Obrazowanie adhezji molekularnej w walcowaniu komórek za pomocą testu śladu adhezyjnego

Scott Minh An; Seong Ho Kim; Vanessa J. White; Adam B. Yasunaga; Kathleen M. McMahon; Yousif Murad; Isaac T. S. Li

doi:10.3791/63013

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Obrazowanie adhezji molekularnej w walcowaniu komórek za pomocą testu śladu adhezyjnego

3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63013

⸱

27 września 2021

Scott Minh An^*¹^,² , Seong Ho Kim^*¹ , Vanessa J. White^*¹^,² , Adam B. Yasunaga^*¹^,² , Kathleen M. McMahon² , Yousif Murad¹^,³ , Isaac T. S. Li¹^,²

¹Department of Chemistry, The University of British Columbia, ²Biochemistry and Molecular Biology, The University of British Columbia, ³Faculty of Medicine, The University of British Columbia

^* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół przedstawia eksperymentalne procedury przeprowadzania testu śladu adhezyjnego w celu zobrazowania zdarzeń adhezji podczas szybkiej adhezji toczenia komórek.

Streszczenie

Zrost toczny, ułatwiony przez interakcje za pośrednictwem selekcji, jest wysoce dynamiczną, pasywną ruchliwością w rekrutacji leukocytów do miejsca zapalenia. Zjawisko to występuje w żyłkach zakapilarnych, w których przepływ krwi popycha leukocyty ruchem tocznym na komórki śródbłonka. Stabilne walcowanie wymaga delikatnej równowagi między tworzeniem wiązań adhezyjnych a ich mechanicznie napędzaną dysocjacją, dzięki czemu ogniwo pozostaje przyczepione do powierzchni podczas toczenia się w kierunku przepływu. W przeciwieństwie do innych procesów adhezji zachodzących w stosunkowo statycznych środowiskach, adhezja walcowa jest bardzo dynamiczna, ponieważ komórki toczne przemieszczają się przez tysiące mikronów z prędkością kilkudziesięciu mikronów na sekundę. W związku z tym konwencjonalne metody mechanobiologiczne, takie jak mikroskopia sił trakcyjnych, nie nadają się do pomiaru poszczególnych zdarzeń adhezji i związanych z nimi sił molekularnych ze względu na krótki czas i wymaganą wysoką czułość. W tym miejscu opisujemy naszą najnowszą implementację testu śladu adhezyjnego do obrazowania interakcji selektyny P: PSGL-1 w adhezji tocznej na poziomie molekularnym. Metoda ta wykorzystuje nieodwracalne linki napinające na bazie DNA w celu wytworzenia trwałej historii zdarzeń adhezji molekularnej w postaci ścieżek fluorescencyjnych. Ścieżki te można obrazować na dwa sposoby: (1) zszywając ze sobą tysiące obrazów ograniczonych dyfrakcją, aby uzyskać duże pole widzenia, umożliwiając ekstrakcję śladu adhezyjnego każdej toczącej się komórki o długości tysięcy mikronów, (2) wykonując DNA-PAINT w celu zrekonstruowania obrazów o wysokiej rozdzielczości ścieżek fluorescencyjnych w małym polu widzenia. W tym badaniu test śladu adhezyjnego został wykorzystany do zbadania komórek HL-60 toczących się przy różnych naprężeniach ścinających. W ten sposób byliśmy w stanie zobrazować rozkład przestrzenny oddziaływania selektyny P: PSGL-1 i uzyskać wgląd w ich siły molekularne poprzez intensywność fluorescencji. W związku z tym metoda ta stanowi podstawę do ilościowego badania różnych interakcji komórka-powierzchnia zaangażowanych w adhezję toczną na poziomie molekularnym.

Wprowadzenie

Kaskada adhezji opisuje, w jaki sposób krążące komórki łączą się ze ścianą naczynia krwionośnego i toczą się wzdłuż niej¹. Pasywne rolowanie odbywa się głównie za pośrednictwem selektyn, głównej klasy komórkowych cząsteczek adhezyjnych (CAM)¹. Pod ścinającym przepływem krwi leukocyty eksprymujące ligand-1 glikoproteiny selektyny P (PSGL-1) tworzą wysoce przejściowe wiązania z selektyną P, które mogą ulegać ekspresji na powierzchni komórek śródbłonka objętych stanem zapalnym. Proces ten ma kluczowe znaczenie dla migracji leukocytów do miejsca zapalenia². Ponadto, PSGL-1 jest również mechanowrażliwy....