Artykuł metodologiczny

Izolacja wysepek dorosłych świń

DOI:

10.3791/63017

⸱

21 października 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Hepatopancreatobiliary Surgery, Shenzhen Institute of Translational Medicine, The First Affiliated Hospital of Shenzhen University, Shenzhen Second People's Hospital, 2Shenzhen Xenotransplantation Medical Engineering Research and Development Center, Shenzhen Institute of Translational Medicine, First Affiliated Hospital of Shenzhen University, Shenzhen Second People's Hospital, 3Imaging Department, Shenzhen Institute of Translational Medicine, The First Affiliated Hospital of Shenzhen University, Shenzhen Second People's Hospital, 4Faculty of Science, University of Waterloo, 5School of Life Science, The Chinese University of Hong Kong, 6General Surgery, The First Affiliated Hospital of Shantou University Medical College, 7Director Islet Programs, Imagine Pharma

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten szczegółowy protokół obejmuje metodologiczne etapy izolacji dorosłych wysepek trzustkowych od fazy trawienia poprzez oczyszczanie do końcowej oceny funkcjonalnej wysp. Zarys ten może być wykorzystany jako wytyczne do izolacji dorosłych wysepek trzustkowych w instytucjach badawczych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cukrzyca typu 1 (T1DM) jest spowodowana autoimmunologicznym niszczeniem komórek β trzustki, co skutkuje niewielką lub żadną produkcją insuliny. Przeszczep wysp trzustkowych odgrywa ważną rolę w leczeniu cukrzycy typu 1, z poprawą kontroli glikometabolicznej, zmniejszeniem progresji powikłań, zmniejszeniem epizodów hipoglikemii w porównaniu z tradycyjną insulinoterapią. Wyniki badania klinicznego III fazy wykazały również bezpieczeństwo i skuteczność allotransplantacji wysp trzustkowych w cukrzycy typu 1. Jednak niedobór dawców trzustki ogranicza jego powszechne stosowanie. Zwierzęta jako źródło wysepek, takie jak świnia, stanowią alternatywny wybór. Ponieważ architektura trzustki świni różni się od wysepek myszy lub ludzi, procedura izolacji wysepek trzustkowych świni jest nadal trudna. Ponieważ przełożenie alternatywnych źródeł wysepek trzustkowych świń (ksenogenicznych) na warunki kliniczne w leczeniu cukrzycy typu 1 poprzez przeszczep komórkowy ma ogromne znaczenie, pilnie potrzebny jest opłacalny, ustandaryzowany i powtarzalny protokół izolowania wysp trzustkowych świń. W tym manuskrypcie opisano uproszczoną i opłacalną metodę izolowania i oczyszczania dorosłych wysepek trzody trzodowej świń w oparciu o poprzednie protokoły, w których z powodzeniem przeszczepiono wysepki świńskie naczelnym innym niż ludzie. Będzie to przewodnik dla początkujących bez użycia specjalistycznego sprzętu, takiego jak procesor komórkowy COBE 2991.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cukrzyca typu 1 (T1DM) jest poważną chorobą, w której autoimmunologiczne niszczenie komórek beta powoduje niewielką lub żadną produkcję insuliny1,2,3. Znaczna grupa pacjentów z cukrzycą typu 1 nie jest w stanie ustabilizować labilności glikemii za pomocą insulinoterapii i doświadcza zagrażających życiu epizodów hipoglikemii. Przeszczep wysp trzustkowych, jeśli się powiedzie, może to osiągnąć. Ponad 1500 pacjentów z cukrzycą przeszło udany przeszczep wysp trzustkowych na całym świecie, wykazując niższe ryzyko, ale długoterminowy sukces niż przeszczep trzustki4.

W porównaniu z insulinoterapią, przeszczep wysp trzustkowych przynosi lepsze wyniki w zmniejszaniu postępu powikłań5. Wyniki badania klinicznego III fazy wykazały również bezpieczeństwo i skuteczność allotransplantacji wysp trzustkowych w T1DM6,7. Przeszczep wysp trzustkowych może być najlepszą dostępną obecnie opcją terapeutyczną dla pacjentów z cukrzycą typu 1, którzy doświadczają zagrażających życiu epizodów hipoglikemii.

Jednak niedobór ludzkich wysepek allogenicznych ogranicza powszechne stosowanie przeszczepiania wysp trzustkowych8,9. W związku z tym pożądane jest użycie wysepek zwierzęcych jako zamiennika10. Świnia została wybrana jako dawca komórek wysp trzustkowych w przedklinicznej ksenotransplantacji i ma potencjalną zdolność do przełożenia na potrzeby kliniczne ze względu na 1) dostępność, 2) podobieństwa metaboliczne z ludźmi, 3) dość dużą masę komórek beta oraz 4) możliwość inżynierii genetycznej w celu poprawy zgodności immunologicznej z ludźmi11.

Wysoka czystość i żywotność wysp trzustkowych są kluczowymi krokami dla powodzenia ksenotransplantacji. Jednak procedura izolowania wysepek trzustkowych od dorosłych dawców świń jest trudna ze względu na architekturę samej trzustki, która różni się od wysepek myszy lub ludzi12. Ogólnie rzecz biorąc, kształt wysp trzustkowych świń nie jest zwarty12. W porównaniu z ludzkimi i gryzoniowymi wyspami trzustkowymi, wysepki świń łatwiej się dysocjują12. Jednak spontaniczna dysocjacja zewnętrznej warstwy komórek wysp trzustkowych, której towarzyszy długi czas hodowli, prowadzi do znacznego zmniejszenia wielkości wysp trzustkowych10.

Podczas procesu izolacji wysepek, wiele czynników wpływa na jakość wysepek, takich jak wiek dawcy, czas ciepłego niedokrwienia, aktywność enzymatyczna, rozdęcie przez iniekcję enzymatyczną13,14. Chociaż wiele wcześniejszych badań zawierało metody izolacji wysepek świń, nie ma szczegółowego protokołu wideo krok po kroku dla badaczy, który byłby skuteczną instrukcją10,15,16,17,18,19,20,21,22,23.

W tym celu, ten szczegółowy protokół obejmuje wszystkie etapy izolacji, od pobrania narządów do oceny funkcjonalnej wysp po izolacji, mając nadzieję zaoferować prosty i zrozumiały przegląd procesu dla łatwego zastosowania. Protokół ten bazuje na wcześniej opublikowanych metodach z modyfikacjami10,11.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury z udziałem zwierząt są zatwierdzane przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Drugiego Szpitala Ludowego w Shenzhen i przestrzegają wszystkich przepisów krajowych. W protokole tym jako dawcy trzustki wykorzystano świnie Duroc-Landrace-Yorkshire (w wieku ~6 miesięcy) zakupione na rynku. Masa pobranej trzustki wynosiła 123,63 g ± 22,50 g. Podczas eksperymentów noszone są środki ochrony osobistej, w tym odzież ochronna, maski, rękawiczki i czepki.

1. Przygotowanie mediów

  1. Podłoże czyszczące: Aby przygotować 100 ml środka czyszczącego, wymieszaj zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS), 2% surowicę wieprzową, 20 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES) i 1% penicyliny-streptomycyny (P/S).
  2. Pożywka zbierająca: Wymieszaj RPMI 1640 z 5% surowicą wieprzową i 1% penicyliny-streptomycyny (P/S).
  3. Pożywka hodowlana: Wymieszaj CMRL 1066 z 10% surowicą wieprzową, 10 mmol/L nikotynamidu, 1% P/S i 2 mmol/L L-glutaminy.
  4. Roztwór enzymatyczny: Przygotować 1 mg/ml roztworu kolagenazy typu V (aktywność: 918 jednostek/mg substancji stałej) w HBSS.
  5. Roztwór o niskim stężeniu glukozy: Aby przygotować roztwór o niskim stężeniu glukozy, dodaj 0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 2,8 mM D-glukozy do 1 ml buforu wodorowęglanowego Ringera (KRBB) Kreba.
  6. Roztwór o wysokim stężeniu glukozy: Aby przygotować roztwór o wysokim stężeniu glukozy, dodaj 0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 28 mM D-glukozy do 1 ml buforu wodorowęglanowego Ringera (KRBB) Kreba.

2. Pobieranie trzustki

  1. Znieczulenie świń i przygotowanie skóry
    1. Znieczulić świnię dawcę za pomocą domięśniowego wstrzyknięcia środków znieczulających Lumianning (2,5-5 mg/kg) i Propofolu (2-3 mg/kg) (szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli Materiałów).
    2. Utrzymuj znieczulenie za pomocą 1%-3% izofluranu w objętości wentylacyjnej 1-1,5 l/min za pomocą masek do znieczulenia gazowego.
    3. Monitoruj tętno, aby potwierdzić prawidłowe znieczulenie. Używaj maści weterynaryjnej na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
    4. Ogolić brzuch, oczyścić go jodoforem i odpowiednio przykryć świnię sterylną serwetą chirurgiczną.
  2. Otwieranie brzucha
    1. Po zapewnieniu sterylnych warunków należy wykonać nacięcie laparotomii w linii środkowej od mieczykowatej kości mieczykowatej do pępka nieco w pobliżu ogona.
    2. Naciąć membranę.
    3. Odizolować aortę nadwątrobową i żyłę główną nadwątrobową dolną (IVC) za pomocą kleszczy naczyniowych, a następnie wyizolować aortę podnerkową i IVC podwątrobową tą samą metodą.
    4. Podawać świni dożylnie heparynę (100 j./kg), aby zapobiec krzepnięciu krwi.
    5. Zewnętrznij jelito cienkie i grube i popchnij wątrobę i żołądek w kierunku głowy, aby w pełni odsłonić trzustkę.
  3. Perfuzja trzustki
    1. Zacisnąć aortę nad przeponą za pomocą kleszczyków naczyniowych, zaintubować aortę powyżej gałęzi aorty nerkowej przez kaniulę aorty (16 G) i zawiązać nicią szwową 2-0.
    2. Podać zwierzęciu 2-3 litry zimnego roztworu HBSS (uprzednio zapakowanego i utrzymywanego w temperaturze 4 °C) przez kaniulę aortalną (16 G). Wlej roztwór HBSS przez kaniulę aorty grawitacyjnie, podczas gdy IVC nadwątrobowy i IVC są transektowane w celu uwolnienia płynu perfuzyjnego.
      UWAGA: Kontynuuj infuzję, aż odpływ IVC będzie czysty.
  4. Wycięcie trzustki
    1. Oderwij sieć słoninę, znajdź płaty trzustki i śledziony wraz ze śledzioną i oddziel je.
    2. Oddziel połączony płat trzustki od sąsiedniej tkanki.
    3. Znajdź główny przewód trzustkowy w zstępującej części dwunastnicy. Podwiązać przewód żółciowy szwem (2-0) i przeciąć go nożyczkami w pobliżu przewodu trzustkowego.
    4. Zacisnąć odcinek dwunastnicy zawierający bańkę Vatera po obu stronach głowy trzustki za pomocą kleszczy naczyniowych, a następnie wyciąć dwunastnicę nożyczkami.
    5. Wyjmij całą trzustkę, zanurz ją w zimnym HBSS i natychmiast przetransportuj do izolatorium wysp trzustkowych.
      UWAGA: Świnie poddano eutanazji przy użyciu pentobarbitalu sodu (100-200 mg/kg). Wlew doprzewodowy HBSS lub roztworu konserwującego może być stosowany do rozdęcia trzustki w miejscu pobrania narządu, jeśli trzustka jest pobierana w lokalnej rzeźni.

3. Przygotuj trzy komory bezpieczeństwa biologicznego do następujących eksperymentów

  1. Ustaw komorę bezpieczeństwa biologicznego #1 z miską nerkową, narzędziami chirurgicznymi i zlewkami do czyszczenia trzustki (sekcja 4, Rysunek 1A).
  2. Ustaw komorę bezpieczeństwa biologicznego #2 z łaźnią wodną, pompą perystaltyczną, stojakiem na rurkę z rurką recyrkulacyjną i komorą mineralizacyjną do trawienia wysp trzustkowych (sekcja 5, Rysunek 1B).
  3. Skonfiguruj komorę bezpieczeństwa biologicznego #3 z jednorazowymi filtrami i probówkami wirówkowymi do przygotowania enzymów, oczyszczania wysp trzustkowych i wykonania następujących kroków (sekcje 6-8, Rysunek 1C).

4. Czyszczenie trzustki

  1. Oczyść i zważ trzustkę.
    1. Opłucz trzustkę w 200 ml jodoforu przez 3 minuty w komorze bezpieczeństwa biologicznego #1. Opłucz trzustkę w 200 ml zimnego HBSS dwa razy po 2 minuty.
    2. Oczyszczoną trzustkę umieścić w misce nerkowej zawierającej 100 ml pożywki czyszczącej na lodzie.
    3. Trzymaj bańkę zaciśniętą, wytnij dwunastnicę. Oczyść trzustkę z zewnętrznego tłuszczu i tkanki łącznej.
    4. Zważ trzustkę.

5. Trawienie trzustki

  1. Napar z kolagenazy
    1. Wytnij przekrój jednej z pierścieniowych gałęzi trzustki i włóż angiocath 18 G (jeśli średnice kanałów są mniejsze, rozważ angiocath 20 G) do głównego przewodu trzustkowego i zszyj go na miejscu za pomocą plecionego jedwabnego szwu 2-0.
    2. Odetnij mostek tkankowy, który przechodzi przez płat łączący w pobliżu głowy trzustki i zaciśnij cewnik po stronie nacięcia w pobliżu głowy trzustki, aby zmniejszyć wyciek enzymu.
    3. Umieść wiele angiokatów, aby uzyskać lepszy wewnątrzprzewodowy wlew enzymów. W tym celu należy wprowadzić dodatkowe angiokaty (rozmiar 20-22 G) po przekroju narządu trzustki, aby odsłonić przewód.
    4. Zainstaluj rurociąg napełniający, w tym silikonową rurkę o długości 1 m (16 #) ze złączem Luer-lock. Środkowa część rurki jest osadzona w głowicy pompy perystaltycznej.
    5. Włącz pompę perystaltyczną, aby napełnić system rurek (rozmiar rurki 16 #) 300 ml 1 mg / ml, kolagenaza typu V (aktywność: 918 jednostek / mg) podgrzana do 24 °C i usuń pęcherzyki powietrza z rurociągu.
    6. Podłączyć rurkę perfuzyjną do angiocath i włączyć pompę perystaltyczną z szybkością 20 ml/min.
    7. Zatrzymaj perfuzję, gdy większość enzymu zostanie wstrzyknięta, a trzustka jest dobrze rozdęta (Rysunek 2B).
    8. Przeciąć przezroczystą galaretowatą tkankę, która tworzy się wokół trzustki podczas perfuzji.
      UWAGA: Ten krok jest bardzo ważny, ponieważ żel może zatkać filtr w komorze i utrudnić zebranie strawionej tkanki (Rysunek 2B).
    9. Usunąć angiokaty po infuzji.
  2. Trawienie tkankowe
    1. Podgrzej 1 l roztworu HBSS do temperatury 36 °C. Przygotuj wcześniej system mineralizacji składający się z komory mineralizacyjnej i przewodów połączonych w układ zamknięty i przenieś wężownicę grzewczą obwodu do łaźni wodnej o temperaturze 36 °C.
    2. Pokrój trzustkę na 3-4 części i wlej je z kolagenazą typu V do zlewki o pojemności 500 ml.
    3. Przykryj zlewkę sterylną pokrywką z szalki Petriego, przenieś ją do szafki bezpieczeństwa biologicznego #2 i umieść zawartość zlewki w komorze trawienia zawierającej cztery kulki ze szkła silikonowanego i oczko 500 μm.
    4. Zamknij komorę i dokręć. Umieścić pozostały enzym w zlewce recyrkulacyjnej i włączyć pompę perystaltyczną z prędkością 80 ml/min.
    5. Dodać ciepły roztwór HBSS (zwykle około 150 ml) podgrzany w kroku 5.2.1, aby napełnić obwód do końca. Delikatnie potrząśnij komorą i odwróć ją tak, aby kulki ze szkła silikonowanego uderzyły w tkankę.
      UWAGA: Ponieważ wysepki świń są delikatniejsze niż tkanka ludzka, wstrząsy powinny być równomierne i powolne, aby uniknąć uszkodzenia. W miarę trawienia tkanka zacznie się rozpadać i wypływać z komory.
    6. Pobierać próbkę (około 1 ml) z obwodu co 2 minuty w celu sprawdzenia, czy wysepki są wolne po wstrząsaniu przez 1 minutę.
    7. Umieścić próbkę na płytce 6-dołkowej z 80 μl ditizonu (DTZ). Dodać 2 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i zbadać próbkę pod mikroskopem w 40-krotnym powiększeniu. DTZ zabarwi wysepki na czerwono.
  3. Zbiór streszczenia
    1. Kontynuuj trawienie, aż zaobserwuje się wolne wysepki (nawet jeśli wiele z nich jest nadal częściowo uwięzionych w wyseparniku).
      UWAGA: Uwolnienie wysepek trwa około 10-15 minut, ale czas trawienia często zależy od wieku dawcy, partii enzymów, stężenia enzymu itp.
    2. Otwórz obwód i zbierz uwolnioną tkankę do butelek o pojemności 1 l. Trzymaj butelki na lodzie podczas zbierania, aby pomóc w dezaktywacji kolagenazy typu V.
    3. Dodać pozostały ciepły roztwór HBSS (~850 ml, krok 5.2.1) do zlewki recyrkulacyjnej i zebrać pozostałą strawioną tkankę z komory wytrawiającej.
    4. Dodać zimny materiał zbierający do komory (przez zlewkę recyrkulacyjną).
      UWAGA: Przerwij zbieranie, gdy granulki tkanek staną się mniejsze. Faza zbierania (kroki 5.3.2-5.3.3) może trwać do 40-75 minut i 5-8 litrów pożywki.
    5. Przenieść tkankę z butelki zbiorczej do stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 250 ml i odwirować przy 200 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.
    6. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić tkankę w 500 ml świeżej pożywki.
    7. Kontynuuj łączenie granulek komórkowych z zimnym podłożem zbiorczym (500 ml), aż do zebrania całego trawienia.
    8. Przemyć osad komórkowy zawieszony w zimnym podłożu przez odwirowanie (3 min przy 200 x g, 4 °C).
    9. Odrzucić supernatant. Oceń i określ ilościowo osad komórkowy, wykonując czynności wymienione w sekcjach 6-8.
      UWAGA: Ostateczna objętość zależy od wielkości trzustki, ale oczekuje się, że będzie mieścić się w granicach 40-80 ml.

6. Oczyszczanie wysepek

  1. Oczyść wysepki świni przez separację gradientu gęstości.
    UWAGA: Zapoznaj się z Tabelą materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat zastosowanych roztworów gradientu gęstości.
    1. Dodaj 2 ml tkanki trzustki do stożkowych probówek o pojemności 50 ml.
    2. Dodać 12 ml gradientu polisacharozy 1119 (1,119 g/cm3), aby zawiesić każde 2 ml tkanki trzustki.
    3. Dodać 10 ml 1083 roztworu polisacharozy (1,083 g/cm3), 10 ml roztworu polisacharozy 1077 (1,077 g/cm3), 10 ml roztworu polisacharozy 1037 (1,037 g/cm3) i kolejno 5 ml HBSS.
      UWAGA: 1037 roztwór polisacharozy (1,037 g/cm3) przygotowuje się przez zmieszanie 1077 roztworu polisacharozy (1,077 g / cm3) i hipertonicznego roztworu puryny cytrynianu (38,5 ml: 11,5 ml).
    4. Wirować przy 900 x g bez hamulca przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    5. Odessać wysepki znajdujące się pomiędzy warstwami roztworu polisacharozy 1077 i roztworu polisacharozy 1037.
    6. Przenieś wysepki do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml, równomiernie rozprowadź ciecz w każdej probówce i zrównoważ przed odwirowaniem.
  2. Umyj wysepki wieprzowe
    1. Wirować przy 200 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C, odrzucić supernatant. Dodaj pożywkę, aby zwiększyć objętość do 45 ml.
    2. Wirować przy 200 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C, pozostawiając około 2 ml supernatantu; delikatnie wstrząsnąć do wymieszania.
    3. Połącz wszystkie granulki w tej samej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Dodaj pożywkę, aby zwiększyć objętość do 45 ml.

7. Liczenie ekwiwalentów wysepek (IEQ) i hodowli wysepek

  1. Barwienie wysepek metodą DTZ
    1. Połącz wysepki razem, dodaj więcej pożywki zbiorczej, aby zwiększyć objętość do 250 ml i ponownie zawieś wysepki.
    2. Pobrać 500 μl reprezentatywnej próbki i umieścić ją w naczyniu o średnicy 35 mm z 80 μl DTZ. Pozostaw do inkubacji w temperaturze pokojowej przez 1-2 minuty, a następnie dodaj 2 ml PBS.
    3. Badaj w 40-krotnym powiększeniu pod odwróconym mikroskopem. Agregaty wysepek są zabarwione na czerwono przez DTZ.
  2. Liczenie poplamionych wysepek
    1. Policz zabarwione wysepki, dzieląc je na kategorie wielkości wymienione w tabeli 1. Użyj współczynnika konwersji, aby określić ekwiwalent wysepek (IEQ) w zależności od size.
      UWAGA: Konwersję IEQ przeprowadza się, gdy większość średnic agregatów DTZ-dodatnich jest większa niż 50 μm (u osób dorosłych (>2 lata) i niektórych preparatów dla młodych dorosłych (6-12 miesięcy) przechodzi się do etapu 7.2.4). We wszystkich pozostałych przypadkach (u młodych świń w wieku poniżej 6 miesięcy i u pozostałych młodych dorosłych świń) liczbę wysepek oszacowano na podstawie objętości cząstek lub zawartości DNA (zgodnie z etapami 7.2.2-7.2.3).
    2. (OPCJONALNIE) Wirować przy 200 x g w temperaturze 4 °C przez 2 minuty w celu zmierzenia palet.
    3. (OPCJONALNIE) Ocenić zawartość DNA w pojedynczych wyspach trzustkowych, jak również w osadach komórek wysp trzustkowych za pomocą zestawu do oznaczania proliferacji komórek. Ekstrapolować liczbę komórek beta świni na podstawie zawartości DNA i analizy immunocytochemicznej.
    4. Dodaj wszystkie kategorie i określ całkowity IEQ dla próbki. Pomnóż tę liczbę przez objętość ułamka. (np. 200 IEQ w 500 μl frakcji 250 ml = 200 x 2 x 250 = 100 000 IEQs).
  3. Kultura wysepek
    1. Odwirować wysepki przy sile 200 x g w temperaturze 4 °C przez 1 minutę; odrzucić supernatant.
    2. Dodać 5 ml wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej, aby ponownie zawiesić wyspy trzustkowe i przenieść na szalkę Petriego o średnicy 150 mm.
      UWAGA: Ponownie zawiesić 10 000 wysepek na talerz.
    3. Dodać więcej pożywki hodowlanej, aby zwiększyć objętość do 30 ml na szalce Petriego o średnicy 150 mm.

8. Ocena jakości wysepek

  1. Calceina AM (CA) -Barwienie jodku propidyny (PI) wysp trzustkowych
    1. Ręcznie wybierz 50 wysepek na 48-dołkową płytkę. Umyj raz 1 ml HBSS.
    2. Dodać 200 μl mieszaniny zawierającej 1x CA i 1x PI zgodnie z instrukcją zestawu do barwienia żywotności komórek.
    3. Przykryć szalkę Petriego i umieścić ją w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 30 minut.
    4. Wizualizuj wysepki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i uchwyć obrazy.
    5. Określ ilościowo żywotność, licząc żywe komórki (kolor zielony) i martwe komórki (kolor czerwony) po barwieniu CA-PI.
  2. Wydzielanie insuliny stymulowane glukozą (GSIS)
    1. Dodaj 1 ml roztworu o niskim stężeniu glukozy do trzech dołków 24-dołkowej rośliny.
    2. Po co najmniej całonocnej hodowli należy ręcznie wybrać 100 wysepek o podobnej wielkości w zakresie średnicy 100-200 μm i przenieść je do trzech dołków 24-dołkowej płytki wstępnie wypełnionej roztworem o niskim stężeniu glukozy (jak w kroku 8.2.1).
      UWAGA: Umyj wysepki w dołku pośrednim za pomocą HBSS przed przeniesieniem ich do studzienki w celu wypłukania pożywki hodowlanej.
    3. Inkubować wysepki w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
    4. Ostrożnie usunąć supernatant pipetą, nie dotykając wysp trzustkowych.
    5. Dodać 1 ml nowego roztworu o niskim stężeniu glukozy.
    6. Inkubować wysepki w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 60 minut.
    7. Zebrać sklarowany osad (bez wysepek) i przenieść co najmniej 500 μl do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Będzie on zawierał insulinę wydzielaną pod wpływem stymulacji niskim poziomem glukozy.
    8. Ostrożnie dodaj 1 ml roztworu o wysokim stężeniu glukozy do tych samych studzienek.
    9. Inkubować wysepki w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 60 minut.
    10. Przenieść kolejne 500 μl pożywki hodowlanej do nowej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Będzie on zawierał insulinę wydzielaną pod wpływem stymulacji wysokim poziomem glukozy.
    11. Należy użyć zestawów do testów immunoenzymatycznych (ELISA) dla insuliny wieprzowej, aby zmierzyć stężenie insuliny uwalnianej po stymulacji niskim i wysokim poziomem glukozy (kroki 8.2.7 i 8.2.10).
      UWAGA: Wskaźnik stymulacji (SI) jest obliczany jako stosunek stężenia insuliny mierzonego po stymulacji wysokim poziomem glukozy do stężenia insuliny po stymulacji niskim poziomem glukozy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przygotowanie komory bezpieczeństwa biologicznego jest pokazane w Rysunek 1. Ustawiono trzy niezależne przestrzenie robocze. Szafa bezpieczeństwa biologicznego #1 jest wyposażona w miski nerkowe, narzędzia chirurgiczne i zlewki do przycinania trzustki (Rysunek 1A). Komora bezpieczeństwa biologicznego #2 jest wyposażona w łaźnię wodną, pompę perystaltyczną, stojak na rurkę z rurką recyrkulacyjną oraz komorę mineralizacyjną do trawienia wysp trzustkowych (Rysunek ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ksenotransplantacja wysepek, wykorzystująca świnie jako źródło wysepek, jest obiecującym podejściem do przezwyciężenia niedoboru ludzkich wysepek. Chociaż izolacja dorosłych wysepek świń jest trudna, kilka grup ustanowiło protokoły skutecznego izolowania wysepekkonsekwentnie 10,11. Niezależnie od metody, należy wykazać żywotność wysepek i właściwości użytkowe, aby potwierdzić wysoką jakość produktów. Protokół ten opiera się na tych opublikowanych

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy profesorowi Davidowi K. C. Cooperowi (Center for Transplantation Sciences, Massachusetts General Hospital) za pomoc w skonfigurowaniu całego systemu ksenotransplantacji. Dziękujemy Pani Xingling Hu (Drugi Szpital Ludowy w Shenzhen), Pani Xiaohe Tian (Uniwersytet Kalifornijski w Berkeley), Panu Bo Zhou (Uniwersytet Bostoński) za pomocne dyskusje i sugestie. Prace te były wspierane przez granty z Narodowego Kluczowego Programu Badawczo-Rozwojowego Chin (2017YFC1103701, 2017YFC1103704), Specjalne Fundusze na Budowę Szpitali Wysokiego Szczebla w prowincji Guangdong (2019) oraz Sanming Project of Medicine w Shenzhen (SZSM201812079).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,22 &mikro; m 500 mL filtr jednorazowyCorning431097
1 L Plastikowa butelka z niebieską nakrętkąCelltransYKBH1
10 mL, 25 ml jednorazowa pipetaCORNING4488
150 mm szalka PetriegoBIOLGIX66-1515
1x HBSS basicGIBCOC14175500BT
200 mL stożkowa  butelka wirówkowaFalcon
Probówka wirówkowa 50 mL NEST602052/430829
500 mL Komora RicordiBiorep600-MDUR-03
Siatka 500 mikronówYikangYKBE
6-dołkowa płytkaCOSTAR3511
(16G, 18G, 20G)BD682245, 383005, 383012
Maszyna anestezjologicznaRWDR620-S1
Środki znieczulające A: Lumianning (2.5– 5 mg / kg)Huamu, ChinyAnimal Drugs GMP (2015)
070011777
Środki znieczulające B: Propofol (2– 3 mg / kg)Sigma AldrichS30930-100g
Zlewka (500 mL, 1000 mL)ShuniuSB500ml, SB1000ml
GlukometrSinocare2JJA0R05232
Paski testowe do pomiaru stężenia glukozy we krwiSinocare41120
Zestaw do oznaczania żywotności komórek Calcein/PIBeyotimeC2015M
CMRL 1066Thermo Fisher 11530037
Kolagenaza VSigma AldrichC9263
Zestaw do oznaczania proliferacji komórek CyQUANTSondy molekularneC7026
Przewód pokarmowyCelltransYKBAO
Jednorazowa igła do pobierania krwiFKE20153152149
DithizoneSigma AldrichD5130
ZasłonyXinwei20182640332
Płaska ramaJinzhongR0B010
Cewnik zewnątrzoponowyAoocnnr 20163661148
Heparyna sodowaChinawanbang99070
HEPESGIBCO15630-080
Histopaque 1077Sigma Aldrich10771-100ml1077 Polisacharoza roztwór
Histopaque 1083Sigma Aldrich10831-100ml1083 Roztwór polisacharozy
Histopaque 1119Sigma Aldrich11191-100ml1119 Roztwór polisacharozy
Rurka infuzyjnaBOON20163660440
JodoforLIRCONQ/1400ALX002
IzofluranRwdlsR510-22-16
Nr 0-2 szewJinhuanNr 20142650770
Nr 22 Ostrze chirurgiczneLianhui2011126
Penicylina/streptomycynaGIBCO15140-122
Pompa perystaltycznaLongerPumpBT300-2J
Surowica świńskaKangyuan20210601
RPMI-1640 ŚredniaC1875500BTGIBCO
Strzykawka do pobierania próbekYikangYKBB0
SkalpelJinzhongJ11030
Koraliki z azotku krzemuCelltransYKBI0
Proste kleszcze do naczyń krwionośnychJinzhongJ31120
Słoik prostyNalgene2118-0001
Kleszczyki do tkanekJinzhongJ41010
Nożyczki do tkanekJinzhongJ21210
Kleszcze zębateJinzhongJD1060
Kleszczyki do ręcznikówShinva154285
Probówka do pobierania krwi VacutainerSanli20150049
Kąpiel wodnaYihengHWS-12
352075 Cewnik angiologiczny naukowy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. Type 1 diabetes. Lancet. 383 (9911), London, England. 69-82 (2014).
  2. Smith, M. J., Simmons, K. M., Cambier, J. C. B cells in type 1 diabetes mellitus and diabetic kidney disease. Nature Reviews. Nephrology. 13 (11), 712-720 (2017).
  3. Zullo, A., Sommese, L., Nicoletti, G., Donatelli, F., Mancini, F. P., Napoli, C. Epigenetics and type 1 diabetes: mechanisms and translational applications. Translational Research. 185, 85-93 (2017).
  4. Shapiro, A. M. J., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. Clinical pancreatic islet transplantation. Nature Reviews. Endocrinology. 13 (5), 268-277 (2017).
  5. Warnock, G. L., et al. A multi-year analysis of islet transplantation compared with intensive medical therapy on progression of complications in type 1 diabetes. Transplantation. 86 (12), 1762-1766 (2008).
  6. Foster, E. D., et al. Improved health-related quality of life in a phase 3 islet transplantation trial in type 1 diabetes complicated by severe hypoglycemia. Diabetes Care. 41 (5), 1001-1008 (2018).
  7. Ricordi, C., et al. National Institutes of Health-sponsored clinical islet transplantation consortium phase 3 trial: manufacture of a complex cellular product at eight processing facilities. Diabetes. 65 (11), 3418-3428 (2016).
  8. Coe, T. M., Markmann, J. F., Rickert, C. G. Current status of porcine islet xenotransplantation. Current Opinion in Organ Transplantation. 25 (5), 449-456 (2020).
  9. Matsumoto, S., Shimoda, M. Current situation of clinical islet transplantation from allogeneic toward xenogeneic. Journal of Diabetes. 12 (10), 733-741 (2020).
  10. Bertera, S., et al. Pig-to-macaque islet xenotransplantation. Methods in Molecular Biology. 2110, Clifton, N.J. 289-314 (2020).
  11. Bertera, S., Marigliano, M., Bottino, R., Trucco, M. Pancreatic islet isolation from swine. Methods in Bioengineering: Cell Transplantation. , Artechhouse. Norwood, MA. 77-99 (2011).
  12. Kim, A., et al. Islet architecture: A comparative study. Islets. 1 (2), 129-136 (2009).
  13. Kim, H. -I., et al. Parameters for successful pig islet isolation as determined using 68 specific-pathogen-free miniature pigs. Xenotransplantation. 16 (1), 11-18 (2009).
  14. Dufrane, D., et al. Parameters favouring successful adult pig islet isolations for xenotransplantation in pig-to-primate models. Xenotransplantation. 13 (3), 204-214 (2006).
  15. Ricordi, C., Finke, E. H., Lacy, P. E. A method for the mass isolation of islets from the adult pig pancreas. Diabetes. 35 (6), 649-653 (1986).
  16. Ulrichs, K., et al. Isolation of porcine pancreatic islets for xenotransplantation. Methods in Molecular Biology. 885, Clifton, N.J. 213-232 (2012).
  17. Dufrane, D., et al. A simple method using a polymethylpenten chamber for isolation of human pancreatic islets. Pancreas. 30 (3), 51-59 (2005).
  18. Ching, C. D., et al. A reliable method for isolation of viable porcine islet cells. Archives of Surgery. 136 (3), 276-279 (2001).
  19. Brandhorst, D., Brandhorst, H., Hering, B. J., Federlin, K., Bretzel, R. G. Islet isolation from the pancreas of large mammals and humans: 10 years of experience. Experimental and Clinical Endocrinology & Diabetes: Official Journal, German Society of Endocrinology [and] German Diabetes Association. 103, Suppl 2 3-14 (1995).
  20. Takei, S., et al. Isolation and function of human and pig islets. Pancreas. 9 (2), 150-156 (1994).
  21. Marchetti, P., et al. Collagenase distension, two-step sequential filtration, and histopaque gradient purification for consistent isolation of pure pancreatic islets from the market-age (6-month-old) pig. Transplantation. 57 (10), 1532-1535 (1994).
  22. Heiser, A., Ulrichs, K., Müller-Ruchholtz, W. Isolation of porcine pancreatic islets: low trypsin activity during the isolation procedure guarantees reproducible high islet yields. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 8 (6), 407-411 (1994).
  23. Noguchi, H. Pancreatic islet purification from large mammals and humans using a COBE 2991 cell processor versus large plastic bottles. Journal of Clinical Medicine. 10 (1), (2020).
  24. Vanderschelden, R., Sathialingam, M., Alexander, M., Lakey, J. R. T. Cost and scalability analysis of porcine islet isolation for islet transplantation: Comparison of juvenile, neonatal and adult pigs. Cell Transplant. 28 (7), 967-972 (2019).
  25. Nagaraju, S., Bottino, R., Wijkstrom, M., Trucco, M., Cooper, D. K. C. Islet xenotransplantation: what is the optimal age of the islet-source pig. Xenotransplantation. 22 (1), 7-19 (2015).
  26. Liu, Z., et al. Pig-to-primate islet xenotransplantation: Past, present, and future. Cell Transplantation. 26 (6), 925-947 (2017).
  27. Jiang, X., et al. Islet isolation and purification from inbred Wuzhishan miniature pigs. Xenotransplantation. 19 (3), 159-165 (2012).
  28. Kim, J. H., et al. Influence of strain and age differences on the yields of porcine islet isolation: extremely high islet yields from SPF CMS miniature pigs. Xenotransplantation. 14 (1), 60-66 (2007).
  29. Heiser, A., Ulrichs, K., Müller-Ruchholtz, W. Influence of porcine strain, age, and pH of the isolation medium on porcine pancreatic islet isolation success. Transplantation Proceedings. 26 (2), 618-620 (1994).
  30. Steffen, A., et al. Production of high-quality islets from goettingen minipigs: Choice of organ preservation solution, donor pool, and optimal cold ischemia time. Xenotransplantation. 24 (1), (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przeszczepianie wysepek trzustkowychwini wysepki trzustkowecukrzyca typu 1beta kom rki trzustkioczyszczanie wysepekprzeszczepianie ksenogeniczneniedob r dawc w trzustkiprzeszczepianie kom rkowekontrola glikometaboliczna
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły