Artykuł metodologiczny

Oznaczanie stężeń białka całkowitego i białka bioaktywnego w siarze bydlęcej

DOI:

10.3791/63001

⸱

10 grudnia 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biology and Genetics, Çanakkale Onsekiz Mart University, 2Uluova Dairy Farm, 3Department of Nutrition, University of Nevada, Reno, 4Department of Food Science and Technology, University of Nebraska, Lincoln, 5Evolve BioSystems Inc.

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Siara bydlęca jest zarówno podstawowym źródłem składników odżywczych, jak i wsparciem immunologicznym dla nowonarodzonego cielęcia. Zrozumienie poziomu białek terapeutycznych (laktoferyny i IgG) jest ważne dla dawkowania siary bydlęcej i standaryzacji do spożycia przez ludzi.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Colostrum to złożony płyn biologiczny wytwarzany przez ssaki bezpośrednio po porodzie. Spełnia wszystkie wymagania żywieniowe noworodków jako dobre źródło makro- i mikroelementów, bioaktywnych peptydów i czynników wzrostu. Siara bydlęca jest również potencjalnym źródłem składników odżywczych i bioaktywna ze względu na bogatą zawartość białka, która obejmuje immunoglobulinę G (IgG) i laktoferynę. Jednak poziom laktoferyny i IgG w siarze bydlęcej zmienia się znacznie w okresie laktacji. Dlatego monitorowanie stężenia IgG i laktoferyny w celu wykorzystania siary bydlęcej jako źródła białka jest ważną kwestią do zbadania. Metody opisane w tym artykule opisują, w jaki sposób oznaczać zawartość białka, a także specyficzne stężenia laktoferyny i IgG. Metody te obejmują następujące etapy: izolacja białek siary bydlęcej, oznaczanie stężenia białka za pomocą testu kwasu bicunchoninowego (BCA), wizualizacja białek za pomocą SDS-PAGE, oznaczanie laktoferyny i stężenia IgG za pomocą testu ELISA.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Siara to początkowa wydzielina gruczołu sutkowego wytwarzana przez ssaki krótko po porodzie. Siara jest bogata w makro- i mikroelementy, peptydy przeciwdrobnoustrojowe i czynniki wzrostu1,2,3,4. Skład zmienia się stopniowo w czasie przez przejście do dojrzałego mleka5,6,7, ale najbardziej znacząco w ciągu 24 godzin po porodzie8. Na skład siary wpływają również czynniki matczyne, w tym wiek, poród, rasa, stan zdrowia i stan odżywienia, a także czynniki zewnętrzne, w tym pora roku, przedwczesny poród, przedwczesna laktacja, czynniki związane z przetwarzaniem colostrali (gromadzenie się siary i temperatura przechowywania) oraz indukcja porodu9,10,11. W porównaniu z dojrzałym mlekiem, siara zawiera mniej laktozy i więcej tłuszczu, białka, peptydów, azotu niebiałkowego, popiołu, hormonów, czynników wzrostu, cytokin, nukleotydów, witamin i minerałów12. Siara bydlęca zawiera szeroką gamę białek, w tym immunoglobuliny, laktoferynę, α-laktoalbuminę (α-LA), β-laktoglobulinę (β-Lg), laktoperoksydazę i kilka czynników wzrostu13. Całkowite stężenie białka w siarze bydlęcej waha się od 11,26 mg/ml do 169,55 mg/ml14. Zawartość białka obejmuje serwatkę i kazeinę w średnim stężeniu odpowiednio 124,00 mg/ml i 26,00 mg/ml15. Część serwatkowa zawiera trzy główne typy immunoglobulin (Igs), takie jak IgG (85%-90%), IgM (7%) i IgA (5%)16. Główną Ig w siarze bydlęcej jest IgG, która zapewnia odporność bierną i moduluje adaptacyjny i wrodzony układ odpornościowy w klasie cielęcej17. Początkowe stężenie Ig siary z pierwszego dojenia bydła może wynosić od 20 do 200 mg/ml i spaść do około 0,4-1,0 mg/ml18. Średnie stężenie IgG wynosi około 60 mg/ml i stale spada do poziomu poniżej 1 mg/ml przez cały okres przejścia na dojrzałe mleko19.

Innym ważnym bioaktywnym białkiem w siarze jest laktoferyna, glikoproteina wiążąca żelazo o stężeniu 1,5-5 mg/ml. Właściwości laktoferyny obejmują zwiększenie wchłaniania żelaza, a także działanie przeciwdrobnoustrojowe20,21, wiązanie lipopolisacharydu, modulację immunologiczną i stymulowanie wzrostu komórek nabłonka jelitowego i fibroblastów22. Siara bydlęca zawiera również α-laktoalbuminę i β-laktoglobulinę. Białka te są źródłem aminokwasów egzogennych, a także mają działanie bakteriobójcze23,24,25. Średnie stężenia α-LA i β-Lg w siarze wynoszą średnio odpowiednio 2,77 mg/ml2 i 11,5 mg/mL26. Następnie stężenia te spadają do 1-1,5 mg/ml27 i 4,8 mg/mL26 w mleku dojrzałym. Colostrum zawiera również znaczną ilość laktoperoksydazy (średnio 22,8 μg/ml) i lizozymu (średnio 0,40 μg/ml)26. Laktoperoksydaza jest glikoproteiną, która wykazuje działanie przeciwdrobnoustrojowe przeciwko bakteriom Gram-dodatnim i Gram-ujemnym28 poprzez wytwarzanie reaktywnych form tlenu. Lizozym działa jako środek przeciwdrobnoustrojowy poprzez rozszczepianie składnika peptydoglikanu w ścianach komórkowych bakterii, prowadząc w ten sposób do śmierci komórki29,30.

Ze względu na swoje właściwości, IgG i laktoferyna są przetwarzane na różne produkty spożywcze do wzbogacania preparatów dla niemowląt, suplementów diety, preparatów wysokobiałkowych dla rekonwalescentów i sportowców, a także w farmakologii i kosmetologii31,32,33. Siara bydlęca stanowi ważne źródło IgG i laktoferyny. Jednak skład tych bioaktywnych białek w siarze bydlęcej zmienia się znacznie w okresie laktacji. Dlatego monitorowanie zmian stężenia tych bioaktywnych białek w próbkach siary wykorzystywanych do badań i przetwórstwa żywności ma kluczowe znaczenie. Niniejsze badanie ma na celu opisanie metod monitorowania stężenia i składu białka całkowitego, laktoferyny i IgG w siarze bydlęcej w ciągu 6 dni po wycieleniu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Próbki siary były pobierane przez 6 dni po wycieleniu w południe w okresie lipiec-sierpień, od 28 krów mlecznych rasy holsztyńskiej z Uluova Milk Trading Company w Çanakkale, Turcja, i głęboko mrożone. Próbki pobrane tego samego dnia zostały połączone zgodnie z dniem każdej próbki i przeanalizowane pod kątem ich całkowitego stężenia białka, laktoferyny i IgG. Wszystkie próbki oznaczono w dwóch egzemplarzach.

1. Przygotowanie próbki

  1. Zmieszać 200 μl siary bydlęcej z 400 μldH2O, aby otrzymać rozcieńczoną próbkę do analizy. Odpowiednio rozcieńczyć wszystkie próbki.
  2. Odwirować rozcieńczone i nierozcieńczone próbki w temperaturze 4 °C, 1000 x g przez 30 minut.
  3. Oddziel środkową fazę od odpowiednio oznakowanej nowej probówki. Powtórz krok 1.2. aby uzyskać wyraźną fazę środkową. Przechowywać całą środkową fazę i rozcieńczone próbki w temperaturze -20 °C, jeżeli nie zostaną natychmiast zużyte.
  4. Użyj środkowej fazy uzyskanej z rozcieńczonych próbek do testów BCA, SDS-PAGE i laktoferyny. Pobrać środkową fazę z nierozcieńczonych próbek do testu IgG.
  5. Przygotować rozcieńczenia próbki dla każdej próbki, aby upewnić się, że odczyty mieszczą się w standardowym zakresie krzywej. Rozcieńczyć każdą środkową fazę otrzymaną z rozcieńczonych próbek w stosunku 1:300 dla testu BCA i 1:30 000 dla testu laktoferyny i rozcieńczyć każdą środkową fazę otrzymaną z nierozcieńczonych próbek do 1:400 000 dla testu IgG.
    UWAGA: Współczynniki rozcieńczenia określa się na podstawie wartości absorbancji i krzywej wzorcowej.

2. Określ stężenie białka za pomocą zestawu do oznaczania białek BCA

  1. Przygotowanie wzorców i odczynników
    1. Do badania należy użyć odczynników znajdujących się w dostępnym w handlu zestawie (patrz tabela materiałów): odczynnik BCA A, zawierający węglan sodu, wodorowęglan sodu, kwas bichininowy i winian sodu w 0,1 M wodorotlenku sodu. Odczynnik BCA B zawiera 4% siarczanu miedzi. Wzorce albumin (BSA) zawierają albuminę surowicy bydlęcej w stężeniu 2,0 mg/ml w 0,9% soli fizjologicznej i 0,05% azydku sodu.
    2. Zrównoważyć wszystkie próbki i wzorce białek do temperatury pokojowej (RT).
    3. Przygotować wystarczające ilości odczynnika roboczego (WR), mieszając odczynnik A:B w stosunku 50:1. Dla każdej próbki i wzorca wymagane jest 200 μl WR.
    4. Przygotować wzorce rozcieńczonej albuminy (BSA) zgodnie z następującym schematem rozcieńczenia (Tabela 1), który przedstawia zakres roboczy między 20-2 000 μg/ml końcowego stężenia BSA. Użyj dH2O jako rozcieńczalnika.

Tabela 1: Schemat rozcieńczania standardów BSA.

Rozdział szt. szt. Rozdział szt. szt. szt. Rozdział szt. szt.
fiolkaObjętość rozcieńczalnika (μL)Objętość i źródło BSA (μL)Końcowe stężenie BSA (μg/ml)
ZA0300 μl zapasuRok 2000
W125375 μL zapasu1500
ZRozdział 325325 μL zapasu1000
D175175 rozcieńczonej fiolki B750
ERozdział 325325 rozcieńczenia C w fiolce500
ZRozdział 325325 rozcieńczenia E w fiolceZ kolei 250
ZRozdział 325325 rozcieńczenia F w fiolce125
H400100 rozcieńczenia G w fiolce25
ja40000 = Puste
  1. Procedura oznaczania BCA
    1. Przenieść 25 μl każdego wzorca BCA lub próbki do płytki 96-dołkowej. Dodać 200 μl WR do każdego studzienki wzorca lub próbki. Dokładnie wymieszaj płytkę na wytrząsarce przez 30 sekund.
    2. Przykryć płytkę zgrzewarką do płytek i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Po inkubacji pozwól, aby reakcje zrównoważyły się do RT przez około 10 minut. Odczyt każdej płytki przy długości fali 562 nm za pomocą czytnika mikropłytek wraz z powiązanym z nim oprogramowaniem.
  2. Generowanie krzywej standardowej i określanie wyników
    1. Zapisać wartości absorbancji dla wzorców i próbek. Patrz Tabela 1 dla serii rozcieńczeń. Odjąć wartości absorbancji wzorcowej próby ślepej od każdej wartości absorbancji wzorców i próbki. Uśrednić podwójne odczyty dla każdego wzorca i próbki, aby oszacować całkowite stężenie białka.
    2. Skonstruuj krzywą standardową, wykreślając skorygowaną średnią absorbancję dla każdego wzorca na osi x i stężenie na osi y. Narysuj krzywą liniową za pomocą odpowiedniego oprogramowania zdolnego do dopasowania krzywej czteroparametrowej.
    3. Użyj krzywej standardowej, aby określić stężenie każdej próbki poprzez interpolację jej reakcji na stężenie. Pomnożyć przez współczynnik rozcieńczenia (krok 1.5), aby uzyskać rzeczywiste stężenie próbki.

3. Wizualizacja białka za pomocą testu SDS-PAGE

  1. Przygotowanie próbki i roztworów
    1. Przygotowanie roztworów podstawowych
      1. Przygotować 10% (w/v) SDS, 1,5 M Tris-HCl pH 8,3, 0,5 M Tris-HCl pH 6,8, 10% (w/v) roztwór nadsiarczanu amonu (APS) (przygotować świeży).
      2. (w/v) SDS: Zważyć 1 g SDS i dodać 10 ml dH2O.
      3. M Tris-HCl pH 8,8: Odważyć 18,15 g Tris i rozpuścić w ~60 ml dH2O. Dostosuj do pH 8,8 za pomocą HCl. Dodaj dH2O, aby doprowadzić objętość do 100 ml.
      4. M Tris-HCl pH 6,8: Odważyć 6,00 g Tris i rozpuścić w ~60 ml dH2O. Dostosować do pH 6,8 za pomocą HCl. Dodaj dH2O, aby doprowadzić objętość do 100 ml.
      5. APS: Odważyć 15 mg APS i dodać 150 μL dH2O.
        UWAGA: Akrylamid i SDS są toksyczne i szkodliwe. Nosić rękawice ochronne i pracować pod kapturem.
    2. Przygotować bufor próbki, dodając 50 μl β-merkaptoetanolu do 950 μl 2x buforu do próbek SDS-PAGE.
      UWAGA: β-merkaptoetanol jest toksyczny w przypadku wdychania. Nosić rękawice ochronne i pracować pod kapturem.
    3. Przygotować bufor do biegania, mieszając 100 ml 10x Tris-glicyny SDS Running Buffer z 900 ml dH2O.
    4. Przygotować roztwór barwiący (45%dH2O, 45% metanol, 10% lodowaty kwas octowy, 2 g Coomassie Brilliant Blue R).
    5. Przygotować roztwór odbarwiający (50%dH2O, 40% metanol, 10% lodowaty kwas octowy).
  2. Przygotowanie żelu
    1. Przygotuj wyposażenie jednostki do elektroforezy, w tym kasetę żelową, zasilacze, elektrody i do testu. Wyczyść szklane talerze etanolem i złóż kanapkę. Upewnij się, że dolne krawędzie szklanych płytek i przekładek są dobrze wyrównane.
    2. Przygotować mieszaninę żelu separującego zawierającą 3,5 mldH2O, 2,4 ml 40% akryloamidu/metyleno-akrylamidu, 2 ml 1,5 M Tris-HCl, 100 μl 10% (w/v) SDS, 80 μL 10% APS, 8 μL N,N,N′,N′-Tetrametylo etylenodiaminy (TEMED).
      UWAGA: TEMED jest toksyczny i/lub drażniący. Nosić rękawice ochronne i pracować pod kapturem.
    3. Wlej mieszaninę żelu rozdzielającego do płytek żelowych do poziomu około 1-1,5 cm poniżej górnej części krótszej płytki.
    4. Warstwę wierzchniej warstwy żelu separującego z izopropanolem, aby usunąć pęcherzyki na wierzchu żelu i zapobiec wysychaniu spolimeryzowanego żelu.
    5. Wlać izopropanol na wierzch żelu rozdzielającego po polimeryzacji żelu oddzielającego przez co najmniej 15 minut.
    6. Przygotuj mieszaninę żelu do układania zawierającą 1,92 mldH2O, 300 μl 40% akrylamidu/metyleno-akrylamidu, 750 μl 0,5M Tris-HCl, 100 μl 10% (w/v) SDS, 30 μL 10% APS i 3 μl TEMED.
    7. Wlej roztwór żelu do układania w stosy na żel separacyjny, tak aby płytki żelowe zostały wypełnione. Włóż grzebień do górnej części przekładek.
    8. Pozostaw żel do układania w stosie w temperaturze pokojowej na około 15 minut.
  3. Uruchamianie żelu
    1. Podłącz żel do zespołu elektrody. Dodaj świeżo przygotowany 1x Tris-glycine SDS Running Buffer do obu komór aparatu.
    2. Wyjmij grzebień.
    3. Załadować 5 μl drabinki (10-250 kDa) i 8 μl środkowej fazy rozcieńczonych próbek do studzienek żelu. Uruchom żel pod napięciem 80 V, aż barwnik przeniesie się do żelu rozdzielającego i zwiększaj do 120 V, aż barwnik dotrze do dna żelu. Wyłącz zastosowaną moc, gdy barwnik dotrze do dna żelu.
  4. Barwienie i odbarwianie żelu
    1. Po zakończeniu pracy usuń żel z aparatu i usuń przekładki i szklane płytki. Umieść żel w małej tacce.
    2. Zabarwić żel, dodając roztwór barwiący (krok 3.1.4) przez 30 minut, delikatnie wstrząsając przy 55 obr./min.
    3. Odlej roztwór barwiący z żelu. Spłucz żel niewielką ilością roztworu odbarwiającego i wyrzuć barwnik.
    4. Dodać odpowiednią ilość roztworu odbarwiającego, aby pokryć żel i odbarwić delikatnym wstrząsem przez ~1 godzinę, aż pasma będą widoczne.

4. Stężenie laktoferyny za pomocą bydlęcego testu ELISA laktoferyny

  1. Przygotowanie wzorców i odczynników
    1. Do tego testu należy użyć dostępnego w handlu zestawu ELISA LF / LTF / laktoferyny dla bydła.
    2. Zrównoważ wszystkie próbki i wzorce z RT.
    3. Przygotować wystarczającą ilość odczynnika do wykrywania A i roztworu roboczego B, które są odpowiedzialne za wiązanie się z wychwyconym antygenem.
    4. Rozcieńczyć odczynniki do wykrywania A i B w stosunku 1:100, stosując odpowiednio rozcieńczalniki do oznaczania A i B.
    5. Przygotować 1x bufor roboczy do mycia, rozcieńczając 30x koncentrat buforu do przemywania z dH2O.
    6. Umieścić wystarczającą ilość roztworu substratu 3,3′,5,5′-tetrametylobenzydyny (TMB) do sterylnej mikroprobówki.
    7. Zawiesić jedną probówkę liofilizowanego wzorca (100 ng/ml) z 0,5 ml rozcieńczalnika do próbek i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut z delikatnym mieszaniem. Zakręć fiolkę, aby upewnić się, że cała liofilizowana sanple została zebrana na dnie.
    8. Przygotować serię rozcieńczeń wzorcowych zgodnie z następującym schematem rozcieńczania (tabela 2).

Tabela 2: Schemat rozcieńczania wzorców laktoferyny bydlęcej.

szt. szt. Rozdział szt. szt. szt. szt. osób szt. TGL szt.
fiolkaObjętość rozcieńczalnika (μL)Objętość i źródło Lf (μL)Końcowe stężenie Lf (ng/ml)
Klasa D10500 μL bulionu100
Zobacz materiał D2Z kolei 250250 rozcieńczenia fiolki D150
Zobacz materiał D3Z kolei 250250 rozcieńczenia D2 w fiolce25
Klasa D4Z kolei 250250 rozcieńczeń D3 w fiolceRozdział 12,5
Zobacz materiał D5Z kolei 250250 rozcieńczenia fiolki D4Godzina 6,25
Zobacz materiał D6Z kolei 250250 fiolki D5 rozcieńczenie3 125
Zobacz materiał D7Z kolei 250250 fiolki D6 rozcieńczenie1 563
Zobacz materiał D8Z kolei 25000 = Puste
  1. Pomiar stężenia laktoferyny bydlęcej
    1. Pobrać pipetą 100 μl każdego wzorca laktoferyny lub próbki do powlekanej 96-dołkowej płytki paskowej. Przykryj płytkę uszczelniaczem do płyt, aby uniknąć parowania. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
    2. Zassać płyn z każdej studzienki. Dodać 100 μl roztworu roboczego odczynnika do wykrywania A do każdej studzienki. Przykryj zgrzewarką do płytek i delikatnie zamieszaj, aby zapewnić dokładne wymieszanie. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
    3. Przemyć trzykrotnie, dodając około 350 μl 1x buforu do płukania po zassaniu płynu z każdej studzienki. Pozostaw każde pranie na 1-2 minuty przed całkowitym zasysaniem. Po ostatnim praniu należy odessać, aby usunąć pozostały bufor do płukania, a następnie odwrócić płytkę i postukać w czysty papier chłonny.
    4. Dodać 100 μl roztworu roboczego odczynnika B do wykrywania do każdej studzienki. Przykryj nową zgrzewarką do płyt. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Odessać płyn z każdej studzienki i umyć go pięć razy, jak opisano w kroku 4.2.3. Do każdej studzienki wlej 90 μl roztworu podłoża TMB i przykryj nowym uszczelniaczem do płyt.
    5. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 10-20 minut z dala od światła. Sprawdź optymalny kolor, okresowo monitorując. Zauważ, że intensywny niebieski kolor w studzience zawiera laktoferynę o wysokim stężeniu.
    6. Do każdej studzienki dodać 50 μl roztworu zatrzymującego. Kolor zmieni się z niebieskiego na żółty. Natychmiast zmierzyć absorbancję każdej studzienki przy długości fali 450 nm za pomocą czytnika mikropłytek z dołączonym oprogramowaniem.
      UWAGA: Delikatnie postukaj w płytkę, aby zapewnić dokładne wymieszanie, aż zmiana koloru będzie jednolita.
  2. Generowanie krzywej standardowej i określanie wyników
    1. Postępuj zgodnie z krokiem 2.3.1, aby wygenerować dane w celu oszacowania stężenia laktoferyny.
    2. Skonstruuj krzywą standardową, wykreślając skorygowaną średnią absorbancję dla każdego wzorca, jak opisano w kroku 2.3.2, ale rysując krzywą wielomianową za pomocą odpowiedniego oprogramowania zdolnego do dopasowania krzywej czteroparametrowej.
    3. Obliczyć zawartość laktoferyny w każdej próbce, interpolując wartość absorpcji do wygenerowanego równania zgodnie z opisem w kroku 2.3.3.

5. Oznaczanie stężenia IgG w próbkach za pomocą bydlęcego testu IgG ELISA

  1. Przygotowanie wzorców i odczynników
    1. Użyj wymaganych elementów spośród tych, które znajdują się w zestawie bydlęcym IgG ELISA.
    2. Zrównoważ wszystkie próbki i wzorce z RT.
    3. Przygotować wystarczającą ilość roboczego roztworu sprzężonego enzym-przeciwciało, rozcieńczając 10 μl koncentratu peroksydazy chrzanowej (HRP) i awidyny (100x) 990 μl rozcieńczalnika sprzężonego enzym-przeciwciało.
    4. Przygotować wystarczającą ilość 1x buforu do przemywania przez rozcieńczenie 20x koncentratu buforu do przemywania z dH2O.
    5. Przygotować wystarczającą ilość 1 roztworu rozcieńczalnika, rozcieńczając 20 razy koncentrat rozcieńczalnika zdH2O.
    6. Dodać 1,0 ml dH2O do kalibratora IgG bydła i delikatnie mieszać aż do rozpuszczenia. Końcowe stężenie kalibratora wynosi 123 000 ng/ml.
    7. Przygotować serię rozcieńczeń wzorcowych zgodnie ze schematem rozcieńczania opisanym w tabeli 3.

Tabela 3: Schemat rozcieńczania wzorców bydlęcej IgG.

szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. Rozdział szt. pkt. szt. szt. osób szt. osób szt.
fiolkaObjętość rozcieńczalnika (μL)Objętość i źródło IgG (μL)Końcowe stężenie IgG (ng/mL)
Klasa D1900100 μL bulionuNumer katalogowy: 12300
Zobacz materiał D2900100 fiolki D1 rozcieńczenie1230
Zobacz materiał D3Rozdział 178122 w fiolce D2 rozcieńczenie500
Klasa D415050 rozcieńczenia D3 w fiolceZ kolei 250
Zobacz materiał D5150150 rozcieńczenia fiolki D4125
Zobacz materiał D6100100 fiolki D5 rozcieńczenie62,5
Zobacz materiał D7100100 fiolek rozcieńczenia D6Godzina 31,25
Zobacz materiał D8100100 fiolki rozcieńczenie D715 625
Zobacz materiał D9100100 fiolek D8 rozcieńczenie7 813
Zobacz materiał D1010000 = Puste
  1. Procedura testu ELISA bydlęcego IgG
    1. Pobrać pipetę 100 μl każdego wzorca IgG lub próbki do powlekanej 96-dołkowej płytki paskowej. Przykryć płytkę zgrzewarką do płytek i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Zassać ciecz z każdej studzienki.
    2. Przemyć cztery razy, napełniając studzienki 1x buforem płuczącym i aspiratem. Po ostatnim praniu odessać, aby usunąć resztki buforu do płukania, a następnie odwrócić płytkę i postukać w czysty papier chłonny. Dodać 100 μl odpowiednio rozcieńczonego koniugatu enzym-przeciwciało do każdej studzienki. Przykryj zgrzewarką do płytek i delikatnie zamieszaj, aby zapewnić dokładne wymieszanie.
    3. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Przepłukać i usunąć resztki buforu płuczącego z dołków, jak opisano w kroku 5.2.2. Dodać 100 μl substratu TMB do każdej studzienki; Przykryj nową zgrzewarką do płyt.
    4. Inkubować w temperaturze pokojowej dokładnie 10 minut z dala od światła. Zatrzymaj reakcję, dodając 100 μl roztworu zatrzymującego do każdej studzienki. Odczyt każdej płytki przy długości fali 450 nm za pomocą czytnika mikropłytek wraz z powiązanym z nim oprogramowaniem.
  2. Generowanie krzywej standardowej i określanie wyników
    1. Postępuj zgodnie z krokiem 2.3.1, aby uzyskać edycję danych, aby oszacować stężenie IgG.
    2. Skonstruuj krzywą wzorcową, wykreślając stężenie na osi x i skorygowaną średnią absorbancję dla każdego wzorca na osi y. Narysuj krzywą wielomianową za pomocą odpowiedniego oprogramowania zdolnego do dopasowania krzywej czteroparametrowej.
    3. Obliczyć zawartość IgG w każdej próbce, interpolując wartość absorpcji do otrzymanego równania zgodnie z opisem w kroku 2.3.3.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zgodnie z protokołem, próbki siary bydlęcej zostały przeanalizowane w celu określenia stężenia białka, laktoferyny i IgG. Wyniki analiz białka, laktoferyny i IgG siary bydlęcej przedstawiono w tabeli 4.

Tabela 4: Stężenie białka, laktoferyny i IgG w siarze bydlęcej.

Siara bydlęca

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie to dostarcza informacji o znacznych zmianach w stężeniach białka, laktoferyny i IgG w siarze przez cały okres przejścia do mleka dojrzałego. Wykrywanie zmian w stężeniu laktoferyny i IgG przeprowadzono za pomocą testu ELISA typu sandwich, a całkowite stężenie białka analizowano za pomocą testu BCA. Wyniki wskazują, że wczesna siara ma najwyższe stężenie białka, laktoferyny i IgG, które następnie zmniejszyło się w ciągu następnych 3 dni. Dokładne pomiary tych białek są istotne dla stosowania siary w produkcji prod...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie jest wspierane przez Uluova Süt Ticaret A.Ş (Uluova Milk Trading Co.). RMD i BMH są pracownikami Evolve BioSystems, firmy zajmującej się przywracaniem mikrobiomu niemowląt.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10X Running Buffer (Tris-Glycine-SDS)ClearBandTGS10SDS-Page Analysis
2-merkaptoetanolGibco31350-010Analiza strony SDS
Kwas octowy GLACIALIsolab901,013,2500Analiza strony SDS
Bydlęcy IgG Zestaw ELISAAviva Systems BiologyOKIA00005Oznaczanie stężenia IgG
Bydlęce LF / Zestaw LTF / Lactoferyna ELISALSBio Lifespan BiosciencesLS-F4884Oznaczanie stężenia laktoferyny
Coomassie Brillant Blue R 250amresco0472-25GAnaliza strony SDS
Kwas solny dymiący 37%Isolab932,103,2501Analiza strony SDS
IzopropanolIsolab961,023,2500Analiza strony SDS
Próbka Laemmli Bufor (2X)ClearBandLSB-2xSDS-Page analysis
MetanolIsolab947,046,2500Analiza strony SDS
PageRuler Plus Prestained Protein Ladder 10 do 250Thermo Scientific26619Analiza SDS
Zestaw do oznaczania białek Pierce BCAThermo Scientific23225Oznaczanie stężenia białka
Dodecylosiarczan sodu (SDS)BioShopSDS001.500Analiza strony SDS
SureCast Roztwór akryloamidu 40% (w/v)strony karty charakterystykiInvitrogenHC2040
Nadsiarczan amonu (APS)Thermo Scientific17874Analiza strony SDS
SureCast Tetrametyloetylenodiamina (TEMED)kart charakterystykiInvitrogenHC2006
Czytnik płytek TECAN Infinite M200Tecan30035094Pomiar absorbancji
bazy TrisBioShopTRS001.1SDS-Page analiza
Analiza Analiza SDS-Page

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kehoe, S. I., Jayarao, B. M., Heinrichs, A. J. A survey of bovine colostrum composition and colostrum management practices on Pennsylvania dairy farms. Journal of Dairy Science. 90 (9), 4108-4116 (2007).
  2. Levieux, D., Ollier, A. Bovine immunoglobulin G, β-lactoglobulin, α-lactalbumin and serum albumin in colostrum and milk during the early post partum period. Journal of Dairy Research. 66 (3), 421-430 (1999).
  3. Elfstrand, L., Lindmark-Månsson, H., Paulsson, M., Nyberg, L., Åkesson, B. Immunoglobulins, growth factors and growth hormone in bovine colostrum and the effects of processing. International Dairy Journal. 12 (11), 879-887 (2002).
  4. Strekozov, N. I., Motova, E. N., Fedorov, Y. N. Evaluation of the chemical composition and immunological properties of colostrum of cows' first milk yield. Russian Agricultural Sciences. 34 (4), 259-260 (2008).
  5. Playford, R. J., Weiser, M. J. Bovine colostrum: Its constituents and uses. Nutrients. 13 (1), 265(2021).
  6. Godhia, M., Patel, N. Colostrum - Its composition, benefits as a nutraceutical: A review. Current Research in Nutrition and Food Science Journal. 1 (1), 37-47 (2013).
  7. Nakamura, T., et al. Concentrations of sialyloligosaccharides in bovine colostrum and milk during the prepartum and early lactation. Journal of Dairy Science. 86 (4), 1315-1320 (2003).
  8. Arain, H. H., Khaskheli, M., Arain, M. A., Soomro, A. H., Nizamani, A. H. Heat stability and quality characteristics of postpartum buffalo milk. Pakistan Journal of Nutrition. 7 (2), 303-307 (2008).
  9. Maunsell, F. P., et al. Effects of mastitis on the volume and composition of colostrum produced by Holstein cows. Journal of Dairy Science. 81 (5), 1291-1299 (1998).
  10. Tittle, D. J. Factors affecting colostrum quality. Cattle Practice. 10 (2), 131-136 (2002).
  11. Zarcula, S., et al. Influence of breed, parity and food intake on chemical composition of first colostrum in cow. Animal Science and Biotechnology. 43 (1), 43(2010).
  12. McGrath, B. A., Fox, P. F., McSweeney, P. L. H., Kelly, A. L. Composition and properties of bovine colostrum: a review. Dairy Science and Technology. 96 (2), 133-158 (2016).
  13. Bastian, S. E. P., Dunbar, A. J., Priebe, I. K., Owens, P. C., Goddard, C. Measurement of betacellulin levels in bovine serum, colostrum and milk. Journal of Endocrinology. 168 (1), 203-212 (2001).
  14. Zhang, L., et al. Bovine milk proteome in the first 9 days: Protein interactions in maturation of the immune and digestive system of the newborn. PloS One. 10 (2), 0116710(2015).
  15. Godden, S. Colostrum management for dairy calves. The Veterinary clinics of North America. Food Animal Practice. 24 (1), 19-39 (2008).
  16. Larson, B. L., Heary, H. L., Devery, J. E. Immunoglobulin production and transport by the mammary gland. Journal of Dairy Science. 63 (4), 665-671 (1980).
  17. Ulfman, L. H., Leusen, J. H. W., Savelkoul, H. F. J., Warner, J. O., van Neerven, R. J. J. Effects of bovine immunoglobulins on immune function, allergy, and infection. Frontiers in Nutrition. 5, 52(2018).
  18. El-Loly, M. M. Bovine milk immunoglobulins in relation to human health. International Journal of Dairy Science. 2 (3), 183-195 (2007).
  19. Korhonen, H., Marnila, P., Gill, H. S. Milk immunoglobulins and complement factors. British Journal of Nutrition. 84 (1), 75-80 (2000).
  20. Arnold, R. R., Brewer, M., Gauthier, J. J. Bactericidal activity of human lactoferrin: Sensitivity of a variety of microorganisms. Infection and Immunity. 28 (3), 893-898 (1980).
  21. Aisen, P., Listowsky, I. Iron transport and storage proteins. Annual Review of Biochemistry. 49 (1), 357-393 (1980).
  22. Zhao, X., et al. The in vitro protective role of bovine lactoferrin on intestinal epithelial barrier. Molecules. 24 (1), 148(2019).
  23. Chatterton, D. E. W., Smithers, G., Roupas, P., Brodkorb, A. Bioactivity of β-lactoglobulin and α-lactalbumin-Technological implications for processing. International Dairy Journal. 16 (11), 1229-1240 (2006).
  24. Pellegrini, A., Dettling, C., Thomas, U., Hunziker, P. Isolation and characterization of four bactericidal domains in the bovine β-lactoglobulin. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1526 (2), 131-140 (2001).
  25. Brück, W. M., et al. rRNA probes used to quantify the effects of glycomacropeptide and α-lactalbumin supplementation on the predominant groups of intestinal bacteria of infant rhesus monkeys challenged with enteropathogenic Escherichia coli. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 37 (3), 273-280 (2003).
  26. Indyk, H. E., Hart, S., Meerkerk, T., Gill, B. D., Woollard, D. C. The β-lactoglobulin content of bovine milk: Development and application of a biosensor immunoassay. International Dairy Journal. 73, 68-73 (2017).
  27. Swaisgood, H. E. Protein and amino acid composition of bovine milk. Handbook of Milk Composition. , 464-468 (1995).
  28. Seifu, E., Buys, E. M., Donkin, E. F. Significance of the lactoperoxidase system in the dairy industry and its potential applications: A review. Trends in Food Science and Technology. 16 (4), 137-154 (2005).
  29. Wheeler, T. T., Hodgkinson, A. J., Prosser, C. G., Davis, S. R. Immune components of colostrum and milk-A historical perspective. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 12 (4), 237-247 (2007).
  30. Clare, D., Catignani, G., Swaisgood, H. Biodefense properties of milk: The role of antimicrobial proteins and peptides. Current Pharmaceutical Design. 9 (16), 1239-1255 (2003).
  31. Mehra, R., Marnila, P., Korhonen, H. Milk immunoglobulins for health promotion. International Dairy Journal. 16 (11), 1262-1271 (2006).
  32. Gapper, L. W., Copestake, D. E. J., Otter, D. E., Indyk, H. E. Analysis of bovine immunoglobulin G in milk, colostrum and dietary supplements: a review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389 (1), 93-109 (2007).
  33. Mettler, A. E. Utilization of whey by-products for infant feeding. International Journal of Dairy Technology. 33 (2), 67-72 (1980).
  34. Zenker, H. E., Raupbach, J., Boeren, S., Wichers, H. J., Hettinga, K. A. The effect of low vs. high temperature dry heating on solubility and digestibility of cow's milk protein. Food Hydrocolloids. 109, 106098(2020).
  35. Costa, F. F., et al. Microfluidic chip electrophoresis investigation of major milk proteins: Study of buffer effects and quantitative approaching. Analytical Methods. 6 (6), 1666-1673 (2014).
  36. Lönnerdal, B., Du, X., Jiang, R. Biological activities of commercial bovine lactoferrin sources. Biochemistry and Cell Biology. 99 (1), 35-46 (2021).
  37. Belanger, L., Sylvestre, C., Dufour, D. Enzyme-linked immunoassay for alpha-fetoprotein by competitive and sandwich procedures. Clinica Chimica Acta. 48 (1), 15-18 (1973).
  38. Sakamoto, S., et al. Enzyme-linked immunosorbent assay for the quantitative/qualitative analysis of plant secondary metabolites. Journal of Natural Medicines. 72 (1), 32-42 (2018).
  39. Engvall, E. The ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay. Clinical Chemistry. 56 (2), 319-320 (2010).
  40. Kohl, T. O., Ascoli, C. A. Immunometric double-antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay. Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (6), (2017).
  41. Shah, K., Maghsoudlou, P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): the basics. British Journal of Hospital Medicine. 77 (7), 98-101 (2016).
  42. Abd El-Fattah, A. M., Abd Rabo, F. H. R., EL-Dieb, S. M., El-Kashef, H. A. Changes in composition of colostrum of Egyptian buffaloes and Holstein cows. BMC Veterinary Research. 8 (1), 19(2012).
  43. Newby, T. J., Stokes, C. R., Bourne, F. J. Immunological activities of milk. Veterinary Immunology and Immunopathology. 3 (1-2), 67-94 (1982).
  44. Chigerwe, M., et al. Comparison of four methods to assess colostral IgG concentration in dairy cows. Journal of the American Veterinary Medical Association. 233 (5), 761-766 (2008).
  45. Foley, J. A., Otterby, D. E. Availability, storage, treatment, composition, and feeding value of surplus colostrum: A review. Journal of Dairy Science. 61 (8), 1033-1060 (1978).
  46. Mechor, G. D., Gröhn, Y. T., McDowell, L. R., Van Saun, R. J. Specific gravity of bovine colostrum immunoglobulins as affected by temperature and colostrum components. Journal of Dairy Science. 75 (11), 3131-3135 (1992).
  47. Pritchett, L. C., Gay, C. C., Besser, T. E., Hancock, D. D. Management and production factors influencing immunoglobulin G1 concentration in colostrum from Holstein cows. Journal of Dairy Science. 74 (7), 2336-2341 (1991).
  48. Quigley, J. D., Martin, K. R., Dowlen, H. H. Concentrations of trypsin inhibitor and immunoglobulins in colostrum of Jersey cows. Journal of Dairy Science. 78 (7), 1573-1577 (1995).
  49. Bielmann, V., et al. An evaluation of Brix refractometry instruments for measurement of colostrum quality in dairy cattle. Journal of Dairy Science. 93 (8), 3713-3721 (2010).
  50. A Ayar, A., Sıçramaz, H., Çetin, I. The effect of bovine colostrum on the lactic flora of yogurt and kefir. JSM Biotechnology and Biomedical Engineering. 3, 3-8 (2016).
  51. Sobaih, A., Zaki, D. A. Production of novel functional yoghurt fortified with bovine colostrum and date syrup for children. Alexandria Science Exchange Journal. 39, 651-662 (2018).
  52. Saalfeld, M. H., et al. Colostro: a redescoberta de um alimento saudável, nutritivo e com potencial probiótico. Agroecologia e Desenvolvimento Rural Sustentável. 5 (2), 18-24 (2012).
  53. Mouton, E., Aryana, K. J. Influence of colostrum on the characteristics of ice cream. Food and Nutrition Sciences. 06 (05), 480-484 (2015).
  54. Nazir, T., Pal, M. A., Manzoor, A. Effect of admixing varying levels of whole milk to the colostrum on the sensory quality of fermented colostrum product. International Journal of Advanced Research in Science, Engineering and Technology. 7 (4), 156-161 (2018).
  55. Korhonen, H. J. Bioactive milk proteins, peptides and lipids and other functional components derived from milk and bovine colostrum. Functional Foods. , 471-511 (2011).
  56. Cortés-Ríos, J., et al. Protein quantification by bicinchoninic acid (BCA) assay follows complex kinetics and can be performed at short incubation times. Analytical Biochemistry. 608, 113904(2020).
  57. Johnson, M. Protein quantitation. Materials and Methods. 2, 115(2012).
  58. Walker, J. M. The Bicinchoninic Acid (BCA) assay for protein quantitation. The Protein Protocols Handbook. , 11-15 (2009).
  59. Wang, R., et al. Sensitive immunoassays based on specific monoclonal IgG for determination of bovine lactoferrin in cow milk samples. Food Chemistry. 338, 127820(2021).
  60. Kazemi, M. G., Feizy, J. Overview of the important of ELISA technique and application in food industry. Analyzing Microbes. 4 (4), 19-25 (2020).
  61. Verma, J., Saxena, S., Babu, S. G. ELISA-based identification and detection of microbes. Analyzing Microbes. , 169-186 (2013).
  62. Minic, R., Zivkovic, I. Optimization, validation and standardization of ELISA. Norovirus. , (2020).
  63. Drijvers, J. M., Awan, I. M., Perugino, C. A., Rosenberg, I. M., Pillai, S. The enzyme-linked immunosorbent assay. Basic Science Methods for Clinical Researchers. , 119-133 (2017).
  64. Walker, A. Breast milk as the gold standard for protective nutrients. The Journal of Pediatrics. 156 (2), 3-7 (2010).
  65. Patel, K., Rana, R. Pedimune in recurrent respiratory infection and diarrhoea-The Indian experience-The PRIDE study. The Indian Journal of Pediatrics. 73 (7), 585-591 (2006).
  66. Saad, K., et al. Effects of bovine colostrum on recurrent respiratory tract infections and diarrhea in children. Medicine. 95 (37), 4560(2016).
  67. Buckley, J. D., Brinkworth, G. D., Abbott, M. J. Effect of bovine colostrum on anaerobic exercise performance and plasma insulin-like growth factor I. Journal of Sports Sciences. 21 (7), 577-588 (2003).
  68. Kotsis, Y., et al. A low-dose, 6-week bovine colostrum supplementation maintains performance and attenuates inflammatory indices following a Loughborough Intermittent Shuttle Test in soccer players. European Journal of Nutrition. 57 (3), 1181-1195 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

St enie bia ekbia ka bioaktywneimmunoglobulina Gst enie laktoferynytest BCASDS PAGEtest ELISAizolacja bia ekczynniki wzrostu
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły