Rekonstrukcja i analiza 3D cienkich subkomórkowych struktur neuronalnych przy użyciu danych ze skaningowej mikroskopii elektronowej ze skupioną wiązką jonów

Summary

Elastyczny metodologiczny potok do identyfikacji, wizualizacji i ilościowego określania cienkich subkomórkowych procesów neuronalnych w objętościach obrazów mikroskopii elektronowej skaningowej z użyciem przyjaznych dla użytkownika pakietów oprogramowania open-source.

Abstract

Ostatnie postępy w technologii skaningowego mikroskopu elektronowego pozwalają teraz na szybką trójwymiarową (3D) analizę ultracienkich procesów subkomórkowych. W tym miejscu przedstawiono metodologiczny potok do identyfikacji, wizualizacji i analizy cienkich procesów neuronalnych, takich jak te, które rzutują do presynaptycznych bulionów innych neuronów (zwanych "kolcami"). Korzystając z ogólnodostępnych pakietów oprogramowania, protokół ten pokazuje, jak używać drzewa decyzyjnego do identyfikacji wspólnych neuronalnych struktur subkomórkowych przy użyciu kryteriów morfologicznych w objętościach obrazów mikroskopii elektronowej ze skaningową wiązką jonów (FIB-SEM), ze szczególnym uwzględnieniem identyfikacji różnorodności spinuli rzutujących na butony presynaptyczne. W szczególności protokół ten opisuje, w jaki sposób śledzić spinule w synapsach neuronalnych w celu wytworzenia rekonstrukcji 3D tych cienkich projekcji subkomórkowych, ich macierzystych neurytów i partnerów postsynaptycznych. Dodatkowo protokół zawiera listę ogólnodostępnych programów typu open source do analizy danych FIB-SEM i oferuje wskazówki (np. wygładzanie, oświetlenie) dotyczące ulepszania rekonstrukcji 3D do wizualizacji i publikacji. Ten adaptowalny protokół stanowi punkt wyjścia do szybkiej analizy struktur subkomórkowych w nanoskali w objętościach obrazów FIB-SEM.

Introduction

Badania nad relacjami struktura-funkcja nanometrowych komponentów subkomórkowych często korzystają z wizualizacji i analizy 3D¹. Jednak badania nad mikroskopią elektronową z transmisją przekroju szeregowego były ograniczone czasowo i przestrzennie przez konieczność użycia noża diamentowego do cięcia i wyrównywania setek do tysięcy seryjnych ultracienkich odcinków ≥40 nm. Ograniczenia te ograniczyły możliwość próbkowania i efektywnej analizy cienkich (<40 nm średnicy) struktur subkomórkowych, a konieczność osiągnięcia biegłości w ultracienkim szeregowym cięciu utrudniła zastosowanie analiz strukturalnych 3D^2,

Protocol

1. Dane dotyczące objętości obrazu i rozmiar obiektu subkomórkowego: rozważania i rejestracja

1. Uzyskaj wysokiej jakości objętość obrazu FIB-SEM obszaru zainteresowania zawierającego subkomórkowe obiekty zainteresowania.
   UWAGA: Protokół ten wykorzystuje segmenty objętości obrazu FIB-SEM z pierwszorzędowej kory wzrokowej fretki w późnym okresie dojrzewania (24,2 x 16,2 x 2,4 μm, woksele izotropowe 4 nm) oraz swobodnie dostępną objętość FIB-SEM z hipokampa CA1 dorosłego szczura (10,2 x 7,7 x 5,3 μm; woksele izotropowe 5 nm) udostępnione przez laboratorium Knott (https://www.epfl.ch/labs/cvlab/data/data-em/). Bardzo ważne jest przygotowanie bloków tkanko....

Results

Ilościowe określenie procentu kolców synaptycznych w populacji pobudzających presynaptycznych boutonów w pierwotnej korze wzrokowej fretek
Chociaż od dziesięcioleci obserwowano wrzecionowate wypukłości neurytów do pobudzających bulionów presynaptycznych^19,26, ich potencjalne znaczenie dla funkcji synaptycznych pozostaje niejasne. Eksperymenty te miały na celu określenie proporcji pobudzających butonów presynaptycznych zawierających spinule w .......

Discussion

Ten potok analizy objętości obrazu FIB-SEM może tworzyć wiarygodne rekonstrukcje 3D i pomiary ilościowe cienkich struktur subkomórkowych. Podczas gdy obecne półautomatyczne techniki wykorzystujące algorytmy głębokich sieci neuronowych i segmentacji mogą zwiększyć szybkość i wydajność rekonstrukcji struktur komórkowych o stosunkowo wysokim kontraście błonowym w dużych objętościach obrazu³³, wiele struktur subkomórkowych (np. kolce, gładka retikula endoplazmatyczna, endosomy) pozostanie trudnych do .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fidżi (ImageJ)			https://imagej.net/software/fiji/downloads
Rekonstrukcja			https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0
Blender	Blender Foundation		https:/www.blender.org