Tutaj opisujemy metodę wizualizacji i kwantyfikacji naczyń mysich kończyn tylnych za pomocą mikrorentgenowskiej tomografii komputerowej.
Artykuł metodologiczny
Przygotowanie próbki do trójwymiarowej wizualizacji naczyń kończyn tylnych myszy w oparciu o tomografię komputerową
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Naczynia krwionośne to skomplikowane sieci o strukturach przypominających drzewa, a sieci naczyniowe są niezbędne do utrzymania zarówno krążenia, jak i utrzymania funkcji narządów. Wyjaśnienie mechanizmu powstawania naczyń krwionośnych jest zatem niezwykle przydatne w wyjaśnianiu procesów rozwojowych i mechanizmów patologicznych. Mysie naczynia kończyn tylnych są często wykorzystywane jako model fizjologicznej i patologicznej angiogenezy. Ocena odbywa się głównie metodą dwuwymiarową z wykorzystaniem skrawków tkanek. Jednak metody oceny trójwymiarowej (3D) morfologii naczyń krwionośnych są szczególnie ograniczone. W artykule przedstawiono metodę wizualizacji mysich kończyn tylnych za pomocą tomografii komputerowej (CT). Przez aortę zstępującą wstrzykuje się żywicę nieprzezroczystą promieniowanie, a całe naczynia wypełnia się barwnikiem. Dostosowując czas wstrzykiwania barwnika, możliwe jest również wypełnienie specyficzne dla tętnicy, a próbki można uzyskać za pomocą dowolnego urządzenia do mikrorentgenowskiej tomografii komputerowej. Ta metoda kontrastowa stanowi podstawową technikę oceny 3D mysich naczyń krwionośnych kończyn dolnych. Ponadto metoda ta może być stosowana do wizualizacji wszystkich naczyń krwionośnych poniżej przepony i oceny naczyń krwionośnych w narządach jamy brzusznej.
Wprowadzenie
Naczynia krwionośne to skomplikowane sieci o strukturze przypominającej drzewa. Angiogeneza i tworzenie nowych naczyń krwionośnych odgrywają istotną rolę w utrzymaniu homeostazy narządów1. Angiogeneza jest regulowana w leczeniu chorób niedokrwiennych i nowotworowych2. Dlatego tak ważne jest zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw angiogenezy. Mysie naczynia kończyn tylnych są często używane jako użyteczny model do badań naczyniowych3; Ipsilateralne podwiązanie tętnicy biodrowej lub udowej jest znanym modelem niedokrwienia kończyn tylnych używanym do oceny angiogenezy i przebudowy naczyń w fizjologicznej i patologicznej angiogenezie4. Jednak ocena angiogenezy jest przeprowadzana głównie za pomocą barwienia skrawków, a metody oceny morfologii naczyń 3D są szczególnie ograniczone.
W porównaniu z barwieniem przekrojów, CT umożliwia wizualizację 3D. Niedawno Weyers i wsp. opisali zaawansowany protokół odpowiedni do obrazowania CT, umożliwiający wizualizację mysiego dorosłego układu krążenia wieńcowego5. Zmodyfikowaliśmy ich metodę, aby stworzyć metodę przygotowania próbki odpowiednią do obrazowania CT naczyń krwionośnych kończyn dolnych6. W tym przypadku przez aortę zstępującą wstrzykuje się żywicę nieprzezroczystą przed promieniowaniem, a naczynia w kończynach dolnych wypełnia się barwnikiem. Dostosowując czas wstrzykiwania barwnika, możliwe jest również wypełnienie specyficzne dla tętnicy, a próbki można uzyskać za pomocą dowolnego urządzenia do tomografii komputerowej mikrorentgenowskiej. Ta metoda kontrastowa stanowi podstawową technikę oceny 3D mysich naczyń krwionośnych poniżej przepony oraz w narządach jamy brzusznej i kończynach dolnych.
Protokół
Wszystkie procedury zostały wykonane zgodnie z wytycznymi Uniwersytetu Kumamoto dotyczącymi opieki nad zwierzętami (numer referencyjny zatwierdzenia M30-040/A2020-105), które są zgodne z amerykańskim Przewodnikiem National Institutes of Health dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych (publikacja nr 85-23, poprawiona w 2011 roku).
1. Przygotowanie
- Przygotować aparat perfuzyjny i bufor rozszerzający naczynia krwionośne (4 mg/l chlorowodorek papaweryny, 4 g/l; adenozyna, 1 g/l; heparyna, 1 j./ml w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)).
UWAGA: Odczynniki do pomiaru refluksu i leków rozszerzających naczynia krwionośne są takie same, jak te zgłoszone przez Weyers et al.5. - Podłączyć cewnik 22 G, rurkę przedłużającą 2 ml i trójdrożny kran (Rysunek 1A).
UWAGA: Dostosuj miernik do wielkości zwierzęcia. Dla dorosłych myszy C57BL/6 optymalna jest wartość 22 G. - Napełnij aparat perfuzyjny ciśnieniem buforem rozszerzającym naczynia krwionośne (Rysunek 1A).
UWAGA: Należy unikać tworzenia się pęcherzyków powietrza, aby zapobiec zakłóceniom w napełnianiu środka kontrastowego.
2. Perfuzja
- Wstrzyknąć 1 j/g heparyny w PBS do jamy dootrzewnowej 30 minut przed operacją.
- Całkowicie znieczulić mysz izofluranem i poddać ją eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy.
- Po dekapitacji wykonaj nacięcie w linii środkowej mostka i przymocuj otwartą klatkę piersiową za pomocą szpilek.
UWAGA: Aby uniknąć wycieku kontrastu, należy unikać uszkodzenia membrany. - Przetnij aortę wstępującą i usuń serce.
- Usunąć płuco i odsłonić aortę zstępującą.
UWAGA: Nie uszkadzaj aorty zstępującej. - Przetnij aortę zstępującą po przekątnej, aby odsłonić przekrój poprzeczny (Rysunek 1B).
UWAGA: Nie odklejaj aorty; Przekrój ukośny jest lepszy do wprowadzenia cewnika. - Wprowadzić cewnik 22 G do aorty zstępującej, jednocześnie uruchamiając bufor rozszerzający naczynia krwionośne.
UWAGA: Wprowadzenie cewnika podczas pracy buforu rozszerzającego naczynia krwionośne pozwala uniknąć zanieczyszczenia powietrza. - Przypnij korzeń cewnika (Rysunek 1C).
- Zrób węzeł, aby zapobiec wyciekom z powodu przepływu wstecznego.
- Roztworu rozszerzającego naczynia krwionośne (chlorowodorek papaweryny, 4 g/l; adenozyna, 1 g/l; heparyna, 1 μ/ml) przez 3 minuty pod stałym ciśnieniem między 13 a 15 kPa.
- Roztworować roztwór 4% paraformaldehydu w (PBS) przez 3 min.
UWAGA: Powodzenie mocowania można potwierdzić ruchem stopy (Rysunek 1D). - Przygotuj środek kontrastowy tuż przed perfuzją.
UWAGA: Dostosuj szybkość rozcieńczania w zależności od próbki; W przypadku dorosłych myszy wymieszaj plamę i rozcieńczalnik w stosunku 1:1. - Zatrzymaj perfuzję i napełnij rurkę przedłużającą 2 ml rozcieńczonego środka kontrastowego (Rysunek 1E).
UWAGA: Środek kontrastowy należy wstrzykiwać powoli, aby uniknąć uszkodzenia naczyń krwionośnych. - Środek kontrastowy należy przelać pod stałym ciśnieniem od 13 do 15 kPa.
- Aby uwidocznić tętnice, sprawdź paznokieć u nogi, aby upewnić się, że środek kontrastowy dotarł do tętnicy (Rysunek 1F).
- Aby uwidocznić wszystkie naczynia, sprawdź żyłę główną dolną przepony, aby potwierdzić pełne krążenie środka kontrastowego.
UWAGA: Na początku kontrast zawiera roztwór rozszerzający naczynia krwionośne; Stąd niezbędne jest jego prawidłowe krążenie.
- Zamknij trójdrogowy kran i wyjmij rurkę (Rysunek 1G).
UWAGA: Jeśli zawór trójdrożny nie jest zamknięty, kontrast będzie płynął do tyłu. - Inkubować próbkę przez noc w temperaturze 4 °C.
- Usuń skórę i utrwal ją w 10% roztworze formaldehydu.
3. Wizualizacja
UWAGA: Protokoły wizualizacji różnią się w zależności od tomografu komputerowego. W protokole tym zastosowano tomograf komputerowy z mikroogniskowym promieniowaniem rentgenowskim. Konieczne jest zoptymalizowanie metody obrazowania w zależności od każdego tomografu komputerowego.
- Umieścić próbkę w probówce o pojemności 50 ml zawierającej PBS.
- Umieść probówkę z próbką na stole.
- Zeskanuj próbkę pod napięciem 50 kV i prądem 600 μA, zapewniając odległość od ostrości do środka 75,2 mm.
UWAGA: Wymiar 1 woksela wynosił 28,7 μm x 28,7 μm x 28,7 μm w tym ustawieniu. - Załaduj pozyskane dane obrazu za pomocą Fidżi, platformy open source do analizy obrazów biologicznych.
- Określ wartość woksela mięśniowego za pomocą mięśnia brzuchatego łydki.
- Wybierz mięsień brzuchaty łydki za pomocą narzędzia prostokąta.
- Sprawdź średnią i odchylenie standardowe (SD) od histogramu (Analizuj | Histogram).
- Zdefiniuj gęstość wokseli mięśniowych jako średnią + 2SD mięśnia brzuchatego łydki.
- Ustaw gęstość wokseli mięśniowych jako dolny poziom progowy (Obraz | dostosuj | Próg | Zestaw | dolny poziom progowy).
UWAGA: Obszar naczyniowy i obszar kości pozostają w danych binaryzowanych po ustawieniu progu.
Wyniki
Wszystkie naczynia w kończynach dolnych mogą zostać zwizualizowane, jeśli protokół zostanie prawidłowo przeprowadzony (Rycina 2A). W modelu niedokrwienia kończyny tylnej niepodwiązana tętnica udowa biegnie równolegle do żyły udowej (Rycina 2B), a podwiązanie tętnicy udowej można potwierdzić poprzez przerwanie ciągłości środka kontrastowego (Rycina 2C). Wyniki wykazały rozwój naczyństw pobocznych (Rycina 2D). Krążenie oboczne tworzy się między tętnicami proksymalnie względem podwiązanej tętnicy a tętnicą w obrębie podudzia oraz po stronie brzusznej i grzbietowej tętnicy udowej. Tętnica pośladkowa dolna – rozpoczynająca się po stronie grzbietowej miednicy i przebiegająca po bocznej stronie uda – ulega znacznemu rozszerzeniu po stronie niedokrwionej.
Naczynia wypełnione kontrastem są wypełnione środkiem kontrastowym (Rysunek 2E); przerwy w kontraście wskazują na zmieszanie z mediami bezkontrastowymi (np. krwią, buforem rozszerzającym naczynia lub pęcherzykami powietrza) lub niewystarczającą perfuzję kontrastu (Rysunek 2F). Rozszerzenie naczyń i fiksacja nie przebiegłyby prawidłowo, gdyby naczynia krwionośne uległy skurczeniu. Chociaż obrazowanie CT pozwala na wizualizację jedynie środka kontrastowego, możliwe jest oglądanie tętnic na powierzchni ciała za pomocą obserwacji makroskopowej lub stereomikroskopowej (Rysunek 2G). W związku z tym łatwiej jest ocenić defekty przy użyciu środka kontrastowego (Rysunek 2H).
Rysunek 1: Schemat procedury. (A) Aparatura do perfuzji ciśnieniowej i cewnik 22 G połączone za pomocą rurki przedłużającej 2 mL i trójdrożnego kranu. (B) Aorta wstępująca jest przecięta ukośnie, aby odsłonić przekrój poprzeczny (żółta strzałka). (C) Cewnik został zamocowany za pomocą dwóch szpilek (żółte strzałki). (D) Ustabilizowane kończyny dolne są wyprostowane po zamocowaniu (żółte strzałki). (E) Wstrzykiwanie kontrastu przez trójdrożny kran. Kierunek wstrzykiwania wskazany jest żółtą strzałką. (F) Łóżysko paznokcia kończyny tylnej wypełnione jest kontrastem (żółta strzałka). (G) Kran zostaje zamknięty i odłączony od aparatury do perfuzji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 2: Obrazy naczyń. (A) Pełny obraz kości i naczyń kończyny tylnej. (B) Tętnica udowa (czerwona strzałka) i żyła udowa (niebieska strzałka). (C) Podwiązana tętnica udowa (żółta strzałka). Obwód jest przerwany przez przeszkodę (żółta przerywana linia). (D) Naczynia poboczne po stronie podwiązanej (żółte strzałki). Żółta przerywana linia reprezentuje przerwaną tętnicę udową. (E) Dobrze wypełniona próbka tętnicy odłogowej (czerwona strzałka) i żyły odłogowej (niebieska strzałka). (F) Niewystarczająca perfuzja prowadzi do przerwania naczyń odłogowych (żółta przerywana linia). (G) Obserwacja stereomikroskopowa reprezentatywnej próbki. Prawa tętnica udowa (żółta strzałka) jest wypełniona środkiem kontrastowym. (H) Obserwacja stereomikroskopowa nieudanej próbki. W prawej tętnicy udowej (żółta strzałka) brakuje środka kontrastowego. Paski skali = 1 mm (B-F), 2 mm (G, H), 10 mm (A). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Dyskusja
W tym raporcie przedstawiono zaawansowaną metodę wizualizacji naczyń krwionośnych w dolnej części ciała. W tym procesie składa się kilka krytycznych etapów: pierwszym z nich jest preperfuzja przed wstrzyknięciem środka kontrastowego. Jeśli nie zostanie usunięta wystarczająca ilość krwi, kontrast nie wypełni systemu. Dodatkowo włączenie pęcherzyków powietrza zaburza wypełnienie kontrastu; W związku z tym powietrze w obwodzie musi zostać całkowicie usunięte. Ponadto, ponieważ środek kontrastowy nie krzepnie natychmiast po wstrzyknięciu, próbka nie powinna być nadmiernie przesuwana.
Ta metoda jest przydatna do oceny zwiększonego tworzenia naczyń krwionośnych i krążenia, takiego jak krążenie oboczne. I odwrotnie, jako ograniczenie, trudno jest ocenić zwężone naczynia krwionośne, ponieważ rozróżnienie między zwężeniem a sztucznym zmniejszeniem środka kontrastowego jest trudne. Ponadto ocena naczyń krwionośnych w kościach jest trudna, ponieważ oddzielenie krwi od kości jest trudne.
Alternatywną metodą wizualizacji 3D jest barwienie immunologiczne. Korzystając z techniki oczyszczania tkanek, dostępnych jest kilka metod obrazowania 3D7. Barwienie immunologiczne jest korzystne, ponieważ umożliwia barwienie określonych białek za pomocą przeciwciał. Niedawny raport kwestionuje obrazowanie całego ciała oparte na barwieniu immunologicznym8; jednak obrazowanie oparte na tomografii komputerowej nie wymaga żadnego wstępnego oczyszczania tkanek.
Metoda ta umożliwia uwidocznienie wszystkich naczyń poniżej przepony, w tym narządów jamy brzusznej. Angiogeneza w obrębie narządów jamy brzusznej ma silny wpływ na utrzymanie homeostazy i rozwój chorób 9,10. Ponieważ protokół ten został zoptymalizowany pod kątem oceny naczyń kończyn dolnych, przygotowanie specyficzne dla narządu umożliwiłoby wizualizację angiogenezy związanej z dowolnym czynnikiem, takim jak stan zapalny lub nowotwory.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.
Podziękowania
Dziękujemy Yasuyo Kimurze, Megumi Nagahiro i Saeko Tokunaga za doskonałe wsparcie techniczne w eksperymentach na zwierzętach.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1 ml strzykawka | TERUMO | SS-01T | |
| 10% roztwór formaliny | Fujifilm-Wako | 068-03841 | |
| 10x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (-) (PBS) | Fujifilm-Wako | 163-25265 | Przygotuj 1x cewnik PBS |
| 22 G (22 G S5 x 1" V(F)) | MEDIKIT | HP2140 | Używany jest tylko cewnik. |
| Igła 23 G | TERUMO | NN-2325R | Użyj jako szpilki |
| 4% paraformaldehydu w PBS | |||
| 5 ml | |||
| FST | No.11255-20 | ||
| Rurka przedłużająca | TOP | X2-FL50 | |
| Falcon 50 mL tubka | CORNING | 352098 | |
| Graefe Kleszcze | FST | No.11051-10 | |
| Heparyna Sód 5,000 jednostek/5 ml | Mochida Co., Ltd. | ||
| Isoflurane | Fujifilm-Wako | 099-06571 | |
| Związki iniekcyjne do mikrofilów | Flow Tech Inc. | MV-117 | Mieszaj płynny związek MV (plama) i rozcieńczalnik MV 1: 1 |
| Chlorowodorek papaweryny | Fujifilm | 164-18002 | Do roztworu rozszerzającego naczynia krwionośne |
| Środek znieczulający dla małych zwierząt | Muromachi Kikai Co., Ltd. | MK-A100ecoW-ST | |
| Nożyczki sprężynowe - kątowe na bok | FST | No.15006-09 | |
| Nożyczki chirurgiczne - ostro-tępe | FST | nr 14001-12 | |
| trójdrożny kurek | TERUMO | TS-TR1K | |
| Pipeta transferowa | SAMCO SCIENTIFIC | SM262-1S | Służy do mieszania środka kontrastowego |
| CT | Toshiba IT & Korporacja Systemów Sterowania | TOSHIBA TOSCANNER 32300 FPD |
Bibliografia
- Folkman, J. Angiogenesis. Annual Review of Medicine. 57, 1-18 (2006).
- Folkman, J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nature Medicine. 1 (1), 27-31 (1995).
- Kochi, T., et al. Characterization of the arterial anatomy of the murine hindlimb: functional role in the design and understanding of ischemia models. PLoS One. 8 (12), 84047(2013).
- Limbourg, A., et al. Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia. Nature Protocols. 4 (12), 1737-1746 (2009).
- Weyers, J. J., Carlson, D. D., Murry, C. E., Schwartz, S. M., Mahoney, W. M. Retrograde perfusion and filling of mouse coronary vasculature as preparation for micro computed tomography imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (60), e3740(2012).
- Arima, Y., et al. Evaluation of collateral source characteristics with 3-dimensional analysis using micro-X-ray computed tomography. Journal of the American Heart Association. 7 (6), 007800(2018).
- Tian, T., Yang, Z., Li, X. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Fernandez, M., et al. Angiogenesis in liver disease. Journal of Hepatology. 50 (3), 604-620 (2009).
- Li, S., et al. Angiogenesis in pancreatic cancer: current research status and clinical implications. Angiogenesis. 22 (1), 15-36 (2019).
Przedruki i uprawnienia
