Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Test komórkowy oparty na reporterze do monitorowania wydajności splicingu

2.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63014

⸱

15 września 2021

 ,  , 
1Department of Basic Medical Sciences, College of Medicine-Phoenix, University of Arizona

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje test reporterowy minigenu do monitorowania wpływu mutacji miejsca 5'-splicingu na splicing i rozwija supresorowe U1 snRNA w celu ratowania indukowanego mutacjami hamowania splicingu. Konstrukty reporterowe i supresorowe U1 snRNA ulegają ekspresji w komórkach HeLa, a splicing jest analizowany przez wydłużenie startera lub RT-PCR.

Streszczenie

Podczas ekspresji genów, kluczowym etapem splicingu pre-mRNA jest dokładne rozpoznanie miejsc splicingu i efektywne składanie kompleksów spliceosomalnych w celu połączenia eksonów i usunięcia intronów przed cytoplazmatycznym eksportem dojrzałego mRNA. Wydajność splicingu może być zmieniona przez obecność mutacji w miejscach splicingu, wpływ trans-działających czynników splicingowych lub aktywność środków terapeutycznych. W tym miejscu opisujemy protokół testu komórkowego, który można zastosować do monitorowania wydajności splicingu dowolnego eksonu. Test wykorzystuje adaptowalny reporter minigenu 3-eksonu/2-intronu kodowany plazmidem, który może ulegać ekspresji w komórkach ssaków przez transfekcję przejściową. Po transfekcji izoluje się całkowity komórkowy RNA, a skuteczność splicingu eksonów w reporterowym mRNA określa się albo przez wydłużenie startera, albo półilościową reakcję łańcuchową polimerazy odwrotnej transkryptazy (RT-PCR). Opisujemy, w jaki sposób można określić wpływ mutacji 5′ splicingu związanych z chorobą, wprowadzając je do reportera; oraz w jaki sposób tłumienie tych mutacji można osiągnąć poprzez kotransfekcję z konstruktem U1 z małym jądrowym RNA (snRNA) przenoszącym mutacje kompensacyjne w regionie 5′, który łączy się w pary z miejscami splicingu 5′ w połączeniach egzon-intron w pre-mRNA. W ten sposób reporter może być wykorzystany do projektowania terapeutycznych cząstek U1 w celu poprawy rozpoznawania zmutowanych miejsc splicingu 5′. Wprowadzenie miejsc regulatorowych działających cis, takich jak sekwencje wzmacniacza splicingu lub tłumika, do reportera można również wykorzystać do zbadania roli U1 snRNP w regulacji, w której pośredniczy określony alternatywny czynnik splicingowy. Wreszcie, komórki wykazujące ekspresję reporterową można inkubować z małymi cząsteczkami w celu określenia wpływu potencjalnych środków terapeutycznych na konstytutywny splicing pre-mRNA lub na eksony przenoszące zmutowane miejsca splicingu 5′. Ogólnie rzecz biorąc, test reporterowy może być stosowany do monitorowania wydajności splicingu w różnych warunkach w celu zbadania podstawowych mechanizmów splicingu i chorób związanych z splicingiem.

Wprowadzenie

Splicing pre-mRNA jest niezbędnym etapem przetwarzania, który usuwa niekodujące introny i precyzyjnie liguje kodujące egzony do dojrzałego mRNA. Rozpoznanie sekwencji konsensusu w połączeniach egzon-intron, określanych jako miejsce 5′-splicingu i miejsce 3′-splicingu, przez elementy maszyny do splicingu inicjuje proces splicingu. Mała rybonukleoproteina jądrowa U1 (snRNP) rozpoznaje miejsce 5′-splicingu poprzez parowanie zasad snRNA U1 z klasą pre-mRNA1. Genetycznie dziedziczone mutacje, które zmieniają sekwencje miejsc splicingu 5′, są związane z wieloma chorobami2,3. Przewiduje się, że utrata parowania zasad snRNA U1 ze zmutowanymi miejscami splicingu 5′ powoduje nieprawidłowe splicing, co może zagrozić translacji dotkniętego transkryptu. Potencjalne podejście terapeutyczne do korygowania defektów splicingu polega na tłumieniu mutacji przez zmodyfikowane snRNA U1 przenoszące kompensacyjne zmiany nukleotydowe w regionie 5′, który łączy się w pary z miejscem splicingu 5′. Stwierdzono, że takie zmodyfikowane snRNA U1, określane również jako snRNA U1 specyficzne dla eksonu, są skuteczne w odwracaniu defektów splicingu, co skutkuje zwiększoną ekspresją białka z uratowanego mRNA4,5,6,7,8.

Tutaj opisujemy test komplementacji U1 snRNP, test splicingu komórkowego oparty na reporterze, który pozwala ocenić wpływ mutacji 5′-ss na splicing eksonu i może być również wykorzystany do rozwoju zmodyfikowanych snRNA U1, aby umożliwić uratowanie inkluzji eksonu. Udostępniamy również protokoły monitorowania splicingowanych transkryptów reporterowych przez rozszerzenie startera i RT-PCR oraz do oznaczania ekspresji zmodyfikowanych snRNA U1 przez rozszerzenie startera i RT-qPCR.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Odczynniki i bufory

UWAGA: Cały proces sterylizacji z wykorzystaniem filtrów próżniowych należy przeprowadzać przy użyciu membrany z polietersulfonu (PES) o wielkości porów 0.2 µm w komorze z laminarnym przepływem powietrza.

  1. Przygotować wodę wolną od RNaz, dodając 1,0 mL diethylopirokarbonianu (DEPC) do 1,0 L wody dejonizowanej, mieszając przez co najmniej 1 h w temperaturze pokojowej (RT), autoklawując dwukrotnie, a następnie chłodząc do RT przed użyciem.
  2. Przygotować modyfikowaną pożywkę Eagle'a Dulbecco (DMEM), mieszając jedną saszetkę proszku DMEM (13,4 g), 3,7 g wodorowęglanu sodu, 100 mL płodowej surowicy bydlęcej (FBS), penicylinę i streptomycynę w ~800 mL sterylnej wody dejonizowanej. Końcowe stężenie penicyliny i streptomycyny w DMEM powinno wynosić odpowiednio 50 U/mL i 50 µg/mL. Dostosować pH do 7,4, a następnie dopełnić objętość do 1,0 L sterylną wodą dejonizowaną. Sterylizować przez filtrację i przechowywać w 4 °C.
  3. Przygotować 10-krotny roztwór soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (10x PBS), dodając 25,6 g siedmiowodnego wodorofosforanu sodu (Na2HPO4·7H2O), 2 g dwuwodorofosforanu potasu (KH2PO4), 2 g chlorku potasu (KCl) i 80 g chlorku sodu (NaCl) do 800 mL wody dejonizowanej. Mieszać do rozpuszczenia i dopełnić objętość do 1,0 L. Sterylizować przez filtrację i przechowywać w 4 °C.
  4. Przygotować 0,5 M kwas etylenodiamino tetraoctowy (EDTA), rozpuszczając 186,1 g Na2•EDTA•2H2O w ~800 mL wody dejonizowanej. Dostosować pH do 8,0, a następnie dopełnić objętość do 1,0 L sterylną wodą dejonizowaną. Sterylizować przez filtrację i przechowywać w 4 °C.
  5. Przygotować 1-krotny roztwór trypsyny z EDTA, mieszając 100 mL 10-krotnej trypsyny (2,5%), 2 mL 0,5 M EDTA i dodając 1x PBS do objętości 1,0 L. Sterylizować przez filtrację i rozdzielić do 50 mL probówek stożkowych. Przechowywać w 4 °C przez 1-2 tygodnie lub zamrozić w -20 °C do długotrwałego użycia.
  6. Przygotować 2-krotny barwnik do ładowania DNA/RNA z formamidem, mieszając 14,4 mL formamidu i 0,6 mL 0,5 M EDTA do uzyskania objętości końcowej 15 mL. Dodać proszek błękitu bromofenolowego i błękitu ksylenolowego do stężenia końcowego 0,02% i przechowywać w 4 °C.
    UWAGA: Formamid jest toksyczny i żrący. Należy zapoznać się z kartami charakterystyki materiałów w celu uzyskania dodatkowych zaleceń dotyczących bezpieczeństwa.
  7. Przygotować 5-krotny bufor Tris/boran/EDTA (5x TBE), mieszając 54,0 g bazy Tris, 27,5 g kwasu borowego i 20 mL 0,5 M EDTA w ~800 mL wody dejonizowanej. Mieszać do rozpuszczenia i dopełnić objętość do 1,0 L wodą dejonizowaną.
  8. Przygotować roztwór do elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z mocznikiem (urea-PAGE), mieszając 200 mL 5x TBE, 250 mL 40% bis-akryloamidu w stosunku 19:1 oraz 450,5 g mocznika. Następnie dodać wodę dejonizowaną do objętości 1,0 L. Mieszać aż do całkowitego rozpuszczenia składników, następnie sterylizować przez filtrację i przechowywać w 4 °C w bursztynowej butelce szklanej.
    UWAGA: Bis-akryloamid jest toksyczny. Należy zapoznać się z kartami charakterystyki materiałów w celu zapoznania się z dodatkowymi procedurami bezpieczeństwa.
  9. Przygotować 10% nadsiarczan amonu (APS), rozpuszczając 1 g APS w 10 mL wody dejonizowanej i przechowywać w 4 °C.

2. Kotransfekcja komórek HeLa plazmidami reporterowymi i U1 snRNA

UWAGA: Transfekcja komórek HeLa musi być przeprowadzona w warunkach sterylnych w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Zewnętrzne powierzchnie wszystkich materiałów należy spryskać 70% etanolem przed wprowadzeniem ich do komory z laminarnym przepływem powietrza.

  1. Hodować komórki HeLa w pożywce DMEM w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2, wykonując pasażowanie co 2-3 dni, gdy komórki osiągną około 80-90% konfluencji.
  2. W celu pasażowania komórek HeLa, odessać zużytą pożywkę, a następnie inkubować komórki z 3 mL 0,25% trypsyny zawierającej 1 mM EDTA w temperaturze 37 °C przez 3 min.
  3. Po inkubacji dodać 7 mL świeżej pożywki DMEM. Przenieść zawiesinę komórkową do probówki 10 mL i wirować przy 1 000 x g przez 5 min.
  4. Resuspendować osad komórkowy w 10 mL świeżej pożywki DMEM, a następnie wysiać komórki na nową szalkę do hodowli tkankowej przy 20% konfluencji.
  5. Do transfekcji przejściowych policzyć komórki HeLa za pomocą czystej komory licznikowej i przygotować zawiesinę o zagęszczeniu 2,5 x 105 komórek/mL.
  6. Wysiać 1,0 mL zawiesiny komórek HeLa o zagęszczeniu 2,5 x 105 komórek/mL do każdego dołka płytki 12-dołkowej i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
  7. Następnego dnia odessać zużytą pożywkę i dodać 0,8 mL świeżej pożywki DMEM z surowicą.
  8. Przygotować Roztwór I, dodając 0,2 µg plazmidu reporterowego Dup51 lub Dup51p, 1,8 µg plazmidu pcDNA, pNS6U1 lub pNS6U1-5a oraz 100 µL pożywki do transfekcji do nowej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL.
  9. Przygotować master mix Roztworu II dla wszystkich próbek przeznaczonych do transfekcji, dodając 100 µL pożywki do transfekcji i 4,0 µL odczynnika do transfekcji na każdą próbkę.
  10. Przygotować mieszaninę do transfekcji, dodając 100 µL Roztworu II do każdej probówki do mikrocentryfugi zawierającej Roztwór I.
  11. Mieszaniny do transfekcji wierzgać na wortexie przez 15 s, wirować w mikrocentry fudze laboratoryjnej przy 3 000 x g przez 10 s w temperaturze pokojowej (RT), a następnie inkubować w RT przez 5 min.
  12. Dodać całe 200 µL mieszaniny do transfekcji do jednego dołka płytki 12-dołkowej z komórkami HeLa, aby uzyskać końcową objętość 1,0 mL na dołek, i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 48 h.
  13. Po inkubacji wyekstrahować RNA z transfektowanych komórek HeLa za pomocą komercyjnie dostępnego roztworu tiocyjanianu guanydyny i fenolu.
    UWAGA: Odczynnik ten zawiera fenol i ten etap należy przeprowadzić w dygestorium. Do resuspensji wyekstrahowanego RNA zaleca się stosowanie wody traktowanej DEPC.
    1. Odessać zużytą pożywkę i dodać 500 µL odczynnika do każdego dołka. Inkubować w RT przez 5 min.
    2. Zhomogenizować poprzez pipetowanie w górę i w dół. Następnie przenieść roztwór do nowej probówki do mikrocentryfugi 1,5 mL.
    3. Dodać 100 µL chloroformu i wierzgać na vortexie przez 15 s.
    4. Wirować przy 12 000 x g przez 15 min w RT.
    5. Przenieść 200 µL górnej warstwy wodnej zawierającej RNA do nowej probówki do mikrocentryfugi 1,5 mL.
    6. Do każdej próbki RNA dodać 2 µg glikogenu i 200 µL izopropanolu. Wymieszać poprzez odwracanie probówek.
    7. zebrać osad RNA poprzez wirowanie przy 12 000 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C.
    8. Usunąć i odrzucić nadosad, nie naruszając osadu RNA.
    9. Przemyć osad dwukrotnie, dodając 1,0 mL 70% etanolu, odwracając probówki i wirować zgodnie z opisem w kroku 2.13.7.
    10. Suszyć osad na powietrzu przez ok. 10-20 min w RT i resuspendować RNA w 10-20 µL wody wolnej od RNaz.
    11. Określić stężenie RNA, mierząc absorbancję przy 260 nm zgodnie z opisem Desjardinsa i Conklina9.
  14. Przejść do przedłużania starterów lub przechowywać próbki RNA w temperaturze -20 °C. Wyizolowane RNA może być przechowywane w -20 °C przez 6-12 miesięcy.

3. Znakowanie oligonukleotydów 32P

UWAGA: Kroki obejmujące użycie 32P-ATP oraz oligonukleotydów znakowanych 32P muszą być wykonywane za osłoną akrylową przez przeszkolone osoby posiadające zgodę uprawnionych jednostek instytucjonalnych. Opisany poniżej protokół może być stosowany do znakowania oligonukleotydów, Dup3r i U17-26-R, a także markerów do urea-PAGE. Do resuspensji oligonukleotydów oraz kulek do chromatografii wykluczania cząsteczek zaleca się stosowanie wody traktowanej DEPC.

  1. Do probówki do mikrowirówki o pojemności 1.5 mL dodać oligonukleotyd, T4 polynucleotide kinase (T4 PNK), bufor T4 PNK oraz 32P-ATP zgodnie z opisem w Tabeli 1. 32P-ATP należy dodać do mieszaniny na samym końcu; jest to istotne.
    UWAGA: Przy dodawaniu roztworów radioaktywnych zaleca się stosowanie końcówek z filtrem.
  2. Inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 30 min.
  3. Podczas inkubacji reakcji znakowania resuspender kulki do chromatografii wykluczania molekularnego z progiem odcięcia masy cząsteczkowej 25 kDa, delikatnie mieszając w wirówce typu vortex przez ~10 s.
    UWAGA: Kulki do chromatografii wykluczania molekularnego powinny być przygotowane zgodnie z instrukcją producenta i przechowywane jako 50% zawiesina w 25% etanolu w temperaturze 4 °C.
  4. Przygotować kolumny, przenosząc 600 μL resuspenderowanych kulek do jednorazowej minikolumny umieszczonej w probówce zbiorczej o pojemności 1.5 mL, a następnie schować zapas kulek do temperatury 4 °C.
  5. Wirować przy 2,000 x g przez 1 min w temperaturze pokojowej (RT) i odrzucić frakcję przepływową.
  6. Przepłukać kulki, dodając do kolumny 300 µL wody wolnej od RNaz.
  7. Powtórzyć kroki 3.5. i 3.6. dwukrotnie, a następnie przenieść minikolumnę do nowej probówki wirówkowej o pojemności 1.5 mL.
  8. Dodać mieszaninę reakcyjną z kinazą do kolumny z kulkami do chromatografii wykluczania molekularnego i wirować przy 5000 x g przez 1 min w temperaturze pokojowej (RT).
  9. Zebrać i zachować frakcję przepływową, która zawiera znakowany 32P oligonukleotyd, a wszystkie końcówki i probówki wyrzucić do akrylowego pojemnika na odpady.
  10. Dodać 20 µL wody wolnej od RNaz, aby rozcieńczyć znakowany 32P oligonukleotyd do końcowego stężenia 2.5 µM.
    UWAGA: Rozcieńczyć znakowane markery w zależności od potrzeb w celu naniesienia na żele urea-PAGE.
  11. Przechowywać znakowany oligonukleotyd w akrylowym pudełku na mikroprobówki w temperaturze -20 °C lub przystąpić do analizy wydłużania primera.

4. Analiza splicingowanych transkryptów reporterowych za pomocą metody wydłużania startera

UWAGA: Przed użyciem zaleca się oczyszczenie powierzchni i sprzętu odczynnikiem inaktywującym RNazy.

  1. Do oddzielnych probówek do mikrocentryfugi o pojemności 200 μL należy dodać 2,0 µg RNA wyekstrahowanego z komórek Hela, a następnie uzupełnić objętość do 6,55 µL za pomocą wody wolnej od RNaz.
  2. Należy przygotować Master Mix I z rozcieńczonym 32P-Dup3r oraz dNTP zgodnie z Tabelą 2, a następnie dodać 0,9 µL mieszaniny do każdej probówki PCR zawierającej próbki RNA.
  3. Probówki należy inkubować najpierw w temperaturze 65 °C przez 5 min, a następnie na lodzie przez 1 min.
  4. Należy przygotować Master Mix II z 5x First Strand Buffer, ditiotreitolem (DTT), inhibitorem RNazy oraz odwrotną transkryptazą zgodnie z Tabelą 2.
  5. Do każdej probówki zawierającej RNA i Master Mix 1 należy dodać 2,55 µL mieszaniny; całkowita objętość reakcji powinna wynosić 10 µL. Probówki należy przechowywać w temperaturze pokojowej (RT) przez 10 min.
  6. Probówki należy przenieść do grzałki blokowej lub termocyklera i inkubować najpierw w temperaturze 50 °C przez 60 min, a następnie w 70 °C przez 15 min.
  7. Po inkubacji do każdej próbki należy dodać 10 µL 2x barwnika do ładowania RNA z formamidem i przechowywać w pudełku akrylowym w temperaturze -20 °C lub przystąpić do rozdziału fragmentów metodą urea-PAGE przy użyciu żelu o długości 14 cm i wizualizacji obrazu żelu zgodnie z opisem w kroku 8 poniżej.
  8. Obraz żelu należy poddać skanowaniu densytometrycznemu za pomocą oprogramowania do analizy obrazu, a intensywności prążków produktów włączonych i pominiętych wykorzystać do obliczenia procentowego włączenia eksonu 2, jak pokazano poniżej.
    Wzór na włączenie eksonu 2 dla analizy stosunku intensywności w badaniu ekspresji genów.

5. Analiza splicingowanych transkryptów reporterowych za pomocą fluorescencyjnego RT-PCR

UWAGA: Opisana poniżej analiza RT-PCR wykorzystuje losowe heksamery do syntezy cDNA oraz kombinację nieznakowanych oligonukleotydów Dup8f i znakowanych Cy5 oligonukleotydów Dup3r do amplifikacji PCR produktów splicingowanych.

  1. W celu syntezy cDNA do osobnych probówek do mikrocentryfugi o pojemności 200 μL należy przenieść 2,0 µg RNA wyekstrahowanego z transfektowanych komórek Hela, a następnie uzupełnić objętość do 11,0 µL wodą wolną od RNaz.
  2. Należy przygotować Master Mix I, zawierający losowe heksamery i dNTP zgodnie z Tabelą 3, a następnie dodać 2,0 μL mieszaniny do każdej próbki. Inkubować najpierw w temperaturze 65 °C przez 5 min, a następnie na lodzie przez 1 min.
  3. Należy przygotować Master Mix II, zawierający bufor First Strand, inhibitor RNazy, DTT oraz odwrotną transkryptazę zgodnie z Tabelą 3, a następnie dodać 7,0 μL mieszaniny do każdej probówki zawierającej RNA i Master Mix I.
  4. Probówki należy pozostawić w temperaturze pokojowej (RT) przez 10 min, a następnie inkubować w temperaturze 50 °C przez 60 min i 70 °C przez 15 min.
    UWAGA: Zakończone reakcje syntezy cDNA można przechowywać w temperaturze -20 °C.
  5. W celu przeprowadzenia PCR należy przenieść 1,0 μL (100 ng/μL) każdej próbki cDNA do nowych probówek PCR.
  6. Należy przygotować master mix składający się z Dup8f, Cy5-Dup3r, dNTP, buforu Taq, polimerazy Taq i wody, zgodnie z opisem w Tabeli 4, a następnie dodać 11,5 μL mieszaniny do każdej probówki zawierającej cDNA.
  7. Reakcję PCR należy przeprowadzić w termocyklerze, rozpoczynając od etapu wstępnej denaturacji w 94 °C przez 3 min, a następnie przeprowadzić 20 cykli obejmujących denaturację (94 °C przez 30 s), przyłączanie (65 °C przez 30 s) i elongację (72 °C przez 15 s), kończąc etapem finalnym w 72 °C przez 5 min.
  8. Do każdej probówki należy dodać 12,5 µL 2x barwnika do ładowania DNA z formamidem i podgrzać w temperaturze 95 °C przez 5 min.
  9. Produkt reakcji PCR należy przechowywać w temperaturze -20 °C lub przystąpić do elektroforezy urea-PAGE zgodnie z opisem w krokach 8.1-8.4.
  10. Po elektroforezie należy wyjąć szklane płytki z aparatu do elektroforezy i przeskanować je za pomocą obrazownika fluorescencyjnego w celu wizualizacji żelu.
  11. Należy przeprowadzić skanowanie densytometryczne obrazu żelu i wykorzystać intensywność prążków produktów włączonych i pominiętych do obliczenia procentowego włączenia eksonu 2 zgodnie z opisem w kroku 4.8.

6. Analiza ekspresji wariantów U1 snRNA metodą prolongaty primera

  1. Do osobnych probówek do mikrocentryfugi o pojemności 200 μL dodać 2,0 µg RNA wyizolowanego z komórek Hela, uzupełnić objętość do 4,325 µL wodą wolną od RNaz, a następnie dodać dATP, zgodnie z Tabelą 5.
  2. Do każdej probówki dodać 10 000 CPM oligonukleotydu 32P-U17-26-R.
    UWAGA: Aby przygotować roztwór 32P-U17-26-R o stężeniu 10 000 cpm/μL (z Kroku 3), należy rozcieńczyć znakowany oligonukleotyd (rozcieńczenie 1:20), oznaczyć cpm w 1,0 μL za pomocą licznika scyntylacyjnego, a następnie dodatkowo rozcieńczyć wodą dejonizowaną, aby przygotować roztwór o stężeniu 10 000 cpm/μL w nowej probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL.
  3. Inkubować w temperaturze 65 °C przez 5 min, a następnie na lodzie przez 1 min.
  4. Przygotować master mix zawierający 5x First Strand Buffer, inhibitor RNazy, DTT oraz odwrotną transkryptazę, zgodnie z Tabelą 5, i dodać 1,8 µL mieszaniny do każdej próbki.
  5. Inkubować najpierw w temperaturze pokojowej (RT) przez 10 min, a następnie w 42 °C przez 10 min.
  6. Po inkubacji dodać 10 µL 2x barwnika do ładowania RNA z formamidem do każdej próbki i przechowywać w pudełku akrylowym w temperaturze -20 °C lub przystąpić do rozdziału fragmentów metodą urea-PAGE, używając żelu o długości 38 cm (patrz Krok 8).

7. Analiza ekspresji wariantów U1 snRNA metodą RT-qPCR

  1. Rozcieńczyć zapas cDNA przygotowany zgodnie z opisem w krokach 5.1 – 5.4 do stężenia 0,2 ng/µL.
  2. Nanieść 5,0 µL rozcieńczonego cDNA do poszczególnych dołków 96-dołkowej płytki qPCR w trzech powtórzeniach. W przypadku kontroli bez matrycy (NTC) zamiast cDNA dodać wodę dejonizowaną.
  3. Przygotować dwie oddzielne mieszaniny starterów składające się ze starterów forward i reverse dla snRNA U1 i U2 oraz wody, zgodnie z Tabelą 6.
    UWAGA: Sekwencje starterów specyficznych dla snRNA U1 i U2 podano w Tabeli 7.
  4. Dodać 5,0 µL mieszaniny starterów snRNA U1 i U2 do dołków z próbkami oraz NTC.
  5. Dodać 10,0 µL mieszaniny do PCR w czasie rzeczywistym do każdego dołka.
  6. Uszczelnić płytki folią optyczną, a następnie wirować z prędkością 1 000 x g przez 2 min w temperaturze pokojowej (RT), aby zebrać odczynniki na dnie dołków.
  7. Przeprowadzić qPCR z początkowym etapem denaturacji w 95 °C przez 10 min, a następnie 40 cykli protokołu 2-etapowego składającego się z denaturacji (95 °C przez 15 s) oraz przyłączania/elongacji (62 °C przez 60 s), rejestrując wartości cyklu kwantyfikacji progowej (Cq) dla amplikonów docelowych.
  8. Zakończyć reakcję qPCR, sprawdzając obecność pojedynczego piku na krzywej dysocjacji dla reakcji snRNA U1 i U2.
  9. Na podstawie wartości Cq obliczyć delta Cq (ΔCq) dla snRNA U1 i U2 w porównaniu z kontrolą pcDNA.
  10. Wyznaczyć ekspresję wariantu snRNA U1 jako ilość względną (RQ) U1 w porównaniu do U2, korzystając z wartości ΔΔCq, jak pokazano poniżej dla wszystkich próbek.
    Równanie ΔCq; kwantyfikacja porównawcza; ekspresja genów; formuła; badania naukowe.
    Analiza ekspresji genów, ΔΔCq=ΔCqU1−ΔCqU2, wyniki qPCR, metoda porównawcza.
    Formuła wyniku qPCR, równanie RQU1=2^-ΔΔCq, analiza ekspresji genów.

8. Przygotowanie i prowadzenie elektroforezy w żelach Urea-PAGE

UWAGA: Montaż szklanych płytek oraz aparatury do elektroforezy należy przeprowadzić zgodnie z instrukcjami producenta. Odlewanie żelu urea-PAGE 10% można wykonać zgodnie z protokołem opisanym wcześniej przez Summer et al.10. Kroki obejmujące przygotowanie markerów i próbek, a także prowadzenie elektroforezy i wizualizację żeli opisano poniżej. Opcjonalnie, aby zapobiec przywieraniu żelu do szklanych płytek, ich powierzchnię wewnętrzną można pokryć roztworem silikonu, nakładając 1 mL roztworu na powierzchnię i rozprowadzając go równomiernie po całej powierzchni za pomocą chusteczki. Po wyschnięciu płytki należy przemyć wodą dejonizowaną i ponownie osuszyć.

UWAGA: Niepolimeryzowana akryloamid jest neurotoksyczna i musi być obchodzona z zachowaniem środków ostrożności zalecanych w karcie charakterystyki materiału.

  1. Próbki do przedłużania starterów oraz markery należy przygotować poprzez ogrzewanie w temperaturze 95 °C przez 5 min, a następnie wirowanie w mikrowirówce stołowej z prędkością 3,000 x g przez 5 s w RT.
  2. Przed naniesieniem markerów i próbek należy wypłukać studzienki buforem 1x TBE, aby usunąć osadzony mocznik.
  3. Nanieść 10 μL na próbkę do każdej studzienki i prowadzić elektroforezę przy napięciu 300-500V przez 2-3 h lub do momentu, aż ksylen cyjanol dotrze do dolnej krawędzi żelu.
    UWAGA: Można nanieść około 1,000 cpm markera znakowanego 32P.
  4. Po zakończeniu elektroforezy należy wyjąć szklane płytki z aparatu do elektroforezy.
  5. Ostrożnie rozdzielić obie płytki tak, aby żel płasko spoczywał na jednej z powierzchni szklanych, a następnie przenieść żel na papier filtracyjny i przykryć go folią spożywczą.
  6. Żel na papierze filtracyjnym należy wysuszyć próżniowo w temperaturze 80 °C przez 30 min przy użyciu suszarki do żeli.
  7. Wysuszony żel należy umieścić w kasecie do obrazowania fosforowego i przechowywać w RT przez noc.
    UWAGA: Przed użyciem ekran fosforowy należy wyczyścić za pomocą stołu świetlnego.
  8. W celu wizualizacji obrazu żelu należy wyjąć ekran i przeprowadzić skanowanie za pomocą skanera fosforowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Reporter skrawania Dup51, minigen składający się z trzech eksonów i dwóch intronów, został wyprowadzony z ludzkiego genu β-globiny i został opisany wcześniej (Rysunek 1A)11,12 . Stworzyliśmy mutant reportera, Dup51p, wprowadzając mutacje miejsca skrawania 5´ powiązane z zespołem Ushera, które występują w eksonie 3 genu protokadheryny 15 (PCDH15)13. Sekwencja miejsca skrawania 5´ na złączeniu ekson 2-i...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Test można dostosować do analizy splicingu w liniach komórkowych innych niż HeLa, jednak czynniki wpływające na wydajność transfekcji, takie jak zbieganie się komórek i ilość DNA, mogą wymagać optymalizacji. Stosunek reportera do konstruktu U1 jest kolejnym krytycznym parametrem, który może wymagać określenia w zależności od poziomów ekspresji obserwowanych w innych typach komórek. Jakość wyekstrahowanego RNA ma kluczowe znaczenie dla analizy splicingu; dlatego zdecydowanie zaleca się stosowanie wody wolnej od RNaz i odk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez fundusze dla S.S. z National Institutes of Health (R21CA170786 i R01GM127464) oraz American Cancer Society (Institutional Research Grant 74-001-34-IRG) oraz dla S.S. i W.M. z Valley Research Partnership Program (P1-4009 i VRP77). Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynnik Woda dejonizowanaThermoFisher Scientific23-751628
Pirowęglan dietylu (DEPC)Sigma-AldrichD5758-25ML
Pakiet proszku Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco12100-046
Wodorowęglan soduThermoFisherScientific S233-500
Płodowa surowica bydlęca (FBS), Źródło australijskie, inaktywowany termicznieOmega ScientificFB-22
Penicylina-Streptomycyna (P / S)Sigma-AldrichP4458-100ML
Wodorotlenek sodu, roztwór wzorcowy 1,0NKwas solny Sigma-AldrichS2567-16A
, certyfikowany ACS Plus, 36,5 do 38,0%ThermoFisher ScientificA144-500
Jednorazowe filtry do butelek PESThermoFisher ScientificFB12566510
EDTA Sól disodowa dwuwodnaAmresco0105-2,5KG
2,5% trypsyna (10x), bez czerwieni fenolowejThermoFisher Scientific15090046
Chlorek soduOdczynnik FisherBP358-212
Odczynnik do chlorku potasuFisherBP366-1
Disodium Wodorofosforan SiedmiowodnyBioreagent FisheraBP332-1
Diwodorofosforan potasuBioreodczynnik FisheraBP362-1
Pożywka transfekcyjna - Opti-MEM&handel; I Zredukowana pożywka w surowicy, bez czerwieni fenolowejThermoFisher Scientific11058021
Odczynnik do transfekcji - Lipofectamine&handel; 2000ThermoFisher Scientific13778150
TRIzol™ OdczynnikThermoFisher Scientific15596018
Chloroform (ok. 0,75% etanolu jako konserwant/biologia molekularna)ThermoFisher ScientificBP1145-1
Etanol, absolutny (200 dowodów), klasa biologii molekularnej, Fisher BioReagentsThermoFisher ScientificBP2818-4
Isopropanol, klasa biologii molekularnej, Fisher BioReagentsThermoFisher ScientificBP2618-212
Glikogen (5 mg / ml)ThermoFisher ScientificAM9510
Zestaw miniprzygotowawczy Direct-zol RNAZymo ResearchR2052
ATP, [γ-32P]- 6000Ci/mmol 150mCi/ml Ołów, 1 mCiPerkinElmer
T4New England BiolabsM0201L
Wykluczenie rozmiaru beands - Sephadex® G-25Sigma-AldrichG2580-10G
Wykluczenie rozmiaru mini kolumnyUSA Scientific1415-0600
pBR322 DNA-MspI DigestNew England BiolabsN3032S
Marker o niskiej masie cząsteczkowej, 10-100 ntAffymetrix76410 100 UL
Odczynniki inaktywujące rnazę - RNaseZAP™Sigma-AldrichR2020-250ML
dNTP Mix (10 mM szt.)ThermoFisher Scientific18427013
RNaseOUT™ Rekombinowany inhibitor rybonukleazyThermoFisher Scientific10777019
Odwrotna transkryptaza - M-MLV Odwrotna transkryptazaThermoFisher Scientific28025013stosowany do przedłużania startera
Polimeraza DNA TaqThermoFisher Scientific10342020
Losowe heksamery (50 &mikro; M)ThermoFisher ScientificN8080127
Mieszanka do PCR w czasie rzeczywistym - SYBR™ Wybierz Master MixThermoFisher Scientific4472903
SuperScript™ III Odwrotna transkryptazaThermoFisher Scientific18080093używany do otrzymywania cDNA
Ditiothreitol (DTT)ThermoFisher Scientific18080093
5X bufor pierwszej niciThermoFisher Scientific18080093
Formamid (≥ 99,5%)ThermoFisher ScientificBP228-100Review Karty charakterystyki substancji niebezpiecznej
Sól sodowa błękitu bromofenolowegoSigma-Aldrich114405-5G
Ksylen Cyanol FFSigma-Aldrich2650-17-1
Tris Base (białe kryształy lub krystaliczny proszek/biologia molekularna)ThermoFisher ScientificBP152-5
Kwas borowy (krystaliczny/ Elektroforeza)ThermoFisher ScientificBP168-500
Akrylamid: Bis-Akrylamid 19:1 (40% roztwór/elektroforeza)ThermoFisher ScientificBP1406-1Review Karty charakterystyki
Mocznik (bezbarwne do białych kryształy lub krystaliczny proszek/mol. Biol.)ThermoFisher ScientificBP169-212
Peroxodisiarczan amonu (APS) ≥ 98%, Pro-Pure, Klasa proteomicznaVWRM133-25G
SigmacoteSigma-AldrichSL2-100ML
N,N,N',N'-tetrametyloetylenodiamina (TEMED) ≥ 99%, UltrapureVWR0761-25MLReview Karty charakterystyki substancji niebezpiecznej
Regulowane systemy żelowe do płyt, ExpedeonVWRASG-400
Vertical Gel Wrap™ Zestawy płytek szklanych, 16,5 x 14,5 cmVWRNGP-125NR
Pionowa folia żelowa i handel; Zestawy płytek szklanych, 16,5 x 22,0 cmVWRNGP-200NR
Pionowa owijka żelowa i handel; Zestawy płyt szklanych, 16,5 x 38,7 cmVWRNGP-400NR
GE Ekrany fosforowe do przechowywaniaSigma-AldrichGE28-9564
Typhoon™ FLA 7000 Obrazownik biomolekularnyGE Healthcare28-9610-73 AB
Beckman Coulter LS6500 Licznik scyntylacyjny cieczyGMI8043-30-1194
C1000 Dotykowy termocyklerThermoFisher Scientific
QuantStudio 6 Flex Systemy PCR w czasie rzeczywistymThermoFisher Scientific
Kinaza polinukleotydowa NEG035C001MC

Bibliografia

  1. Zhuang, Y., Weiner, A. M. A compensatory base change in U1 snRNA suppresses a 5' splice site mutation. Cell. 46 (6), 827-835 (1986).
  2. Scotti, M. M., Swanson, M. S. RNA mis-splicing in disease. Nature Review Genetics. 17 (1), 19-32 (2016).
  3. Ward, A. J., Cooper, T. A. The pathobiology of splicing. Journal of Pathology. 220 (2), 152-163 (2010).
  4. Scalet, D., et al. Disease-causing variants of the conserved +2T of 5' splice sites can be rescued by engineered U1snRNAs. Human Mutatation. 40 (1), 48-52 (2019).
  5. Yamazaki, N., et al. Use of modified U1 small nuclear RNA for rescue from exon 7 skipping caused by 5'-splice site mutation of human cathepsin A gene. Gene. 677, 41-48 (2018).
  6. Yanaizu, M., Sakai, K., Tosaki, Y., Kino, Y., Satoh, J. I. Small nuclear RNA-mediated modulation of splicing reveals a therapeutic strategy for a TREM2 mutation and its post-transcriptional regulation. Science Reports. 8 (1), 6937(2018).
  7. Balestra, D., et al. Splicing mutations impairing CDKL5 expression and activity can be efficiently rescued by U1snRNA-based therapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 20174130(2019).
  8. Donadon, I., et al. Exon-specific U1 snRNAs improve ELP1 exon 20 definition and rescue ELP1 protein expression in a familial dysautonomia mouse model. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2466-2476 (2018).
  9. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. (45), e2565(2010).
  10. Summer, H., Gramer, R., Droge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE). Journal of Visualized Experiments. (32), e1485(2009).
  11. Dominski, Z., Kole, R. Selection of splice sites in pre-mRNAs with short internal exons. Molecular Cell Biology. 11 (12), 6075-6083 (1991).
  12. Amir-Ahmady, B., Boutz, P. L., Markovtsov, V., Phillips, M. L., Black, D. L. Exon repression by polypyrimidine tract binding protein. RNA. 11 (5), 699-716 (2005).
  13. Le Guedard-Mereuze, S., et al. Sequence contexts that determine the pathogenicity of base substitutions at position +3 of donor splice-sites. Human Mutation. 30 (9), 1329-1339 (2009).
  14. Sharma, S., Wongpalee, S. P., Vashisht, A., Wohlschlegel, J. A., Black, D. L. Stem-loop 4 of U1 snRNA is essential for splicing and interacts with the U2 snRNP-specific SF3A1 protein during spliceosome assembly. Genes and Development. 28 (22), 2518-2531 (2014).
  15. Steitz, J. A., et al. Functions of the abundant U-snRNPs. Structure and function of major and minor small nuclear ribonucleoprotein particles. , Springer Berlin Heidelberg. Berlin, Heidelberg. 115-154 (1988).
  16. Fortes, P., et al. Inhibiting expression of specific genes in mammalian cells with 5' end-mutated U1 small nuclear RNAs targeted to terminal exons of pre-mRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 100 (14), 8264-8269 (2003).
  17. Roca, X., et al. Widespread recognition of 5' splice sites by noncanonical base-pairing to U1 snRNA involving bulged nucleotides. Genes and Development. 26 (10), 1098-1109 (2012).
  18. Roca, X., Krainer, A. R. Recognition of atypical 5' splice sites by shifted base-pairing to U1 snRNA. Nature Structural Molecular Biology. 16 (2), 176-182 (2009).
  19. Taladriz-Sender, A., Campbell, E., Burley, G. A. Splice-switching small molecules: A new therapeutic approach to modulate gene expression. Methods. 167, 134-142 (2019).
  20. Hamid, F. M., Makeyev, E. V. A mechanism underlying position-specific regulation of alternative splicing. Nucleic Acids Research. 45 (21), 12455-12468 (2017).
  21. Martelly, W., et al. Synergistic roles for human U1 snRNA stem-loops in pre-mRNA splicing. RNA Biology. , 1-18 (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Reporter minigenowysplicing pre mRNAmutacja miejsca splicinguU1 snRNAtransfekcja przej ciowaprzed u anie starter wRT PCRkom rki HeLa
Test komórkowy oparty na reporterze do monitorowania wydajności splicingu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.