Elastyczny metodologiczny potok do identyfikacji, wizualizacji i ilościowego określania cienkich subkomórkowych procesów neuronalnych w objętościach obrazów mikroskopii elektronowej skaningowej z użyciem przyjaznych dla użytkownika pakietów oprogramowania open-source.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Rekonstrukcja i analiza 3D cienkich subkomórkowych struktur neuronalnych przy użyciu danych ze skaningowej mikroskopii elektronowej ze skupioną wiązką jonów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ostatnie postępy w technologii skaningowego mikroskopu elektronowego pozwalają teraz na szybką trójwymiarową (3D) analizę ultracienkich procesów subkomórkowych. W tym miejscu przedstawiono metodologiczny potok do identyfikacji, wizualizacji i analizy cienkich procesów neuronalnych, takich jak te, które rzutują do presynaptycznych bulionów innych neuronów (zwanych "kolcami"). Korzystając z ogólnodostępnych pakietów oprogramowania, protokół ten pokazuje, jak używać drzewa decyzyjnego do identyfikacji wspólnych neuronalnych struktur subkomórkowych przy użyciu kryteriów morfologicznych w objętościach obrazów mikroskopii elektronowej ze skaningową wiązką jonów (FIB-SEM), ze szczególnym uwzględnieniem identyfikacji różnorodności spinuli rzutujących na butony presynaptyczne. W szczególności protokół ten opisuje, w jaki sposób śledzić spinule w synapsach neuronalnych w celu wytworzenia rekonstrukcji 3D tych cienkich projekcji subkomórkowych, ich macierzystych neurytów i partnerów postsynaptycznych. Dodatkowo protokół zawiera listę ogólnodostępnych programów typu open source do analizy danych FIB-SEM i oferuje wskazówki (np. wygładzanie, oświetlenie) dotyczące ulepszania rekonstrukcji 3D do wizualizacji i publikacji. Ten adaptowalny protokół stanowi punkt wyjścia do szybkiej analizy struktur subkomórkowych w nanoskali w objętościach obrazów FIB-SEM.
Wprowadzenie
Badania nad relacjami struktura-funkcja nanometrowych komponentów subkomórkowych często korzystają z wizualizacji i analizy 3D1. Jednak badania nad mikroskopią elektronową z transmisją przekroju szeregowego były ograniczone czasowo i przestrzennie przez konieczność użycia noża diamentowego do cięcia i wyrównywania setek do tysięcy seryjnych ultracienkich odcinków ≥40 nm. Ograniczenia te ograniczyły możliwość próbkowania i efektywnej analizy cienkich (<40 nm średnicy) struktur subkomórkowych, a konieczność osiągnięcia biegłości w ultracienkim szeregowym cięciu utrudniła zastosowanie analiz strukturalnych 3D2,
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Dane dotyczące objętości obrazu i rozmiar obiektu subkomórkowego: rozważania i rejestracja
- Uzyskaj wysokiej jakości objętość obrazu FIB-SEM obszaru zainteresowania zawierającego subkomórkowe obiekty zainteresowania.
UWAGA: Protokół ten wykorzystuje segmenty objętości obrazu FIB-SEM z pierwszorzędowej kory wzrokowej fretki w późnym okresie dojrzewania (24,2 x 16,2 x 2,4 μm, woksele izotropowe 4 nm) oraz swobodnie dostępną objętość FIB-SEM z hipokampa CA1 dorosłego szczura (10,2 x 7,7 x 5,3 μm; woksele izotropowe 5 nm) udostępnione przez laboratorium Knott (https://www.epfl.ch/labs/cvlab/data/data-em/). Bardzo ważne jest przygotowanie bloków tkanko....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Kwantyfikacja procentowego udziału kolców synaptycznych w populacji pobudzających zakończeń presynaptycznych w pierwotnej korze wzrokowej fretki
Chociaż wypustki przypominające kolce, rozciągające się z neurytów do pobudzających zakończeń presynaptycznych, były obserwowane od dziesięcioleci19,26, ich potencjalne znaczenie dla funkcji synaptycznej pozostawało niejasne. Niniejsze eksperymenty zostały zaprojektowane w celu określenia proporcji p.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Ten potok analizy objętości obrazu FIB-SEM może tworzyć wiarygodne rekonstrukcje 3D i pomiary ilościowe cienkich struktur subkomórkowych. Podczas gdy obecne półautomatyczne techniki wykorzystujące algorytmy głębokich sieci neuronowych i segmentacji mogą zwiększyć szybkość i wydajność rekonstrukcji struktur komórkowych o stosunkowo wysokim kontraście błonowym w dużych objętościach obrazu33, wiele struktur subkomórkowych (np. kolce, gładka retikula endoplazmatyczna, endosomy) pozostanie trudnych do .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez University of Washington Bridge Fund oraz University of Washington Tacoma Pilot RRF Fund. Serdeczne podziękowania dla dr Claudii Lopez i dr Jessiki Riesterer z MMC na Oregon Health & Sciences University za wsparcie techniczne FIB-SEM, dr Grahama Knotta za wykorzystanie objętości obrazu CA1 FIB-SEM oraz studentom UW Tacoma na kursie Rekonstrukcje neuronalne (TBIOMD 495) za ich cierpliwość i doskonałość w pracy z tym protokołem.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Fidżi (ImageJ) | https://imagej.net/software/fiji/downloads | ||
| Rekonstrukcja | https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0 | ||
| Blender | Blender Foundation | https:/www.blender.org |
Bibliografia
- Holler, S., Kostinger, G., Martin, K. A. C., Schuhknecht, G. F. P., Stratford, K. J. Structure and function of a neocortical synapse. Nature. 591 (7848), 111-116 (2021).
- Xu, C. S., Pang, S., Hayworth, K. J., Hess, H. F. Transforming FIB-SEM. Volume microscopy: Multiscale imaging with photons, electrons, and io....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
