Wykrywanie indel po mutagenezie CRISPR/Cas9 przy użyciu analizy stopienia w wysokiej rozdzielczości u komara Aedes aegypti

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje protokół szybkiej identyfikacji indeli indukowanych przez CRISPR/Cas9 i selekcji linii mutantów u komara Aedes aegypti za pomocą analizy topnienia w wysokiej rozdzielczości.

Streszczenie

Edycja genów komarów stała się rutyną w wielu laboratoriach wraz z ustanowieniem takich systemów jak nukleazy efektorowe podobne do aktywatora transkrypcji (TALENs), nukleazy palców cynkowych (ZFNs) i endonukleazy naprowadzające (HEs). Niedawno, technologia CRISPR/białko 9 (Cas9) związane z regularnymi odstępami między sobą (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) zaoferowała łatwiejszą i tańszą alternatywę dla precyzyjnej inżynierii genomu. Po działaniu nukleazy szlaki naprawy DNA naprawiają uszkodzone końce DNA, często wprowadzając indele. Te mutacje poza ramką są następnie wykorzystywane do zrozumienia funkcji genów w organizmach docelowych. Wadą jest jednak to, że zmutowane osobniki nie są nosicielami dominującego markera, co sprawia, że identyfikacja i śledzenie zmutowanych alleli jest trudne, zwłaszcza w skali potrzebnej do wielu eksperymentów.

Analiza topnienia w wysokiej rozdzielczości (HRMA) jest prostą metodą identyfikacji zmian w sekwencjach kwasów nukleinowych i wykorzystuje krzywe topnienia PCR do wykrywania takich zmian. Ta metoda analizy post-PCR wykorzystuje fluorescencyjne dwuniciowe barwniki wiążące DNA z oprzyrządowaniem, które ma zdolność przechwytywania danych kontroli rampy temperatury i można je łatwo skalować do formatów płytek 96-dołkowych. Opisano tutaj prosty przepływ pracy wykorzystujący HRMA do szybkiego wykrywania indeli indukowanych przez CRISPR/Cas9 i ustanawiania zmutowanych linii u komara Ae. aegypti. Co najważniejsze, wszystkie etapy można wykonać przy użyciu niewielkiej ilości tkanki nogi i nie wymagają poświęcania organizmu, co pozwala na przeprowadzenie krzyżówek genetycznych lub testów fenotypowania po genotypowaniu.

Wprowadzenie

Jako wektory patogenów, takich jak wirusy denga¹, Zika² i chikungunya³, a także pasożyty malarii⁴, komary stanowią poważne zagrożenie dla zdrowia publicznego ludzi. W przypadku wszystkich tych chorób interwencja transmisyjna kładzie się duży nacisk na zwalczanie komarów-wektorów. Badanie genów ważnych na przykład w odniesieniu do pobłażliwości wobec patogenów, przystosowania komarów, przeżywalności, reprodukcji i odporności na środki owadobójcze ma kluczowe znaczenie dla opracowania nowych strategii zwalczania komarów. W tym celu edycja genomu u komarów staje się powszechną....

Protokół

1. Skanowanie w poszukiwaniu polimorfizmów pojedynczych nukleotydów (SNP), projektowanie starterów HRMA i walidacja starterów

1. Identyfikacja SNP u komarów z kolonii laboratoryjnych typu dzikiego
   1. Wybierz docelowy ekson, aby zakłócić prawidłową translację polipeptydów.
      UWAGA: Cel powinien znajdować się blisko kodonu start lub wśród kluczowych reszt wymaganych do funkcjonowania białka. Im krótszy ekson (np. ≤200 zasad), tym trudniej jest go namierzyć i przeanalizować. Unikaj edycji blisko granic eksonu, ponieważ zmusza to jeden ze starterów HRMA do przejścia przez intron lub znalezienia się w intronie. Jest to niepożądane, ponieważ wskaźnik....

Wyniki

Komary zawierające mutacje w genach AaeZIP11 (domniemany transporter żelaza²¹) i myo-fem (gen miozyny związany z mięśniami lotu¹³) uzyskano przy użyciu technologii CRISPR/Cas9, genotypowano za pomocą HRMA i zweryfikowano sekwencyjnie (Rysunek 5). Rysunek 5A i Rysunek 5C pokazuje znormalizowaną intensywność fluorescencji z krzywych HRM z próbek mutantów AaeZIP11 i myo-fem

Dyskusja

Analiza stopienia o wysokiej rozdzielczości oferuje proste i szybkie rozwiązanie do identyfikacji indeli generowanych przez technologię CRISPR/Cas9 w wektorze komara Ae. aegypti. Zapewnia elastyczność, umożliwiając genotypowanie komarów zmutowanych dla szerokiego zakresu genów, od mięśni ucieczki po metabolizm żelaza i nie tylko ^13,14. HRMA można wykonać w ciągu zaledwie kilku godzin od pobrania próbki do końcowych analiz. Dodatkowy czas jest wymagany do.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
70% etanol			70% roztwór etanolu w wodzie
96-dołkowe płytki do PCR i PCR w czasie rzeczywistym	VWR	82006-636	Do uzyskiwania genomowego DNA (z nogi komara)
Szablony			Drukowane w domu, do rejestracji genotypu
Bio Rad CFX96	Maszyna Bio Rad		PCR z możliwością
gradientu i HRMAZróżnicowane zbiorniki odczynników biotechnologicznych	VWR	490006-896
Exo-Zestaw do szybkiego czyszczenia PCR	New England Biolabs	E1050S
Szklana szalka Petriego	VWR	89001-246	150 mm x 20 mm
Cienkościenne 96-dołkowe płytki PCR z twardą skorupą	Bio-rad	HSP9665	Do
HRMA Pipetor wielokanałowy (P10)	Integra Biosciences	4721
Pipetor wielokanałowy (P300)	Integra Biosciences	4723
Taśma uszczelniająca z poliolefiny i akrylanu Nunc, Thermo Scientific	VWR	37000-548	Do użytku z 96-dołkiem  Płytki PCR do otrzymywania genomowego DNA
Optyczny taśma uszczelniająca	Bio-rad	2239444	Do użytku z 96-dołkowymi płytkami PCR z osłoną do zestawu do
bezpośredniego PCR tkanek zwierzęcych HRMA Phire (bez narzędzi do pobierania próbek)	Thermo Fisher	F140WH	Do uzyskiwania genomowego DNA i wykonywania
PCR Plastikowe dzielniki fiolek na muchy	Genesee	59-128W
Oprogramowanie do precyzyjnej analizy stopu	Bio Rad	1845025	Służy do genotypowania próbek DNA komarów i analizy właściwości denaturacji termicznej dwuniciowego DNA (patrz krok protokołu 3.3)
Oprogramowanie		DNAstar Lasergene	Do wyrównywania wielu sekwencji
Pipetor jednokanałowy	Gilson
Pęseta Dumont #5 11 cm	WPI	14098
Białe zatyczki piankowe	VWR	60882-189
Szerokie fiolki Drosophila, polistyren	Genesee	32-117
Szeroka tacka na fiolki na muchy, niebieska	Genesee	59-164B