Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Generowanie transgeników i nokautów u gatunków Strongyloides za pomocą mikroiniekcji

2.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63023

⸱

7 października 2021

 , 
1Department of Microbiology, Immunology, and Molecular Genetics, University of California, Los Angeles, 2Molecular Biology Institute, University of California, Los Angeles

W tym artykule

Podsumowanie

Funkcjonalny zestaw narzędzi genomicznych dla pasożytniczych nicieni Strongyloides stercoralis i Strongyloides ratti obejmuje transgenezę, mutagenezę za pośrednictwem CRISPR/Cas9 oraz RNAi. Protokół ten pokaże, jak wykorzystać mikroiniekcje dogonadalne do wprowadzenia transgenów i składników CRISPR do S. stercoralis i S. ratti.

Streszczenie

Rodzaj Strongyloides składa się z wielu gatunków nicieni penetrujących skórę o różnych zakresach żywicieli, w tym Strongyloides stercoralis i Strongyloides ratti. S. stercoralis jest pasożytniczym dla człowieka, penetrującym skórę nicieniem, który zakaża około 610 milionów ludzi, podczas gdy pasożyt szczurów S. ratti jest blisko spokrewniony z S. stercoralis i jest często używany jako model laboratoryjny dla S. stercoralis. Zarówno S. stercoralis, jak i S. ratti są łatwo podatne na generowanie transgeników i nokautów za pomocą techniki dostarczania egzogennych kwasów nukleinowych mikroiniekcji dogonadalnej i jako takie pojawiły się jako systemy modelowe dla innych pasożytniczych robaków, które nie są jeszcze podatne na tę technikę.

Pasożytnicze dorosłe osobniki Strongyloides zamieszkują jelito cienkie swojego gospodarza i uwalniają potomstwo do środowiska poprzez kał. Po dostaniu się do środowiska larwy rozwijają się w wolno żyjące dorosłe osobniki, które żyją w kale i produkują potomstwo, które musi znaleźć i zaatakować nowego żywiciela. To pokolenie środowiskowe jest unikalne dla gatunku Strongyloides i na tyle podobne pod względem morfologii do modelowego wolno żyjącego nicienia Caenorhabditis elegans, że techniki opracowane dla C. elegans mogą być dostosowane do stosowania z tymi pasożytniczymi nicieniami, w tym mikroiniekcja downętrzna. Za pomocą mikroiniekcji intragonadalnej można wprowadzić do Strongyloides szeroką gamę transgenów. Składniki CRISPR/Cas9 mogą być również mikrowstrzykiwane w celu stworzenia zmutowanych larw Strongyloides. W tym miejscu opisano technikę mikroiniekcji dogonad do Strongyloides, w tym przygotowanie wolno żyjących osobników dorosłych, procedurę iniekcji oraz selekcję transgenicznego potomstwa. Dołączono obrazy transgenicznych larw Strongyloides stworzonych przy użyciu mutagenezy CRISPR/Cas9. Celem tej pracy jest umożliwienie innym badaczom wykorzystania mikroiniekcji do stworzenia transgenicznych i zmutowanych Strongyloides.

Wprowadzenie

Strongyloides stercoralis przez długi czas był pomijany jako istotny patogen ludzki w porównaniu do szerzej znanych glistw i glisty Ascaris lumbricoides1. Poprzednie badania nad obciążeniem organizmu pasożytami często znacznie niedoszacowywały rozpowszechnienia S. stercoralis ze względu na niską czułość powszechnych metod diagnostycznych dla S. stercoralis2. W ostatnich latach badania epidemiologiczne oparte na ulepszonych narzędziach diagnostycznych pozwoliły oszacować, że rzeczywista zapadalność na infekcje S. stercoralis jest znacznie wyższa niż zgłaszano wcześniej i obejmuje około 610 milionów ludzi na całym świecie2.

Zarówno S. stercoralis, jak i inne gatunki Strongyloides, w tym blisko spokrewniony pasożyt szczurzy i powszechny model laboratoryjny S. ratti, charakteryzują się nietypowym cyklem życiowym, który jest korzystny dla eksperymentalnych badań genomicznych, ponieważ składa się on zarówno z pokoleń pasożytniczych, jak i wolnożyjących (środowiskowych)3 (Rysunek 1). W szczególności zarówno S. stercoralis, jak i S. ratti mogą przejść przez jedno pokolenie wolnożyjące. Pokolenie wolnożyjące składa się z larw popasożytniczych, które rozwijają się w wolnożyjące dorosłe samce i samice; całe potomstwo dorosłych osobników wolnożyjących rozwija się w larwy zakaźne, które muszą zainfekować gospodarza, aby kontynuować cykl życiowy. Ponadto to pokolenie środowiskowe lub wolnożyjące może być manipulowane eksperymentalnie w laboratorium. Ponieważ dorosłe osobniki wolnożyjące Strongyloides oraz dorosłe C. elegans mają podobną morfologię, techniki takie jak mikroiniekcje wewnątrzgonadalne, które zostały pierwotnie opracowane dla C. elegans, mogą zostać dostosowane do użytku u wolnożyjących dorosłych Strongyloides4,5. Chociaż DNA jest zazwyczaj wprowadzane do wolnożyjących dorosłych samic, mikroiniekcje u Strongyloides można wykonywać zarówno u samców, jak i samic6. W związku z tym dostępne są narzędzia genomiki funkcjonalnej pozwalające na badanie wielu aspektów biologii Strongyloides. Inne nicienie pasożytnicze nie posiadają pokolenia wolnożyjącego i w rezultacie nie są tak łatwo dostępne dla technik genomiki funkcjonalnej3.

Schemat cyklu życiowego S. stercoralis; stadia pasożytnicze i wolnożyjące; autoinfekcja, screening transgeniczny.
Rycina 1: Cykl życiowy Strongyloides stercoralis. Pasożytnicze samice S. stercoralis bytują w jelicie cienkim swoich ssaczych gospodarzy (ludzi, naczelnych niebędących ludźmi, psów). Samice pasożytnicze rozmnażają się poprzez partenogenezę i składają jaja w jelicie cienkim. Jaja wykluwają się jeszcze wewnątrz gospodarza, przekształcając się w larwy postpasożytnicze, które następnie są wydalane do środowiska wraz z kałem. Jeśli larwy postpasożytnicze są samcami, rozwijają się w wolnożyjące dorosłe samce. Jeśli larwy postpasożytnicze są samicami, mogą rozwinąć się albo w wolnożyjące dorosłe samice (rozwój pośredni), albo w zakaźne larwy trzeciego stadium (iL3; rozwój bezpośredni). Wolnożyjące samce i samice rozmnażają się płciowo, tworząc potomstwo, które musi przekształcić się w iL3. W określonych warunkach S. stercoralis może również przejść autoinfekcję, podczas której część larw postpasożytniczych pozostaje w jelicie gospodarza zamiast zostać wydalona do środowiska z kałem. Larwy te mogą rozwinąć się w larwy autoinfekcyjne (L3a) wewnątrz gospodarza, przebić się przez ścianę jelita, migrować przez organizm i ostatecznie powrócić do jelita, aby stać się dorosłymi osobnikami zdolnymi do rozmnażania. Cykl życiowy S. ratti jest podobny, z wyjątkiem tego, że S. ratti infekuje szczury i nie posiada cyklu autoinfekcyjnego. Generacja środowiskowa jest kluczowa dla wykorzystania gatunków Strongyloides w badaniach genetycznych. Wolnożyjące dorosłe samice (P0) mogą być poddawane mikroiniekcji; ich potomstwo, z którego wszystkie staną się iL3, stanowi potencjalne transgeniczne pokolenie F1. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Castelletto et al.3. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

S. stercoralis wykazuje wiele cech biologicznych wspólnych z innymi nicieniami pasożytniczymi przewodu pokarmowego człowieka, w tym sposób wnikania do organizmu gospodarza oraz modulację jego odpowiedzi immunologicznej. Na przykład pasożytnicze nicienie haczykowate z rodzajów Necator i Ancylostoma również infekują poprzez penetrację skóry, przemieszczają się w podobny sposób w organizmie i ostatecznie bytują w formie dorosłych pasożytów w jelicie cienkim7. Zatem wiele nicieni układu pokarmowego prawdopodobnie wykorzystuje wspólne zachowania sensoryczne i techniki unikania odpowiedzi immunologicznej. W konsekwencji wiedza zdobyta na przykładzie rodzaju Strongyloides uzupełni wyniki badań nad innymi, mniej podatnymi na manipulacje genetyczne nicieniami i doprowadzi do pełniejszego zrozumienia tych złożonych i istotnych pasożytów.

Niniejszy protokół mikrowstrzykiwania opisuje metodę wprowadzania DNA do wolno żyjących dorosłych samic Strongyloides w celu uzyskania potomstwa transgenicznego i mutantów. Opisano wymagania dotyczące utrzymania szczepów, w tym czas rozwoju dorosłych nicieni pod kątem mikrowstrzykiwań oraz metodę zbierania potomstwa transgenicznego. Protokół zawiera demonstrację kompletnej techniki mikrowstrzykiwania oraz procedury hodowli i screeningu potomstwa transgenicznego, wraz z listą całego niezbędnego sprzętu i materiałów eksploatacyjnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Do pasażowania S. stercoralis wykorzystano gerbile, a do pasażowania S. ratti szczury. Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez UCLA Office of Animal Research Oversight (Protokół nr 2011-060-21A), który przestrzega standardów AAALAC oraz wytycznych Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Następujące czynności muszą zostać wykonane co najmniej jeden dzień przed mikrowstrzyknięciem: hodowla nicieni, przygotowanie podkładek do mikrowstrzykiwania, stworzenie konstruktów do mieszaniny do mikrowstrzykiwania oraz wysianie bakterii (E. coli HB101) na 6 cm płytki z pożywką NGM (Nematode Growth Media)8. Samice wolnożyjące wymagają minimum 24 h po pobraniu kału w temperaturze 25 °C, aby rozwinęły się w młode dorosłe osobniki przed możliwością wykonania mikrowstrzyknięcia. Podkładki do mikrowstrzykiwania muszą być całkowicie suche. Płytki z bakteriami muszą wyschnąć i wytworzyć niewielki trawnik bakteryjny.

1. Przygotowanie szkiełek do mikroiniekcji: co najmniej jeden dzień przed iniekcją

UWAGA: Nicienie są mocowane na szkiełkach podstawkowych do mikroiniekcji za pomocą suchych podkładek agarowych w celu wykonania iniekcji.

  1. Ustaw blok grzejny na 90 °C.
  2. Do probówki z borokrzemianowego szkła dodaj 5 mL ddH2O, a następnie 100 mg agarozy.
  3. Podgrzewaj mieszaninę agarozy w probówce nad płomieniem, aż agaroza się rozpuści.
  4. Umieść probówkę w bloku grzejnym ustawionym na 90 °C, aby utrzymać agarozę w stanie ciekłym.
  5. Nanieś ~180 µL roztworu agarozy na szkiełko nakrywkę, używając szklanej pipety Pasteura lub pipety z plastikowym końcówką. Natychmiast połóż na wierzchu drugie szkiełko nakrywkowe, aby spłaszczyć agarozę do postaci cienkiego krążka.
  6. Po 5-10 s usuń górne szkiełko nakrywkowe, rozsuwając oba szkiełka. Ustal, na którym szkiełku znajduje się krążek agarowy, i połóż go stroną aktywną do góry.
  7. Wybierz mały odłamek szkła z rozbitej nakrywki i za pomocą pęsety delikatnie wciśnij go w agar w pobliżu górnej krawędzi krążka (Supplemental Figure S1).
  8. Kontynuuj przygotowywanie krążków do mikroiniekcji z roztworu agarozy.
  9. Susz krążki agarowe przez noc na blacie lub w suszarce. Przechowuj w pudełku na szkiełka nakrywkowe.
    UWAGA: Krążki agarowe mogą być używane przez maksymalnie 2 miesiące, jednak służą one tylko do jednej serii iniekcji.

2. Hodowla Strongyloides w celu uzyskania nicieni do mikroiniekcji: 1–2 dni przed iniekcją

UWAGA: Protokół utrzymania szczepów znajduje się w Materiałach Suplementarnych, które zawierają szczegółowy opis sposobu zakażania gerbili i szczurów nicieniami oraz metod pobierania nicieni z odchodów zakażonych zwierząt.

  1. Na dwa dni przed dniem iniekcji umieść zakażone zwierzęta9,10 na noc w klatkach zbiorczych.
  2. Następnego ranka zbierz zakażone odchody i przygotuj płytki z odchodów i węgla drzewnego9,10.
  3. Pozostaw płytkę w temperaturze 25 °C przez 24 h, aby umożliwić rozwój wolno żyjących nicieni w młode osobniki dorosłe.
  4. W noc poprzedzającą dzień iniekcji umieść niezakażone zwierzęta gospodarza w klatkach zbiorczych.
  5. W dniu iniekcji zbierz niezakażone odchody do hodowli po iniekcji.

3. Przygotowanie mieszaniny do mikroiniekcji: przed dniem lub w dniu iniekcji

UWAGA: Mieszanina do mikroiniekcji składa się z plazmidów zainteresowania rozcieńczonych do pożądanego stężenia w soli buforowej dla nicieni (BU) (50 mM Na2HPO4, 22 mM KH2PO4, 70 mM NaCl)11.

  1. Wyznaczyć stężenie zapasów plazmidów oraz pożądane stężenie w mieszaninie do mikroiniekcji (Tabela 1).
Mieszanina do mikroiniekcji: konstrukt reporterowy
SkładnikStężenie zapasuIlośćStężenie końcowe
pMLC30 gpa-3::gfp300 ng/µL1.7 µL50 ng/µL
BUna8.3 µLna
łącznie10 µL50 ng/µL
Mieszanina do mikroiniekcji: mutageneza CRISPR/Cas9
SkładnikStężenie zapasuIlośćStężenie końcowe
pMLC47 tax-4 sgRNA300 ng/µL2.7 µL80 ng/µL
Plazmid HDR pEY11 Ss-tax-4400 ng/µL2.0 µL80 ng/µL
Plazmid pPV540 strCas9350 ng/µL1.1 µL40 ng/µL
BUna4.2 µLna
łącznie10 µL200 ng/µL
Mieszanina do mikroiniekcji: integracja piggyBac
SkładnikStężenie zapasuIlośćStężenie końcowe
pMLC30 gpa3::gfp300 ng/µL2.0 µL60 ng/µL
Plazmid transpozazy pPV402450 ng/µL0.9 µL40 ng/µL
BUna7.1 µLna
łącznie10 µL100 ng/µL

Tabela 1: Przykłady mieszanin do mikroiniekcji. Plasmidy i stężenia dla trzech przykładowych mieszanin do mikroiniekcji: jednej dla konstruktu reporterowego gpa-3::GFP10, jednej dla przerwania locus Ss-tax-4 za pomocą systemu CRISPR/Cas914,15 oraz jednej dla integracji konstruktu Ss-gpa-3::GFP za pomocą systemu piggyBac13,17,18. strCas9 oznacza gen Cas9 z optymalizacją kodonów dla Strongyloides. Wymienione stężenia końcowe są powszechnie stosowane w mieszaninach do mikroiniekcji u Strongyloides.

  1. Rozcieńcz plazmidy w BU do całkowitej objętości 10-20 µL.
  2. Wirowarkuj mieszaninę przez kolumnę filtrującą przy 5,000 × g przez 1-2 min.
  3. Użyj mieszaniny do mikroiniekcji natychmiast lub przechowuj ją w temperaturze -20 °C do późniejszego użycia.

4. Pobieranie młodych dorosłych osobników Strongyloides do mikroiniekcji: rano w dniu iniekcji

  1. Przygotuj aparat Baermanna z jedną płytką z kału i węgla zawierającą młode dorosłe osobniki Strongyloides (Rysunek 2).
    UWAGA: Płytka z kału i węgla może zawierać zainfekowane larwy. Środki ochrony indywidualnej obejmują fartuch laboratoryjny, rękawiczki i ochronę oczu. Żadna część skóry nie powinna być odsłonięta między rękawiczką a rękawem fartucha.

Układ chromatograficzny, proces filtracji, sprzęt laboratoryjny, papier filtracyjny, zlewka, etapy techniki.
Rysunek 2: Aparat Baermanna używany do zbierania nicieni pasożytniczych z hodowli10. Zawartość płytki z kałem i węglem umieszcza się na górze kolumny ciepłej wody. Nicienie migrują do wody i gromadzą się na dnie lejka. (A) Aby przygotować aparat Baermanna, statyw lejka Baermanna mocuje się do blatu za pomocą zacisku śrubowego. Gumowa rurka przymocowana do końca lejka jest zamknięta zaciskami, a pod rurką umieszcza się naczynie na krople. Do szklanego lejka dolewa się ciepłą wodę. (B) Plastikowy uchwyt pierścieniowy do mieszaniny kału i węgla wyściela się 3 kawałkami ręcznika laboratoryjnego (lewo). Do przeniesienia zawartości płytki z kałem i węglem (prawo) do plastikowego uchwytu pierścieniowego używa się drewnianego patyczka lub szpatułki do języka (środek). (C) Zbliżenie dna plastikowego uchwytu pierścieniowego dla mieszaniny kału i węgla, pokazujące podwójną warstwę tiulu nylonowego wyścielającą dno uchwytu. (D) Uchwyt z kałem i węglem umieszcza się następnie na górze szklanego lejka. (E) Ręcznik laboratoryjny zwilża się wodą i przykrywa nim mieszaninę kału i węgla. Dodaje się więcej ciepłej wody, aby w większości zanurzyć próbkę z kałem i węglem. (F) Kompletny układ Baermanna z hodowlą z kałem i węglem zanurzoną w ciepłej wodzie. Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

  1. Zainstaluj szklany lejek z gumową rurką odpływową na statywie z pierścieniem, używając uszczelki typu O-ring, i zabezpiecz go zaciskiem. Zamknij rurkę odpływową za pomocą 2 zacisków zaciskowych (Rycina 2A).
  2. Pod lejkiem ustaw naczynie odbiorcze, aby zbierać wycieki.
  3. Wlej do lejka ciepłą wodę (około 40 °C) do poziomu 5 cm poniżej krawędzi. Sprawdź, czy system nie przecieka.
  4. Wyściel uchwyt Baermanna – sito wykonane z 2 plastikowych pierścieni z 2 warstwami nylonowej siatki tiulowej zabezpieczonej pomiędzy nimi – 3 nakładającymi się kawałkami ręcznika laboratoryjnego. Umieść mieszaninę kałową z węglem w uchwycie Baermanna (Rycina 2B,C).
  5. Umieść uchwyt Baermanna z mieszaniną kałową z węglem w lejku. Zawiń ręczniki wokół mieszaniny kałowej z węglem i dolej tyle wody, aby zanurzyć większość mieszaniny. Nie napełniaj powyżej 2 cm od krawędzi lejka (Rycina 2D,E).
  6. Przykryj lejek pokrywką od plastikowej szalki Petriego o średnicy 15 cm, aby ograniczyć zapach. Oznakuj lejek w razie potrzeby (Rycina 2F).
  7. Odczekaj od 30 min do 1 h, aby zebrać nicienie z aparatu Baermanna.
  8. Przytrzymaj probówkę wirówkową o pojemności 50 mL pod gumową rurką na dnie lejka. Ostrożnie otwórz zaciski na dole, aby odprowadzić 30-40 mL wody zawierającej nicienie do probówki 50 mL.
  9. Przenieś 15 mL wody z aparatu Baermanna zawierającej nicienie do probówki wirówkowej 15 mL. Wiruj probówkę 15 mL przez 1 min przy ~750 × g (powolne wirowanie). Alternatywnie pozwól nicieniom opaść grawitacyjnie przez 10-15 min.
  10. Odbierz nadkład z cieczy do poziomu ~2 mL i wylej nadkład do pojemnika na odpady ciekłe z jodem, aby zabić wszelkie nicienie.
  11. Dolej kolejną porcję wody z aparatu Baermanna do probówki zbiorczej 15 mL i powtórz wirowanie. Odbierz nadkład do poziomu ~2 mL i zutylizuj go zgodnie z krokiem 4.11.
  12. Powtarzaj kroki 4.11 i 4.12, aż wszystkie nicienie zostaną zebrane w probówce wirówkowej 15 mL. Po ostatnim wirowaniu usuń jak najwięcej wody.
  13. Obejrzyj pellet z nicieniami (40-100 µL) na dnie probówki. Jeśli nicienie nie są widoczne, odczekaj kolejne 1-2 h i spróbuj ponownie zebrać nicienie z aparatu Baermanna.
  14. Przenieś nicienie w jak najmniejszej ilości wody na płytkę 6 cm z 2% podłożem NGM z trawnikiem E. coli HB101. Użyj tej płytki jako płytki źródłowej do mikroiniekcji.
  15. Zutylizuj mieszaninę kałową z węglem, traktując ją rozcieńczonym jodem (50% rozcieńczenie jodyny Lugola w wodzie), zawijając w folię plastikową, aby zapobiec wyciekom, i umieszczając w pojemniku na odpady biologiczne.
  16. Dolej 10 mL rozcieńczonego jodu do naczynia odbiorczego i spuść do niego nadmiar wody z aparatu Baermanna.
  17. Umyj elementy wielorazowego użytku (lejek, naczynie odbiorcze, plastikowy uchwyt z tiulem, plastikową pokrywkę oraz zaciski) 10% wybielaczem i dokładnie spłucz.

5. Wyciąganie i ładowanie igieł do mikroiniekcji: bezpośrednio przed iniekcją

  1. Przygotuj igły do mikroiniekcji, wyciągając szklane kapilary za pomocą wyciągarki do igieł.
    UWAGA: Przykładowe ustawienia dla komercyjnej wyciągarki wyposażonej w 3 mm platynowo-irydowy włókno to Heat = 810-820, Pull = 800-820, mikrometr = 2.5.
  2. Obejrzyj końcówki pod mikroskopem stereoskopowym. Jeśli igły mają pożądany kształt (Rycina 3A-F), wyciągnij 4-6 igieł (z 2-3 kapilar). Aby uzyskać odpowiedni kształt igły, dostosuj ustawienia w razie potrzeby: zmień parametry Heat lub Pull o 10 i wyciągaj nowe igły, aż kształt stożka i trzonu będzie bardziej odpowiedni.

Mikroiniekcja CRISPR w gonadzie C. elegans; obrazy z mikroskopu wskazujące miejsca iniekcji.
Rysunek 3: Igły do mikroiniekcji oraz dorosła samica Strongyloides stercoralis z zidentyfikowanymi optymalnymi miejscami mikroiniekcji. (A-F) Obrazy igieł do mikroiniekcji. (A-B) Zwężenie trzonu (A) i końcówka (B) igły o kształcie odpowiednim do mikroiniekcji. Końcówka jest wystarczająco ostra, aby przebić kutykulę, i wystarczająco wąska, aby nie powodować nadmiernych uszkodzeń. (C-D) Zwężenie trzonu (C) i końcówka (D) igły do mikroiniekcji o nieprawidłowym kształcie. Końcówka jest zbyt tępa i szeroka, co spowoduje nadmierne uszkodzenie nicienia. (E-F) Zwężenie trzonu (E) i końcówka (F) igły, która prawdopodobnie jest zbyt długa i cienka, aby nadawała się do mikroiniekcji. Końcówka w F jest bardzo podobna do końcówki w D. Jednak trzon jest węższy i zbyt giętki, aby skutecznie przebić kutykulę. Ponadto bardzo cienkie igły łatwo się zapychają. (G) Obraz całego nicienia prawidłowo ustawionego do mikroiniekcji, przy założeniu, że igła wchodzi z prawej strony. Strona przednia znajduje się na dole i po lewej; vulva jest wskazana grotem strzałki. Gonada jest widoczna wzdłuż prawej strony samicy. Ta samica ma w macicy tylko jedno jajo (oznaczone gwiazdką). (H, I) Powiększone widoki miejsc mikroiniekcji. Kąt strzałki odpowiada przybliżeniu kąta wprowadzenia igły do iniekcji. Vulva może służyć jako punkt orientacyjny; znajduje się ona po przeciwnej stronie nicienia niż ramiona gonady. Ramiona gonady wyginają się wokół jelita, a ich końce z dzielącymi się jądrami znajdują się naprzeciwko vulvy. (H) Tylne ramię gonady; (I) przednie ramię. Można przeprowadzić iniekcję w jedno lub w oba ramiona. Dla H, I konwencje są takie same jak w G. Paski skali = 50 µm (B, D, F, H, I); 100 µm (A, C, E, G). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Przechowywać przygotowane igły w plastikowej szalce Petri o średnicy 15 cm, używając kawałka zwiniętej taśmy, aby unieruchomić igły i zapobiec osadzaniu się kurzu na ich końcówkach.
  2. Nanieść kroplę 0,7 µL mieszaniny do mikroiniekcji na otwarty koniec trzpienia. Zawiesić igłę prostopadle do półki za pomocą zwiniętego kawałka taśmy, aby w ciągu 10 min wypełnić zwężający się trzpień mieszaniną. Przygotować 2 igły jednocześnie na wypadek, gdyby pierwsza nie zadziałała.

6. Przygotowanie mikroskopu i łamanie igły

UWAGA: Mikroiniekcja odbywa się przy użyciu mikroskopu odwróconego z obiektywami 5x i 40x, wyposażonego w zestaw do mikroiniekcji służący do kontrolowania ruchu igły. Mikroskop odwrócony powinien być umieszczony na ciężkim stole lub pneumatycznym stole antywibracyjnym w celu zredukowania szumów wibracyjnych. Uchwyt igły mikroiniekcyjnej jest podłączony do azotu, który wytwarza ciśnienie niezbędne do podania mieszaniny mikroiniekcyjnej. W pobliżu znajduje się mniejszy mikroskop sekcyjny, używany do przenoszenia nicieni.

  1. Ustaw ciśnienie w zbiorniku gazu na ~40-60 psi w celu złamania igły oraz na ~30-50 psi do mikroiniekcji, w zależności od przepływu cieczy.
  2. Pod mikroskopem sekcyjnym pokryj odłamek szkła na szkiełku przykrywkowym podkładki do mikroiniekcji olejem halokarbonowym, używając standardowej platynowej pęsety do nicieni.
  3. Umieść szkiełko przykrywkowe podkładki do mikroiniekcji pod mikroskopem do mikroiniekcji i zlokalizuj pokryty olejem odłamek szkła. Ustaw odłamek szkła tak, aby jego krawędź była prostopadła do kierunku igły, aby służyła jako powierzchnia do łamania igły.
  4. Zweryfikuj pod mikroskopem sekcyjnym, czy w zwężonym trzonie igły nie ma pęcherzyków powietrza ani zanieczyszczeń. Następnie zamocuj igłę, wsuwając ją na 1-1,5 cm do uchwytu ciśnieniowego.
  5. Ustaw końcówkę igły w centrum pola widzenia mikroskopu „na oko”. Następnie, przy niskim powiększeniu, ustaw końcówkę igły w polu widzenia, prostopadle do boku odłamka szkła.
  6. Przełącz na duże powiększenie i wyrównaj końcówkę igły z krawędzią szkła, tak aby znajdowała się blisko niej, ale jej nie dotykała.
    UWAGA: Po wyciągnięciu igły są one zamknięte przez stopienie.
  7. Aby złamać końcówkę igły i umożliwić przepływ cieczy, delikatnie opukaj ją o bok kawałka szkła, wywierając jednocześnie ciągły nacisk gazu (Supplemental Figure S1). Gdy ciecz zacznie płynąć, sprawdź kształt końcówki i upewnij się, że jest ostra, a ciecz płynie swobodnie.
    UWAGA: Jeśli ciecz płynie zbyt szybko lub końcówka jest zbyt tępa, nicienie zostaną uszkodzone podczas mikroiniekcji (Video 1 oraz Figure 3A-F).
  8. Gdy ciecz będzie swobodnie wypływać z igły, przenieś preparat do mikroiniekcji pod mikroskop sekcyjny i nanieś krople 1-2 µL oleju halokarbonowego na podkładkę agarową w celu umieszczenia nicieni.
  9. Przenieś 20-30 młodych dorosłych osobników Strongyloides na płytkę NGM 2% bez bakterii na co najmniej 5 min, aby usunąć nadmiar bakterii powierzchniowych, a następnie wybierz pojedyncze nicienie do mikroiniekcji. W razie potrzeby dodawaj kolejne nicienie na płytkę NGM w trakcie wstrzykiwania.

7. Mikroiniekcja Strongyloides

  1. Używając niewielkiej ilości oleju halocarbonowego na igle do przenoszenia nicieni, wybierz młodą dorosłą samicę Strongyloides z 1-4 jajami w gonadzie z płytki NGM 2% bez bakterii.
  2. Przenieś nicienia do małej kropli oleju na podkładce agarowej. Za pomocą igły do przenoszenia delikatnie ustaw nicienia tak, aby nie był zwinięty, a gonada była widoczna i łatwo dostępna. Zwróć uwagę na kierunek gonady (Rysunek 3G).
  3. Ustaw nicienia w polu widzenia mikroskopu do mikroiniekcji. Upewnij się, że gonada znajduje się po tej samej stronie co igła i jest ustawiona tak, aby igła stykała się z gonadą pod lekkim kątem (Rysunek 3H,I).
  4. Zbliż końcówkę igły do boku nicienia w tej samej płaszczyźnie ogniskowania. Celuj w ramię gonady w pobliżu środka ciała nicienia. Użyj mikroinjektora, aby delikatnie wprowadzić igłę do gonady (Wideo 2).
  5. Natychmiast wywrzyj nacisk na igłę, aby delikatnie wypełnić całe ramię gonady roztworem DNA. Oceń wzrokowo, kiedy wstrzyknięto odpowiednią ilość płynu (Wideo 2).
    UWAGA: Wypełnienie gonady może zająć do 2 s.
  6. Wyjmij igłę i sprawdź, czy rana się zamknęła.
    UWAGA: Nicień jest zbyt uszkodzony, aby wyprodukować potomstwo, jeśli gonada wystaje przez ścianę ciała (Wideo uzupełniające S1).
  7. Powtórz czynność z drugim ramieniem gonady, jeśli jest ono widoczne.
  8. Po zakończeniu iniekcji szybko sprawdź, czy igła nie jest zapchana, wywierając nacisk końcówką igły na podkładkę agarową. Przenieś preparat z wstrzykniętym nicieniem pod mikroskop dissectingowy.
  9. Aby odzyskać wstrzykniętego nicienia, najpierw nanieś kilka kropli BU na nicienia, aby odseparować go od podkładki agarowej.
  10. Nanieś niewielką ilość bakterii HB101 na igłę do przenoszenia nicieni. Dotknij nicienia bakteriami przylegającymi do igły, aby usunąć go z cieczy.
  11. Delikatnie przenieś nicienia na płytkę regeneracyjną, czyli płytkę NGM 2% zawierającą trawnik bakterii HB101.
    UWAGA: Nicień powinien zacząć pełzać w ciągu kilku minut.
  12. Po wstrzyknięciu kilku samic dodaj z płytki źródłowej kilka niewstrzykniętych samców.
    UWAGA: Dobrym punktem wyjścia jest minimum jeden samiec na pięć samic; preferowana jest nadwyżka samców.
  13. Powtarzaj wszystkie kroki, aż do momentu wstrzyknięcia odpowiedniej liczby samic do eksperymentu.
  14. Pozostaw dorosłe osobniki na płytce regeneracyjnej przez co najmniej 1 h po iniekcji, aby umożliwić nicieniom regenerację i kopulację.

8. Odzyskiwanie i hodowla wstrzykniętych Strongyloides

  1. Należy pobrać kał w ciągu nocy od niezarażonych zwierząt gospodarzy, stosując ten sam protokół, co w przypadku zwierząt zarażonych.
  2. Wymieszać niezarażone odchody z niewielką ilością węgla aktywnego (stosunek odchodów do węgla dla tych płytek wynosi około 2:1).
  3. Wlej niewielką ilość mieszaniny kał-węgiel do szalki Petriego o średnicy 6 cm wyłożonej wilgotnym papierem filtracyjnym. Upewnij się, że mieszanina nie dotyka pokrywki szalki.
  4. Zapełnij płytkę do regeneracji BU. Używając pipety ustawionej na 3 µLprzenieś nicienie na odchody w płytce z odchodami i węglem. Umieść nicienie bezpośrednio na odchodach, a nie na węglu.
  5. Za pomocą stereomikroskopu należy sprawdzić, czy osobniki dorosłe znajdują się na płytce z węglem aktywnym i kałem.
  6. Aby hodować nicienie, należy umieścić płytkę w komorze nawilżonej, t. j.plastikowe pudełko z dopasowaną pokrywką, wyłożone wilgotnymi ręcznikami papierowymi.
    UWAGA: Po 2 dniach wystąpi mieszanina stadiów larwalnych. Po 5 dniach większość larw rozwinie się do stadium iL3; pozostanie kilka młodszych larw. Po 7 dniach wszystkie larwy powinny być w stadium iL3.

9. Zbieranie i przesiewanie larw F 1 w celu odzyskania osobników transgenicznych/knockout

  1. Za pomocą zestawu Baermanna zebrać larwy z małoskalowych płytek hodowlanych z odchodów i węgla drzewnego po wstrzyknięciu. Aby uzyskać jak największą liczbę larw, należy odczekać co najmniej 2 h przed odzyskaniem nicieni z aparatury Baermanna.
  2. Skoncentrować larwy w probówce wirówkowej o pojemności 15 mL zgodnie z krokami 4.10-4.14, a następnie przenieść larwy na małe szkiełko zegarkowe z BU.
  3. Jeśli larwy mają zostać wykorzystane do eksperymentów behawioralnych, do przesiewania należy użyć płytek NGM 2% z gęstym trawnikiem bakterii HB101.
    1. Przenieść 20-30 larw na trawnik HB101.
      UWAGA: Bakterie spowolnią ruch larw.
    2. Pod fluorescencyjnym mikroskopem stereotypowym zidentyfikować larwy wykazujące ekspresję interesującego transgenu. Używając igły do nicieni, wybrać larwy transgeniczne i przenieść je na małe szkiełko zegarkowe z BU.
    3. Użyć nowej płytki HB101 do przesiewania kolejnej małej partii larw. Po zebraniu wystarczającej liczby larw do celów eksperymentalnych, potraktować płytki HB101 oraz nadmiar nicieni rozcieńczonym jodkiem (50% jod Lugola rozcieńczonego w wodzie) i zutylizować jako odpady biologiczne. Alternatywnie, nadmiar nicieni można zabić za pomocą skoncentrowanego środka do czyszczenia kojców zawierającego chlorki alkilobenzyloamoniowe.
    4. Użyć nicieni niezwłocznie lub pozostawić je na noc w płytkim szkiełku zegarkowym w niewielkiej ilości BU.
      UWAGA: Nicienie mogą doznać hipoksji, jeśli warstwa cieczy będzie zbyt głęboka. Pozostawienie larw w BU na noc może wpłynąć na niektóre zachowania; dlatego w eksperymentach behawioralnych należy wykorzystać larwy w ciągu 6 h.
  4. Jeśli larwy mają zostać wykorzystane do mikroskopii, a nie do testów behawioralnych, unieruchomić nicienie odwracalnie poprzez paraliż nikotynowy w celu przesiewania.
    1. Używając żyletki, naciąć siatkę na plastikowym dnie płytki do chemotaksji o średnicy 10 cm12, aby łatwiej śledzić położenie nicieni na płytce.
    2. Nanosić ~3 µL zawiesiny larw w BU do kwadratu na siatce. Wypełnić tyle kwadratów, ile jest potrzebne. Nie używać kwadratów blisko krawędzi płytki, ponieważ larwy mogą pełznąć do boków płytki.
    3. Dodać krople 15-20 µL 1% nikotyny w wodzie do kropel z nicieniami.
      UWAGA: Po 4 min nicienie zostaną sparaliżowane.
    4. Przesiać nicienie, używając fluorescencyjnego mikroskopu stereotypowego.
    5. Używając igły do nicieni, przenieść larwy transgeniczne do małego szkiełka zegarkowego z 1-2 mL BU.
      UWAGA: Larwy pozostaną sparaliżowane przez kilka godzin i mogą być łatwo zamontowane na szkiełkach mikroskopowych do mikroskopii. Jeśli zostaną pozostawione na noc w BU, iL3 odzyskają sprawność i mogą być użyte do niektórych testów lub zakażania gospodarza ssącego. Jednakże paraliż nikotynowy i inkubacja nocna w BU mogą wpływać na niektóre zachowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Jeśli eksperyment zakończył się sukcesem, larwy F1 będą wykazywać transgen i/lub interesujący fenotyp mutanta (Rysunek 4). Jednakże wskaźniki transformacji są bardzo zmienne i zależą od konstruktów, stanu zdrowia nicieni, warunków hodowli po iniekcji oraz umiejętności eksperymentatora. Generalnie udany eksperyment daje >15 larw F1 na jedną iniektowaną samicę i wskaźnik transformacji >3% dla markerów fluorescencyjnych. Jeśli całkowita liczba żyjącego potomstwa wyno...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ten protokół mikroiniekcji szczegółowo opisuje metody wprowadzania konstruktów do transgenezy i mutagenezy za pośrednictwem CRISPR/Cas9 do S. stercoralis i S. ratti. Zarówno w przypadku S. stercoralis , jak i S. ratti, przeżycie po wstrzyknięciu oraz tempo transgenezy lub mutagenezy podlegają kilku zmiennym, które można precyzyjnie dostosować.

Pierwszą krytyczną kwestią dla udanej transgenezy jest to, jak zbudowane są transgeny plazmidowe. Wcześniejsze badan...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

pPV540 i pPV402 były miłymi prezentami od dr Jamesa Loka z University of Pennsylvania. Dziękujemy Astrze Bryant za pomocne komentarze do manuskryptu. Praca ta została sfinansowana przez Burroughs-Wellcome Fund Investigators in the Pathogenesis of Disease Award, Howard Hughes Medical Institute Faculty Scholar Award oraz National Institutes of Health R01 DC017959 (E.A.H.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
(−)-Nikotyna, ≥ 99% (GC), płynnaSigma-AldrichN3876-5MLnikotyna na paraliżujące robaki
3-calowy żelazny zacisk C, 3" x 2" (pojemność x głębokość)VWR470121-790C-clamp do bezpiecznego montażu na stole
Agaroza LEPhenixRBA-500do szkiełek
Zwęglenie kostne, wiadro 4 lb, siatka 10 x 28 WęgielEbonexn/ado kultur
kałowo-drzewnychZwęglenie kostne, granulki, siatka 10 x 28Readebonechar10x28węgiel drzewny do kultur kałowych (alternatywa dla powyższego)
Mikromanipulator gruboziarnistyNarishigeMMN-1mikromanipulator gruboziarnisty
Corning Costar Spin-X Filtry probówkowe do wirówekFisher07-200-385
Szkło nakrywkowe, 48 x 60 mm, grubość nr 1Brain Research Lab4860-1 (48 x 60 mm)
Głębokie szalki Petriego, wersja ciężka z 6 otworami wentylacyjnymi, średnica 100 mmVWR82050-91810 cm szalki Petriego (do kultur kału węgla drzewnego)
Podstawa retorty Eisco z prętemStojak Fisher12-000-101do aparatu Baermann
Eppendorf FemtoJet mikrowtryskiwacz końcówki do mikroładowarekVWR89009-310do napełniania igieł do mikroiniekcji
Fisherbrand podkładki chłonne FisherbrandFisher14-206-62papier stołowy (do przygotowania)
Pierścienie żeliwne FisherbrandFisher14-050CQO-ring Baermann
Fisherbrand trójkątne zlewki polipropylenowe Fisher14-955-111FZlewka plastikowa (do mieszania)
Zlewki polipropylenowe trójkątne FisherbrandFisher14-955-111FZlewka plastikowa (do wiadra na wodę/wiadra na wodę)
Trójkątne zlewki polipropylenowe FisherbrandFisher14-955-111FPlastikowa zlewka (x2) (do wykonania uchwytu)
Żywica epoksydowa Gorilla w strzykawceMcMaster-Carr7541A51(do mocowania rurki)
Olej halowęglowy 700Sigma-AldrichH8898-50MLhalowęglowy
Wysokotemperaturowe rurki z gumy silikonowej do żywności i napojów, 1/2" ID, 5/8" ODMcMaster-Carr3038K24rurka (do lejka)
Lejki KIMAX, długi trzpień, 60° Kąt, Kimble ChaseVWR89001-414Lejek Baermann
Kimberly-Clark Professional Ochraniacze stołowe Kimtech SciencePapier15-235-101(do przygotowania)
Mikroskop stereoskopowy Leica z fluorescencją Mikroskop stereoskopowyLeicaM165 FCGFP do identyfikacji i sortowania transgenicznych robaków
microINJECTOR mosiężny uchwyt na igłę z prostym ramieniemTritechMINJ-4uchwyt igły do mikroiniekcji
system mikrowtryskiwaczyTritechmikroiniekcjiMINJ-1
Myszoskoczki mongolskieCharles River Laboratories213-myszoskoczki mongolskiedo utrzymania S. stercoralis, samce 4-6 tygodni
Worki łatwe do zamknięcia Nasco Whirl-Pak, 18 uncjiVWR11216-776Whirl-Pak
Tiul nylonowy (siateczka)Tkaniny Jo-Annzprd_14061949asiatka nylonowa do uchwytu Baermann
Drut platynowy, 36 Gauge, na calDrut platynowo-irydowyThomas Scientific1233S72
ślimakowych Purytańskie depresory do języka, 152 mm (dł.) x 17,5 mm (szer.)VWR62505-007(do mieszania próbek)
Zestaw QIAprep Spin Miniprep (250)Zestaw
do miniprepu QIAGEN 27106 QIAGENSzczury-Long EvansEnvigo140 HsdBlu:LE Długieszczury Evans do utrzymania S. ratti, samica 4-6 tygodni
Szczury-Sprague DawleyEnvigo002 Hsd:Sprague Dawley SDdo utrzymania S. ratti, samica 4-6 tygodni
Naprawdę przydatne pudełka półprzezroczyste pudełka do przechowywania z pokrywkami, pojemność 1,6 l, 7-5/8" x 5-5/16" x 4-5/16" OfficeDepot452369plastikowe pudełka do komory
nawilżanejTablica techniczna Shepherd, 8 x 16,5 calaNewco999589techboard
Podłoga z drutu podniesionego ze stali nierdzewnejAncareR20SSRWFdruciane dna klatki
Kompostowalne łyżki do sztućców StalkMarket, 6", białe, opakowanie 1,000łyżek9587303Office Depot
Naczynie do studzienek, 37 x 25 mmCarolina (Science)741012okulary do zegarków (małe, okrągłe)
Mikroskop stereoskopowyMoticK-400Luneta preparcyjna
Torba do przechowywania, kolor przezroczysty/biały, wysokość zewnętrzna 4-7/8 cala, długość zewnętrzna 13-5/8 cala, SterylizatorGrainger53GN16plastikowe pudełka do komory nawilżanej
Ściągacz do mikropipet Sutter P-30ŚciągaczP-30/Pz filamentem platynowo-irydowym
Okulary do zegarków SyracuseFisherS34826okulary zegarkowe (duże, okrągłe)
Zaciski stałokątne Thermo Scientific CastaloyZaciski05-769-2Q(2x)
Trójosiowy mikromanipulator hydrolizacyjny z joystickiem wiszącymNarishigeMM0-4precyzyjny mikromanipulator
United Zaciski zaciskowe MohrFisherS99422Zaciski zaciskowe (2x)
Wentylowane, szalki Petriego z ostrymi krawędziami (średnica 60 mm)Tritech ResearchT3308P6 cm szalki Petriego (do małych kultur kału i węgla drzewnego)
Lekkie wycieraczki do tkanek VWRVWR82003-820z uchwytem Baermann
, kwadratowa, 1-5/8 wKarolinie (Nauka)Okulary zegarkowe 742300(małe, kwadratowe)
Gładkie koła Whatman klasy jakościowej, klasa 1, średnica 5,5 cmBibuła09-805B(do 6 cm Petriego naczynia)
Gładkie koła Whatman klasy jakościowej, klasa 1, średnica 9 cmFisher09-805D(na szalki Petriego 10 cm)
Kapilara ze szkła borokrzemianowego World Precision Instrument, 1,2 mm x 4 cale KapilaryFisher50-821-813do igieł do mikroiniekcji
Noże X-Acto, nr 1 Nóż z ostrzem nr 11 OfficeDepot238816Noże X-Acto bez ostrzy do trzymania wykałaczek ślimakowych
Zeiss AxioObserver A1odwróconyZeissn/a
drzewny Szkiełka nakrywkowe Klej olej stołowy Fisher System Worki na próbki do kilofów Pałeczki drewniane do LED igieł Sutter lejkowe Fisher Podszewka do szkiełka zegarka filtracyjna Fisher Bibuła filtracyjna szklane Mikroskop

Bibliografia

  1. Krolewiecki, A. J., et al. A public health response against Strongyloides stercoralis: time to look at soil-transmitted helminthiasis in full. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (5), 2165(2013).
  2. Buonfrate, D., et al. The global prevalence of Strongyloides stercoralis infection. Pathogens. 9 (6), 468(2020).
  3. Castelletto, M. L., Gang, S. S., Hallem, E. A. Recent advances in functional genomics for parasitic nematodes of mammals. Journal of Experimental Biology. 223, Pt Suppl 1 206482(2020).
  4. Evans, T. C., et al. Transformation and microinjection. WormBook. , ed. The C. elegans Research Communnity (2006).
  5. Lok, J. B., Unnasch, T. R., et al. Transgenesis in animal parasitic nematodes: Strongyloides spp. and Brugia spp. WormBook. , ed. The C. elegans Research Communnity (2013).
  6. Shao, H. G., Li, X. S., Lok, J. B. Heritable genetic transformation of Strongyloides stercoralis by microinjection of plasmid DNA constructs into the male germline. International Journal for Parasitology. 47 (9), 511-515 (2017).
  7. Schafer, T. W., Skopic, A. Parasites of the small intestine. Current Gastroenterology Reports. 8 (4), 312-320 (2006).
  8. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. The C. elegans Research Community, WormBook. , (2006).
  9. Gang, S. S., et al. Targeted mutagenesis in a human-parasitic nematode. PLoS Pathogens. 13 (10), 1006675(2017).
  10. Lok, J. B. Strongyloides stercoralis: a model for translational research on parasitic nematode biology. The C. elegans Research Community, WormBook. , (2007).
  11. Hawdon, J. M., Schad, G. A. Long-term storage of hookworm infective larvae in buffered saline solution maintains larval responsiveness to host signals. Proceedings of the Helminthological Society of Washington (USA). 58 (1), 140-142 (1991).
  12. Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74 (3), 515-527 (1993).
  13. Junio, A. B., et al. Strongyloides stercoralis: cell- and tissue-specific transgene expression and co-transformation with vector constructs incorporating a common multifunctional 3' UTR. Experimental Parasitology. 118 (2), 253-265 (2008).
  14. Gang, S. S., et al. Chemosensory mechanisms of host seeking and infectivity in skin-penetrating nematodes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (30), 17913-17923 (2020).
  15. Bryant, A. S., et al. A critical role for thermosensation in host seeking by skin-penetrating nematodes. Current Biology. 28 (14), 2338-2347 (2018).
  16. Lok, J. B. Nucleic acid transfection and transgenesis in parasitic nematodes. Parasitology. 139 (5), 574-588 (2012).
  17. Shao, H., et al. Transposon-mediated chromosomal integration of transgenes in the parasitic nematode Strongyloides ratti and establishment of stable transgenic lines. PLoS Pathogens. 8 (8), 1002871(2012).
  18. Lok, J. piggyBac: a vehicle for integrative DNA transformation of parasitic nematodes. Mobile Genetic Elements. 3 (2), 24417(2013).
  19. Li, X., et al. Successful transgenesis of the parasitic nematode Strongyloides stercoralis requires endogenous non-coding control elements. International Journal for Parasitology. 36 (6), 671-679 (2006).
  20. Bryant, A. S., Hallem, E. A. The Wild Worm Codon Adapter: a web tool for automated codon adaptation of transgenes for expression in non-Caenorhabditis nematodes. G3. 3 (7), (2021).
  21. Crane, M., et al. In vivo measurements reveal a single 5'-intron is sufficient to increase protein expression level in Caenorhabditis elegans. Scientific Reports. 9 (1), 9192(2019).
  22. Han, Z., et al. Improving transgenesis efficiency and CRISPR-associated tools through codon optimization and native intron addition in Pristionchus nematodes. Genetics. 216 (4), 947-956 (2020).
  23. Adams, S., Pathak, P., Shao, H., Lok, J. B., Pires-daSilva, A. Liposome-based transfection enhances RNAi and CRISPR-mediated mutagenesis in non-model nematode systems. Scientific Reports. 9 (1), 483(2019).
  24. Dulovic, A., Puller, V., Streit, A. Optimizing culture conditions for free-living stages of the nematode parasite Strongyloides ratti. Experimental Parasitology. 168, 25-30 (2016).
  25. Harvey, S. C., Gemmill, A. W., Read, A. F., Viney, M. E. The control of morph development in the parasitic nematode Strongyloides ratti. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 267 (1457), 2057-2063 (2000).
  26. Kim, A., Pyykko, I. Size matters: versatile use of PiggyBac transposons as a genetic manipulation tool. Molecular and Cellular Biochemistry. 354 (1-2), 301-309 (2011).
  27. Lok, J. B., Shao, H., Massey, H. C., Li, X. Transgenesis in Strongyloides and related parasitic nematodes: historical perspectives, current functional genomic applications and progress towards gene disruption and editing. Parasitology. 144 (3), 327-342 (2017).
  28. Farboud, B., Meyer, B. J. Dramatic enhancement of genome editing by CRISPR/Cas9 through improved guide RNA design. Genetics. 199 (4), 959-971 (2015).
  29. Cheong, M. C., et al. Identification of a nuclear receptor/coactivator developmental signaling pathway in the nematode parasite Strongyloides stercoralis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (8), 2021864118(2021).
  30. Nolan, T. J., Megyeri, Z., Bhopale, V. M., Schad, G. A. Strongyloides stercoralis: the first rodent model for uncomplicated and hyperinfective strongyloidiasis, the Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus). Journal of Infectious Diseases. 168 (6), 1479-1484 (1993).
  31. Li, X., et al. Transgenesis in the parasitic nematode Strongyloides ratti. Molecular and Biochemical Parasitology. 179 (2), 114-119 (2011).
  32. Viney, M. E. Exploiting the life cycle of Strongyloides ratti. Parasitology Today. 15 (6), 231-235 (1999).
  33. Stoltzfus, J. D., Massey, H. C., Nolan, T. J., Griffith, S. D., Lok, J. B. Strongyloides stercoralis age-1: a potential regulator of infective larval development in a parasitic nematode. PLoS ONE. 7 (6), 38587(2012).
  34. Castelletto, M. L., Massey, H. C., Lok, J. B. Morphogenesis of Strongyloides stercoralis infective larvae requires the DAF-16 ortholog FKTF-1. PLoS Pathogens. 5 (4), 1000370(2009).
  35. Douglas, B., et al. Transgenic expression of a T cell epitope in Strongyloides ratti reveals that helminth-specific CD4+ T cells constitute both Th2 and Treg populations. PLoS Pathogens. 17 (7), 1009709(2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Transgeniczne Strongyloidesknockauty Strongyloidesmikrowstrzykiwanie wewn trzgonadalnemutageneza CRISPR Cas9nicienie paso ytniczemikrowstrzykiwanie DNAselekcja larw transgenicznychinterakcja gospodarz paso ytanaliza funkcji gen wpod o e wzrostowe dla nicieni
Generowanie transgeników i nokautów u gatunków Strongyloides za pomocą mikroiniekcji
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.