Rekonstrukcja i analiza 3D cienkich subkomórkowych struktur neuronalnych przy użyciu danych ze skaningowej mikroskopii elektronowej ze skupioną wiązką jonów

Summary

Elastyczny metodologiczny potok do identyfikacji, wizualizacji i ilościowego określania cienkich subkomórkowych procesów neuronalnych w objętościach obrazów mikroskopii elektronowej skaningowej z użyciem przyjaznych dla użytkownika pakietów oprogramowania open-source.

Abstract

Ostatnie postępy w technologii skaningowego mikroskopu elektronowego pozwalają teraz na szybką trójwymiarową (3D) analizę ultracienkich procesów subkomórkowych. W tym miejscu przedstawiono metodologiczny potok do identyfikacji, wizualizacji i analizy cienkich procesów neuronalnych, takich jak te, które rzutują do presynaptycznych bulionów innych neuronów (zwanych "kolcami"). Korzystając z ogólnodostępnych pakietów oprogramowania, protokół ten pokazuje, jak używać drzewa decyzyjnego do identyfikacji wspólnych neuronalnych struktur subkomórkowych przy użyciu kryteriów morfologicznych w objętościach obrazów mikroskopii elektronowej ze skaningową wiązką jonów (FIB-SEM), ze szczególnym uwzględnieniem identyfikacji różnorodności spinuli rzutujących na butony presynaptyczne. W szczególności protokół ten opisuje, w jaki sposób śledzić spinule w synapsach neuronalnych w celu wytworzenia rekonstrukcji 3D tych cienkich projekcji subkomórkowych, ich macierzystych neurytów i partnerów postsynaptycznych. Dodatkowo protokół zawiera listę ogólnodostępnych programów typu open source do analizy danych FIB-SEM i oferuje wskazówki (np. wygładzanie, oświetlenie) dotyczące ulepszania rekonstrukcji 3D do wizualizacji i publikacji. Ten adaptowalny protokół stanowi punkt wyjścia do szybkiej analizy struktur subkomórkowych w nanoskali w objętościach obrazów FIB-SEM.

Introduction

Badania nad relacjami struktura-funkcja nanometrowych komponentów subkomórkowych często korzystają z wizualizacji i analizy 3D¹. Jednak badania nad mikroskopią elektronową z transmisją przekroju szeregowego były ograniczone czasowo i przestrzennie przez konieczność użycia noża diamentowego do cięcia i wyrównywania setek do tysięcy seryjnych ultracienkich odcinków ≥40 nm. Ograniczenia te ograniczyły możliwość próbkowania i efektywnej analizy cienkich (<40 nm średnicy) struktur subkomórkowych, a konieczność osiągnięcia biegłości w ultracienkim szeregowym cięciu utrudniła zastosowanie analiz strukturalnych 3D^2,3. Jednak ostatnie postępy w skaningowej mikroskopii elektronowej ze skupioną wiązką jonów (FIB-SEM) zrewolucjonizowały szybkość i rozdzielczość uzyskiwanych objętości obrazu, a teraz umożliwiają ilościową analizę cienkich struktur subkomórkowych, takich jak gładka retikula endoplazmatyczna^4,5, synapsy neuronalne^3,6 i pęcherzyki synaptyczne^7,8 na dużą skalę. Ponadto szersze wykorzystanie woluminów obrazów FIB-SEM przyspieszyło rozwój ogólnodostępnych repozytoriów woluminów obrazów FIB-SEM⁹ oraz oprogramowania do analizy 3D (np. Espina¹⁰, IMOD¹¹, Neuromorph¹², Reconstruct¹³, TrakEM¹⁴), które rozszerzają zasięg tej technologii i umożliwiają obecnie badania nad strukturą i funkcją drobnych struktur subkomórkowych.

Jedną z takich nanoskalowych cech subkomórkowych jest neuronalny 'spinule' synaptyczny. Spinule to cienkie (~0,06-0,15 μm szerokości, 0,1-1 μm długości), przypominające palce wypustki, które emanują z jednego neuronu i zostają otoczone przez neuryt (np. bulon presynaptyczny) innego neuronu^15,16. Spinule osadzone w procesach neuronalnych są opisywane w literaturze mikroskopii elektronowej od prawie 60 lat¹⁷, a wypukłości przypominające spinule są konserwatywne^18,19,20 i ubiquitous^21,22 cecha synaps pobudzających. Niemniej jednak, pomimo wszechobecności kolców synaptycznych, ich funkcja (funkcje) pozostaje niejasna i brakuje niezbędnych danych, aby wyjaśnić ich obfitość i zachowanie strukturalne. Ten brak eksperymentalnej charakterystyki spinuli wynika głównie z trudności w ilościowej analizie rozpowszechnienia i rozmiarów spinuli. Ich niewielkie wymiary najlepiej nadają się do analiz z wykorzystaniem nieosiągalnej wcześniej rozdzielczości z (głębokości) (tj. ≤15 nm).

Tutaj prezentowany jest potok analizy FIB-SEM do identyfikacji, wizualizacji i analizy cienkich (o przekrojach poprzecznych ≤40 nm szerokości) struktur subkomórkowych, które mogą służyć jako punkt wyjścia zarówno dla nowicjuszy FIB-SEM, jak i ekspertów. Protokół ten służy jako podstawa do identyfikacji neuronalnych struktur subkomórkowych w objętości obrazu 3D FIB-SEM, kładąc nacisk na to, jak używać określonych kryteriów do rozpoznawania i klasyfikowania podtypów spinuli i synaps. Ponadto protokół pokazuje, jak importować objętości obrazów do bezpłatnej platformy oprogramowania do analizy 3D (Reconstruct), używać tego oprogramowania do śledzenia spinuli w pobudzających synapsach neuronalnych i tworzenia rekonstrukcji 3D tych subkomórkowych projekcji, ich macierzystych neurytów i otaczających presynaptycznych boutonów. Wreszcie, protokół pokazuje, jak korzystać z bezpłatnego oprogramowania do rozdzierania 3D o otwartym kodzie źródłowym (Blender) do wygładzania "skóry" na rekonstrukcjach 3D w celu wizualizacji i potencjalnej publikacji, szczegółowo opisując zalety i potencjalne pułapki tej techniki.

Protocol

1. Dane dotyczące objętości obrazu i rozmiar obiektu subkomórkowego: rozważania i rejestracja

1. Uzyskaj wysokiej jakości objętość obrazu FIB-SEM obszaru zainteresowania zawierającego subkomórkowe obiekty zainteresowania.
   UWAGA: Protokół ten wykorzystuje segmenty objętości obrazu FIB-SEM z pierwszorzędowej kory wzrokowej fretki w późnym okresie dojrzewania (24,2 x 16,2 x 2,4 μm, woksele izotropowe 4 nm) oraz swobodnie dostępną objętość FIB-SEM z hipokampa CA1 dorosłego szczura (10,2 x 7,7 x 5,3 μm; woksele izotropowe 5 nm) udostępnione przez laboratorium Knott (https://www.epfl.ch/labs/cvlab/data/data-em/). Bardzo ważne jest przygotowanie bloków tkankowych do FIB-SEM przy użyciu protokołu, który zachowuje szczegóły ultrastrukturalne i zapewnia wysoki kontrast w warunkach obrazowania FIB-SEM^23,24. Co ważne, tkanka powinna być zobrazowana w taki sposób, aby wynikowa rozdzielczość woksela obrazu FIB-SEM wynosiła <0,5 × wielkości średnicy najmniejszej interesującej nas struktury subkomórkowej. Na przykład, ponieważ miejsca wystania spinuli do presynaptycznych boutonów mogą mieć średnicę zaledwie 30 nm, rozmiar woksela <15 nm byłby odpowiedni do pobrania próbek tych struktur powyżej kryterium Nyquista. Ponadto przydatne jest obrazowanie tkanek w rozdzielczości izotropowej (równej we wszystkich wymiarach) (np. woksele 5 x 5 x 5 nm), aby umożliwić wizualizację i rekonstrukcję drobnych struktur, które mają równe wymiary we wszystkich płaszczyznach x/y/z.
2. Pobierz i zainstaluj aplikację ImageJ²⁵ (https://imagej.net/software/fiji/downloads) w dystrybucji na Fidżi.
3. Wyrównaj głośność obrazu.
   UWAGA: Podczas gdy nowoczesne systemy FIB-SEM wytwarzają z grubsza wyrównane objętości obrazu, rejestracja obraz do obrazu może nadal cierpieć z powodu dryfu subpikseli.
   1. Na Fidżi przejdź do Wtyczki | Zarejestruj się i wybierz opcję Zarejestruj wirtualne wycinki stosu. Zapoznaj się z instrukcją obsługi, aby uzyskać pomoc (https://imagej.net/Register_Virtual_Stack_Slices). Zacznij od rejestracji sztywnej, a następnie w razie potrzeby użyj techniki afinicznej.
4. Skalowanie głośności obrazu.
   1. Otwórz wyrównany wolumin obrazu na Fidżi, klikając Plik | Import | Sekwencja obrazów i przechodzenie do folderu z wyrównanymi obrazami.
   2. W oknie dialogowym kliknij opcję Sortuj nazwy numerycznie, jeśli obrazy są nazwane w kolejności numerycznej. Kliknij Użyj wirtualnego stosu, aby uzyskać szybszą wydajność Fidżi.
   3. Po otwarciu obrazu kliknij Obraz | Właściwości i wstaw fizyczny rozmiar pikseli objętości obrazu w mikrometrach w polach wysokości, szerokości i głębokości pikseli. Wpisz um OR μm w każdym z pól po prawej stronie. Zapisz ten wyrównany wolumin obrazu jako plik .tiff, klikając Plik | Zapisz jako | Tiff.
      UWAGA: Jeśli obraz został przeskalowany, górna krawędź obrazu powinna teraz wskazywać rozmiar obrazu w mikrometrach (np. 9,82 x 8,65 μm).

2. Identyfikacja neurytów i synaptycznych spinułów

1. Przewijając stos (za pomocą strzałek lub kółka myszy), zapoznaj się z drzewem decyzyjnym identyfikacji neurytów (Rysunek 1) i przykładami sekcyjnych neurytów (Rysunek 2), aby zlokalizować i zidentyfikować interesujące obiekty.
   1. Zidentyfikuj spinule synaptyczne jako wypukłości związane z błoną z neurytu, który zostaje w pełni otoczony przez neuryt presynaptyczny lub postsynaptyczny.
      UWAGA: Pozytywna identyfikacja spinuły synaptycznej wymaga wizualnego dowodu na to, że błona obiektu wystającego z spinuły wnika w błonę odwróconą struktury presynaptycznej lub postsynaptycznej oraz obecność spinuli związanej z błoną, w pełni otoczonej błoną struktury pre- lub postsynaptycznej na co najmniej jednym obrazie.
2. Tworzenie regionów zainteresowania (ROI) na Fidżi
   1. Kliknij odpowiednie narzędzie na pasku narzędzi Fidżi (np. narzędzie owalne), a następnie kliknij i przeciągnij obraz, aby utworzyć ROI. Zapisz ten zwrot z inwestycji w Menedżerze zwrotów z inwestycji, wpisując literę "T."
      UWAGA: Menedżer ROI powinien teraz pojawiać się ze współrzędnymi obrazu jako domyślną nazwą.
   2. Zmień nazwę ROI zgodnie z potrzebami, klikając przycisk Zmień nazwę w Menedżerze ROI i wpisując żądaną nazwę w wyświetlonym polu tekstowym. Zmień nazwę ROI na podstawie kryteriów ilościowych (np. 12. bouton presynaptyczny, który jest analizowany i ma dwie synapsy z kolcami postsynaptycznymi, może być nazwany B12_s,s).
      UWAGA: Aby powiązać każdy ROI z jednym "wycinkiem" obrazu (zamiast mieć go obecnym w całym stosie obrazów) i aby nazwy ROI były widoczne na pojedynczych obrazach, kliknij te opcje w Menedżerze ROI | Więcej | Opcje, a następnie kliknij pola wyboru Pokaż wszystko i Etykiety u dołu Menedżera ROI. Należy pamiętać, że ten krok ma kluczowe znaczenie w przypadku zapisywania ROI w woluminie obrazu, ponieważ skojarzenie ROI z całą objętością obrazu, a nie z pojedynczymi obrazami, może prowadzić do podwójnego zliczania obiektów w objętości.
   3. Aby zapisać wszystkie ROI znajdujące się obecnie w menedżerze ROI jako plik, najpierw kliknij przycisk Odznacz w Menedżerze ROI, kliknij przycisk Więcej i przewiń w dół do Save.
      UWAGA: Ten zapisany plik .zip można teraz otworzyć na Fidżi, aby ponownie załadować wszystkie te ROI do Menedżera ROI.

3. Określ obszar zainteresowania i przenieś objętość obrazu do oprogramowania do analizy 3D

1. Określ, czy pożądane jest przeniesienie całej objętości obrazu do oprogramowania do rekonstrukcji i analizy 3D, czy też należy utworzyć mniejszy podzbiór (patrz 3.3.2) w celu przeanalizowania mniejszej liczby obrazów i/lub obszaru zainteresowania z oryginalnego stosu.
2. Przeprowadź małe badanie "pilotażowe" na stosunkowo małym obszarze zawierającym obiekt (obiekty) będący przedmiotem zainteresowania, aby oszacować wielkość efektu i liczbę obiektów zainteresowania wymaganych do uzyskania pożądanej mocy do porównań statystycznych. Należy użyć konserwatywnego oszacowania wielkości objętości obrazu wymaganej do pobrania próbek interesujących obiektów, jeśli te obiekty subkomórkowe są nierównomiernie rozmieszczone w objętości obrazu.
3. Aby wykorzystać część objętości obrazu do analizy 3D, najpierw zduplikuj objętość obrazu, klikając Obraz | Duplikat.
   1. Aby użyć przyciętej części obrazu do analizy, wybierz narzędzie prostokąt z paska narzędzi Fidżi i narysuj żądany obszar zainteresowania; jeśli nie jest to pożądane, przejdź do następnego kroku.
   2. Przejdź do obrazu | Stosy | Narzędzia | Utwórz Substack. Wpisz zakres obrazów, które mają zostać uwzględnione w stosie podrzędnym (np. dołącz obrazy od 1 do 500, wpisując od 1 do 500) w polu tekstowym.
   3. Zapoznaj się z powyższymi rozważaniami dotyczącymi próbkowania (uwaga po 1.1), aby określić wymaganą rozdzielczość z na podstawie rozmiaru obiektu (obiektów) będącego przedmiotem zainteresowania. Na przykład, jeśli objętość obrazu ma głębokość woksela wynoszącą 5 nm, możliwe jest próbkowanie interesującego obiektu w odstępach 10 nm w wymiarze z, tak aby Fidżi zachowało każdy inny obraz w podstosie. Aby to zrobić, wpisz numer n-tego obrazu po zakresie (np. aby uwzględnić tylko każdy inny obraz w zakresie obrazów od 1 do 500, wpisz 1 - 500 - 2).
      UWAGA: Każdy pakiet oprogramowania do analizy 3D (patrz Tabela 1) będzie miał własne wymagania dotyczące importu plików. Protokół ten koncentruje się na importowaniu woluminów obrazów zapisanych jako pliki .tiff do oprogramowania do tworzenia woluminów obrazów Reconstruct.

4. 3D rekonstrukcje i analiza cienkich struktur subkomórkowych w Reconstruct

UWAGA: Korzystanie z myszy wyposażonej w kółko podczas korzystania z Rekonstrukcji jest bardzo korzystne. Ponadto, jeśli większość lub wszystkie ślady będą wykonywane ręcznie, użycie rysika do rysowania konturów na komputerze z ekranem dotykowym może znacznie zwiększyć wydajność trasowania.

1. Pobierz i zainstaluj program Reconstruct (https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0) do użytku na komputerze z systemem Microsoft Windows w środowisku natywnym lub wirtualnym.
2. Rozpocznij nową rekonstrukcję, tworząc nowy folder dla plików rekonstrukcji, klikając Seria | Nowy i zapisując tę rekonstrukcję (plik .ser) z żądaną nazwą pliku w folderze, który właśnie został utworzony.
3. Zaimportuj zapisany wolumin obrazu .tiff do programu Reconstruct.
   1. Przejdź do sekcji Seriale | Import | Obrazy, kliknij przycisk Wybierz w oknie Importuj obrazy i znajdź plik woluminu obrazu. W oknie Importowanie obrazów poszukaj plików woluminów obrazów, które są wyświetlane jako osobny wiersz dla każdego obrazu w woluminie.
   2. Ważne: W polu tekstowym Rozmiar piksela wpisz prawidłowy rozmiar piksela, który odpowiada rozmiarowi piksela x/y (w μm) objętości obrazu. Gdy to zrobisz, kliknij przycisk Importuj w oknie Importuj obrazy.
      UWAGA: Po zaimportowaniu obrazów w środku okna Reconstruct (Rekonstrukcja) powinien znajdować się obraz, a lista Import Images (Importuj obrazy) powinna być pusta.
   3. Jeśli w środku okna Reconstruct (Rekonstrukcja) znajduje się obraz, a lista Import Images (Importuj obrazy) jest pusta, kliknij przycisk Quit (Zakończ) w oknie Import Images.
   4. Ustaw grubość przekroju (tj. wysokość woksela lub wymiar z), klikając Przekrój | Wyświetl listę sekcji, podświetlając wszystkie wymienione sekcje, a następnie klikając Modyfikuj | Grubość w menu Lista przekrojów i wpisując grubość przekroju (w μm) w polu tekstowym (np. 0,005 dla przekroju o grubości 5 nm).
      UWAGA: Przypomnij sobie, że w przypadku pracy z substackiem z większego oryginalnego woluminu obrazu, który zawiera tylko co n-tą sekcję (patrz krok 3.3.3), konieczne jest uwzględnienie tych "brakujących" sekcji w całkowitej grubości sekcji. Na przykład, jeśli oryginalna grubość sekcji objętości obrazu (inaczej wysokość woksela) wynosiła 0,005 μm, a substack zawiera tylko co trzecią sekcję (np. 1-500-3), grubość sekcji tego substacka wynosi 0,015 μm (tj. 0,005 μm x 3 sekcje).
4. Zrób ślady interesujących Cię obiektów.
   1. Przejdź do sekcji Seria | Opcje | Zakładka Nazwy/Kolory, aby nadać nazwę nowemu obiektowi. Wybierz kolor konturu i wypełnienia wewnętrznego śladów obiektu, a następnie kliknij przycisk OK.
      UWAGA: Rekonstrukcja spróbuje połączyć wszystkie ślady o tej samej nazwie, co jeden obiekt. Zapoznaj się z podręcznikiem Reconstruct, aby zapoznać się z konwencjami nazewnictwa śladów (np. nie dołączaj spacji w nazwach). Kolory śladów służą jedynie do wizualizacji śladów; kolor rekonstrukcji 3D tego obiektu można później łatwo zmienić.
   2. Na pasku narzędzi wybierz narzędzie Rysuj odręcznie, które wygląda jak ołówek. Przytrzymaj lewy przycisk myszy i przeciągnij myszą, aby obrysować membranę obiektu; Puść lewy przycisk myszy, aby automatycznie uzupełnić obrys. Kliknij Page Up / Page Down lub użyj kółka myszy, aby przejść do następnej sekcji optycznej w objętości obrazu i stopniowo twórz ślady, aż struktura zostanie ukończona.
5. Śledzenie kolców synaptycznych
   UWAGA: Spinule osadzone w butonach presynaptycznych pojawiają się jako przezroczyste struktury związane z błoną, czasami z nieprzezroczystym materiałem podobnym do elektronów przypominającym aktynę i/lub fałdami błonowymi w ich wnętrzu.
   1. Przejdź przez objętość obrazu i zlokalizuj miejsce wniknięcia spinułki do bulionu presynaptycznego, uważając, aby odróżnić spinule od retikuli endoplazmatycznej, wakuoli, endosomów, autofagosomów i innych organelli subkomórkowych.
      UWAGA: W przeciwieństwie do organelli związanych z błoną, upewnij się, że spinule synaptyczne zawsze wystają z (tj. Zerwanej błony) neurytu / gleju i są odbierane przez (tj. Odwróconą błonę) strukturę pre- lub postsynaptyczną. Ten wizualny dowód na wgłębienie spinułki powinien wystąpić na obrazach ≥2, a w pełni zamknięty spinule związany błoną powinien być obecny w strukturze pre- lub postsynaptycznej na obrazie ≥1. Małe spinule mogą być pokryte klatryną. Aby odróżnić zdarzenia wgłębienia spinułki od endocytozy pokrytej klatryną do neurytu pre- lub postsynaptycznego, upewnij się, że pozytywna identyfikacja spinuli pokrytych klatryną wymaga wizualnego potwierdzenia zbieżnej błony everting z obiektu rodzicielskiego spinuli rzutującego na błonę odwracającą struktury pre- lub postsynaptycznej na tym samym obrazie.
   2. Przejdź przez objętość obrazu, aby zlokalizować miejsce projekcji/początku spinuli od jej macierzystego neurytu/gleju; zapoznaj się z Rysunek 1 i Rysunek 2, aby pomóc zidentyfikować te struktury rodzicielskie.
   3. Rozpocznij ślad spinule w miejscu wystania błony w strukturę odbiorczą (np. bulion presynaptyczny) i kontynuuj ciągnięcie spinuli tak długo, jak długo pojawia się ona jako struktura związana z błoną w otaczającym neurycie pre- lub postsynaptycznym neurycie.
   4. Kontynuuj przytrzymywanie lewego przycisku myszy (lub kontynuuj rysowanie wzdłuż błony spinuli za pomocą rysika, jeśli używasz komputera z ekranem dotykowym), jednocześnie śledząc błonę spinuli za pomocą wskaźnika myszy.
   5. Gdy dojdziesz do punktu, w którym rozpoczął się ślad, puść lewy przycisk myszy.
      UWAGA: Zbyt wczesne puszczenie lewego przycisku myszy spowoduje automatyczne uzupełnienie trasy, często z niepożądanymi skutkami. Jeśli tak się stanie, po prostu naciśnij usuń, gdy ten ślad jest podświetlony na liście śledzenia.
   6. Powtórz kroki 4.5.2-4.5.5 dla każdej sekcji, w której pojawia się spinule.
      UWAGA: Pamiętaj, aby w razie potrzeby prześledzić spinule jako otoczoną strukturę związaną z błoną w bouton. Ponieważ Reconstruct nie pozwala na automatyczne odejmowanie zamkniętych struktur subkomórkowych (np. spinulów, organelli subkomórkowych) od objętości struktury otaczającej, można to przeprowadzić post hoc (np. po prostu odejmując objętość spinuli od całkowitej objętości bulonu presynaptycznego).
6. Rekonstrukcja obiektów w 3D w programie Reconstruct
   1. Przejdź do sekcji Seriale | Opcje | 3D i upewnij się, że kliknięty jest przycisk radiowy Ślady.
   2. Otwórz listę obiektów, klikając kolejno opcje Obiekty | Wyświetlanie listy obiektów.
   3. Po załadowaniu nazw śledzonych obiektów w oknie kliknij dwukrotnie nazwę obiektu (obiektów) na liście obiektów, aby wyświetlić je w 3D. Poczekaj, aż pojawi się okno Scena 3D.
   4. Upewnij się, że początek, koniec i liczba śladów są poprawne na liście obiektów dla każdego obiektu, tak aby liczba = koniec - początek. Jeśli dla obiektu pole Count ≠ End - Start (Koniec) oznacza, że co najmniej jeden ślad z tego obiektu mógł zostać omyłkowo pominięty.
   5. Obróć ślady 3D obiektów, przytrzymując lewy przycisk myszy i poruszając myszą i/lub przytrzymując prawy przycisk myszy i przesuwając mysz do przodu i do tyłu, aby powiększać i pomniejszać. Upewnij się, że ślady obiektu są odpowiednio wyrównane i że wydaje się, że przejście między każdym kolejnym śladem jest płynne.
   6. W razie potrzeby prześledź poszczególne ścieżki, aby usunąć błędy, które prowadzą do ostrych krawędzi i/lub przejść między ścieżkami.
   7. Umieść czworościenną warstwę siatki na obiekcie, przechodząc do sekcji Seria | Obiekt | 3D i klikając przycisk radiowy Powierzchnia Boissonnat.
   8. W oknie Scena 3D kliknij Scena | Wyczyść, a następnie kliknij dwukrotnie żądaną nazwę obiektu na liście obiektów.
   9. Obróć obiekt(y), aby zapewnić płynne przejścia między śladami i w razie potrzeby przerysuj ślady.
   10. Aby zmienić kolory i przezroczystość obiektu, kliknij nazwę obiektu na liście obiektów, a następnie kliknij Scena | Kolor/przezroczystość... w menu Lista obiektów. Kliknij dwukrotnie nazwę obiektu na liście obiektów, aby wyświetlić tę zmianę w oknie Scena 3D.
       UWAGA: Kolor, przezroczystość i wygładzanie obiektu mogą być zmieniane z większym stopniem kontroli i szczegółowości za pomocą Blendera (patrz 5.4-5.6).
7. Analiza ilościowa obiektów 3D
   1. Przejdź do sekcji Seriale | Opcje | Listy i kliknij wszystkie żądane pomiary w sekcjach Lista obiektów i Lista śledzenia w tym oknie.
   2. Eksportuj wymiary obiektu, otwierając Listę obiektów (punkt menu Obiekt | Lista obiektów...) a następnie klikając Lista | Zapisz.
   3. Zapisz wymiary obiektów w takiej postaci, w jakiej są wyświetlane na liście obiektów, jako plik rozdzielany przecinkami (.csv).
   4. Zaimportuj plik .csv do wybranego oprogramowania do analizy danych. Aby zaimportować do arkusza kalkulacyjnego (np. Microsoft Excel), po prostu kliknij dwukrotnie plik lub otwórz nowy pusty skoroszyt, kliknij Plik | Import | CSV i postępuj zgodnie z instrukcjami.
   5. Aby zmierzyć odległości między obiektami w 3D (np. aby zmierzyć odległość projekcji wrzeciona synaptycznego w bulionie presynaptycznym), użyj funkcji śledzenia Z w Reconstruct.
   6. Najpierw nadaj śladowi nową nazwę, przechodząc do punktu menu Seria | Opcje | Nazwy/Kolory i wpisując nazwę dla śledzenia Z.
   7. Następnie kliknij narzędzie Z-trace na pasku narzędzi.
   8. Aby narysować ślad Z odległości projekcji wrzeciona synaptycznego, kliknij początek wrzeciona synaptycznego, klikając lewym przyciskiem myszy, a następnie naciśnij przyciski Page Up lub Page Down, aby przejść przez objętość obrazu, klikając kolejne punkty wzdłuż błony wrzeciona synaptycznego w każdej sekcji.
   9. Zakończ ten ślad Z, klikając prawym przyciskiem myszy.
   10. Eksportuj pomiary śladu Z, klikając Śledź | Lista śladów... , aby wyświetlić listę śledzenia, a następnie kliknąć Lista | Zapisz, aby zapisać pomiary z listy śledzenia jako plik .csv.
8. Dodawanie kostki skali
   1. Przechodzenie do jednego z pierwszych lub ostatnich obrazów w stosie
   2. Przejdź do sekcji Seria | Opcje | Nazwy/Kolory i wpisz nazwę kostki skali.
   3. Na pasku narzędzi wybierz narzędzie Rysuj prostokąt i narysuj mały kwadrat (rozmiar nieistotny) przylegający do obiektów, ale nie zasłaniający ich. Przejdź do sekcji Seria | Opcje | 3D, kliknij opcję opcji Pole w obszarze Generuj i określ rozmiar kostki skali (w μm), wpisując jej wymiary w polach A:, B:, C: w obszarze Rozmiar (np. wpisz 0,5 dla A, B i C, aby wygenerować kostkę skali 0,5 μm/bok).
      UWAGA: Przed przystąpieniem do rekonstrukcji sześcianu skali w 3D należy się upewnić, że żądane obiekty 3D zostały już zrekonstruowane w scenie 3D za pomocą opcji Ślady lub powierzchnia Boissonnat. Pamiętaj, aby zmienić opcję Generuj z powrotem na powierzchnię Boissonnat, a rozmiary A, B i C z powrotem na -1 po zrekonstruowaniu kostki skali (tj. po kroku 4.8.5).
   4. Otwórz Listę obiektów i kliknij dwukrotnie nazwę sześcianu skali; poczekaj, aż sześcian skali pojawi się w oknie sceny 3D.
   5. Aby przesunąć sześcian skali względem innych obiektów, przejdź do punktu menu Seria | Opcje | 3D i wpisz żądaną liczbę μm, aby przesunąć kostkę skali do pól X, Y i/lub Z. Kliknij przycisk OK, aby zamknąć okno, a następnie kliknij dwukrotnie nazwę modułu skali na liście obiektów.
      UWAGA: Alternatywnie można to zrobić za pomocą Blendera (patrz poniżej).

5. Importowanie, ponowne kolorowanie, wygładzanie i dodawanie przezroczystości do rekonstrukcji 3D w Blenderze

UWAGA: Aby uzyskać szczegółową pomoc w korzystaniu z Blendera, zapoznaj się z instrukcją obsługi Blendera i/lub niezliczonymi filmami instruktażowymi na temat korzystania z każdej funkcji Blendera (po prostu wyszukaj w Internecie Blendera ORAZ Pożądaną Funkcję). Poniżej znajduje się krótki przewodnik po tym, jak ponownie kolorować, wygładzać i dodawać przezroczystość do rekonstrukcji 3D.

1. Pobierz i zainstaluj najnowszą wersję Blendera, bezpłatnego pakietu oprogramowania 3D o otwartym kodzie źródłowym (www.blender.org).
2. W programie Rekonstrukcja zapisz rekonstrukcje 3D, wywołując żądane obiekty w oknie sceny 3D, a następnie klikając kolejno opcje Scena | Eksportuj jako | Język VRML 2.0.
3. W Blenderze przejdź do pozycji Plik | Import | X3D Extensible 3D (.x3d/.wrl).Kliknij plik VRML 2.0, który został zapisany z Reconstruct, a następnie kliknij przycisk Importuj X3D/VRML2.
4. Ponownie pokoloruj rekonstrukcje.
   1. W oknie Kolekcja scen, w prawym górnym rogu, kliknij, aby odznaczyć/odznaczyć ikonę oka dla domyślnego obiektu Cube, a następnie kliknij nazwy poszczególnych obiektów, aby podświetlić każdy obiekt w scenie. Zmień nazwy tych obiektów zgodnie z potrzebami.
   2. Kliknij nazwę pierwszego obiektu, aby ponownie pokolorować go w oknie Kolekcja scen.
   3. Kliknij okrągły kontekst. Materiał u dołu paska ikon po prawej stronie, a następnie kliknij przycisk Dodaj materiał. Poniżej powinna pojawić się lista opcji. Następnie kliknij pasek obok opcji Kolor bazowy i wybierz żądaną luminancję i odcień obiektu.
   4. Aby zmienić metaliczny wygląd, połysk i właściwości odblaskowe obiektu, dostosuj opcje Metaliczny, Lustrzany, Szorstkość i Połysk, aby uzyskać pożądany efekt.
      UWAGA: Aby niektóre opcje pojawiły się w scenie (np. przezroczystość, połysk), może być konieczne ustawienie Viewport Shading: Look Dev lub Viewport Shading: Rendered viewport. Aby zmienić ustawienie na dowolną rzutnię, najedź kursorem na ikony kuli ziemskiej w prawym górnym rogu i kliknij żądane ustawienie rzutni.
   5. Aby zmienić kąt oświetlenia, kliknij obiekt Światło w oknie Kolekcja scen, kliknij ikonę Pokaż metauchwyt w prawym górnym rogu, a następnie przeciągnij światło wokół sceny, aby uzyskać pożądany efekt świetlny. Zmień natężenie światła w oknie Dane obiektu, które pojawia się pod oknem Zbiór scen po wybraniu obiektu Światło.
   6. Aby oddzielnie obracać obiekty w wybranych osiach, kliknij nazwy obiektów w oknie Kolekcja scen, naciśnij R, a następnie kliknij literę osi obrotu (x, y lub z) i przesuń mysz, aby uzyskać żądany obrót. Aby chwycić i przesunąć obiekty, zaznacz je w oknie Kolekcja scen, naciśnij G, a następnie użyj myszy, aby przesunąć obiekty po scenie.
5. Remesh (tj. Wygładź) rekonstrukcje.
   1. Kliknij nazwę interesującego Cię obiektu w oknie Kolekcja scen, a następnie użyj gimballa i kółka myszy, aby wyśrodkować i powiększyć obiekt.
   2. Kliknij ikonę klucza Context.Modifiers na pasku ikon po prawej stronie, kliknij pozycję Dodaj modyfikator, a następnie kliknij pozycję Zmień siatkę (pod nagłówkiem Generuj). Użyj menu rozwijanego, aby wybrać Wygładzanie, kliknij przycisk Wygładź cieniowanie i zmień głębokość i skalę drzewa, aby uzyskać żądaną gładkość.
      UWAGA: Pomocne jest, aby znajdować się w oknie Cieniowanie rzutni: Szkielet (opcja ikony kuli ziemskiej w prawym górnym rogu) podczas ponownego tworzenia siatki, aby bezpośrednio wyświetlić wyniki. Ponowne tworzenie siatki spowoduje utworzenie na obiekcie siatek czworościennych o różnych rozmiarach. Podczas wygładzania obiektu w celu usunięcia artefaktów przekroju lub obrysu należy zachować jego oryginalny kształt i kontury. Zacznij od głębokości drzewa = 7 i skali = 0,95, a następnie powoli zmniejszaj te liczby, jeśli to konieczne. Zwróć szczególną uwagę na małe, cienkie obiekty, takie jak kolce i gęstości postsynaptyczne, ponieważ mała objętość tych obiektów zmniejsza zakres wygładzania, który można wykonać bez zmiany ich pierwotnego kształtu.
6. Dodawanie przezroczystości do objects.
   UWAGA: Uczynienie obiektów przezroczystymi jest ważne, gdy pożądane jest pokazanie relacji 3D jednego obiektu (np. kolczyków, pęcherzyków presynaptycznych, mitochondriów, endosomów) znajdujących się w innym obiekcie (np. bulionie presynaptycznym).
   1. Kliknij żądaną nazwę obiektu w oknie Kolekcja scen. Przewiń do dołu kontekstu. Materiał (ikona w prawym dolnym rogu listy po prawej stronie), otwórz sekcję Ustawienia i użyj menu rozwijanego, aby zmienić tryb mieszania na Alpha Blend. Następnie otwórz sekcję Powierzchnia, przewiń w górę do opcji Alfa i zmień liczbę na wartość mniejszą niż jeden (1 = całkowicie nieprzezroczysta, 0 = całkowicie przezroczysta).
7. Eksport zrzutów ekranu rekonstrukcji 3D.
   1. Po uzyskaniu optymalnego kolorowania, wygładzania i oświetlenia dla rekonstrukcji 3D zapisz obraz w scenie, klikając nagłówek menu Okno i wybierając Zapisz zrzut ekranu.
   2. W opcjach Zapisz zrzut ekranu w lewym dolnym rogu wybierz żądany typ pliku, format koloru i kompresję.
   3. Wpisz nazwę nowego zrzutu ekranu w polu tekstowym nazwy pliku powyżej, a następnie zapisz zrzut ekranu w żądanej lokalizacji.

Results

Ilościowe określenie procentu kolców synaptycznych w populacji pobudzających presynaptycznych boutonów w pierwotnej korze wzrokowej fretek
Chociaż od dziesięcioleci obserwowano wrzecionowate wypukłości neurytów do pobudzających bulionów presynaptycznych^19,26, ich potencjalne znaczenie dla funkcji synaptycznych pozostaje niejasne. Eksperymenty te miały na celu określenie proporcji pobudzających butonów presynaptycznych zawierających spinule w ...

Discussion

Ten potok analizy objętości obrazu FIB-SEM może tworzyć wiarygodne rekonstrukcje 3D i pomiary ilościowe cienkich struktur subkomórkowych. Podczas gdy obecne półautomatyczne techniki wykorzystujące algorytmy głębokich sieci neuronowych i segmentacji mogą zwiększyć szybkość i wydajność rekonstrukcji struktur komórkowych o stosunkowo wysokim kontraście błonowym w dużych objętościach obrazu³³, wiele struktur subkomórkowych (np. kolce, gładka retikula endoplazmatyczna, endosomy) pozostanie trudnych do ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fidżi (ImageJ)			https://imagej.net/software/fiji/downloads
Rekonstrukcja			https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0
Blender	Blender Foundation		https:/www.blender.org