Wykrywanie indel po mutagenezie CRISPR/Cas9 przy użyciu analizy stopienia w wysokiej rozdzielczości u komara Aedes aegypti

Jako wektory patogenów, takich jak wirusy denga¹, Zika² i chikungunya³, a także pasożyty malarii⁴, komary stanowią poważne zagrożenie dla zdrowia publicznego ludzi. W przypadku wszystkich tych chorób interwencja transmisyjna kładzie się duży nacisk na zwalczanie komarów-wektorów. Badanie genów ważnych na przykład w odniesieniu do pobłażliwości wobec patogenów, przystosowania komarów, przeżywalności, reprodukcji i odporności na środki owadobójcze ma kluczowe znaczenie dla opracowania nowych strategii zwalczania komarów. W tym celu edycja genomu u komarów staje się powszechną praktyką, zwłaszcza wraz z rozwojem technologii takich jak HE, ZFN, TALENs, a ostatnio CRISPR with Cas9. Tworzenie szczepów z edytowanymi genami zazwyczaj obejmuje krzyżowanie wsteczne osobników niosących pożądane mutacje przez kilka pokoleń w celu zminimalizowania efektów off-target i założyciela (wąskiego gardła), a następnie krzyżowanie osobników heterozygotycznych w celu wytworzenia linii homozygotycznych lub trans-heterozygotycznych. W przypadku braku markera dominującego, genotypowanie molekularne jest konieczne w tym procesie, ponieważ w wielu przypadkach nie można wykryć wyraźnych cech fenotypowych dla mutantów heterozygotycznych.

Chociaż sekwencjonowanie jest złotym standardem w charakterystyce genotypowej, przeprowadzanie tego na setkach, a nawet tysiącach osób, wiąże się ze znacznymi kosztami, pracą i czasem potrzebnym do uzyskania wyników, co jest szczególnie ważne dla organizmów o krótkiej długości życia, takich jak komary. Powszechnie stosowanymi alternatywami są test nukleazy Surveyor⁵ (SNA), test T7E1⁶ i analiza topnienia w wysokiej rozdzielczości (HRMA, przejrzana w⁷). Zarówno SNA, jak i T7E1 używają endonukleaz, które rozszczepiają tylko niedopasowane zasady. Kiedy zmutowany region heterozygotycznego zmutowanego genomu jest amplifikowany, fragmenty DNA ze zmutowanych i dzikich alleli są wyżarzane w celu wytworzenia niedopasowanego dwuniciowego DNA (dsDNA). SNA wykrywa obecność niedopasowań poprzez trawienie za pomocą endonukleazy specyficznej dla niezgodności i prostą elektroforezę w żelu agarozowym. Alternatywnie, HRMA wykorzystuje właściwości termodynamiczne dsDNA wykryte przez barwniki fluorescencyjne wiążące dsDNA, przy czym temperatura dysocjacji barwnika zmienia się w zależności od obecności i rodzaju mutacji. HRMA został wykorzystany między innymi do wykrywania polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNPs)⁸, genotypowania mutantów ryb danio pręgowanego⁹, zastosowań mikrobiologicznych¹⁰ oraz badań genetycznych roślin¹¹.

Ten artykuł opisuje HRMA, prostą metodę molekularnego genotypowania dla zmutowanych komarów generowaną przez technologię CRISPR/Cas9. Zalety HRMA w porównaniu z alternatywnymi technikami obejmują: 1) elastyczność, ponieważ udowodniono, że jest przydatna dla różnych genów, szeroki zakres rozmiarów indel, a także rozróżnienie między różnymi rozmiarami indel oraz różnicowaniem heterozygotycznym, homozygotycznym i trans-heterozygotycznym^12,13,14, 2) koszt, ponieważ opiera się na powszechnie stosowanych odczynnikach PCR, oraz 3) oszczędność czasu, ponieważ można go wykonać w ciągu zaledwie kilku godzin. Ponadto protokół wykorzystuje małą część ciała (nogę) jako źródło DNA, co pozwala komarowi przetrwać proces genotypowania, co pozwala na ustanowienie i utrzymanie zmutowanych linii.

1. Skanowanie w poszukiwaniu polimorfizmów pojedynczych nukleotydów (SNP), projektowanie starterów HRMA i walidacja starterów

1. Identyfikacja SNP u komarów z kolonii laboratoryjnych typu dzikiego
   1. Wybierz docelowy ekson, aby zakłócić prawidłową translację polipeptydów.
      UWAGA: Cel powinien znajdować się blisko kodonu start lub wśród kluczowych reszt wymaganych do funkcjonowania białka. Im krótszy ekson (np. ≤200 zasad), tym trudniej jest go namierzyć i przeanalizować. Unikaj edycji blisko granic eksonu, ponieważ zmusza to jeden ze starterów HRMA do przejścia przez intron lub znalezienia się w intronie. Jest to niepożądane, ponieważ wskaźniki SNP są zwykle znacznie wyższe w tych regionach.
   2. Wzór podkładu
      1. Wejdź na stronę NCBI Blast - Primer Blast class¹⁵, skopiuj i wklej wybrany ekson w polu u góry strony | wybierz rozmiar produktu PCR (upewnij się, że obejmuje większość eksonu) | wybierz organizm.
      2. Kliknij Parametry zaawansowane | Wybierz (dla produktu PCR Tm) i dodaj 60 (dla optymalnej temperatury 60 °C) | Zdobądź podkłady. Pozostałe parametry należy zachować jako domyślne.
   3. Uzyskaj genomowe DNA (gDNA) z kolonii laboratoryjnej typu dzikiego. Odłóż na bok 10 komarów, znieczul je CO₂ i umieść na szalce Petriego na lodzie, aby były nieaktywne. Ustawić 10 probówek zawierających 0,5 μl odczynnika do uwalniania DNA z tkanki i 20 μl buforu do rozcieńczania, oba dostarczone w zestawie do uwalniania DNA sugerowanym w Tabeli Materiałów.
   4. Usunąć jedną nogę z pojedynczego komara za pomocą kleszczy i umieścić ją w odpowiedniej probówce z rozcieńczonym roztworem odczynnika uwalniającego DNA (od kroku 1.1.3), całkowicie zanurzając nogę w roztworze. Powtórz ten krok z pozostałymi komarami, wycierając kleszcze 70% etanolem przed przejściem do następnego.
   5. Roztwór zawierający nogę inkubować w temperaturze pokojowej przez 2-5 minut, a następnie w temperaturze 98 °C przez 2 minuty i pozostawić do ostygnięcia, przygotowując reakcję PCR.
      UWAGA: Płytki zawierające uwolnione gDNA mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C, a protokół może zostać w tym momencie wstrzymany.
   6. Przygotować 10 probówek zawierających 10 μl 2x PCR Master Mix, startery do końcowego stężenia 0,5 μM i wodę molekularną do końcowej objętości 20 μl i przenieść 1 μl rozcieńczonej próbki do każdej probówki. Wykonać PCR zgodnie z następującymi parametrami cyklicznymi: 98 °C 5 min, 40 cykli po 98 °C przez 5 s, 60 °C 30 s, 72 °C 20 s na kb; końcowe przedłużenie temperatury 72 °C przez 1 min.
   7. Oczyść produkty PCR enzymem w celu degradacji pozostałych starterów PCR i defosforylacji nadmiaru dNTP lub dowolnego zestawu do czyszczenia kolumny. Kontynuuj sekwencjonowanie próbek.
   8. Przeanalizuj każdy elektroferogram pod kątem obecności podwójnych pików/niejednoznacznych zasad i dostosuj wywołania podstawowe ręcznie w każdej sekwencji przy użyciu odpowiedniego zdegenerowanego kodu podstawowego.
      UWAGA: Ten krok należy wykonać przed wyrównaniem wielu sekwencji, ponieważ często zdarza się, że oprogramowanie do wywoływania baz wybiera bardziej widoczny szczyt jako "prawdziwe" wywołanie podstawowe, dając fałszywe wrażenie braku SNP.
   9. Wykonaj wyrównanie wielu sekwencji za pomocą oprogramowania do wyrównywania SeqMan Pro, wymienionego w Tabeli materiałów lub innego oprogramowania do wyrównywania typu open source, takiego jak ClustalW¹⁶ lub T-Coffee¹⁷.
      1. Otwórz oprogramowanie do wyrównywania | kliknij Dodaj sekwencje | wybierz żądane sekwencje i kliknij Dodaj | po wybraniu wszystkich sekwencji kliknij Gotowe.
      2. Kliknij Zmontuj, aby wykonać wyrównanie. Aby otworzyć wyrównanie, kliknij Contig 1 i przeanalizuj wyrównanie oraz zidentyfikuj SNP (Rysunek 1).
         UWAGA: Jako alternatywę dla kroków 1.1.3-1.1.6, PCR można przeprowadzić z izolowanego genomowego DNA uzyskanego z próbek zbiorczych (pochodzących od >10 osób). Sekwencjonowane amplikony mogą być analizowane bezpośrednio pod kątem obecności SNP pojawiających się jako podwójne piki w elektroferogramie, chociaż rzadkie SNP będą trudniejsze do wykrycia.
   10. Zaprojektuj 3-5 pojedynczych przewodnikowych RNA (sgRNA), unikając regionów zawierających jakiekolwiek SNP określone powyżej, zgodnie z protokołem opisanym w¹⁸.
2. Konstrukcja podkładu HRMA
   1. Przetestuj sekwencję eksonów pod kątem możliwego tworzenia się struktur drugorzędowych podczas PCR za pomocą mFold¹⁹.
      1. Przejdź do serwera WWW UNAFold | kliknij na mFold | w menu rozwijanym kliknij na Aplikacje | Forma fałdowania DNA.
      2. Wprowadź nazwę sekwencji w polu i wklej ekson.
      3. Zmień temperaturę składania na 60 °C; w warunkach jonowych zmień [Mg⁺⁺] na 1,5 i włącz Jednostki przełącz na mM; kliknij Złóż DNA.
      4. Na Wyjściu, poniżej Struktura 1, kliknij pdf, aby otworzyć Wykresy struktury kołowej.
   2. Przejdź do NCBI Blast - Primer Blast¹⁵ do projektowania podkładu.
   3. Skopiuj i wklej wybraną sekwencję eksonów określoną przez sekwencjonowanie w kroku 1.1 (sekwencja, która zawiera najmniejszą liczbę SNP lub brak SNP) w polu u góry strony.
   4. Użyj symbolu < >, aby oznaczyć i wykluczyć sekwencje zawierające SNP, miejsce docelowe i regiony, w których możliwe jest utworzenie struktury drugorzędowej.
   5. Wybierz rozmiar produktu PCR w zakresie od 80 do 150 pz i wybierz organizm.
      UWAGA: Z powodzeniem można stosować większe rozmiary fragmentów (~300 pz). Jednak dłuższe amplikony mogą zmniejszać czułość między sekwencjami różniącymi się jedną lub tylko kilkoma parami zasad.
   6. Kliknij Pobierz podkłady. Wybierz 2–3 pary starterów do przetestowania (najlepiej, aby miejsca starterów były oddalone o ≥20–50 pz od wszelkich miejsc docelowych CRISPR).
3. Walidacja podkładu
   1. Wykonaj gradientowy PCR przy użyciu gDNA od jednej osoby.
      1. Przygotować mieszankę wzorcową i usunąć jedną próbkę do kontroli bez matrycy (NTC) w oddzielnej probówce. Dodać szablon do pozostałej mieszanki wzorcowej i podwielokrotność do płytki 96-dołkowej.
      2. Postępuj zgodnie z parametrami cyklu: 98 °C 30 s, 34 cykle po 98 °C przez 10 s, 55–65 °C 30 s, 72 °C 15 s; końcowe wydłużenie 72 °C przez 10 min.
      3. Generuj termiczne profile stopu według parametrów: etap denaturacji 95 °C przez 1 min, wyżarzanie 60 °C przez 1 min, wykrywanie krzywej topnienia między 75 °C a 95 °C w krokach co 0,2 °C, z czasem podtrzymania 10 s w każdej temperaturze.
         UWAGA: Należy stosować tylko temperatury wyżarzania z pojedynczym profilem termicznym stopu.
4. Kontynuuj generowanie zmutowanych linii za pomocą wstrzyknięć zarodków zgodnie z opisem w¹².

2. Przygotowanie genomowego DNA z nóg komara

1. Oddziel komary G₁ według płci na etapie poczwarki, tak aby nie łączyły się w pary przed genotypowaniem, i upewnij się, że komary kontrolne typu dzikiego w tym samym wieku będą dostępne do wykorzystania do celów referencyjnych i krzyżówek wstecznych. Płeć rozdzieli ich podobnie.
2. Zbierz potrzebne materiały (Rysunek 2A) i przygotuj 96-dołkową płytkę PCR z 0,5 μl odczynnika do uwalniania DNA i 20 μl buforu do rozcieńczania (z zestawu do uwalniania gDNA) na osobę do genotypowania (Rysunek 2B) i pozostaw ją na lodzie. Zarezerwuj dwie reakcje dla NTC.
3. Oznaczyć tackę na fiolki z komarami (fiolki z Drosophila) tak, aby każda studzienka na płytce 96 odpowiadała odpowiedniej fiolce na komary w tacy.
4. Znieczulij komary G₁ CO₂ i umieść je na szklanej szalce Petriego, aby utrzymać je w stanie uspokojenia (Rysunek 2C, D). Znieczul i umieść 8 komarów typu dzikiego na drugiej szalce Petriego.
5. Przetrzyj pęsetę 70% etanolem i usuń jedną z tylnych nóg komara (Rysunek 2E,F).
6. Zanurz nogę w roztworze odczynnika uwalniającego DNA, umieść komara w odpowiedniej fiolce i zamknij ją gąbką (Rysunek 2G, H).
7. Ponownie przetrzyj pęsetę 70% etanolem i przystąp do usuwania nogi z następnego komara. Powtarzaj kroki 2.5-2.7, aż 96-dołkowa płytka zostanie ukończona.
   UWAGA: Ważne jest, aby przetrzeć pęsetę 70% etanolem. Minimalizuje to zanieczyszczenie krzyżowe DNA.
8. Uszczelnić płytkę za pomocą optycznej płytki PCR (Rysunek 2I) i inkubować 96-dołkową płytkę zawierającą nogi w temperaturze pokojowej (RT) przez 2-5 minut, a następnie w temperaturze 98 °C przez 2 minuty. Poczekaj, aż płytka ostygnie do temperatury pokojowej podczas przygotowywania mieszanki PCR.
   UWAGA: Cały proces trwa zazwyczaj 3-4 godziny. Jeśli komary muszą być trzymane w fiolkach dłużej niż oczekiwany czas (szczególnie ≥1 dzień), umieść mały kawałek rodzynek (lub źródło cukru i wody) z każdym komarem, aby zapewnić przetrwanie komarów podczas przedłużonej inkubacji.

3. HRMA

1. Wykonaj PCR.
   1. Przygotować mieszankę wzorcową zawierającą następujące składniki na każdą reakcję: 10 μL 2x buforu (z zestawu do uwalniania gDNA), 0,5 μM każdego startera, 1 μL barwnika EvaGreen, 0,4 μL polimerazy (z zestawu do uwalniania gDNA) i uzupełnić do 19 μL wodą molekularną.
   2. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieść 19 μl mieszanki wzorcowej do każdej studzienki. Przenieść 1 μl roztworu uwalniającego DNA zawierającego DNA komara przygotowanego w sekcji 2 na płytkę (Rysunek 3A). Uszczelnij płytkę za pomocą optycznej uszczelki PCR.
   3. Wykonać PCR zgodnie z parametrami cyklu: 98 °C przez 5 min, 39 cykli po 98 °C przez 10 s, wybrana temperatura wyżarzania (72 °C) przez 30 s; końcowe przedłużenie 72 °C przez 2 min.
2. Generuj termiczne profile stopu według parametrów: etap denaturacji 95 °C przez 1 min, wyżarzanie 60 °C przez 1 min, wykrywanie krzywej topnienia między 75 °C a 95 °C w krokach co 0,2 °C, z czasem podtrzymania 10 s w każdej temperaturze. Zapoznaj się z materiałem uzupełniającym i rysunkiem uzupełniającym S1-S5, aby uzyskać szczegółowy opis konfiguracji oprogramowania do uruchamiania HRMA przy użyciu systemu czasu rzeczywistego CFX96.
3. Zbadaj profile stopu (Rysunek 3B). Przypisywanie formantu typu dzikiego do klastra referencyjnego.
   UWAGA: Oprogramowanie (patrz Tabela materiałów) automatycznie normalizuje dane i wyznacza klastry kolorami dla różnych krzywych topnienia.
4. Zaznacz różne klastry odpowiednimi kolorami na 96-dołkowym szablonie (Rysunek 3C).
5. Wybierz osoby z interesującymi Cię krzywymi, usuń je z rurek i krzyżuj wstecznie (Rysunek 3D). Nakarm krwią kryte samice i zbierz jaja_G2.

4. Weryfikacja sekwencji za pomocą sekwencjonowania Sangera

1. Oczyścić produkt PCR z dołków z wybranymi komarami (z płytki przygotowanej w sekcji 3.1), używając enzymu do degradacji pozostałych starterów PCR i odfosforylować nadmiar dNTP. Alternatywnie można użyć dowolnego zestawu do czyszczenia kolumn i przystąpić do sekwencjonowania próbek.
   UWAGA: Sekwencjonowanie bezpośrednie może być trudniejsze, gdy rozmiar produktu PCR jest mały (≤200 pz). W takich przypadkach należy zaprojektować startery do amplifikacji większych fragmentów obejmujących miejsce docelowe (≥250 pz) i amplifikacji metodą PCR przy użyciu DNA w 96-dołkowej płytce (krok 2.2).
2. Przeanalizuj i zidentyfikuj indele za pomocą oprogramowania do przeglądania śladów (Rysunek 4). Alternatywnie, oprogramowanie Poly Peak Parser²⁰ może pomóc w wykryciu mutacji u osób heterozygotycznych.
   1. Przejdź do witryny Poly Peak Parser, wybierz sekwencję z zmutowanych osobników w menu Przeglądaj, a następnie skopiuj i wklej sekwencję referencyjną w polu.
      UWAGA: Wyrównanie między alternatywnym allelem a odniesieniem pojawi się automatycznie po prawej stronie ekranu.

Komary zawierające mutacje w genach AaeZIP11 (domniemany transporter żelaza21) i myo-fem (gen miozyny związany z mięśniami lotu13) uzyskano przy użyciu technologii CRISPR/Cas9, genotypowano za pomocą HRMA i zweryfikowano sekwencyjnie (Rysunek 5). Rysunek 5A i Rysunek 5C pokazuje znormalizowaną intensywność fluorescencji z krzywych HRM z próbek mutantów AaeZIP11 i myo-fem, odpowiednio, wraz z kontrolami typu dzikiego. Rysunek 4B i Rysunek 4D pokazuje powiększenie krzywych różnicowych (odpowiednio z próbek mutantów AaeZIP11 i myo-fem) między profilami topnienia różnych klastrów przypisanych przez oprogramowanie po odjęciu każdej krzywej od odniesienia typu dzikiego. Heterozygotyczne i homozygotyczne zmutowane osobniki AaeZIP11 umieszczono w różnych skupiskach i można je łatwo odróżnić od kontrolnych typu dzikiego (Figura 5B). Heterozygotyczne zmutowane osobniki myo-fem również różnią się od kontrolnych (Ryc. 5D). Należy zauważyć, że w obu przypadkach obecne były dwa klastry w kontrolach typu dzikiego, najprawdopodobniej z powodu obecności SNP w regionie docelowym (Rysunek 5), podkreślając potrzebę użycia wielu próbek kontrolnych, aby uniknąć kategoryzowania kontroli jako mutantów, gdy nie można uniknąć SNP.

Rysunek 4A przedstawia analizę sekwencji mutanta AaeZIP11. Elektroferogram heterozygotycznych mutantów AaeZIP11 wskazuje pozycję nukleotydu, w której wystąpił indel. Jest to reprezentowane przez przesunięcie od pojedynczych do podwójnych pików, ponieważ pozycje polimorficzne pokażą oba nukleotydy jednocześnie (Rysunek 4A). Liczba usuniętych lub wstawionych par zasad została obliczona poprzez zliczenie pojedynczych pików na końcu serii (Rysunek 4B), ponieważ jedna z nici DNA będzie krótsza lub dłuższa od drugiej odpowiednio o liczbę par zasad usuniętych lub wstawionych. Zaleca się stosowanie zweryfikowanego sekwencyjnie gDNA z mutantów jako punktu odniesienia do identyfikacji heterozygot, aby pomóc w analizach HRMA dla kolejnych pokoleń. Ręczne przypisanie krzywych może być konieczne, gdy podobne krzywe są automatycznie przypisywane do różnych klastrów. Można to zrobić, porównując krzywe przesunięte temperaturowo i krzywe różnicowe. Ręczne dostosowanie oprogramowania może być konieczne do prawidłowego przypisania próbek do klastrów. Wyniki HRMA z AaeZIP11 i mutanta o nazwie Aeflightin pokazują, że do pomyślnej kategoryzacji heterozygot, homozygot i transheterozygot potrzebne były analizy poszczególnych próbek. Początkowo automatyczne przypisanie klastrów przez oprogramowanie nie mogło dokonać prawidłowego rozróżnienia między grupami (Rysunek 6A, Rysunek 6C, Rysunek 6E, oraz Rysunek 6G). Każda próbka została następnie przeanalizowana indywidualnie i przypisana do odpowiednich grup na podstawie podobieństwa do próbek referencyjnych heterozygot, homozygot i trans-heterozygot (wcześniej zweryfikowanych przez sekwencjonowanie) (Rysunek 6B, Rysunek 6D, Rysunek 6F, oraz Figura 6H).

Rysunek 1: Identyfikacja SNP. Schematyczne przedstawienie wielokrotnego wyrównania sekwencji fragmentu AaeZIP11 z typu dzikiego. Na czerwono zaznaczono SNP, a na zielono fragmenty wolne od SNP; ten region wolny od SNP jest sugerowany do projektowania sgRNA i starterów. Skróty: SNP = polimorfizm pojedynczego nukleotydu; sgRNA = pojedynczy przewodnik RNA; LVP = szczep Liverpool. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Eksperymentalna procedura pozyskiwania genomowego DNA z nóg komara dla HRMA. (A) Materiały do otrzymywania genomowego DNA, w tym pipety, końcówki, płytka do PCR, uszczelka optyczna, zbiornik, bufor rozcieńczający i roztwór do uwalniania DNA. (B) Przygotowanie płytki PCR zawierającej odczynnik do uwalniania DNA i bufor do rozcieńczania. (C) Znieczulenie komarami z CO2 . (D) Przetarcie pęsety 70% etanolem, aby zapobiec zanieczyszczeniu między próbkami. (E) Zestaw eksperymentalny obejmujący pęsetę, stojak na fiolki z komarami, szalkę Petriego na pojemniku na lód ze znieczulonymi komarami oraz wcześniej przygotowaną płytkę PCR. (F) Usunięcie nogi komara. (G) Powiększenie nogi komara zanurzonej w roztworze odczynnika uwalniającego DNA. (H) Pojedynczy komar umieszczony w fiolce. (I) Zapieczętowanie płytki PCR zawierającej nogi komara. Skrót: HRMA = analiza stopu w wysokiej rozdzielczości. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Procedura eksperymentalna dla analiz HRM. (A) Przeniesienie uwolnionego gDNA na 96-dołkową płytkę zawierającą mieszaninę PCR. (B) Oględziny krzywych różnicowych. (C) Oznaczanie każdej próbki na 96-dołkowej matrycy tym samym kolorem, co odpowiedni kolor krzywej różnicy. (D) Krzyżowanie wsteczne osobników z tej samej grupy. Skróty: HRM = stopiony o wysokiej rozdzielczości; gDNA = genomowe DNA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Analiza sekwencji mutanta AaeZIP11. (A) Wyrównanie nukleotydowe mutanta AaeZIP11Δ56. Kreski podświetlone na żółto to usunięte podstawy. W ramce elektroferogram przechodzi od pojedynczych pików do podwójnych pików, przedstawiając pozycję, w której nastąpiła delecja (strzałka). (B) Elektroferogram zakończenia serii sekwencjonowania i przejścia od pików podwójnych do pików pojedynczych. Należy zauważyć, że liczba pojedynczych szczytów reprezentuje liczbę usuniętych zasad (szary prostokąt). Sekwencje starterów znajdują się w tabeli uzupełniającej S1. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: HRMA DNA wyekstrahowane z nóg komara. DNA wyekstrahowano z pojedynczej nogi komarów AaeZIP11 (A i B) oraz myo-fem (C i D) z nokautem Ae. aegypti i przeanalizowano za pomocą HRMA. A i C oznaczają znormalizowane sygnały fluorescencji próbek do wartości względnych od 1,0 do 0. B i D oznaczają powiększenie różnic krzywych poprzez odjęcie każdej krzywej od odniesienia typu dzikiego (szczep Liverpool). Skróty: HRMA = analiza stopu w wysokiej rozdzielczości; LVP = szczep Liverpool; RFU = względne jednostki fluorescencji. Sekwencje starterów znajdują się w tabeli uzupełniającej S1. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Przykłady ręcznego przypisywania grup. (A-D) HRMA dla mutantów Aeflightin. (A i C) Krzywe topnienia (odpowiednio znormalizowane krzywe skali liniowej i krzywe różnicowe) są automatycznie grupowane przez oprogramowanie do precyzyjnej analizy stopienia. (B) Normalizacja krzywych różnicowych zmienianych ręcznie. (D) Po zmianie normalizacji krzywych różnicowych, każda próbka została przypisana indywidualnie przez temperatury szczytowe na krzywych różnicowych dla odpowiednich kontroli pozytywnych (wcześniej zsekwencjonowane próbki zidentyfikowane przez heterozygoty Δ4 i Δ5 oraz transheterozygoty Δ4Δ5), umożliwiając wyraźną identyfikację 3 grup. Dodano czerwone i brązowe strzałki, aby podkreślić szczyty w różnych temperaturach. (E-H) HRMA dla mutantów AaeZIP11. (E i G) Krzywe topnienia są automatycznie przypisywane przez oprogramowanie. (F i H) Mutanty w drugim heterozygotycznym samokrzyżowaniu zostały odpowiednio przypisane do właściwych grup przez podobieństwo krzywych znormalizowanych i różnicowych do wcześniej wyznaczonych odniesień (oznaczonych kolorami w krzywych). Heterozygoty asg, Homozygoty asg i Trans-heterozygoty asg: przypisane krzywe topnienia za pomocą oprogramowania do precyzyjnej analizy stopienia. Skróty: HRMA = analiza stopu w wysokiej rozdzielczości; LVP = szczep Liverpool; RFU = względne jednostki fluorescencji. Sekwencje starterów znajdują się w tabeli uzupełniającej S1. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Materiały uzupełniające: Szczegółowy protokół konfiguracji HRMA w systemie czasu rzeczywistego CFX96 (np. Bio-rad). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający S1: Instrukcje krok po kroku dotyczące konfiguracji protokołu rowerowego w Bio-rad CFX Manager. Patrz materiał uzupełniający 2.1-2.3. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający S2: Instrukcje krok po kroku dotyczące konfiguracji płytki w Bio-rad CFX Manager. Patrz materiał uzupełniający 3.1-3.4. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający S3: Instrukcje krok po kroku dotyczące konfiguracji płytki w Bio-rad CFX Manager. Patrz materiał uzupełniający 3.5-3.6. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający S4: Instrukcje krok po kroku dotyczące konfiguracji uruchamiania w Bio-rad CFX Manager. Patrz materiał uzupełniający 4.1. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający S5: Instrukcje krok po kroku dotyczące analizy HRMA w Bio-rad CFX Manager. Patrz materiał uzupełniający 5.1-5.3. Skrót: HRMA = analiza stopu w wysokiej rozdzielczości. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca S1: Lista starterów. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.