Method Article

Niedegradacyjna metoda ekstrakcji do charakterystyki struktury molekularnej cząstek bakteryjnego glikogenu

DOI:

10.3791/63016

⸱

February 18th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Bioinformatics, School of Medical Informatics and Engineering, Xuzhou Medical University, 2Jiangsu Key Laboratory of New Drug Research and Clinical Pharmacy, School of Pharmacy, Xuzhou Medical University, 3Department of Pharmaceutical Analysis, School of Pharmacy, Xuzhou Medical University, 4Department of Biological Sciences, School of Life Sciences, Xuzhou Medical University, 5School of Chemistry and Molecular Biosciences, The University of Queensland, 6Centre for Nutrition and Food Sciences, Queensland Alliance for Agriculture and Food Innovation, The University of Queensland, 7Joint International Research Laboratory of Agriculture and Agri-Product Safety, College of Agriculture, Yangzhou University, 8State Key Laboratory of Quality Research in Chinese Medicines, Macau University of Science and Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na strukturę bakteryjnego glikogenu duży wpływ mają metody ekstrakcji, które mogą prowadzić do degradacji molekularnej i/lub tendencyjnego pobierania próbek. Konieczne jest opracowanie metod minimalizacji tych problemów. W tym miejscu porównano cztery metody ekstrakcji, wykorzystując rozkład wielkości i rozkład długości łańcucha jako kluczowe kryteria minimalizacji artefaktów ekstrakcji.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecnie istnieje wiele metod ekstrakcji glikogenu, które albo uszkadzają strukturę przestrzenną glikogenu, albo tylko częściowo go ekstrahują, co prowadzi do tendencyjnej charakterystyki struktury molekularnej glikogenu. Aby zrozumieć dynamiczne zmiany struktur glikogenu i wszechstronne funkcje cząstek glikogenu u bakterii, konieczne jest wyizolowanie glikogenu przy minimalnej degradacji. W tym badaniu wykazano łagodną metodę izolacji glikogenu poprzez zastosowanie wytrącania zimną wodą (CW) za pomocą ultrawirowania w gradiencie gęstości cukru (SDGU-CW). Dla porównania wykonano również tradycyjną metodę kwasu trichlorooctowego (TCA) oraz metodę wodorotlenku potasu (KOH). Powszechnie stosowany szczep laboratoryjny, Escherichia coli BL21(DE3), został wykorzystany jako organizm modelowy w tym badaniu w celach demonstracyjnych. Po ekstrakcji cząstek glikogenu różnymi metodami, ich struktury przeanalizowano i porównano za pomocą chromatografii wykluczania wielkości (SEC) dla rozkładu wielkości cząstek i elektroforezy kapilarnej wspomaganej fluoroforem (FACE) dla liniowego rozkładu długości łańcucha. Analiza potwierdziła, że glikogen wyekstrahowany za pomocą SDGU-CW miał minimalną degradację.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Glikogen to wysoce rozgałęziony polisacharyd, który składa się z reszt glukozylowych, a także niewielkiej, ale znaczącej ilości białek, w której wszystkie reszty glukozylowe są połączone ze sobą wiązaniami α-1,4-glikozydowymi w łańcuchach liniowych i wiązaniami α-1,6-glikozydowymi w punktach rozgałęzień1. Struktura cząstek glikogenu jest ogólnie podzielona na trzy hierarchie: 1) oligomery o krótkich łańcuchach, 2) kuliste cząstki β (o średnicy ~20 nm) oraz 3) duże cząstki α w kształcie rozety agregowane razem przez cząstki β, których średnica waha się w przybliżeniu do 300 nm. Ostatnio stwierdzono, że cząstki α glikogenu mają u eukariontów dwa stany strukturalne, tj. stan kruchy i stan stabilny. W tym przypadku kruchość oznacza dysocjację większych cząstek α na mniejsze cząstki β w obecności czynnika chaotropowego, takiego jak DMSO2. Dalsze analizy wykazały, że cząsteczki α glikogenu w wątrobie chorego na cukrzycę są konsekwentnie kruche3, a kruche cząstki α ulegają degradacji znacznie szybciej niż stabilne cząstki α4. Tak więc kruchość strukturalna glikogenu może nasilać stany hiperglikemiczne w cukrzycy2,4, co sprawia, że krucha cząstka α jest potencjalnym patologicznym biomarkerem cukrzycy na poziomie molekularnym. Jednak istnienie cząstek α glikogenu u prokariontów jest zgłaszane tylko sporadycznie5 i nie ma doniesień o dwóch różnych stanach strukturalnych cząstek α glikogenu u bakterii.

Aby zrozumieć fizjologiczne funkcje bakteryjnych cząsteczek glikogenu, konieczne jest określenie drobnej struktury cząsteczek glikogenu, co wymaga izolacji glikogenu z maksymalną wydajnością i minimalną degradacją1. Do tej pory opracowano różne techniki ekstrakcji glikogenu, w tym między innymi ekstrakcję gorącą wodą, ekstrakcję kwasem trichlorooctowym (TCA) i ekstrakcję gorącymi alkaliami (wodorotlenek potasu, KOH) 6. Ponadto inna metoda, która jest powszechnie stosowana do izolacji glikogenu eukariotycznego, metoda ultrawirowania gradientu gęstości cukru (SDGU), została również opisana do izolacji glikogenu bakteryjnego w Selenomonas ruminantium i Fibrobacter succinogenes7,8. Chociaż zalety i wady tych metod były szeroko dyskutowane w badaniach eukariotycznych9,10, rzadko prowadzi się badania porównawcze drobnych struktur glikogenu wyizolowanych różnymi metodami ekstrakcji u bakterii z perspektywy struktur cząstek glikogenu.

W tym badaniu, ten problem został rozwiązany poprzez użycie Escherichia coli BL21(DE3) jako organizmu modelowego. Porównano łącznie cztery metody ekstrakcji glikogenu, a mianowicie: ekstrakcję gorącą wodą wytrąconą TCA (TCA-HW), ekstrakcję zimną wodą wytrąconą TCA (TCA-CW), ekstrakcję gorącym roztworem 30% KOH (KOH-HW) oraz ekstrakcję zimną wodą przy użyciu ultrawirowania w gradionym gradieniu gęstości sacharozy (SDGU-CW). Rozkład wielkości cząstek glikogenu mierzono następnie za pomocą chromatografii wykluczania wielkości (SEC), podczas gdy rozkład długości łańcucha wykrywano za pomocą elektroforezy węglowodanowej wspomaganej fluoroforem (FACE), które wykorzystano do oceny jakości metod ekstrakcji. Ponadto porównano stabilność i kruchość cząstek α glikogenu bakteryjnego między różnymi metodami ekstrakcji, porównując rozkład wielkości cząstek przed i po traktowaniu powszechnie stosowanym środkiem chaotropowym, dimetylosulfotlenkiem (DMSO). Szczegółowe procedury ekstrakcji glikogenu i charakterystyki strukturalnej przedstawiono poniżej. Podsumowując, metoda SDGU-CW ma najlepszy ogólny efekt pod względem integralności strukturalnej glikogenu i dlatego jest zalecana do ekstrakcji glikogenu bakteryjnego w przyszłych odpowiednich badaniach.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla i zbieranie bakterii

  1. Reanimować E. coli BL21(DE3) z bakteryjnego glicerolu (-80 °C) poprzez inokulację sterylnej płytki agarowej LB (10 g / l tryptonu, 5 g / l ekstraktu drożdżowego, 10 g / l NaCl i 15 g / l agar). Umieść płytkę w standardowym inkubatorze i uprawiaj przez noc w temperaturze 37 °C.
  2. Weź pojedynczą kolonię i zaszczep ją w 10 ml sterylnego płynnego podłoża LB (10 g / l tryptonu, 5 g / l ekstraktu drożdżowego i 10 g / l NaCl). Dobrze wymieszać przez wirowanie i hodowlę przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 220 obr./min.
    UWAGA: O ile nie określono inaczej, wszystkie warunki hodowli płynnej wynosiły 37 °C przy szybkości wstrząsania 220 obr./min.
  3. Przenieś 1 ml nocnej kultury E. coli do 100 ml sterylnej płynnej pożywki LB i hoduj przez 5 godzin. Przenieś 50 ml do 1 l 1x M9 minimalnej pożywki (3 g/L KH2PO4, 0,5 g/L NaCl, 6,78 g/L Na2HPO4 i 1 g/L NH4Cl) zawierającej 0,8% D-(+)-glukozy. Dobrze wymieszaj i hoduj przez 20 godz.
    UWAGA: 1x M9 minimalna pożywka i glukoza zostały wysterylizowane oddzielnie, a następnie zmieszane podczas aseptycznego schładzania do temperatury pokojowej.
  4. Po hodowli przez 20 godzin, odwirować roztwór bakteryjny o stężeniu 6 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant. Przechowuj granulat komórkowy w temperaturze -80 °C przez noc, a następnie liofilizuj go.
  5. Zamknij i przechowuj liofilizowany proszek bakteryjny w lodówce (-20 °C) do późniejszego użycia.

2. Ekstrakcja glikogenu

  1. Ekstrakcja gorącą wodą wytrąconą kwasem trichlorooctowym (TCA-HW)
    1. Dokładnie odważ 500 mg liofilizowanego proszku E. coli BL21 (DE3) i zawieś go ponownie w 20 ml lodowatego buforu 0,05 M trietanoloaminy (TEA). Użyj ultradźwiękowej kruszarki do komórek (25% energii, 4 °C), aby rozbić komórki bakteryjne przez 3 minuty (30 sekund cykli roboczych i 2 sekundy). Upewnij się, że w roztworze nie ma widocznych osadów.
      UWAGA: Rozbijanie komórek przeprowadzono na lodzie. Dostosuj pH buforu do herbaty do pH 7 przez dodanie HCl i przechowuj w temperaturze pokojowej.
    2. Przenieś cały homogenat bakteryjny do dwóch probówek ultrawirówek o pojemności 10,4 ml (10 ml / probówkę). Napełnij probówki wodą dejonizowaną do góry i odwiruj przy 104 000 x g w ultrawirówce w temperaturze 4 °C przez 90 minut. Odrzucić supernatant.
    3. Dodaj 2 ml wody dejonizowanej, aby ponownie zawiesić osad w każdej probówce. Przenieść zawiesinę do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i dodać wodę dejonizowaną do końcowej objętości 20 ml. Podgrzej i gotuj przez 5 minut, aby denaturować wszystkie białka.
    4. Odwirować zawiesinę przez 10 minut przy 18 000 x g i zachować supernatant (S1). Osad należy traktować w taki sam sposób, jak w kroku 2.1.3. Połącz nowy supernatant (S2) z S1.
    5. Dodać 50% TCA (0,1 objętości) do supernatantu (S1+S2) i umieścić mieszaninę na lodzie na 10 minut, aby wytrącić makrocząsteczki, takie jak DNA, RNA, białka itp. Odwirować mieszaninę przy 18 000 x g przez 10 minut i wymieszać supernatant z 1,5 objętości absolutnego etanolu.
      UWAGA: Stężenie TCA wynosi 50% v/v. Do przechowywania trzymaj go z dala od światła.
    6. Wytrącać glikogen na lodzie przez 20 minut i odwirowywać przy 18 000 x g przez 10 minut. Wylać supernatant.
    7. Rozpuść osad w 5 ml ddH2O, a następnie dodaj 5 ml lodowatego absolutnego etanolu. Inkubować roztwór przez noc w temperaturze 4 °C i odwirowywać przy 18 000 x g przez 10 minut. Odrzucić supernatant i zachować osad.
    8. Powtórz kroki "mycie i wytrącanie", jak w kroku 2.1.7, jeszcze dwa razy.
    9. Na koniec rozpuść wytrącony glikogen w 400 μl ddH2O w probówce o pojemności 2 ml, wstępnie zamrozić w temperaturze -80 °C i liofilizować w celu uzyskania suchego proszku glikogenowego.
  2. Ekstrakcja zimną wodą wytrąconą kwasem trichlorooctowym (TCA-CW)
    UWAGA: Metoda TCA-CW jest taka sama jak metoda TCA-HW, z wyjątkiem tego, że po odrzuceniu supernatantu poddaje się działaniu osadu bez gotowania (patrz krok 2.1.3) i ponownie zawiesza go w 20 ml ddH2O zawierającym 1 mg/ml koktajlu inhibitorów proteazy.
    1. Aby przygotować roztwór koktajlowy inhibitora proteazy o stężeniu 1 mg/ml, należy rozpuścić 50 mg koktajlu inhibitora proteazy w 1 ml wody dejonizowanej i rozcieńczyć w stosunku 50:1 (woda dejonizowana: roztwór koktajlu inhibitora proteazy).
  3. Ekstrakcja zimną wodą za pomocą ultrawirowania w gradieniu gęstości sacharozy (SDGU-CW)
    1. Rozpuścić i homogenizować 1 g liofilizowanego proszku E. coli w 4 ml buforu do ekstrakcji glikogenu (GEB) za pomocą koktajlu inhibitorów proteazy o stężeniu 1 mg/ml.
      UWAGA: GEB składa się z 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM NaF i 5 mM pirofosforanu sodu. GEB należy dostosować do pH 8 za pomocą HCl.
    2. Użyj ultradźwiękowej kruszarki do komórek (25% energii, 4 °C), aby rozbić komórki bakteryjne przez 3 minuty (8 s cykli roboczych i 9 s interwałów). Upewnij się, że cały proces odbywa się na lodzie. Po sonifikacji przenieś homogenat bakteryjny do probówki wirówkowej, napełnij go GEB do końcowej objętości 10 ml i zmieszaj probówkę do mieszania.
      UWAGA: Nie homogenizować przez zbyt długi czas, ponieważ wytwarzane ciepło może powodować degradację glikogenu.
    3. Wirować przy 6 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do probówki ultrawirówki o pojemności 10,4 ml, napełnić probówkę do góry GEB, a następnie odwirować przy 360 000 x g przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Upewnij się, że rurka jest napełniona i nie ma pęcherzyków powietrza.
    4. Po odwirowaniu odrzucić sklarowany osad i ponownie zawiesić osad w 2 ml wody dejonizowanej.
    5. W nowej probówce do ultrawirówki powoli ułóż 4 ml 75% roztworu sacharozy z 4 ml 37,5% roztworu sacharozy. Następnie, zawiesinę otrzymaną w kroku 2.3.4 nałożyć na roztwór sacharozy i uzupełnić wodą dejonizowaną (patrz Rysunek 1).
      UWAGA: Stężenie sacharozy wynosi 75% [v/v] i 37,5% [v/v]. Zachowaj ostrożność podczas wykonywania gradientu gęstości sacharozy i upewnij się, że między dwoma roztworami sacharozy znajduje się obserwowalna warstwa. Upewnij się również, że w probówce ultrawirówki nie ma pęcherzyków powietrza.
    6. Wirować przy 360 000 x g przez 2,5 godziny w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Rozpuść osad w 200 μl wody dejonizowanej. Dodać 800 μl bezwzględnego etanolu do wytrącania glikogenu.
    7. Wytrącić glikogen w temperaturze -20 °C przez noc. Wirować przy 4 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
    8. Powstały osad rozpuścić w 400 μl ddH2O w probówce o pojemności 2 ml, wstępnie zamrozić w temperaturze -80 °C i liofilizować w celu uzyskania suchego proszku glikogenu. Suchy glikogen w proszku należy zachować w temperaturze 4 °C do analizy strukturalnej.
      UWAGA: Szczegółowa procedura jest zilustrowana w Rysunek 1.
  4. Ekstrakcja gorącym 30% roztworem wodorotlenku potasu (KOH-HW)
    1. Gotować liofilizowany proszek E. coli (50 mg) w 1 ml 30% [w/v] KOH przez 1 godzinę.
    2. Dodać 67% [v/v] etanolu zawierającego 15 mM LiCl do wytrącania w temperaturze -20 °C przez co najmniej 1 godzinę. Odwirować próbki w temperaturze 16 000 x g w temperaturze 4 °C przez 20 min.
      UWAGA: 67% [v/v] etanol z 15 mM LiCl zawiera 0,6358 g LiCl, 67 ml absolutnego etanolu i 33 ml wody dejonizowanej.
    3. Ponownie rozpuścić granulki w 1 ml ddH2O i podgrzewać przez 10 minut w temperaturze 95 °C z przerywanym mieszaniem.
    4. Powtórzyć etap wytrącania etanolu jeszcze trzy razy, jak opisano w kroku 2.4.2. Ponownie rozpuścić końcowe osadki w 400 μl ddH2O w probówce o pojemności 2 ml, wstępnie zamrozić w temperaturze -80 °C i liofilizować w celu uzyskania suchego proszku glikogenu.

3. Oznaczanie struktury glikogenu

  1. Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM)
    1. Zawiesić glikogen w proszku w 50 mM soli fizjologicznej buforowanej trisem (pH 7) o końcowym stężeniu 1 mg/ml.
    2. Zawiesinę rozcieńczyć 10-krotnie i nałożyć rozcieńczoną zawiesinę na siatkę miedzianą o siatce jarzeniowej o oczkach 400.
    3. Po 2 minutach pobrać nadmiar próbki z siatki za pomocą bibuły filtracyjnej i zabarwić siatkę 2-3 kroplami 1% octanu uranylu.
    4. Do zbadania preparatów należy użyć transmisyjnego mikroskopu elektronowego pracującego pod napięciem 75 kV.
  2. Chromatografia wykluczająca wielkość (SEC)
    1. Przygotowanie fazy ruchomej: przygotować 0,02% (w/w) roztwory azydku sodu i 50 mM azotanu sodu w wodzie dejonizowanej i przefiltrować przez membranę filtracyjną 0,45 μm. Użyj ultradźwiękowej oscylacyjnej łaźni wodnej, aby sonikować roztwór przez ponad 15 minut w celu usunięcia pęcherzyków powietrza.
    2. Przygotowanie próbki: Za pomocą fazy ruchomej rozpuścić glikogen w proszku tak, aby końcowe stężenie wynosiło 1 mg/ml. Roztwór inkubować w temperaturze 80 °C przez noc w termomikserze. Odwirować rozpuszczoną próbkę o masie 6 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej i przenieść supernatant do standardowej fiolki SEC.
    3. Przygotowanie próbek glikogenu poddanych działaniu DMSO
      1. Rozpuścić 1 mg glikogenu w proszku w 300 μl DMSO i inkubować w temperaturze 80 °C przez noc w termomikserze. Dodaj 4x objętość etanolu, aby wytrącić glikogen i odwirować roztwór przy 6,000 x g.
      2. Umyć osad dwukrotnie etanolem, rozpuścić osad w ddH2O i liofilizować.
      3. Przeanalizować liofilizowany glikogen w proszku za pomocą SEC, przygotowując próbki w sposób opisany powyżej.
    4. Użyj systemu SEC z kolumnami wstępnymi oraz kolumnami 1000 i 10000 do analizy rozkładu wielkości cząstek glikogenu. Utrzymuj kolumny w temperaturze 80 °C, a natężenie przepływu na poziomie 0,3 ml/min.
  3. Elektroforeza węglowodanowa wspomagana fluoroforem (FACE)
    1. Rozgałęzianie glikogenu
      UWAGA: W przypadku stosowania FACE do wykrywania rozkładu długości łańcucha (CLD), wszystkie próbki, które mają być badane, muszą zostać poddane wstępnej obróbce rozgałęzienia.
      1. Do >3, 3,5 μl izoamylazy (200 U/ml) i 8 μl buforu kwasu octowego i octanu sodu (pH 3,5). UWAGA: Izoamylaza jest dodawana w celu specyficznego przecięcia rozgałęzionego łańcucha badanej próbki. Izoamylaza jest enzymem rozgałęziającym, który może specyficznie niszczyć wiązanie α-(1-6) bez niszczenia wiązania α-(1-4), dzięki czemu może specyficznie rozszczepiać łańcuch boczny glikogenu bez niszczenia struktury łańcucha głównego.
      2. Inkubować mieszaninę w temperaturze 37 °C przez 3 godziny w termomikserze. Po osiągnięciu neutralnego pH za pomocą 8 μl 0,1 M roztworu NaOH, mieszaninę inkubować w temperaturze 80 °C przez 1 godzinę w termomikserze.
      3. Dodaj 4x objętość bezwzględnego etanolu do mieszaniny, aby wytrącić glikogen. Następnie odwirować przy 6 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Umyj osad dwukrotnie etanolem, rozpuść osad w ddH2O i liofilizuj.
    2. Przygotowanie roztworu fluorescencyjnego
      1. Odwirować butelkę z odczynnikiem APTS (sól trisodowa kwasu 8-aminopireno-1,3,6-trisulfonowego) (każda butelka zawiera 5 mg APTS) przy 4 000 x g przez 2 minuty. Dodać 50 μl 15% roztworu kwasu octowego w celu rozpuszczenia proszku, dobrze wymieszać i odwirować przy 4 000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, aby otrzymać 0,2 M APTS roztwór kwasu octowego.
        UWAGA: Roztwór APTS należy przechowywać w lodówce w temperaturze -20 °C.It należy całkowicie zużyć w ciągu dwóch tygodni od otwarcia. W przeciwnym razie zostanie dezaktywowany. APTS jest powszechnie stosowanym ujemnie naładowanym barwnikiem, który wiąże się z redukującym końcem łańcucha glikogenu. Ponieważ wszystkie łańcuchy o różnym stopniu polimeryzacji (DP) przenoszą tylko jeden ładunek ujemny, FACE może je rozdzielić na podstawie ich różnych stosunków masy do ładunku. W ten sposób sygnały o różnych wartościach DP są wykrywane przez detektor fluorescencyjny.
    3. Przenieść rozgałęziony glikogen do probówki i dodać 1,5 μl roztworu APTS i 1,5 μl roztworu cyjanoborowodorku sodu. Inkubować w temperaturze 60 °C przez 1,5 godziny w ciemności. Dodać 80 μl wody dejonizowanej, odwirować przy 4 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej i zachować supernatant.
    4. Wprowadzić próbkę do systemu elektroforezy kapilarnej, wstrzykując przez 3 s przy 0,5 psi (3,4 kPa powyżej ciśnienia atmosferycznego).
      UWAGA: Znakowane fluorescencyjnie liniowe glukany zostały rozdzielone poprzez przyłożenie napięcia 30 kV i przybliżonego prądu 14 mA w temperaturze 25 °C. Obszary pików dały względne ilości glukanów o różnych masach (stopień polimeryzacji (DP) glukanów w sąsiednich pikach różnił się o 1 DP). Temperaturę próbki utrzymywano na poziomie 18 °C.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozkład wielkości cząsteczek glikogenu
Seria badań wykazała, że cząsteczki α glikogenu w wątrobie chorego na cukrzycę są kruche i łatwo rozpadają się w substancji zaburzającej wiązania wodorowe DMSO11,12,13,14. W niniejszym badaniu sprawdzono, jak zmieniła się wielkość cząstek i stabilność strukturalna glikogenu bakteryjnego ekstrahowanego czterema różnymi metodami. Wszystk...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Glikogen jest ważną rezerwą energii, która została zidentyfikowana u wielu bakterii16. Aby przeanalizować fizjologiczne funkcje cząsteczek glikogenu, konieczne jest lepsze zrozumienie drobnej struktury cząsteczek glikogenu. Do tej pory opracowano różne metody ekstrakcji glikogenu z hodowli bakteryjnej. Zaobserwowano jednak różne rozkłady wielkości cząstek glikogenu przy różnych metodach ekstrakcji, co sugeruje uszkodzoną strukturę glikogenu. W związku z tym konieczne jest porównanie i standaryzacj...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jesteśmy niezmiernie wdzięczni profesorowi Robertowi G. Gilbertowi z University of Queensland i Yangzhou University, który dostarczył spostrzeżeń i ekspertyzy, które znacznie pomogły w ukończeniu tego badania. Wyrażamy uznanie dla wsparcia finansowego ze strony Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (nr 31900022, nr 32171281), Fundacji Nauk Przyrodniczych prowincji Jiangsu (nr BK20180997), Zespół Młodych Innowacji Naukowych i Technologicznych Uniwersytetu Medycznego Xuzhou (nr TD202001) oraz Jiangsu Qinglan Project (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
Agilent 1260 infinity SEC systemAgilent1260 infinity IIRozkład wielkości cząstek
Kolumnaanalityczna PSS10-1000-Wirówka
Eppendorf5420-Membrana
filtracyjnaCambioKm-0220-
System elektroforezy kapilarnej wspomagany fluorescencjąRozkład długości łańcuchaBeckman Coulter-Chain
LiofilizatorXinzhiSCIENTZ-10NLiofilizacja bakterii i glikogenu
ZamrażarkaThermo FisherForma 900Przechowywanie próbek
Kolumnaochronna PSSSUPPERMA-Inkubator
Thermo FisherPR505750R-CN-
Wolnoobrotowa wirówka o dużej pojemnościHexiHR/T20MMWirowanie próbek
Czytnik mikropłytek Multiskan FCUltrawirówka Thermo Fisher
1410101-Optima XPNBeckmanXPN-100/90/80Do
oscylatoraXinbaoSHZ-82-PA-800
Plus SystemBeckman CoulterA66528-pH-metr
Mettler ToledoFE28 -TRIS-Detektor
indeksu refrakcjiWyattOptilab T-rEX-Lodówka
HaierBCD-406WDPD-Thermomixer
Szanghaj JingxinJXH-100Inkubacja próbki
Transmisyjny mikroskop elektronowyHitachi CorporationH-7000Morfologia cząstek glikogenu
Rurka ultrawirówkowaBeckman355651-Ultradźwiękowa
kruszarka do komórekNingbo XinzhiScientz-IID  Zakłócacz bakterii
Ultradźwiękowa oscylacyjna kąpiel wodnaJietuoJT-1027HTD-Mieszalnik
VortexSystem wodny TiangenOSE-VX-01-System
wodnyMerck MilliporeH2O-MM-UV-TWoda dejonizowana
Materiał
8-aminopiren-1,3,6-trisulfonowy Kwas trisodowy Sól trisodowaSigma-Aldrich196504-57-1-Absolutny
etanolGuoyao
10009228-Agar w proszkuSolarbioA1890-Alfa-amylaza
MegazymeE-BLAAM-40ML-Amyloglucozydaza
MegazymeE-AMGDF-40ML-cOmplete
MiniRoche4693159001-D
- (+)ZestawSigma-AldrichG8270-1kg-D
-(format GOPOD)MegazymeK-GLUC K-GLUCKlingoligacja ilościowa
Dimetylosulfotlenek VicmedVic147Środek chaotropowy
E. coli BL21(DE3)TiangenCB105-02-Kwas
etylenodiaminotetraoctowyVicmed Vic1488-
Lodowaty kwas octowyGuoyao10000218-Glycerol
Guoyao10010618Magazynowanie bakterii
Kwas solnyGuoyao
10011008-hydroksymetyloaminometanSigma-AldrichV900483-500g-Izoamylaza
MegaZyme9067-73-6Rozgałęzienie glikogenu
Chlorek lituSigma-Aldrich62476-100g-M9
, Sole minimalne, 5 razy;Sigma-AldrichM6030-1kgKultura bakteryjna
Wodorotlenek potasuGuoyao
10017008-Pullulan standardPSS--
Trójwodny octan soduGuoyao10018718-Sodium
azydekSigma-Aldrich26628-22-8-Chlorek
soduGuoyao10019318Bakteryjny kultura
Cyjanoborowodorek soduHuaweiruikehws001297-Difosforan
soduSigma-Aldrich71515-250g-Fluorek
soduMacklin S817988-250g-Wodorotlenek
soduGuoyao10019762-Azotan
soduGuoyao
10019928-pirofosforan soduSigma-AldrichV900195-500g-sacharoza
Guoyao10021463-kwas
trichlorooctowyGuoyao
40091961-tryptonOxoidLP0042Kultura bakteryjna
EkstraktOxoidLP0021Kultura bakteryjna
glikogenu do oznaczania glukozy drożdżowy

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, L., et al. Molecular structure of glycogen in Escherichia coli. Biomacromolecules. 20 (7), 2821-2829 (2019).
  2. Deng, B., et al. Molecular structure of glycogen in diabetic liver. Glycoconjugate Journal. 32 (3-4), 113-118 (2015).
  3. Hu, Z., et al. Diurnal changes of glycogen molecular structure in healthy and diabetic mice. Carbohydrate Polymers. 185, 145-152 (2018).
  4. Nawaz, A., Zhang, P., Li, E., Gilbert, R. G., Sullivan, M. A. The importance of glycogen molecular structure for blood glucose control. iScience. 24 (1), 101953(2021).
  5. Rashid, A. M., et al. Assembly of α-glucan by GlgE and GlgB in mycobacteria and streptomycetes. Biochemistry. 55 (23), 3270-3284 (2016).
  6. Wang, L., et al. Recent progress in the structure of glycogen serving as a durable energy reserve in bacteria. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 36 (1), 14(2020).
  7. Kamio, Y., Terawaki, Y., Nakajima, T., Matsuda, K. Structure of glycogen produced by Selenomonas ruminantium. Agricultural and Biological Chemistry. 45 (1), 209-216 (1981).
  8. Gong, J., Forsberg, C. W. Separation of outer and cytoplasmic membranes of Fibrobacter succinogenes and membrane and glycogen granule locations of glycanases and cellobiase. Journal of Bacteriology. 175 (21), 6810-6821 (1993).
  9. Mojibi, N. Comparison of methods to assay liver glycogen fractions: the effects of starvation. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 11 (3), (2017).
  10. Orrell, S. A., Bueding, E. A comparison of products obtained by various procedures used for the extraction of glycogen. The Journal of Biological Chemistry. 239, 4021-4026 (1964).
  11. Tan, X., et al. Proteomic investigation of the binding agent between liver glycogen beta particles. ACS Omega. 3 (4), 3640-3645 (2018).
  12. Hu, Z., et al. Diurnal changes of glycogen molecular structure in healthy and diabetic mice. Carbohydrate Polymers. 185, 145-152 (2018).
  13. Sullivan, M. A., Harcourt, B. E., Xu, P., Forbes, J. M., Gilbert, R. G. Impairment of liver glycogen storage in the db/db animal model of type 2 diabetes: a potential target for future therapeutics. Current Drug Targets. 16 (10), 1088-1093 (2015).
  14. Deng, B., et al. Molecular structure of glycogen in diabetic liver. Glycoconjugate Journal. 32 (3-4), 113-118 (2015).
  15. Sullivan, M. A., et al. Molecular structural differences between type-2-diabetic and healthy glycogen. Biomacromolecules. 12 (6), 1983-1986 (2011).
  16. Wang, L., et al. Systematic analysis of metabolic pathway distributions of bacterial energy reserves. G3 Genes|Genomes|Genetics. 9 (8), 2489-2496 (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Glycogen ExtractionBacterial GlycogenMolecular Structure CharacterizationCold Water PrecipitationSugar Density GradientUltracentrifugationEscherichia ColiSize Exclusion ChromatographyCapillary ElectrophoresisGlycogen Particle Isolation
Video Coming Soon

Related Articles