste.
    10. Przemyć komórki przygotowanym medium oddechowym, jak wspomniano w krokach 2.4.11-2.4.12.
    11. Usunąć wszystkie oprócz 20 μl pożywki hodowlanej z każdej studzienki. Usunąć 55 μl, jeśli pożywka hodowlana miała 80 μl z powodu odparowania przez noc (około 5 μl).
    12. Przemyć komórki dwukrotnie 90 μl pożywki do oznaczania. Na koniec dodać 100 μl pożywki testowej. Objętość końcowa powinna wynosić 120 μL.
      UWAGA: Na tym etapie zalecana jest pipeta wielokanałowa, aby upewnić się, że ta sama procedura mycia została zastosowana w każdym warunku eksperymentalnym (w zależności od konfiguracji płytki). Podczas zasysania należy przechylić płytkę pod kątem 45° i umieścić końcówki pipet w rogu studzienek w celu zasysania i wstrzykiwania płynów. Konieczne jest zachowanie ostrożności podczas mycia, ponieważ niektóre komórki mogą łatwo oderwać się od dna płytki do hodowli komórkowej.
    13. Umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C bez CO2 na 60 minut przed badaniem.
    14. Wyjmij uwodnioną płytkę wkładu czujnika z inkubatora wolnego od CO2 .
    15. Odrzucić stary roztwór kalibru i zastąpić go świeżym roztworem kalibru, wstępnie podgrzanym do temperatury 37 °C.
    16. Przygotować inhibitory i pożywkę do oznaczania (3 ml na inhibitor, co daje łącznie 12 ml pożywki do oznaczania) i użyć zbiornika na pipety do ładowania inhibitora do portów.
    17. Otwórz oprogramowanie i uruchom wstępnie zaprojektowany lub nowy szablon. Wypełnij mapę płyty, wyreguluj miareczkowanie i cykle pomiaru, a następnie naciśnij przycisk Start, aby rozpocząć kalibrację czujników optycznych.
    18. Zdejmij pokrywę z załadowanego wkładu i umieść go w gnieździe, które automatycznie wysuwa się z urządzenia, sprawdzając, czy oznaczenia w prawym dolnym rogu płytki pokrywają się z trójkątem w prawym dolnym rogu szczeliny.
    19. Kliknij Kontynuuj, aby przeprowadzić automatyczną kalibrację, trwającą około 20 minut.
    20. Po kalibracji wyjmij tabliczkę narzędziową zawierającą kaliber.
    21. Zdejmij pokrywkę z mikropłytki zawierającej komórki i umieść płytkę w szczelinie, gdy pojawi się monit urządzenia. Kliknij Kontynuuj, aby rozpocząć bieg.
  5. Pobieranie próbek po uruchomieniu
    1. Wyjąć płytkę z maszyny, ostrożnie usunąć pozostałą pożywkę do oznaczania, nie naruszając komórek, i zamrozić całą płytkę w temperaturze -80 °C do dalszego przetwarzania (sekcja 3).

3. Oznaczanie białka za pomocą testu kwasu bicinchoninowego (test BCA)

  1. Przygotować rozcieńczoną albuminę surowicy bydlęcej (BSA) w buforze używanym do ekstrakcji białek i zgodnym z BCA: 2 mg/ml, 1,5 mg/mL, 1 mg/ml, 0,5 mg/mL, 0,25 mg/ml i 0 mg/ml dla krzywej wzorcowej w duplikatach.
  2. Ekstrahować białka przez ponowne zawieszenie w odpowiednim buforze do lizy (np. RIPA) z 20 μl na studzienkę dla mHRR lub 100 μl na osad zawarty w probówce o pojemności 1,5 ml dla cHRR.
  3. Inkubować płytkę mHRR lub probówkę o pojemności 1,5 ml zawierającą lizaty białkowe przez 30 minut na lodzie.
  4. Odwirować probówkę o pojemności 1,5 ml zawierającą lizat białkowy w temperaturze 4 °C przy 20 000 x g przez 20 minut i przenieść otrzymany supernatant do nowej, czystej probówki o pojemności 1,5 ml.
  5. Użyć 10 μl na próbkę w duplikatach i wzorcach na płytce do mikromiareczkowania. Dodać 200 μl odczynnika roboczego BCA i inkubować przez >15 min.
  6. Odczytać płytkę w standardowym spektrofotometrze o długości fali 562 nm i obliczyć stężenia białka przy użyciu krzywej wzorcowej BSA.
  7. Znormalizuj wyniki oddychania do stężenia białka.
    UWAGA: Normalizacja do ilości białka pozwala potwierdzić gęstość wysiewu komórek lub wprowadzaną mokrą masę. Wyekstrahowane białka nadają się na przykład do późniejszego immunoblottingu przeciwko podjednostkom ETS, ale nie reprezentują w pełni próbki natywnej (np. utrata miejsc fosforylacji).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszym materiale przedstawiamy protokoły służące do wyznaczania bioenergetyki mitochondrialnej w komórkach eukariotycznych, tkance niewłóknistej (np. móżdżku) oraz tkance włóknistej (np. mięśniu szkieletowym). W przypadku komórek eukariotycznych, pomiarów komórek HEK293 z CRISPR-wymierzoną eliminacją dwóch różnych białek związanych z translacją mitochondrialną, co skutkuje wielokrotnym (CRISPRKO1) lub ciężkim/całkowitym niedoborem OXPHOS (CRISPRKO2), przeprowadzono przy użyciu cHRR (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Tradycyjnie, bioenergetyka mitochondriów była badana za pomocą elektrod tlenowych typu Clark. Brak rozdzielczości i przepustowości gwarantował jednak postęp technologiczny. Do tej pory O2k (określany jako cHRR) i analizator strumienia Seahorse XF96 (określany jako mHRR) były szeroko stosowane w dziedzinie bioenergetyki komórkowej. W tym miejscu przedstawiamy zrozumiały zbiór protokołów analizy metabolizmu energii komórkowej poprzez ocenę oddychania mitochondrialnego za pomocą cHRR lub mHRR, omawiamy kluczowe zalety każde...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Brak konfliktu interesów do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez fundusze z Akademii Fińskiej (C.B.J), Fundacji Magnusa Ehrnroota (C.B.J) oraz stypendium doktoranckie Integrated Life Sciences Graduate School (R.A.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2 ml Potter-Elvehjem Szkło/PTFE Młynek/homogenizatorOmni International07-358029
95% mieszaniny gazów medycznych O2, 5% CO2Potter do mielenia tkanek
PHR1279-1GChemiczny, rozpuszcza się w etanolu
BSA (bez tłuszczów)SigmaA 6003Chemiczny
CaCO3< / sub>SigmaC 4830Chemiczny
Cytochrom cSigmaC 7752Chemiczny
DigitoninaSigmaD 5628Chemiczny
DitiotreitolSigmaD 0632Chemiczny, rozpuścić w DMSO
D-sacharozaRoth4621.1Chemical
Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium (wysoka glukoza)Fisher Scientific41965-039Chemical
Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s średni  (bez glukozy)Fisher ScientificA14430-01
EGTASigmaE 4378
EtomoxirSigmaE1905Chemical
Falcon 15 ml Stożkowe probówki wirówkoweFisher ScientificAM12500Chemical
Falcon 50 mlFisher ScientificAM12501
FCCPSigmaC 2920
GlukozaSigmaG7021Chemiczna, rozpuszcza się w etanolu
GlutaminianSigmaG 1626Chemiczna
GlutaMax ( 100x)  (200 nM  Dipeptyd L-alanylo-L-glutaminy)Fisher Scientific35050061Chemical
HEK293 komórkiATTCCRL-1573
HemocytometrFisher Scientific0267151BPrzyrząd do liczenia komórek
HepesSigma H7523Chemiczny
ImidazolFluka56750Chemiczny
KClMerck1.04936Chemiczna
L-karnitynaSigmaC0283
JabłczanSigmaM 1000Chemiczny
hydrat MESSigmaM8250Chemiczny
MgCl2SigmaM 9272Chemiczny
Na2ATPSigmaA 2383Chemiczny
Na2FosfokreatynaSigmaP 7936Chemiczna
Na-pirogronian ( 100 mM)  (100x)Fisher Scientific11360070
NEAA ( Aminokwasy endogenne) 100xFisher Scientific11140035
Normal FBS ( 10x)Fisher Scientific10500064
O2k-Core: Oxygraph-2kOroboros Instruments10000-02Przyrząd do respirometrii o wysokiej rozdzielczości
O2k-Zestaw do miareczkowaniaOroboros Instruments20820-03Strzykawki Hamilton do wstrzykiwań chemicznych
OligomycynaSigmaO 4876Substancja chemiczna, rozpuszczać w etanolu
PalmitoylkarnitynaSigmaP 4509Chemiczna
penicylina-streptomycynaFisher Scientific15140122
Pierce BCA Zestaw do oznaczania białekFisher Scientific23227
PirogronianSigmaP 2256Chemiczny
bufor RIPAFisher Scientific89900Chemiczny
RotenonSigmaR 8875Substancja chemiczna, rozpuszczona w etanolu
SaponinaSigmaS7900Chemical

Seahorse XF DMEM Test DMEM opakowanie średnie, pH 7,4
Agilent, Santa Clara, CA		103680-100
Seahorse XFe96 Analizator strumienia zewnątrzkomórkowego
Agilent, Santa Clara, CA		Wysokoprzepustowy przyrząd do respirometrii
Seahorse XFe96 FluxPak
Agilent, Santa Clara, CA		br/> Zawiera płytki testowe, wkłady, prowadnice ładowania do przenoszenia związków do wkładu testowego oraz roztwór kalibru.
Małe nożyczkiFisher Scientific08-951-20
Azydek soduSigmaS2002
BursztynianSigmaS 2378Chemiczny
TaurynaSigmaT 8691Chemiczny
TMPDSigmaT 3134Chemiczny
roztwór błękitu trypanowegoMerck72-57-1Chemiczny
Trypsyna 0,25% EDTAFisher Scientific25200056
Dwa kleszcze cienkokrawędzioweFisher Scientific12-000-122
Kolba urydynowa (500x)SigmaU3750Chemical
ADP Sigma A 4386 Antymycyna A Sigma A 8674 Chemiczny askorbinian Merck chemiczny < chemiczny

Bibliografia

  1. McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. Mitochondria: More than just a powerhouse. Current Biology. 16 (14), 551-560 (2006).
  2. Mehta, M. M., Weinberg, S. E., Chandel, N. S. Mitochondrial control of immunity. Beyond ATP. Nature Reviews Immunology. 17 (10), 608-620 (2017).
  3. Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
  4. Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle. New perspectives of mitochondrial physiology. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).
  5. Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Reviews Disease Primers. 2, 1-23 (2016).
  6. Boushel, R., Gnaiger, E., Schjerling, P., Skovbro, M., Kraunsøe, R., Dela, F. Patients with type 2 diabetes have normal mitochondrial function in skeletal muscle. Diabetologia. 50 (4), 790-796 (2007).
  7. Cogliati, S., et al. Mitochondrial cristae shape determines respiratory chain supercomplexes assembly and respiratory efficiency. Cell. 155 (1), 160-171 (2013).
  8. Kühlbrandt, W. Structure and function of mitochondrial membrane protein complexes. BMC Biology. 13, 1-11 (2015).
  9. Gnaiger, E. Mitochondrial pathways and Respiratory control. An introduction to OXPHOS analysis. Bioenergetics communications. 5th ed. , Steiger Druck GmbH. Axams, Austria. (2020).
  10. Jackson, C. B., et al. Mutations in SDHD lead to autosomal recessive encephalomyopathy and isolated mitochondrial complex II deficiency. Journal of Medical Genetics. 51 (3), 170-175 (2014).
  11. Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods in Molecular Biology. 810, Clifton, N.J. 25-58 (2012).
  12. Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. O. Review: Quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. Journals of Gerontology - Series A Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).
  13. Doerrier, C., Garcia-Souza, L. F., Krumschnabel, G., Wohlfarter, Y., Mészáros, A. T., Gnaiger, E. High-resolution fluorespirometry and oxphos protocols for human cells, permeabilized fibers from small biopsies of muscle, and isolated mitochondria. Methods in Molecular Biology. 1782, Clifton, N.J. 31-70 (2018).
  14. Zhang, J., et al. Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells. Nature Protocols. 7 (6), 1068-1085 (2012).
  15. García-Roche, M., Casal, A., Carriquiry, M., Radi, R., Quijano, C., Cassina, A. Respiratory analysis of coupled mitochondria in cryopreserved liver biopsies. Redox Biology. 17, 207-212 (2018).
  16. Acin-Perez, R., et al. A novel approach to measure mitochondrial respiration in frozen biological samples. The EMBO Journal. 39 (13), 1-18 (2020).
  17. SUITBrowserWeb. , Available from: http://suitbrowser.oroboros.at/ (2021).
  18. Cell metabolism assay kits. Seahorse assay kits and media. , Available from: https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-lits-reagents-cell-assay-media (2021).
  19. Chance, B., Williams, G. R. A method for the localization of sites for oxidative phosphorylation. Nature. 176 (4475), 250-254 (1955).
  20. Gnaiger, E., et al. Mitochondrial respiratory states and rates. MitoFit Preprint Arch. , (2019).
  21. Gnaiger, E. O2k-procedures: SOP O2k quality control 1: Polarographic oxygen sensors and accuracy of calibration Section Page. Oroboros. 03 (18), http://wiki.oroboros.at/index.php/MiPNet06.03_POS-Calibration-SOP 1-21 (2020).
  22. Robinson, B. H., Petrova-Benedict, R., Buncic, J. R., Wallace, D. C. Nonviability of cells with oxidative defects in galactose medium: A screening test for affected patient fibroblasts. Biochemical Medicine and Metabolic Biology. 48 (2), 122-126 (1992).
  23. King, M. P., Attardi, G. Human cells lacking mtDNA: Repopulation with exogenous mitochondria by complementation. Science. 246 (4929), 500-503 (1989).
  24. Makrecka-Kuka, M., Krumschnabel, G., Gnaiger, E. High-resolution respirometry for simultaneous measurement of oxygen and hydrogen peroxide fluxes in permeabilized cells, tissue homogenate and isolated mitochondria. Biomolecules. 5 (3), 1319-1338 (2015).
  25. Fasching, M., Gnaiger, E. O2k quality control 2: Instrumental oxygen background correction and accuracy of oxygen flux. Mitochondrial Physiology Network. 14 (06), 1-14 (2016).
  26. Gnaiger, E., Lassnig, B., Kuznetsov, A., Rieger, G., Margreiter, R. Excess capacity of cytochrome c oxidase. Journal of Experimental Biology. 1139, 1129-1139 (1998).
  27. Gnaiger, E., et al. Mitochondria in the Cold. Life in the Cold. , Springer. Berlin, Heidelberg. 431-442 (2000).
  28. Fontana-Ayoub,, Fasching, M., Gnaiger, E. Selected media and chemicals for respirometry with mitochondrial preparations. Mitochondrial Physiology Network. 02 (17), 1-9 (2014).
  29. Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
  30. Krumschnabel, G., Eigentler, A., Fasching, M., Gnaiger, E. Use of safranin for the assessment of mitochondrial membrane potential by high-resolution respirometry and fluorometry. Methods in Enzymology. 542, 163-181 (2014).
  31. Nászai, A., Terhes, E., Kaszaki, J., Boros, M., Juhász, L. Ca(2+)N it be measured? Detection of extramitochondrial calcium movement with high-resolution fluorespirometry. Scientific Reports. 9 (1), 1-13 (2019).
  32. Pajak, B., et al. 2-Deoxy-d-Glucose and its analogs: From diagnostic to therapeutic agents. International Journal of Molecular Sciences. 21 (1), 234(2019).
  33. Mercier-Letondal, P., Marton, C., Godet, Y., Galaine, J. Validation of a method evaluating T cell metabolic potential in compliance with ICH Q2 (R1). Journal of Translational Medicine. 19 (1), 1-15 (2021).
  34. Sauerbeck, A., et al. Analysis of regional brain mitochondrial bioenergetics and susceptibility to mitochondrial inhibition utilizing a microplate based system. Journal of Neuroscience Methods. 198 (1), 36-43 (2011).
  35. Jackman, M. R., Willis, W. T. Characteristics of mitochondria isolated from type I and type IIb skeletal muscle. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 270 (2), 673-678 (1996).
  36. Ponsot, E., et al. Mitochondrial tissue specificity of substrates utilization in rat cardiac and skeletal muscles. Journal of Cellular Physiology. 203 (3), 479-486 (2005).
  37. Schönfeld, P., Reiser, G. Why does brain metabolism not favor burning of fatty acids to provide energy-Reflections on disadvantages of the use of free fatty acids as fuel for brain. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33 (10), 1493-1499 (2013).
  38. Calderon-Dominguez, M., Mir, J. F., Fucho, R., Weber, M., Serra, D., Herrero, L. Fatty acid metabolism and the basis of brown adipose tissue function. Adipocyte. 5 (2), 98-118 (2016).
  39. Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the seahorse XF analyzer or a clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 2014, 1-16 (2014).
  40. Iuso, A., Repp, B., Biagosch, C., Terrile, C., Prokisch, H. Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from various mouse tissues using Seahorse XF96 analyzer. Methods in Molecular Biology. 1567, 217-230 (2017).
  41. Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS ONE. 6 (7), 21746(2011).
  42. Jordá, A., Zaragozá, R., Portolés, M., Báguena-Cervellera, R., Renau-Piqueras, J. Long-term high-protein diet induces biochemical and ultrastructural changes in rat liver mitochondria. Archives of Biochemistry and Biophysics. 265 (2), 241-248 (1988).
  43. Jackson, C. B., Gallati, S., Schaller, A. QPCR-based mitochondrial DNA quantification: Influence of template DNA fragmentation on accuracy. Biochemical and Biophysical Research Communications. 423 (3), 441-447 (2012).
  44. Hirsch, H. M. Tissue autoxidation inhibitors: II. The presence of inhibitor in intact cells; Assay of liver and hepatoma effect on radio-oxidations. Cancer Research. 16 (11), 1076-1082 (1956).
  45. Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard Isolation methods. PLoS ONE. 6 (3), 18317(2011).
  46. Tanumihardja, E., Slaats, R. H., Van Der Meer, A. D., Passier, R., Olthuis, W., Van Den Berg, A. Measuring both pH and O2 with a single On-Chip sensor in cultures of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes to track induced changes in cellular metabolism. ACS Sensors. 6 (1), 267-274 (2021).
  47. Harms, F., Stolker, R. J., Mik, E. Cutaneous respirometry as novel technique to monitor mitochondrial function: A feasibility study in healthy volunteers. PLoS ONE. 11 (7), 159544(2016).
  48. Levitsky, Y., et al. Micro-respirometry of whole cells and isolated mitochondria. RSC Advances. 9 (57), 33257-33267 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Bioenergetyka mitochondrialnazu ycie tlenufosforylacja oksydacyjnarespirometria komorowarespirometria p ytkowasubstrat odsprz gacz inhibitorkom rki HEK293 CRISPRniedob r OXPHOSzakwaszenie pozakom rkowe

Powiązane artykuły