Przygotowanie próbki do trójwymiarowej wizualizacji naczyń kończyn tylnych myszy w oparciu o tomografię komputerową

Summary

Tutaj opisujemy metodę wizualizacji i kwantyfikacji naczyń mysich kończyn tylnych za pomocą mikrorentgenowskiej tomografii komputerowej.

Abstract

Naczynia krwionośne to skomplikowane sieci o strukturach przypominających drzewa, a sieci naczyniowe są niezbędne do utrzymania zarówno krążenia, jak i utrzymania funkcji narządów. Wyjaśnienie mechanizmu powstawania naczyń krwionośnych jest zatem niezwykle przydatne w wyjaśnianiu procesów rozwojowych i mechanizmów patologicznych. Mysie naczynia kończyn tylnych są często wykorzystywane jako model fizjologicznej i patologicznej angiogenezy. Ocena odbywa się głównie metodą dwuwymiarową z wykorzystaniem skrawków tkanek. Jednak metody oceny trójwymiarowej (3D) morfologii naczyń krwionośnych są szczególnie ograniczone. W artykule przedstawiono metodę wizualizacji mysich kończyn tylnych za pomocą tomografii komputerowej (CT). Przez aortę zstępującą wstrzykuje się żywicę nieprzezroczystą promieniowanie, a całe naczynia wypełnia się barwnikiem. Dostosowując czas wstrzykiwania barwnika, możliwe jest również wypełnienie specyficzne dla tętnicy, a próbki można uzyskać za pomocą dowolnego urządzenia do mikrorentgenowskiej tomografii komputerowej. Ta metoda kontrastowa stanowi podstawową technikę oceny 3D mysich naczyń krwionośnych kończyn dolnych. Ponadto metoda ta może być stosowana do wizualizacji wszystkich naczyń krwionośnych poniżej przepony i oceny naczyń krwionośnych w narządach jamy brzusznej.

Introduction

Naczynia krwionośne to skomplikowane sieci o strukturze przypominającej drzewa. Angiogeneza i tworzenie nowych naczyń krwionośnych odgrywają istotną rolę w utrzymaniu homeostazy narządów¹. Angiogeneza jest regulowana w leczeniu chorób niedokrwiennych i nowotworowych². Dlatego tak ważne jest zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw angiogenezy. Mysie naczynia kończyn tylnych są często używane jako użyteczny model do badań naczyniowych³; Ipsilateralne podwiązanie tętnicy biodrowej lub udowej jest znanym modelem niedokrwienia kończyn tylnych używanym do oceny angiogenezy i przebudowy naczyń w fizjologicznej i patologicznej angiogenezie4. Jednak ocena angiogenezy jest przeprowadzana głównie za pomocą barwienia skrawków, a metody oceny morfologii naczyń 3D są szczególnie ograniczone.

W porównaniu z barwieniem przekrojów, CT umożliwia wizualizację 3D. Niedawno Weyers i wsp. opisali zaawansowany protokół odpowiedni do obrazowania CT, umożliwiający wizualizację mysiego dorosłego układu krążenia wieńcowego⁵. Zmodyfikowaliśmy ich metodę, aby stworzyć metodę przygotowania próbki odpowiednią do obrazowania CT naczyń krwionośnych kończyn dolnych⁶. W tym przypadku przez aortę zstępującą wstrzykuje się żywicę nieprzezroczystą przed promieniowaniem, a naczynia w kończynach dolnych wypełnia się barwnikiem. Dostosowując czas wstrzykiwania barwnika, możliwe jest również wypełnienie specyficzne dla tętnicy, a próbki można uzyskać za pomocą dowolnego urządzenia do tomografii komputerowej mikrorentgenowskiej. Ta metoda kontrastowa stanowi podstawową technikę oceny 3D mysich naczyń krwionośnych poniżej przepony oraz w narządach jamy brzusznej i kończynach dolnych.

Protocol

Wszystkie procedury zostały wykonane zgodnie z wytycznymi Uniwersytetu Kumamoto dotyczącymi opieki nad zwierzętami (numer referencyjny zatwierdzenia M30-040/A2020-105), które są zgodne z amerykańskim Przewodnikiem National Institutes of Health dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych (publikacja nr 85-23, poprawiona w 2011 roku).

1. Przygotowanie

1. Przygotować aparat perfuzyjny i bufor rozszerzający naczynia krwionośne (4 mg/l chlorowodorek papaweryny, 4 g/l; adenozyna, 1 g/l; heparyna, 1 j./ml w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)).
   UWAGA: Odczynniki do pomiaru refluksu i leków rozszerzających naczynia krwionośne są takie same, jak te zgłoszone przez Weyers et al.⁵.
2. Podłączyć cewnik 22 G, rurkę przedłużającą 2 ml i trójdrożny kran (Rysunek 1A).
   UWAGA: Dostosuj miernik do wielkości zwierzęcia. Dla dorosłych myszy C57BL/6 optymalna jest wartość 22 G.
3. Napełnij aparat perfuzyjny ciśnieniem buforem rozszerzającym naczynia krwionośne (Rysunek 1A).
   UWAGA: Należy unikać tworzenia się pęcherzyków powietrza, aby zapobiec zakłóceniom w napełnianiu środka kontrastowego.

2. Perfuzja

1. Wstrzyknąć 1 j/g heparyny w PBS do jamy dootrzewnowej 30 minut przed operacją.
2. Całkowicie znieczulić mysz izofluranem i poddać ją eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy.
3. Po dekapitacji wykonaj nacięcie w linii środkowej mostka i przymocuj otwartą klatkę piersiową za pomocą szpilek.
   UWAGA: Aby uniknąć wycieku kontrastu, należy unikać uszkodzenia membrany.
4. Przetnij aortę wstępującą i usuń serce.
5. Usunąć płuco i odsłonić aortę zstępującą.
   UWAGA: Nie uszkadzaj aorty zstępującej.
6. Przetnij aortę zstępującą po przekątnej, aby odsłonić przekrój poprzeczny (Rysunek 1B).
   UWAGA: Nie odklejaj aorty; Przekrój ukośny jest lepszy do wprowadzenia cewnika.
7. Wprowadzić cewnik 22 G do aorty zstępującej, jednocześnie uruchamiając bufor rozszerzający naczynia krwionośne.
   UWAGA: Wprowadzenie cewnika podczas pracy buforu rozszerzającego naczynia krwionośne pozwala uniknąć zanieczyszczenia powietrza.
8. Przypnij korzeń cewnika (Rysunek 1C).
9. Zrób węzeł, aby zapobiec wyciekom z powodu przepływu wstecznego.
10. Roztworu rozszerzającego naczynia krwionośne (chlorowodorek papaweryny, 4 g/l; adenozyna, 1 g/l; heparyna, 1 μ/ml) przez 3 minuty pod stałym ciśnieniem między 13 a 15 kPa.
11. Roztworować roztwór 4% paraformaldehydu w (PBS) przez 3 min.
    UWAGA: Powodzenie mocowania można potwierdzić ruchem stopy (Rysunek 1D).
12. Przygotuj środek kontrastowy tuż przed perfuzją.
    UWAGA: Dostosuj szybkość rozcieńczania w zależności od próbki; W przypadku dorosłych myszy wymieszaj plamę i rozcieńczalnik w stosunku 1:1.
13. Zatrzymaj perfuzję i napełnij rurkę przedłużającą 2 ml rozcieńczonego środka kontrastowego (Rysunek 1E).
    UWAGA: Środek kontrastowy należy wstrzykiwać powoli, aby uniknąć uszkodzenia naczyń krwionośnych.
14. Środek kontrastowy należy przelać pod stałym ciśnieniem od 13 do 15 kPa.
    1. Aby uwidocznić tętnice, sprawdź paznokieć u nogi, aby upewnić się, że środek kontrastowy dotarł do tętnicy (Rysunek 1F).
    2. Aby uwidocznić wszystkie naczynia, sprawdź żyłę główną dolną przepony, aby potwierdzić pełne krążenie środka kontrastowego.
       UWAGA: Na początku kontrast zawiera roztwór rozszerzający naczynia krwionośne; Stąd niezbędne jest jego prawidłowe krążenie.
15. Zamknij trójdrogowy kran i wyjmij rurkę (Rysunek 1G).
    UWAGA: Jeśli zawór trójdrożny nie jest zamknięty, kontrast będzie płynął do tyłu.
16. Inkubować próbkę przez noc w temperaturze 4 °C.
17. Usuń skórę i utrwal ją w 10% roztworze formaldehydu.

3. Wizualizacja

UWAGA: Protokoły wizualizacji różnią się w zależności od tomografu komputerowego. W protokole tym zastosowano tomograf komputerowy z mikroogniskowym promieniowaniem rentgenowskim. Konieczne jest zoptymalizowanie metody obrazowania w zależności od każdego tomografu komputerowego.

1. Umieścić próbkę w probówce o pojemności 50 ml zawierającej PBS.
2. Umieść probówkę z próbką na stole.
3. Zeskanuj próbkę pod napięciem 50 kV i prądem 600 μA, zapewniając odległość od ostrości do środka 75,2 mm.
   UWAGA: Wymiar 1 woksela wynosił 28,7 μm x 28,7 μm x 28,7 μm w tym ustawieniu.
4. Załaduj pozyskane dane obrazu za pomocą Fidżi, platformy open source do analizy obrazów biologicznych.
5. Określ wartość woksela mięśniowego za pomocą mięśnia brzuchatego łydki.
   1. Wybierz mięsień brzuchaty łydki za pomocą narzędzia prostokąta.
   2. Sprawdź średnią i odchylenie standardowe (SD) od histogramu (Analizuj | Histogram).
   3. Zdefiniuj gęstość wokseli mięśniowych jako średnią + 2SD mięśnia brzuchatego łydki.
6. Ustaw gęstość wokseli mięśniowych jako dolny poziom progowy (Obraz | dostosuj | Próg | Zestaw | dolny poziom progowy).
   UWAGA: Obszar naczyniowy i obszar kości pozostają w danych binaryzowanych po ustawieniu progu.

Results

Wszystkie naczynia w kończynach dolnych mogą być wizualizowane, jeśli ten protokół jest prawidłowo wykonany (Rysunek 2A). W modelu niedokrwienia kończyn tylnych niepodwiązana tętnica udowa biegnie równolegle do żyły udowej (Rysunek 2B), a podwiązaną tętnicę udową można potwierdzić przez przerwanie środka kontrastowego (Rysunek 2C). Wyniki ujawniły rozwój naczyń pobocznych (Rysunek 2D). Krążenie oboczne powstaje między tętnicami bliższymi tętnicy podwiązanej a tętnicą w okolicy podudzia oraz po brzusznej i grzbietowej stronie tętnicy udowej. Tętnica pośladkowa dolna - zaczynająca się po grzbietowej stronie miednicy i biegnąca po bocznej stronie uda - rozszerza się silnie po stronie niedokrwiennej.

Naczynia wypełnione kontrastem są wypełnione środkiem kontrastowym (Rysunek 2E); zakłócenie kontrastu wskazuje na mieszanie środków niekontrastowych (np. krwi, buforu rozszerzającego naczynia krwionośne lub pęcherzyki) lub niewystarczającą perfuzję kontrastu (Rysunek 2F). Rozszerzenie naczyń krwionośnych i utrwalenie nie działałoby dobrze, gdyby naczynia krwionośne się skurczyły. Chociaż obrazowanie CT może uwidocznić tylko środek kontrastowy, możliwe jest obejrzenie tętnic na powierzchni ciała za pomocą obserwacji makroskopowej lub stereomikroskopowej (Rysunek 2G). Dzięki temu łatwiej jest ocenić defekty przy użyciu środka kontrastowego (Rysunek 2H).

Rysunek 1: Zarys procedury. (A) Aparat do perfuzji ciśnieniowej i cewnik 22 G połączone za pomocą rurki przedłużającej o pojemności 2 ml i trójdrożnego kurka. (B) Aorta wstępująca jest przecięta po przekątnej, aby odsłonić przekrój poprzeczny (żółta strzałka). (C) Cewnik został zamocowany za pomocą dwóch szpilek (żółte strzałki). (D) Nieruchome kończyny dolne wysuwają się po unieruchomieniu (żółte strzałki). ( E) Wstrzyknięcie kontrastu przez zawór trójdrogowy. Kierunek wtrysku jest oznaczony żółtą strzałką. (F) Paznokieć kończyny tylnej jest wypełniony kontrastem (żółta strzałka). (G) Zawór odcinający jest zamykany i wyjmowany z aparatu perfuzyjnego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Obrazy statków. (A) Pełny obraz kości i naczyń kończyn tylnych. (B) Tętnica udowa (czerwona strzałka) i żyła (niebieska strzałka). (C) Podwiązana tętnica udowa (żółta strzałka). Obwód jest przerwany przez przeszkodę (żółta przerywana linia). (D) Naczynia poboczne po stronie podwiązanej (żółte strzałki). Żółta przerywana linia reprezentuje przerwaną tętnicę udową. (E) Dobrze wypełniona próbka tętnicy odpiszczelowej (czerwona strzałka) i żyły (niebieska strzałka). (F) Niewystarczająca perfuzja prowadzi do przerwania naczyń odpiszczelowych (żółta przerywana linia). (G) Obserwacja stereomikroskopowa reprezentatywnej próbki. Prawa tętnica udowa (żółta strzałka) jest wypełniona środkiem kontrastowym. (H) Obserwacja stereomikroskopowa uszkodzonej próbki. Prawa tętnica udowa (żółta strzałka) nie ma środka kontrastowego. Podziałka = 1 mm (B-F), 2 mm (G, H), 10 mm (A). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

W tym raporcie przedstawiono zaawansowaną metodę wizualizacji naczyń krwionośnych w dolnej części ciała. W tym procesie składa się kilka krytycznych etapów: pierwszym z nich jest preperfuzja przed wstrzyknięciem środka kontrastowego. Jeśli nie zostanie usunięta wystarczająca ilość krwi, kontrast nie wypełni systemu. Dodatkowo włączenie pęcherzyków powietrza zaburza wypełnienie kontrastu; W związku z tym powietrze w obwodzie musi zostać całkowicie usunięte. Ponadto, ponieważ środek kontrastowy nie krzepnie natychmiast po wstrzyknięciu, próbka nie powinna być nadmiernie przesuwana.

Ta metoda jest przydatna do oceny zwiększonego tworzenia naczyń krwionośnych i krążenia, takiego jak krążenie oboczne. I odwrotnie, jako ograniczenie, trudno jest ocenić zwężone naczynia krwionośne, ponieważ rozróżnienie między zwężeniem a sztucznym zmniejszeniem środka kontrastowego jest trudne. Ponadto ocena naczyń krwionośnych w kościach jest trudna, ponieważ oddzielenie krwi od kości jest trudne.

Alternatywną metodą wizualizacji 3D jest barwienie immunologiczne. Korzystając z techniki oczyszczania tkanek, dostępnych jest kilka metod obrazowania 3D⁷. Barwienie immunologiczne jest korzystne, ponieważ umożliwia barwienie określonych białek za pomocą przeciwciał. Niedawny raport kwestionuje obrazowanie całego ciała oparte na barwieniu immunologicznym⁸; jednak obrazowanie oparte na tomografii komputerowej nie wymaga żadnego wstępnego oczyszczania tkanek.

Metoda ta umożliwia uwidocznienie wszystkich naczyń poniżej przepony, w tym narządów jamy brzusznej. Angiogeneza w obrębie narządów jamy brzusznej ma silny wpływ na utrzymanie homeostazy i rozwój chorób ^9,10. Ponieważ protokół ten został zoptymalizowany pod kątem oceny naczyń kończyn dolnych, przygotowanie specyficzne dla narządu umożliwiłoby wizualizację angiogenezy związanej z dowolnym czynnikiem, takim jak stan zapalny lub nowotwory.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml strzykawka	TERUMO	SS-01T
10% roztwór formaliny	Fujifilm-Wako	068-03841
10x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (-) (PBS)	Fujifilm-Wako	163-25265	Przygotuj 1x cewnik PBS
22 G (22 G S5 x 1" V(F))	MEDIKIT	HP2140	Używany jest tylko cewnik.
Igła 23 G	TERUMO	NN-2325R	Użyj jako szpilki
4% paraformaldehydu w PBS
5 ml
	FST	No.11255-20
Rurka przedłużająca	TOP	X2-FL50
Falcon 50 mL tubka	CORNING	352098
Graefe Kleszcze	FST	No.11051-10
Heparyna Sód 5,000 jednostek/5 ml	Mochida Co., Ltd.
Isoflurane	Fujifilm-Wako	099-06571
Związki iniekcyjne do mikrofilów	Flow Tech Inc.	MV-117	Mieszaj płynny związek MV (plama) i rozcieńczalnik MV 1: 1
Chlorowodorek papaweryny	Fujifilm	164-18002	Do roztworu rozszerzającego naczynia krwionośne
Środek znieczulający dla małych zwierząt	Muromachi Kikai Co., Ltd.	MK-A100ecoW-ST
Nożyczki sprężynowe - kątowe na bok	FST	No.15006-09
Nożyczki chirurgiczne - ostro-tępe	FST	nr 14001-12
trójdrożny kurek	TERUMO	TS-TR1K
Pipeta transferowa	SAMCO SCIENTIFIC	SM262-1S	Służy do mieszania środka kontrastowego
CT	Toshiba IT & Korporacja Systemów Sterowania	TOSHIBA TOSCANNER 32300 FPD