Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Obrazowanie adhezji molekularnej w walcowaniu komórek za pomocą testu śladu adhezyjnego

3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63013

⸱

27 września 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, The University of British Columbia, 2Biochemistry and Molecular Biology, The University of British Columbia, 3Faculty of Medicine, The University of British Columbia

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół przedstawia eksperymentalne procedury przeprowadzania testu śladu adhezyjnego w celu zobrazowania zdarzeń adhezji podczas szybkiej adhezji toczenia komórek.

Streszczenie

Zrost toczny, ułatwiony przez interakcje za pośrednictwem selekcji, jest wysoce dynamiczną, pasywną ruchliwością w rekrutacji leukocytów do miejsca zapalenia. Zjawisko to występuje w żyłkach zakapilarnych, w których przepływ krwi popycha leukocyty ruchem tocznym na komórki śródbłonka. Stabilne walcowanie wymaga delikatnej równowagi między tworzeniem wiązań adhezyjnych a ich mechanicznie napędzaną dysocjacją, dzięki czemu ogniwo pozostaje przyczepione do powierzchni podczas toczenia się w kierunku przepływu. W przeciwieństwie do innych procesów adhezji zachodzących w stosunkowo statycznych środowiskach, adhezja walcowa jest bardzo dynamiczna, ponieważ komórki toczne przemieszczają się przez tysiące mikronów z prędkością kilkudziesięciu mikronów na sekundę. W związku z tym konwencjonalne metody mechanobiologiczne, takie jak mikroskopia sił trakcyjnych, nie nadają się do pomiaru poszczególnych zdarzeń adhezji i związanych z nimi sił molekularnych ze względu na krótki czas i wymaganą wysoką czułość. W tym miejscu opisujemy naszą najnowszą implementację testu śladu adhezyjnego do obrazowania interakcji selektyny P: PSGL-1 w adhezji tocznej na poziomie molekularnym. Metoda ta wykorzystuje nieodwracalne linki napinające na bazie DNA w celu wytworzenia trwałej historii zdarzeń adhezji molekularnej w postaci ścieżek fluorescencyjnych. Ścieżki te można obrazować na dwa sposoby: (1) zszywając ze sobą tysiące obrazów ograniczonych dyfrakcją, aby uzyskać duże pole widzenia, umożliwiając ekstrakcję śladu adhezyjnego każdej toczącej się komórki o długości tysięcy mikronów, (2) wykonując DNA-PAINT w celu zrekonstruowania obrazów o wysokiej rozdzielczości ścieżek fluorescencyjnych w małym polu widzenia. W tym badaniu test śladu adhezyjnego został wykorzystany do zbadania komórek HL-60 toczących się przy różnych naprężeniach ścinających. W ten sposób byliśmy w stanie zobrazować rozkład przestrzenny oddziaływania selektyny P: PSGL-1 i uzyskać wgląd w ich siły molekularne poprzez intensywność fluorescencji. W związku z tym metoda ta stanowi podstawę do ilościowego badania różnych interakcji komórka-powierzchnia zaangażowanych w adhezję toczną na poziomie molekularnym.

Wprowadzenie

Kaskada adhezji opisuje, w jaki sposób krążące komórki łączą się ze ścianą naczynia krwionośnego i toczą się wzdłuż niej1. Pasywne rolowanie odbywa się głównie za pośrednictwem selektyn, głównej klasy komórkowych cząsteczek adhezyjnych (CAM)1. Pod ścinającym przepływem krwi leukocyty eksprymujące ligand-1 glikoproteiny selektyny P (PSGL-1) tworzą wysoce przejściowe wiązania z selektyną P, które mogą ulegać ekspresji na powierzchni komórek śródbłonka objętych stanem zapalnym. Proces ten ma kluczowe znaczenie dla migracji leukocytów do miejsca zapalenia2. Ponadto, PSGL-1 jest również mechanowrażliwym receptorem zdolnym do wyzwalania kolejnego etapu mocnej adhezji toczącej się kaskady adhezyjnej po jego zaangażowaniu z P-selectin3.

Mutacje genetyczne wpływające na funkcję CAM mogą poważnie wpływać na układ odpornościowy, np. w rzadkiej chorobie niedoboru adhezji leukocytów (LAD), gdzie nieprawidłowe działanie cząsteczek adhezyjnych pośredniczących w toczeniu prowadzi do osób z poważnie obniżoną odpornością4,5,6. Ponadto wykazano, że krążące komórki nowotworowe migrują w podobny sposób w procesie toczenia, co prowadzi do przerzutów7,8. Ponieważ jednak zwijanie komórek jest szybkie i dynamiczne, konwencjonalne eksperymentalne metody mechanobiologiczne nie nadają się do badania interakcji molekularnych podczas walcowania komórek. Podczas gdy metody manipulacji pojedynczymi komórkami i pojedynczymi cząsteczkami, takie jak mikroskopia sił atomowych i pęseta optyczna, były w stanie badać interakcje molekularne, takie jak zależna od siły interakcja selektyny P z PSGL-1 na poziomie pojedynczej cząsteczki9, nie nadają się one do badania zdarzeń adhezji na żywo podczas walcowania komórek. Dodatkowo, oddziaływanie scharakteryzowane in vitro nie może bezpośrednio odpowiedzieć na pytanie o adhezję molekularną in vivo. Na przykład, jaki zakres napięcia molekularnego jest biologicznie istotny, gdy komórki funkcjonują w swoim naturalnym środowisku? Metody obliczeniowe, takie jak symulacja dynamiki adhezji10 lub prosty model stanu ustalonego11 uchwyciły pewne szczegóły molekularne i ich wpływ na zachowanie toczenia, ale są w dużym stopniu zależne od dokładności parametrów i założeń modelowania. Inne techniki, takie jak mikroskopia sił trakcyjnych, mogą wykrywać siły podczas migracji komórek, ale nie zapewniają wystarczającej rozdzielczości przestrzennej ani informacji ilościowych na temat napięcia molekularnego. Żadna z tych technik nie może zapewnić bezpośrednich obserwacji eksperymentalnych dynamiki czasowej, rozkładu przestrzennego i niejednorodności wielkości sił molekularnych, które bezpośrednio odnoszą się do funkcji i zachowania komórek w ich naturalnym środowisku.

Dlatego implementacja czujnika siły molekularnej zdolnego do dokładnego pomiaru oddziaływań za pośrednictwem selektoryny jest kluczowa dla lepszego zrozumienia adhezji toczenia. W tym miejscu opisujemy protokół testu śladu adhezyjnego12, w którym koraliki powlekane PSGL-1 są walcowane na powierzchni prezentującej selektorowane p-selectin uwięzi napinające (TGT)13. Te TGT są nieodwracalnymi czujnikami siły opartymi na DNA, które skutkują stałą historią zdarzeń pęknięcia w postaci odczytu fluorescencji. Osiąga się to poprzez pęknięcie TGT (dsDNA), a następnie znakowanie pękniętego TGT (ssDNA) fluorescencyjnie znakowaną nicią komplementarną. Jedną z głównych zalet tego systemu jest jego kompatybilność zarówno z obrazowaniem o ograniczonej dyfrakcji, jak i z obrazowaniem superrozdzielczym. Znakowana fluorescencyjnie nić komplementarna może być trwale związana (>12 pz) w przypadku obrazowania o ograniczonej dyfrakcji lub przejściowo związana (7-9 pz) w przypadku obrazowania w superrozdzielczości za pomocą DNA PAINT. Jest to idealny system do badania przyczepności tocznej, ponieważ TGT pękają podczas aktywnego walcowania, ale odczyt fluorescencji jest analizowany po walcowaniu. Obie metody obrazowania zapewniają również użytkownikowi większą swobodę w badaniu przyczepności tocznej. Zazwyczaj obrazowanie z ograniczoną dyfrakcją jest przydatne do wyodrębniania siły rozrywania molekularnego poprzez intensywność fluorescencji13, podczas gdy obrazowanie o wysokiej rozdzielczości pozwala na ilościową analizę gęstości receptorów. Dzięki możliwości zbadania tych właściwości adhezji tocznej, podejście to stanowi obiecującą platformę do zrozumienia mechanizmu regulacji siły w adhezji molekularnej komórek toczących się pod wpływem przepływu ścinającego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Znakowanie oligonukleotydów i hybrydyzacja

  1. Redukcja wiązań dwusiarczkowych białka G
    1. Rozpuść 10 mg białka G (ProtG) w 1 ml ultraczystej wody.
      UWAGA: Białko G jest tutaj modyfikowane pojedynczą resztą cysteiny na C-końcu i N-końcowym znacznikiem polihistydyny.
    2. Wymiana buforowa ≥20 μL ProtG (10 mg/mL) na 1x PBS (pH 7,2) z kolumną P6.
    3. Zmierzyć stężenie białka po wymianie buforu.
      UWAGA: Typowe stężenie 7-8 mg/mL.
    4. Przygotować 120 mM tris(2-karboksetylo)fosfiny (TCEP), rozpuszczając 3 mg TCEP w 90 μl 1x PBS (pH 7,2), a następnie 10 μL 0,5 M EDTA.
      UWAGA: TCEP powinien być świeżo przygotowany
      5. .
    5. Dodaj 4 μl 120 mM TCEP (480 nmol) do 20 μl ProtG (4-5 nmol).
      UWAGA: Dąż do stosunku molowego ~100:1 TCEP do białka.
    6. Pozwól reakcji postępować przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT).
    7. Usunąć nadmiar TCEP ze zredukowanego ProtG za pomocą kolumny P6 (bufor wymieniony w 1x PBS, pH 7,2).
    8. Zmierz stężenie zredukowanego ProtG za pomocą spektrofotometru UV/Vis i zapisz widma.
      UWAGA: Typowe stężenie 3,5-4,5 mg/ml.
  2. Reakcja ssDNA znakowana aminami z Sulfo-SMCC
    1. Rozpuścić znakowany aminami ssDNA (amino-ssDNA) w wodzie wolnej od nukleaz do stężenia 1 mM. Sprawdzić stężenie nici za pomocą spektrofotometru UV/Vis.
    2. Przygotować świeży roztwór 11,5 mM sulfo-SMCC (hetero-bifunkcyjny środek sieciujący z estrem sulfo-NHS i maleimidem), rozpuszczając 2 mg sulfo-SMCC w 400 μl ultraczystej wody i wirować do wymieszania.
    3. Dodać 6 μl 1 mM amino-ssDNA (6 nmol) do 5,2 μl 11,5 mM sulfo-SMCC (60 nmol) i 88,8 μl 1x PBS (pH 7,2). Wirować przez 5 s, a następnie odwirować przy 8600 x g przez 3 min.
    4. Pozwól, aby reakcja postępowała przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Usuń nadmiar sulfo-SMCC z sprzężonego SMCC amino-ssDNA (mal-ssDNA) z kolumną P6 (bufor wymieniony w 1x PBS, pH 7,2).
    6. Zmierz stężenie mal-ssDNA za pomocą spektrofotometru UV/Vis i zapisz widma.
      UWAGA: Typowe stężenie 35-45 μM.
  3. Koniugacja ProtG-ssDNA
    1. Dodać 21 μl 4,5 mg/ml zredukowanego ProtG (3 nmol) do mal-ssDNA (~4-5 nmol).
      UWAGA: Objętości i stężenia są tutaj wartościami typowymi. Dostosuj zgodnie z indywidualnym pomiarem eksperymentalnym. Zawsze upewnij się, że nadmiar mal-ssDNA nad ProtG jest w stosunku ~1,5:1.
    2. Wirować przez 5 s i pozwolić reakcji postępować przez 3 godziny w temperaturze pokojowej.
  4. Oczyszczanie i charakterystyka ProtG-ssDNA
    1. Oczyść sprzężony ProtG-ssDNA poprzez izolację jego znacznika za pomocą magnetycznych kulek kwasu niklowo-nitrylotryoctowego (Ni-NTA).
    2. Usunąć nadmiar imidazolu (buforu elucyjnego Ni-NTA) z produktu za pomocą kolumny P6 (bufor wymieniony w 1x PBS, pH 7,2).
      UWAGA: Ten etap jest niezbędny do ilościowego określenia koniugacji, ponieważ imidazol ma znaczną absorpcję przy 280 nm.
    3. Za pomocą spektrofotometru UV/Vis zarejestrować widma produktu ProtG-ssDNA oraz buforu elucyjnego Ni-NTA (1x).
      UWAGA: Typowa absorbancja ProtG-ssDNA przy 260 nm i 280 nm wynosi odpowiednio 0,8 i 0,6.
    4. Aby określić wydajność koniugacji i stosunek ProtG do ssDNA, użyj specjalnie napisanego skryptu MATLAB (Supplemental Coding File 1), aby zdekomponować widmo produktu końcowego na podstawie trzech zebranych wcześniej widm (ProtG, nić SMCC, bufor elucyjny Ni-NTA).
      UWAGA: Krótko mówiąc, kod działa zgodnie z opisem w krokach 1.4.5-1.4.8. Typowe stężenie to 4 μM ProtG-ssDNA z ProtG i ssDNA w stosunku molowym ~1:1 (Rysunek 2A).
    5. Wprowadź ProtG, nić SMCC, bufor elucyjny koralików Ni-NTA i widma ProtG-ssDNA UV/Vis do skryptu MATLAB
    6. Wykonaj wielowymiarową, nieograniczoną minimalizację nieliniową, aby zrekonstruować widma ProtG-ssDNA z widm źródłowych (widma bufora buforowego do elucji ProtG, nici SMCC i Ni-NTA)
      UWAGA: Funkcja minimalizacji wyprowadza trzy współczynniki transformacji, po jednym dla każdego widma źródłowego.
    7. Zrekonstruuj widma ProtG-ssDNA, mnożąc widma przez odpowiadający im współczynnik i łącząc przekształcone widma źródłowe.
    8. Pomnóż początkowe stężenie nici ProtG i SMCC przez odpowiednie współczynniki przemiany, aby określić stężenia nici SMCC i ProtG w produkcie ProtG-ssDNA.
    9. (OPCJONALNIE) Uruchom natywną stronę PAGE zgodnie z Rysunek 2B, aby upewnić się, że każdy komponent i krok działają zgodnie z oczekiwaniami.
  5. Hybrydyzacja TGT
    1. Hybrydyzować ProtG-ssDNA (górna nić) z biotynylowaną dolną nicią w stosunku molowym 1,2:1 o stężeniach odpowiednio 240 nM i 200 nM w buforze T50M5 (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2) w celu hybrydyzacji pełnego konstruktu TGT. Pozwól hybrydyzować w temperaturze RT ≥1 godzina.

2. Pegylacja powierzchniowa

  1. Czyszczenie powierzchni
    1. Oczyścić jedną kolbę Erlenmeyera i dwa słoiki do barwienia na każde 8 szkiełek nakrywkowych. Napełnij każdy pojemnik 1 M roztworem KOH i poddaj sonikacji przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Dokładnie umyj każdy pojemnik ultraczystą wodą i osusz N2 lub w piekarniku.
      UWAGA: Napełnij KOH do góry, aby dotknąć pokrywy, aby zostały również wyczyszczone.
    2. Dokładnie spłucz każde szkiełko nakrywkowe ultraczystą wodą i umieść je w jednym z oczyszczonych słoików do barwienia.
      UWAGA: Upewnij się, że nie są przyklejone do siebie ani do ścianki słoików do barwienia.
    3. W dygestorium świeżo przygotuj roztwór piranii, dodając 30 ml nadtlenku wodoru (30%) do 90 ml stężonego (95%-98%) kwasu siarkowego w zlewce o pojemności 250 ml.
      UWAGA: Stężony kwas siarkowy jest silnie. Bardzo powoli dodawaj nadtlenek wodoru do kwasu siarkowego i ostrożnie mieszaj, aby wymieszać.
    4. Całkowicie zanurz szkiełka nakrywkowe w słoiku do barwienia z roztworem piranii. Pozostaw szkiełka nakrywkowe w piranii na 30 minut w dygestorium.
      UWAGA: Przed nalaniem schłodzić roztwór piranii do temperatury nie wyższej niż 80 °C, aby zapobiec pękaniu słoika do barwienia.
    5. Wylać roztwór piranii do zlewki o pojemności 1000 ml i zneutralizować za pomocą 1 M KOH z czyszczenia szkła.
    6. (OPCJONALNIE) Powtórzyć czyszczenie piranii (kroki 2.1.3-2.1.5) świeżym roztworem piranii.
    7. Opłucz szkiełka nakrywkowe dużą ilością ultraczystej wody, aby usunąć wszystkie pozostałości roztworu piranii. Delikatnie potrząśnij słoikiem do barwienia podczas każdego wyrastania, aby ułatwić usunięcie (zalecane jest 10 płukań).
    8. Opłucz szkiełka nakrywkowe metanolem 3 razy, aby usunąć wodę z powierzchni szkiełka nakrywkowego i utrzymuj szkiełka nakrywkowe zanurzone w metanolu.
  2. Silanizacja powierzchni
    1. Przygotować 1% roztwór aminosilanu, dokładnie mieszając 94 ml metanolu, 1 ml amiinozylu i 5 ml lodowatego kwasu octowego w oczyszczonej i wysuszonej kolbie Erlenmeyera. Wlej do drugiego oczyszczonego i wysuszonego słoika do barwienia14.
    2. Przenieść szkiełka nakrywkowe zanurzone w roztworze metanolu do słoika do barwienia zawierającego 1% roztwór aminozelanu i przykryć słoik.
      UWAGA: Nie pozwól, aby szkiełka nakrywkowe wyschły podczas przenoszenia do aminozilanu, aby ograniczyć ekspozycję powierzchni szkła na działanie powietrza.
    3. Inkubować słoik do barwienia zawierający szkiełka nakrywkowe w aminozalinie przez 1 godzinę w temperaturze 70 °C w piekarniku15.
    4. Ostrożnie wyrzuć roztwór aminozelanu do oddzielnego pojemnika na odpady i spłucz szkiełka nakrywkowe w słoiku do barwienia metanolem 5 razy, aby usunąć roztwór aminosilu.
    5. Szkiełka nakrywkowe spłukać w słoiku do barwienia ultraczystą wodą 5 razy i wysuszyćN2.
    6. Piecz wysuszone szkiełka nakrywkowe w słoiku do barwienia w piekarniku w temperaturze 110 °C przez 20 minut. Poczekaj, aż szkiełka nakrywkowe ostygną do temperatury suchej, a następnie umieść je na ruszcie do PEGylacji.
      UWAGA: Przykryj słoik do barwienia pokrywką podczas pieczenia, aby zminimalizować szczególne i chemiczne osadzanie się na powierzchni15.
  3. Przygotowanie roztworu PEG
    1. Rozmrażać PEG (glikol polietylenowy) i PEG-biotynę do RT przez około 30 min.
      UWAGA: Ten krok minimalizuje kondensację wilgoci, która może degradować ester NHS na PEG.
    2. Przygotuj bufor PEG, dodając 84 mg wodorowęglanu sodu do 10 ml ultraczystej wody. Ten preparat powinien zapewnić bufor o pH 8,4.
    3. Dla 8 szkiełek nakrywkowych, każde z jedną stroną PEGylowaną z 20:1 PEG:PEG-biotyna: odmierz 100 mg PEG i 5 mg PEG-biotyny, aby dodać do 400 μl buforu PEG. Wirować roztwór przez 30 s i wirować przez 1 minutę z maksymalną prędkością (≥18000 x g).
      UWAGA: Ten krok jest wrażliwy na czas, ponieważ hydroliza estru SVA NHS rozpoczyna się natychmiast i ma okres półtrwania 34 minuty przy pH 8,0, z krótszym okresem półtrwania przy pH 8,4.
  4. Inkubacja PEG i przechowywanie szkiełek nakrywkowych
    1. Ustaw komorę wilgotnościową i umieść w niej szkiełka nakrywkowe.
    2. Dodaj 90 μl roztworu PEG do szkiełka nakrywkowego w komorze wilgotnościowej i umieść drugie szkiełko nakrywkowe na roztworze PEG za pomocą pęsety do trzymania szkiełka nakrywkowego, aby równomiernie rozprowadzić roztwór PEG.
    3. Upewnij się, że w roztworze upuszczonym na szkiełko nakrywkowe nie ma pęcherzyków powietrza. Opuść jeden koniec drugiego szkiełka nakrywkowego na pierwszym szkiełku nakrywkowym i powoli upuść drugi koniec, aby między szkiełkami nakrywkowymi nie było pęcherzyków powietrza.
      UWAGA: Bąbelki spowodują, że niektóre obszary będą słabo pegylowane.
    4. Powtarzaj, aż wszystkie szkiełka nakrywkowe będą miały PEG (tj. 8 szkiełek nakrywkowych = 4 kanapki z PEG). Inkubuj roztwory PEG przez noc (~12 godzin) w temperaturze pokojowej w komorze wilgotnościowej w ciemności16.
    5. Oddziel pary szkiełek nakrywkowych i umieść je w słoiku do barwienia. Zwróć uwagę na strony PEGylowane.
    6. Dokładnie spłucz szkiełka nakrywkowe ultraczystą wodą i osusz N2,
      UWAGA: Przytrzymaj szkiełka nakrywkowe pęsetą i przedmuchaj N2 w poprzek powierzchni w kierunku pęsety, aby zapobiec wysychaniu zanieczyszczeń na powierzchnię.
    7. Zaznacz stronę niepegylowaną kropką w rogu za pomocą markera permanentnego lub pisaka diamentowego.
    8. Umieść 2 PEGylowane szkiełka nakrywkowe w tubach pocztowych bokami PEGylowanymi skierowanymi do siebie, aby ułatwić identyfikację PEGylowanej strony przed użyciem.
    9. Odkurzyć rurkę przez 5 minut i zasypaćN2. Uszczelnij rurkę parafilmem.
    10. Szkiełka nakrywkowe z PEGylowaną należy przechowywać w temperaturze -20 °C w szczelnie zamkniętych tubach pocztowych przez okres do 6 miesięcy.
      UWAGA: Ogrzej rurki do przechowywania do RT przed montażem chipa. Kondensacja na szkiełkach nakrywkowych podczas uszczelniania spowoduje nieszczelność.

3. Przygotowanie komory przepływowej

  1. Montaż chipów
    1. Cienko rozprowadź niewielką ilość żywicy epoksydowej po obu stronach taśmy dwustronnej za pomocą żyletki.
      UWAGA: Zbyt dużo żywicy epoksydowej może rozprzestrzenić się do kanału podczas montażu.
    2. Wytnij laserowo taśmę pokrytą żywicą epoksydową, aby utworzyć 4 kanały. Utwórz chip przepływowy, umieszczając taśmę epoksydową między 4-otworowym szkiełkiem a szkiełkiem nakrywkowym PEG (Rysunek 1A).
    3. Za pomocą końcówki do pipet delikatnie dociśnij wzdłuż kanałów, aby uzyskać dobre uszczelnienie. Utwardź żywicę epoksydową do ≥1 h.
      UWAGA: Nie ścinaj szkła, aby uniknąć ślizgania się po żywicy epoksydowej.
  2. Montaż komory
    1. Wyrównaj chip tak, aby otwór każdego kanału znajdował się w środku adaptera (Rysunek 1A). Umieść dwie przezroczyste akrylowe przekładki na wierzchu chipa, mocno dociśnij środek bloku i wkręć dwie 4-40 na końcach każdej przekładki.
      UWAGA: Nie wkręcaj śruby na siłę ani nie naciskaj zbyt mocno na przekładki, ponieważ wiór może pęknąć.
    2. Po drugiej stronie wspornika wkręć wloty w gwintowane otwory. Monitoruj stan uszczelnienia przez przezroczysty blok akrylowy.
    3. Gdy rurka styka się z otworem chipa, uszczelnij połączenie, delikatnie przekręcając rurkę zgodnie z ruchem wskazówek zegara.
      UWAGA: Zbyt mocno dokręcone wloty mogą spowodować zablokowanie przepływu, a luźne styki spowodują wyciek.

4. Przygotowanie powierzchni

UWAGA: Zapoznaj się z Rysunek 1B, aby zapoznać się z ogólnym przepływem pracy.

  1. Środki blokujące zapobiegające niespecyficznemu wiązaniu
    1. Za pomocą pipety wlać 200 μl buforu do przemywania (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 i 2 mM CaCl2, 0,05% Tween 20) do komory w celu sprawdzenia szczelności. Jeśli w kanale utworzą się pęcherzyki, agresywnie wciśnij dodatkowe 200 μl, aby usunąć bąbelki.
      UWAGA: Duże pęcherzyki powietrza, które nie zostaną usunięte na tym etapie, mogą później usunąć się i zniszczyć funkcjonalizację powierzchni.
    2. Dodać 40 μl BSA (1% w/v) do komory przepływowej, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu i inkubować przez 10 minut.
    3. Upewnij się, że w każdym okresie inkubacji dodajesz wystarczającą objętość, aby wypełnić komory przepływowe i utworzyć kropelki na wlotach i wylotach. Dostosuj odpowiednio objętość inkubacji i wykonaj wszystkie inkubacje w komorze wilgotnościowej.
    4. Dodać 40 μl Tween 20 (5% v/v) do komory przepływowej. Inkubować przez 10 minut, aby jeszcze bardziej zmniejszyć niespecyficzne wiązanie.
    5. (OPCJONALNIE) Sprawdź powierzchnię pod kątem odpowiedniej pasywacji poprzez przepuszczenie kulek polistyrenowych przez kanał. Dodać 40 μl kulek polistyrenowych powlekanych ProtG (0,01% w/v) i wykonać obraz za pomocą mikroskopu ciemnego pola z obiektywem 10x. Jeśli koraliki nie przylegają do powierzchni, przejdź do następnego kroku.
    6. Przemyć kanał 200 μl buforu do płukania, aby usunąć wszystkie środki pasywacyjne.
  2. Funkcjonalizacja powierzchni komory
    1. Dodać 40 μl streptawidyny (100 μg/ml) do komory przepływowej i inkubować przez 20 min. Następnie przemyć 200 μl buforu do płukania.
    2. Dodać 40 μl zhybrydyzowanego ProtG-TGT (100 nM) do komory przepływowej i inkubować przez 20 minut. Następnie przemyć 200 μl buforem do płukania.
    3. Dodaj 40 μl górnej nici ProtG-TGT (100 nM) przez 20 minut, aby uzupełnić wszelkie niezhybrydyzowane dolne pasmo TGT na powierzchni. Przemyć 200 μl buforu do płukania.
    4. Dodać 40 μl selektyny P-selektyny-Fc (10 μg/ml) do komory przepływowej i inkubować przez 60 minut. Następnie przemyć 200 μl buforu do płukania.
      UWAGA: Czas inkubacji ma kluczowe znaczenie.

5. Eksperyment i obrazowanie

  1. Konfiguracja systemu przepływu
    1. Napełnij szklaną strzykawkę o pojemności 5 ml buforem rolkowym (HBSS z 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 0,1% BSA). Upewnij się, że w strzykawce nie ma pęcherzyków powietrza, stukając w boki strzykawki w celu usunięcia pęcherzyków i wypychając je, gdy unoszą się w kierunku końcówki.
    2. Włóż sterylną igłę (26 g, 5/8 cala długości) do ~200 mm rurki polietylenowej (średnica wewnętrzna: 0,38 mm; Średnica zewnętrzna: 1,09 mm) i podłączyć igłę do szklanej strzykawki.
      UWAGA: Upewnij się, że żadne powietrze nie jest uwięzione w żadnym miejscu w złączu igły.
    3. Zamocować strzykawkę na pompie strzykawkowej i przechylić pompkę strzykawkową tak, aby strona tłoka była podniesiona, aby zapobiec przedostawaniu się pęcherzyków powietrza do kanału. Włóż koniec rurki do wlotu komory przepływowej.
      UWAGA: Podczas wykonywania połączenia należy zapewnić kontakt ciecz z cieczą, osadzając kropelki na wlotach i umieszczając kropelki na końcu rurki strzykawki. Upewnij się, że żadne pęcherzyki powietrza nie dostały się do kanału, pozwalając, aby na końcu rurki strzykawki utworzyła się niewielka kropla przed włożeniem jej do wlotu.
    4. Włóż jeden koniec drugiej rurki polietylenowej o długości 200 mm do wylotu, a drugi koniec zanurz w zlewce na odpady.
  2. Ustawianie do zwijania komórek
    1. Hodować komórki HL-60 w 25 cm2 wentylowanych kolbach hodowlanych w pożywce IMDM uzupełnionej 20% płodową surowicą bydlęcą i 1% antybiotykami w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Utrzymuj gęstość komórek między 1 x 105-2 × 106 komórek/ml.
    2. (OPCJONALNIE) Zróżnicuj komórki HL-60 w kompletnym podłożu IMDM zawierającym 1,25% DMSO o początkowej gęstości 2 x 105 komórek / ml. Inkubuj komórki, aby były najbardziej aktywne przez 5-6 dni.
    3. Pobrać próbkę (1-2 ml) z zawiesiny komórek i odwirować (200 x g, 3 min) w celu osadzenia komórek.
    4. Usunąć pożywkę i delikatnie zawiesić komórki w 500 μl buforu do toczenia. Powtórz krok prania dwa razy, aby usunąć zanieczyszczenia komórkowe.
    5. Zmierz gęstość komórek za pomocą hemocytometru. Zawiesić granulki komórek za pomocą buforu do objętości 2 x 105 komórek/ml.
    6. Ostrożnie odłączyć rurkę od wlotów/wylotów i odpipetować 40 μl zawiesiny komórek do komory przepływowej. Podłącz ponownie rurkę zgodnie z wcześniejszym opisem, upewnij się, że do kanału przepływowego nie dostały się pęcherzyki.
    7. Rozpocznij eksperyment z toczeniem komórek, uruchamiając pompę strzykawkową z żądanym natężeniem przepływu.
      UWAGA: Intensywność ścieżek fluorescencyjnych zależy od naprężenia ścinającego, a naprężenie ścinające o niższej prędkości komórki/prędkość komórki na ogół wytwarza ciemniejsze ścieżki (Rysunek 4A). Unikaj dużego zagęszczenia komórek na powierzchni lub nadmiernego czasu toczenia, aby zapewnić rozłączne ścieżki jednokomórkowe (Rysunek 4B, C).
    8. Użyj mikroskopu ciemnego pola z obiektywem 10x, aby upewnić się, że obserwuje się zwijanie komórek.
    9. Po zakończeniu eksperymentu usuń komórki z kanału, podając bufor rolkowy w ilości 100 ml / h, aż powierzchnia będzie wolna od komórek.
  3. Obrazowanie lokalnych ścieżek za pomocą "DNA-based Point Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography" (DNA-PAINT)
    1. Dodać 40 μl nici imagera DNA-PAINT (500 pM) do buforu DNA-PAINT (0,05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA) do kanału.
    2. Wykonaj mikroskopię fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) przy użyciu 100-krotnej soczewki obiektywowej TIRF zanurzonej w oleju. Uchwyć 40000+ klatek z czasem naświetlania 25 ms na klatkę przy wzmocnieniu zwielokrotniania elektronów (EM) wynoszącym 300 za pomocą kamery EMCCD (Electron-multiplying charge-coupled device).
    3. Użyj pakietu oprogramowania Picasso17, aby zlokalizować i wyrenderować obrazy w super rozdzielczości (Rysunek 4D), wykonując kroki 5.3.4-5.3.5.
    4. Załaduj film DNA-PAINT do programu Localize, aby określić lokalizację każdego fluoroforu w każdej klatce.
      UWAGA: Zoptymalizuj długość boku pudełka i Min. Parametry gradientu sieci, aż dokładnie będą śledzone tylko fluorofory. Min. Parametr gradientu sieci może często przekroczyć 100000, aby osiągnąć optymalne śledzenie. Ustawienie dopasowania: MLE, zintegrowana metoda Gaussa daje najlepszy wynik. Na koniec, jeśli film jest zbyt długi, podziel go na stosy po 10000 klatek, aby śledzenie podglądu w Localize działało poprawnie, zanim ponownie połączysz je w ostateczny plik hdf5.
    5. Następnie załaduj wynikowy plik hdf5 do programu Render, aby wykonać korekcję dryfu i rendering.
      UWAGA: Wykonaj wielokrotną korekcję dryfu za pomocą Undrift by RCC, aby poprawić wynik końcowy.
  4. Obrazowanie długich ścieżek za pomocą trwałego etykietowania
    1. Dodać stałą nić imagera i inkubować przez 120 s w buforze T50M5. Przemyć kanał, podając 200 μl buforu do mycia.
    2. Nagraj obraz z wyłączonym laserem wzbudzającym, aby uzyskać szum kamery w tle. Obrazowanie dużego obszaru we wzorze siatki za pomocą mikroskopii TIRF.
      UWAGA: W przypadku kolejnych zszywania zaleca się nakładanie się klatek na klatkę wynoszące ≥10%.
    3. Zaprogramuj mikroskop tak, aby skanował obszar 400 x 50 obrazów (łącznie 20000 obrazów). Korzystając z programu FIJI, podziel surowe dane na indywidualne pliki tiff, z których każdy zawiera maksymalnie 10000 obrazów.
    4. Spłaszcz wszystkie obrazy za pomocą profilu oświetlenia (Rysunek 3A-C), wykonując kroki 5.4.5-5.4.7.
    5. Odejmij szum tła kamery od każdej klatki. Uzyskaj średnią projekcję stosu (profil oświetlenia) dla każdej klatki odjętej od tła.
    6. Znormalizuj profil oświetlenia według jego wartości maksymalnej. Podziel każdą odjętą klatkę tła przez znormalizowany profil oświetlenia.
    7. Przeskaluj poprawione klatki do odpowiedniego zakresu dla odpowiedniej głębi bitowej.
    8. Użyj MIST18, aby zszyć obrazy (Rysunek 3D,E).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Powyższy protokół opisuje procedurę eksperymentalną testu odcisków adhezyjnych (adhesion footprint assay). Ogólny schemat doświadczenia przedstawiono na Rysunku 1, od montażu komory przepływowej (Rysunek 1A), poprzez funkcjonalizację powierzchni (Rysunek 1B), aż po etapy przeprowadzania eksperymentu i obrazowania (Rysunek 1C).

Rysunek 2 przedstaw...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Test śladu adhezyjnego umożliwia wizualizację zdarzeń adhezji molekularnej między PSGL-1 a selektyną P podczas adhezji toczenia komórek. Proces ten jest inicjowany przez wychwytywanie za pośrednictwem selektyny P, a następnie toczenie pod wpływem płynnego naprężenia ścinającego. Potencjalne problemy podczas eksperymentu zwykle obejmują słabe zwijanie komórek lub brak ścieżek fluorescencyjnych, nawet jeśli komórki toczą się dobrze. Problemy te często wynikają z kontroli jakości na krytycznych etapach protokołu, zgodnie z ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Canada Foundation of Innovation (CFI 35492), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (RGPIN-2017-04407), New Frontiers in Research Fund (NFRFE-2018-00969), Michael Smith Foundation for Health Research (SCH-2020-0559) oraz University of British Columbia Eminence Fund.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4-kanałowa prowadnica wiertłaWykonanyna zamówienie druk 3D z
4-otworową prowadnicąna zamówienieWywierć czysty szkiełko mikroskopowe za pomocą Dremel z wiertłami z powłoką diamentową na 4-kanałowej prowadnicy wiertarskiej, która ma układ pasujący do środków 8-32 gwintowanych otworów na aluminiowym zacisku.
AcetonVWRBDH1101-4LP
Przekładka akrylowaWykonaneWytnij dwa bloki arkuszy akrylowych o wymiarze 40 mm x 30 mm x 2,5 mm. Na każdym bloku wywierć dwa otwory o średnicy 3 mm, które są dokładnie wyrównane z 4-40 otworami w aluminiowym uchwycie.
Aluminiowy uchwyt na wióryWykonanyBlok aluminiowy anodowany maszynowo w uchwycie w kształcie litery C o wymiarze zewnętrznym 640 mm x 500 mm x 65 mm i wymiarze otworu 400 mm x 380 mm x 65 mm. Wloty i wyloty są gwintowane gwintem 8-32.
AminosilanAlfaAesarL14043CAS 1760-24-3
Antybiotyk/roztwór przeciwgrzybiczyCytiva HyCloneSV3007901Pen/Strep/Fungiezone
Koraliki, polistyren powlekany ProtGSpherotechPGP-60-5
Albumina surowicy bydlęcejVWR332
Bufor FARBA0,05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM bufor EDTA
, T50M510mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2
Buffer, RollingHBSS with 2mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 0.1% bufor BSA
, Wash10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 i 2 mM CaCl2, 0,05% Tween 20
Chlorek wapniaVWRBDH9224
Kolby do hodowli komórkowychVWR10062-868
Stężony kwas siarkowyVWRBDH3072-2.5LG95-98%
Pęseta do trzymania szkiełek nakrywkowychTechni-Tool758TW150
Wiertło z powłoką diamentową bityTechnologia ściernaC52505100,75 mm wiertło diamentowe
DNA, amina-ssDNA (górna nić)IDT DNANiestandardowy oligoCCGGGCGACGCAGGAGGG /3AmMO/
DNA, biotyna-ssDNA (dolna nić)IDT DNANiestandardowy oligo/5BiotinTEG/ TTTTT CCCTCCTGCGTCGCCCGG
DNA, nić imager do DNA-PAINTIDT DNANiestandardowy oligoGAGGGAAA TT/3Cy3Sp/
DNA, nić do obrazowania do trwałego znakowaniaIDT DNANiestandardowy oligoCCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/
Taśma dwustronnaScotch2373/4 cala szerokość, trwała taśma dwustronna
EDTAThermofisher155750200,5 M EDTA, pH 8,0
EpoksydowyGoryl420015-minutowy czas utwardzania
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Avantor97068-085
GelGreenBiotium41005
Lodowaty kwas octowyVWRBDH3094-2.5LG
Szkło, Szkiełka nakrywkoweFisher Scientific12-548-5P
Szkło, Szkiełko mikroskopoweVWR48300-02675 mm x 25 mm x 1 mm
Szkło, Słoik do barwieniaVWR74830-150Słoik do barwienia Wheaton (900620)
Zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS)Lonza04-315Q
HemocytometrSigma-AldrichZ359629-1EA
Ogniwa HL-60ATCCCCL-240
Wspornik przesuwny komory wilgotnościowejWykonany na zamówieniedruk 3D z filamentem ABS
Nadtlenek wodoruVWRBDH7690-130%
ImidazolSigma-AldrichI2399
Wloty / wylotyWykonanePrzewierć osiem dociskowych 8-32 za pomocą wierteł kobaltowych. Wkład 1,5 cm  rurki polietylenowe (Tygon, ID 1/32" Ø 3/32") do każdej pustej dociskowej
Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM)Lonza12-722F
Chlorek magnezuVWRBDH9244
Magnetyczne kulki Ni-NTAInvitrogen10103D
Rurki pocztoweEMSEMS71406-10
MetanolVWRBDH1135-4LP
Micro Bio-Spin P-6 Kolumny żeloweBiorad7326200W buforze SSC
PEGLaysan BioMPEG-SVA-5000
PEG-biotynaLaysan BioBiotyna-PEG-SVA-5000
Wodorotlenek potasuVWR470302-132
Białko, białko GAbcamab155724N-końcowy His-Tag i C-końcowy Białko cysteiny
, selektyna P-FcR& D System137-PSRekombinowana ludzka selektyna P/CD62P Fc Chimera białko
białko CF, streptawidynaCedarlanCL1005-01-5MG
Pompa StrzykawkaAparat Harvard704801
Wodorowęglan soduWard' s Science470302-444
Chlorek soduVWR97061-274
Sulfo-SMCCThermofisher22322
StrzykawkaHamilton81520Strzykawki z PTFE luer lock, 5 mL
Igły strzykawkoweBD305115Precision Glide 26 g, długość 5/8 cala
TCEPSigma-AldrichC4706-2G
TrisVWRBDH4502-500GP
Przewody, adapterTygonABW00001Formulacja 3350, średnica wewnętrzna 1/32"; średnica zewnętrzna 3/32"
Przewody polietylenoweBD Intramedic427406Intramedic (PE20) średnica wewnętrzna 0,38mm; średnica zewnętrzna 1,09mm
Tween-20Sigma-Aldrich93773
z włókna ABS Wykonany na zamówienie na zamówienie na zamówienie ,

Bibliografia

  1. McEver, R. P., Zhu, C. Rolling cell adhesion. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 363-396 (2010).
  2. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: The leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
  3. Zarbock, A., Ley, K. Neutrophil adhesion and activation under flow. Microcirculation. 16 (1), 31-42 (2009).
  4. Etzioni, A. Adhesion molecules - Their role in health and disease. Pediatric Research. 39 (2), 191-198 (1996).
  5. van de Vijver, E., vanden Berg, T. K., Kuijpers, T. W. Leukocyte adhesion deficiencies. Hematology/Oncology Clinics of North America. 27 (1), 101-116 (2013).
  6. Hanna, S., Etzioni, A. Leukocyte adhesion deficiencies. Annals of the New York Academy of Sciences. 1250 (1), 50-55 (2012).
  7. Geng, Y., Marshall, J. R., King, M. R. Glycomechanics of the metastatic cascade: Tumor cell-endothelial cell interactions in the circulation. Annals of Biomedical Engineering. 40 (4), 790-805 (2012).
  8. Yasmin-Karim, S., King, M. R., Messing, E. M., Lee, Y. F. E-selectin ligand-1 controls circulating prostate cancer cell rolling/adhesion and metastasis. Oncotarget. 5 (23), 12097-12110 (2014).
  9. Marshall, B. T., Long, M., Piper, J. W., Yago, T., McEver, R. P., Zhu, C. Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules. Nature. 423 (6936), 190-193 (2003).
  10. Hammer, D. A. Adhesive dynamics. Journal of Biomechanical Engineering. 136 (2), 021006(2014).
  11. Yasunaga, A. B., Murad, Y., Kapras, V., Menard, F., Li, I. T. S. Quantitative interpretation of cell rolling velocity distribution. Biophysical Journal. 120 (12), 2511-2520 (2021).
  12. Li, I. T. S., Ha, T., Chemla, Y. R. Mapping cell surface adhesion by rotation tracking and adhesion footprinting. Scientific Reports. 7 (1), 44502(2017).
  13. Yasunaga, A. B., Li, I. T. S. Quantification of fast molecular adhesion by fluorescence footprinting. Science Advances. 7 (34), (2021).
  14. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods. 8 (12), 1027-1040 (2011).
  15. Zhu, M., Lerum, M. Z., Chen, W. How to prepare reproducible, homogeneous, and hydrolytically stable aminosilane-derived layers on silica. Langmuir. 28 (1), 416-423 (2012).
  16. Chandradoss, S. D., Haagsma, A. C., Lee, Y. K., Hwang, J. H., Nam, J. M., Joo, C. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549(2014).
  17. Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. Super-resolution microscopy with DNA-PAINT. Nature Protocols. 12 (6), 1198-1228 (2017).
  18. Chalfoun, J., et al. MIST: Accurate and scalable microscopy image stitching tool with stage modeling and error minimization. Scientific Reports. 7 (1), 4988(2017).
  19. Wang, X., et al. Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors. Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).
  20. Crockett-Torabi, E. Selectins and mechanisms of signal transduction. Journal of Leukocyte Biology. 63 (1), 1-14 (1998).
  21. Ye, Z., et al. The P-selectin and PSGL-1 axis accelerates atherosclerosis via activation of dendritic cells by the TLR4 signaling pathway. Cell Death and Disease. 10 (7), 507(2019).
  22. Saha, K., Bender, F., Gizeli, E. Comparative study of IgG binding to proteins G and A: Nonequilibrium kinetic and binding constant determination with the acoustic waveguide device. Analytical Chemistry. 75 (4), 835-842 (2003).
  23. Murad, Y., Li, I. T. S. Quantifying molecular forces with serially connected force sensors. Biophysical Journal. 116 (7), 1282-1291 (2019).
  24. Yasunaga, A. B., Murad, Y., Li, I. T. S. Quantifying molecular tension-classifications, interpretations and limitations of force sensors. Physical Biology. 17 (1), 011001(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Adhezja toczkowaP selektyna PSGL 1obrazowanie DNA PAINTtether z czujnikiem napr emonta komory przep ywowejca kowite wewn trzne odbiciemikroskopia fluorescencyjnazachowanie toczkowe kom rekmolekularna si a adhezji
Obrazowanie adhezji molekularnej w walcowaniu komórek za pomocą testu śladu adhezyjnego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.