Artykuł metodologiczny

Charakterystyka połączeń nerwowo-mięśniowych u myszy za pomocą połączonej mikroskopii konfokalnej i superrozdzielczej

DOI:

10.3791/63032

⸱

8 grudnia 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Genethon, 91000, Evry, France, 2Université Paris-Saclay, Univ Evry, Inserm, Genethon, Integrare research unit UMR_S951, 91000, Evry, France, 3Ecole Pratique des Hautes Etudes, PSL Research University, 75014, Paris, France

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje metodę analizy morfometrycznej połączeń nerwowo-mięśniowych za pomocą połączonej mikroskopii konfokalnej i STED, która jest używana do ilościowego określania zmian patologicznych w mysich modelach SMA i CMS związanych z ColQ.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Połączenia nerwowo-mięśniowe (NMJ) to wysoce wyspecjalizowane synapsy między dolnymi neuronami ruchowymi a włóknami mięśni szkieletowych, które odgrywają istotną rolę w przekazywaniu cząsteczek z układu nerwowego do mięśni dobrowolnych, prowadząc do skurczu. Są one dotknięte wieloma chorobami ludzkimi, w tym dziedzicznymi zaburzeniami nerwowo-mięśniowymi, takimi jak dystrofia mięśniowa Duchenne'a (DMD), wrodzone zespoły miasteniczne (CMS), rdzeniowy zanik mięśni (SMA) i stwardnienie zanikowe boczne (ALS). Dlatego monitorowanie morfologii połączeń nerwowo-mięśniowych i ich zmian w mysich modelach choroby stanowi cenne narzędzie do badań patologicznych i przedklinicznej oceny podejść terapeutycznych. W tym miejscu opisano metody znakowania i analizy trójwymiarowej (3D) morfologii pre- i postsynaptycznych części motorycznych płytek końcowych z mysich drażnionych włókien mięśniowych. Szczegółowo opisano procedury przygotowywania próbek i pomiaru objętości NMJ, powierzchni, krętości i morfologii/zajętości końcówek aksonów za pomocą obrazowania konfokalnego oraz odległości między postsynaptykalnymi fałdami połączeniowymi a szerokością pasma receptora acetylocholiny (AChR) za pomocą mikroskopii STED (Authorized emission depletion) o wysokiej rozdzielczości. Zmiany w tych parametrach NMJ są zilustrowane u zmutowanych myszy dotkniętych SMA i CMS.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Połączenie nerwowo-mięśniowe (NMJ) to złożona struktura składająca się z zakończenia aksonu ruchowego, perisynaptycznej komórki Schwanna i części szkieletu włókna mięśniowego zaangażowanej w przekazywanie informacji chemicznej i sprzężenie aktywności dolnego neuronu ruchowego ze skurczem mięśni. U ssaków morfologia połączenia nerwowo-mięśniowego zmienia się podczas rozwoju, przyjmując typowy kształt podobny do precla po osiągnięciu dojrzałości, z różnicami w kształcie i złożoności między gatunkami, i wykazuje pewien stopień plastyczności w odpowiedzi na procesy fizjologiczne, takie jak ćwiczenia lub starzenie się1,2,3,4. Postsynaptyczna płytka końcowa silnika tworzy wgłębienia błonowe zwane fałdami połączeniowymi, gdzie górna część zawierająca receptory acetylocholiny (AChR) jest w bliskim kontakcie z presynaptyczną końcową gałęzią aksonu5.

Zmiany morfologiczne i funkcjonalne w połączeniach nerwowo-mięśniowych przyczyniają się do patofizjologii wielu zaburzeń neurodegeneracyjnych, takich jak rdzeniowy zanik mięśni (SMA) i stwardnienie zanikowe boczne (ALS), miopatie takie jak dystrofia mięśniowa Duchenne'a (DMD), wrodzone zespoły miasteniczne (CMS), miastenia (MG) i miopatie centronuklearne (CNM) oraz sarkopenia związana ze starzeniem się3,6,7,8,9,10,11,12. W tych chorobach obserwuje się zmiany strukturalne NMJ, takie jak fragmentacja płytki końcowej, zmniejszony rozmiar postsynaptycznego fałdu połączeniowego i/lub odnerwienie. Patologia NMJ może być pierwotnym lub wczesnym zdarzeniem podczas progresji choroby lub pojawić się ostatnio jako zdarzenie wtórne przyczyniające się do objawów klinicznych. W każdym razie monitorowanie morfologii NMJ w modelach zwierzęcych tych chorób stanowi cenny parametr do badania zmian patologicznych i oceny skuteczności potencjalnych metod leczenia.

Morfologia połączeń nerwowo-mięśniowych jest zazwyczaj analizowana za pomocą technik wykorzystujących mikroskopię konfokalną2,13,14,15 lub mikroskopia elektronowa5,16, z ich nieodłącznymi ograniczeniami, takimi jak rozdzielczość lub trudności techniczne. Ostatnio mikroskopia superrozdzielcza została również wykorzystana do wizualizacji poszczególnych regionów NMJ, takich jak presynaptyczne strefy aktywne lub rozkład AChR na błonie postsynaptycznej16,17,18, jako alternatywne lub uzupełniające podejście do analizy ultrastrukturalnej za pomocą mikroskopii elektronowej.

Ten protokół ma na celu dostarczenie szczegółowej i powtarzalnej metody oceny parametrów morfologicznych NMJ poprzez połączenie fluorescencji konfokalnej i mikroskopii STED (Stimulated emission depletion). Ważne cechy presynaptycznych i postsynaptycznych płytek końcowych, takie jak objętość, obszar, względna krętość, szerokość paska AChR i dystrybucja końców aksonów w unerwionych drażnionych włóknach mięśniowych mięśnia brzuchatego łydki myszy i piszczela przedniego, określono ilościowo w kontekście normalnych i chorobowych stanów. W szczególności defekty NMJ zostały zilustrowane w mysim modelu rdzeniowego zaniku mięśni Smn2B/-, choroby nerwowo-mięśniowej ze zwyrodnieniem neuronu ruchowego spowodowanym mutacjami w genie SMN111,19, oraz w podjednostce ogonowej podobnej do kolagenu myszy z asymetrycznym nokautem acetylocholinoesterazy (ColQDex2/Dex2 lub ColQ-KO), jako model wrodzonego zespołu miastenicznego20,21,22.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opieka i manipulacja myszami zostały przeprowadzone zgodnie z krajowym i europejskim prawodawstwem dotyczącym eksperymentów na zwierzętach i zatwierdzone przez instytucjonalną komisję etyczną. W badaniu wykorzystano samce i samice myszy Smn2B/- (tło C57Bl/6J) i ColQDex2/Dex2 (tło B6D2F1/J) w wieku odpowiednio 3 i 6 tygodni.

1. Eutanazja myszy i rozwarstwienie mięśni: piszczelowy przedni i brzuchaty łydki

  1. Przejdź do znieczulenia myszy przez dootrzewnowe wstrzyknięcie mieszaniny ketaminy (87,5 mg/kg)/ksylazyny (12,5 mg/kg) (0,1 ml/20 g masy ciała) przed eutanazją przez zwichnięcie szyjki macicy.
    UWAGA: Ponieważ SMA i ColQ-CMS wpływają na osoby niezależnie od ich płci, w niniejszym protokole użyto samców i samic myszy.
  2. Usuń włosy z tylnych kończyn za pomocą małej golarki elektrycznej i spłucz nogi 70% etanolem.
    UWAGA: Procedura preparacji będzie się różnić dla każdego mięśnia. W przypadku rozwarstwienia kości piszczelowej przedniej (TA) wykonaj kroki 1.2.1-1.2.3, a w przypadku mięśnia brzuchatego łydki (GA) (część przyśrodkowa i boczna) wykonaj kroki 1.2.4-1.2.6. Delikatnie obchodź się z mięśniami, aby zapobiec uszkodzeniu tkanek i ich zgnieceniu lub rozciąganiu podczas sekcji.
    1. Umieść mysz w pozycji leżącej.
    2. Wykonaj nacięcie skóry o średnicy 5 mm ostrymi-nożyczkami wzdłuż przednio-zewnętrznej części dystalnej kończyny tylnej, równolegle do kości piszczelowej, aby odsłonić mięsień. Użyj bardzo cienkich nożyczek, aby usunąć powięź.
    3. Najpierw przetnij ścięgno dystalne (blisko łapy), a następnie ścięgno proksymalne (blisko kolana) za pomocą bardzo cienkich nożyczek i zakrzywionych cienkich kleszczy. Z mięśniem należy obchodzić się ostrożnie, aby uniknąć uszkodzenia włókien mięśniowych i nerwów.
      UWAGA: Ścięgno bliższe musi być przecięte jak najbliżej kości, aby pobrać cały mięsień.
    4. Umieść mysz w pozycji leżącej, użyj ostrych, nożyczek, aby wykonać nacięcie skóry od górnej części dystalnej tylnej części kończyny tylnej w dół do łapy i usuń skórę.
    5. Chwyć ścięgno Achillesa średnio ząbkowanymi kleszczami, przetnij je bardzo cienkimi nożyczkami i delikatnie oddziel GA od otaczającej tkanki z powrotem do jej bliższego przyczepu.
    6. Po stronie proksymalnej włóż średnio ząbkowane kleszcze do kieszeni utworzonej między mięśniem dwugłowym uda (BF) a GA. Oddziel dwa mięśnie, aby przeciąć ścięgno GA jak najbliżej przyczepu kostnego za pomocą wyjątkowo cienkich nożyczek.
  3. W celu utrwalenia tkanek umieścić każdy mięsień w probówce mikrowirówki o pojemności 2 ml zawierającej 1 ml 4% w/v roztworu paraformaldehydu (PFA) rozcieńczonego w roztworze soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS bez Ca2 + Mg2+) i przechowywać w temperaturze 4 °C przez 18-24 h.
    UWAGA: Paraformaldehyd i formaldehyd są toksyczne i należy się z nimi obchodzić w dygestoriach chemicznych z odpowiednim sprzętem ochronnym.
  4. Następnego dnia myj utrwalone mięśnie 3x przez 5 minut za pomocą PBS w 12-dołkowych płytkach, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej (RT) wewnątrz dygestorii chemicznej.
    UWAGA: Protokół można zatrzymać na tym etapie i kontynuować w ciągu miesiąca. W takim przypadku należy dodać PBS uzupełniony 0,01% azydkiem sodu w celu przechowywania próbek w temperaturze 4 °C.
  5. Drażnić każdy mięsień w małych wiązkach włókien o szerokości około 1 mm za pomocą dwóch drobno ząbkowanych kleszczyków.
    UWAGA: Bardzo ważne jest, aby bardzo delikatnie manipulować mięśniami kleszczami, bez nadmiernej siły, aby zapobiec uszkodzeniu tkanek podczas drażnienia.
    1. Zdysocjuj mięsień TA na 3 lub 4 wiązki w zależności od jego wielkości.
    2. W przypadku GA oddziel przyśrodkową i boczną część mięśnia, a następnie rozdziel każdą część na 4-5 wiązek w zależności od ich wielkości.

2. Barwienie immunologiczne

  1. Kontynuuj przepuszczalność włókien mięśniowych: Przenieś wiązki mięśniowe do 24-dołkowych płytek zawierających 1% (v/v) Triton X-100 w PBS i utrzymuj je pod delikatnym mieszaniem (50 obr./min) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub 5 godzin w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Podziel wiązki mięśni między dwie płytki, aby przeprowadzić oddzielne barwienie immunologiczne i zminimalizować ryzyko pomylenia przeciwciał. Nie dziel ich na więcej niż dwie studzienki (1 dołek / płytka); w przeciwnym razie liczba (N) NMJ, które są reprezentatywne dla ich ogólnego stanu w analizowanym mięśniu, może być niewystarczająca.
  2. Przemywać próbki 3 razy przez 5 minut PBS w temperaturze pokojowej i inkubować je z roztworem blokującym składającym się z 4% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w PBS/Triton X-100 1% przez 4 godziny w temperaturze 4 °C, pod delikatnym mieszaniem (50 obr./min).
    UWAGA: Nie należy używać pompy zasysającej podczas etapów mycia, ale należy zassać roztwór ręcznie za pomocą pipety o pojemności 200 μl i małych końcówek (odniesienie znajduje się w Tabeli materiałów).
  3. Inkubować próbki przez noc (O/N) w temperaturze 4 °C przy delikatnym mieszaniu (50 obr./min) roztworem blokującym wskazanym w kroku 2.2 zawierającym pierwszorzędowe przeciwciała monoklonalne przeciwko neurofilamentowi M (NF-M, 2H3, rozcieńczenie 1/200) lub glikoproteinie pęcherzyków synaptycznych 2 (SV2, rozcieńczenie 1/200) w celu znakowania presynaptycznych zakończeń aksonów lub stref aktywnych, odpowiednio.
  4. Następnego dnia myj wiązki mięśniowe 3x przez 5 minut w PBS pod mieszaniem (50 obr./min).
    1. Do obrazowania konfokalnego: Inkubować wiązki mięśniowe z drugorzędowymi przeciwciałami anty-mysim sprzężonymi z fluoroforem emitującym czerwień (F594) (rozcieńczenie 1/500) i α-bungarotoksyną sprzężoną z fluoroforem emitującym zieleń (α-BTX-F488) (rozcieńczenie 1/1000) w PBS przez 2 godziny w temperaturze pokojowej pod mieszaniem (50 obr./min).
    2. Do obrazowania chorób przenoszonych drogą płciową: Inkubować wiązki mięśniowe z drugorzędowymi przeciwciałami anty-mysimi sprzężonymi z fluoroforem emitującym zieleń (F488) (rozcieńczenie 1/500) i α-bungarotoksyną sprzężoną z fluoroforem emitującym daleko czerwoną charakteryzującą się wysoką fotostabilnością (α-BTX-F633) (rozcieńczenie 1/1000) w PBS przez 2 godziny w temperaturze pokojowej pod mieszaniem (50 obr./min).
      UWAGA: Nie wystawiaj próbek na działanie światła podczas inkubacji, aby uniknąć fotowybielania.
  5. Umyj oznakowane wiązki mięśni 3x przez 5 minut za pomocą PBS pod mieszaniem (50 obr./min) i umieść je na szkiełku z podłożem montażowym.
    UWAGA: Umieść maksymalnie 4 do 5 wiązek mięśni na szkiełku, aby umożliwić uszczelnienie.
  6. Dodaj szklane szkiełko nakrywkowe klasy #1.5 (lub #1.5H) (grubość 0.17 mm) na górze i umieść cylindryczne magnesy po obu stronach szkiełka, aby wywrzeć nacisk i spłaszczyć mięśnie.
  7. Chroń szkiełka przed światłem O/N w temperaturze 4°C. Uszczelnij szkiełka na stałe lakierem do paznokci.

3. Akwizycja obrazu

  1. Akwizycja za pomocą mikroskopu konfokalnego
    UWAGA: Obrazy zostały zebrane za pomocą odwróconego laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego przy użyciu obiektywu olejowego o jasności 63x (HCX Plan Apo CS, apertura numeryczna 1,4 (NA)).
    1. W przypadku analizy zaślepionej niech osoba niezaangażowana w analizę zakoduje każdy slajd z podaną liczbą. Pozostań zaślepiony dla grup eksperymentalnych do czasu zakończenia kwantyfikacji parametrów NMJ dla wszystkich próbek.
    2. Uruchom oprogramowanie mikroskopu w trybie konfiguracji > machine.xlhw (Rysunek uzupełniający 1).
    3. Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu i znajdź płaszczyznę obserwacyjną w próbce, patrząc pod szerokokątne oświetlenie fluorescencyjne DAPI z zestawem filtrów DAPI.
    4. Kliknij Otwórz projekt > nowe projekty i utwórz folder do przechowywania pozyskanych obrazów (rysunek uzupełniający 1).
      UWAGA: Utwórz nowy projekt dla każdego NMJ, aby ograniczyć rozmiar folderu i zapobiec problemom z pamięcią komputera.
    5. Aby zarządzać parametrami akwizycji, kliknij zakładkę Akwizycja i ustaw konfokalny otwór na jednostkę Airy 1.0 i moc lasera, aby zoptymalizować poziomy wzmocnienia i przesunięcia dla fluorescencji zielonej/F488 (α-BTX) za pomocą lasera 488 nm na płycie końcowej, która ma być obrazowana (włączony tryb Live).
    6. Następnie zoptymalizuj akwizycję fluorescencji czerwonej/F594 (NF-M lub SV2) za pomocą lasera przystosowanego do obserwacji F594. W pracy wykorzystano laser o długości fali 552 nm (Live mode ON). Ustaw widmo emisji barwnika z następującymi zakresami dla każdego lasera: laser 405 (DAPI) od 414 do 483 nm, laser 488 (F488-α-BTX) od 506-531 nm i laser 552 (NF-M/SV2) od 622-650 nm.
    7. Zbierz stosy obrazów połączeń nerwowo-mięśniowych w każdej grupie eksperymentalnej z tymi samymi ustawieniami: rozmiar obrazu 1024 x 1024 pikseli (73,7 x 73,7 μm) przy częstotliwości próbkowania 400 Hz, dwukierunkowy X WŁ., współczynnik powiększenia 2,5, rozmiar kroku Z 0,5 μm w trybie Z-Wide.
      UWAGA: Dla każdego NMJ liczba wycinków jest ustawiona tak, aby uzyskać całe połączenie. Opisane powyżej ustawienia akwizycji spełniają twierdzenie o próbkowaniu Nyquista-Shanona. Użytkownik może jednak kliknąć przycisk Optymalizuj format, znajdujący się we wszystkich najnowszych konfokalnych programach operacyjnych, aby upewnić się, że rozmiar piksela i krok Z spełniają idealną częstotliwość próbkowania Nyquista. To działanie pozwoli uniknąć nadpróbkowania lub niedostatecznego próbkowania obrazów, co spowoduje utratę dokładności pomiarów objętości.
    8. Zapisz oryginalny plik (.lif) lub obrazy stosu Z (.tif) w folderze o nazwie zawierającej nazwę kodową szkiełka, typ barwienia i numer tabliczki końcowej.
      UWAGA: Skany należy zbierać sekwencyjnie (nie równocześnie) za pomocą laserów 488 nm i 552 nm (F488 i F594), aby uniknąć przesłuchów fluorescencji F488 do kanału F594 i odwrotnie (przebijanie). Uwaga: ścieżkę wiązki można skonfigurować za pomocą Dye Assistant w oprogramowaniu mikroskopu.
    9. Przejdź do następnego zakodowanego slajdu i powtórz kroki 3.1.3-3.1.8 dla każdego NMJ.
    10. Pod koniec sesji kliknij Otwórz w przeglądarce 3D i wybierz przedstawiciela NMJ grupy eksperymentalnej, aby zwizualizować etykietowanie 3D.
      UWAGA: Ten tryb widoku pomoże zweryfikować, czy parametry akwizycji były poprawne.
    11. Zamknij oprogramowanie mikroskopu, wyczyść obiektywy za pomocą tkanek soczewki, a następnie wyłącz system.
  2. Akwizycja metodą mikroskopii STED
    UWAGA: Obrazy zostały zebrane za pomocą odwróconego skaningowego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w bramkowany STED przy długości fali 775 nm przy użyciu 100-krotnego obiektywu zanurzeniowego w oleju (HC PL APO CS2 1,4 NA).
    1. W przypadku analizy zaślepionej niech osoba niezaangażowana w analizę zakoduje każdy slajd z podaną liczbą. Pozostań zaślepiony dla grup eksperymentalnych do czasu zakończenia kwantyfikacji parametrów NMJ dla wszystkich próbek.
    2. Uruchom oprogramowanie mikroskopu w trybie konfiguracji > machine.xlhw i STED ON (Rysunek uzupełniający 2).
    3. Kliknij Otwórz projekt > Nowe projekty, aby utworzyć folder do przechowywania akwizycji obrazów.
      UWAGA: Wygeneruj nowy folder dla każdego slajdu, aby ograniczyć rozmiar folderu i zapobiec problemom z pamięcią komputera.
    4. Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu i obejrzyj je w szerokim oświetleniu fluorescencyjnym za pomocą lasera 488 nm, aby znaleźć płaszczyznę obserwacyjną w próbce.
    5. Wyszukaj NMJ znakowany neurofilamentem M (NF-M) lub barwieniem SV2 za pomocą lasera 488 nm z detekcją spektralną od 506-531 nm.
    6. Po zidentyfikowaniu NMJ kliknij Aktywuj STED i rozpocznij pobieranie obrazów w regionie, który zawiera kilka fałdów połączeniowych (rysunek uzupełniający 3) za pomocą lasera 635 nm z detekcją spektralną od 640-750 nm.
      UWAGA: Podczas akwizycji obrazu należy zwrócić uwagę na tabelę wyszukiwania nasycenia i kliknąć przycisk Szybka tablica LUT, aby uniknąć prześwietlenia (wartości szarości >255; dla 8 bitów).
    7. Zbierz obrazy każdej grupy eksperymentalnej z tymi samymi ustawieniami: rozmiar obrazu 2048 x 2048 pikseli (38,75 x 38,75 μm) przy częstotliwości próbkowania 400 Hz.
      UWAGA: Moc lasera zubożającego (STED) jest ustawiona na 65%.
    8. Zapisz obrazy z nazwą pliku, która zawiera kod slajdu.
      UWAGA: Możliwe jest kliknięcie na Optimized XY Format: Set Format na, aby uzyskać najlepsze ustawienie akwizycji za pomocą obrazowania STED.
    9. Przejdź do następnego zakodowanego slajdu i powtórz kroki 3.2.3-3.2.8. Powtórz tę procedurę dla wszystkich slajdów.
    10. Pod koniec sesji mikroskopowej STED przenieś pliki obrazów na inny komputer i zapisz oryginalne pliki (.lif) na dysku zewnętrznym lub serwerze.
    11. Wyłącz oprogramowanie mikroskopu, wyczyść obiektywy za pomocą chusteczek soczewek, a następnie wyłącz system.

4. Analiza obrazu - mikroskopia konfokalna

UWAGA: Wszystkie obrazy zostały przetworzone na komputerach z systemem operacyjnym Microsoft Windows 10 professional.

  1. Uruchom ImageJ i niestandardowe makro, aby obliczyć postsynaptyczną objętość płytki końcowej NMJ, obszar projekcji maksymalnej intensywności (MIP) i względną krętość.
    1. Przetwarzaj stosy obrazów NMJ za pomocą NIH ImageJ freeware23, wtyczki iGeodesic i niestandardowego makra do uzyskiwania pomiarów parametrów NMJ. Uruchom oprogramowanie ImageJ.
      UWAGA: Najnowsza wersja ImageJ jest dostępna bezpłatnie i można ją pobrać pod adresem24. Aby otworzyć zastrzeżone formaty plików, należy pobrać wtyczkę Bio-Formats Package2526 . Ten krok nie jest konieczny w przypadku, gdy operator korzysta z Fidżi, ponieważ wtyczka jest już zainstalowana w oprogramowaniu. Wtyczka iGeodesic27 do obliczania zawiłości jest również dostępna online28; sprawdź dostępność tej wtyczki w wersji ImageJ/Fiji, która będzie używana. Niestandardowe makra są również dostępne online29.
    2. Przeciągnij i upuść plik Macro_NMJ_VOL_Marinelloetal.ijm (custom made, Supplementary Coding File 1) do okna ImageJ; makro zostanie otwarte w drugim oknie. W tym nowym oknie kliknij Makra > Uruchom makro.
      UWAGA: Makro może przetwarzać zarówno pliki zastrzeżone, jak i pliki TIFF. Pliki muszą spełniać następujące kryteria: w przypadku zastrzeżonych formatów plików zapisz tylko jedno skrzyżowanie (tj. stos obrazów) na plik, uporządkowany w folderze; w przypadku obrazów TIFF pliki muszą być zapisane w folderze zawierającym podfoldery, z których każdy nosi nazwę >JunctionX (X odpowiada numerowi NMJ) ze stosami obrazów danego skrzyżowania (RGB TIFF) (Rysunek uzupełniający 4).
    3. Wybierz folder natywny zawierający podfoldery Skrzyżowanie, które mają zostać przeanalizowane, a następnie kliknij przycisk Wybierz.
    4. W nowym menu podręcznym o nazwie Zapisywanie folderu wybierz folder przechowywania i kliknij Wybierz.
    5. W nowym menu podręcznym o nazwie Typ obrazu wybierz format akwizycji stosu Z.
    6. Wybierz kanał RGB odpowiadający interesującemu Cię barwieniu i wskaż rozmiar piksela XY oraz krok Z (z). Makro automatycznie wykona analizę.
      UWAGA: W przypadku wybrania zastrzeżonych formatów plików, makro bezpośrednio odczytuje rozmiar piksela i krok Z (z). Użytkownik musi jednak jeszcze wskazać interesujący go kanał (C1, C2 lub C3). Makro dostarczy arkusz danych (.csv) dla każdego parametru skrzyżowania (objętość płyty końcowej, obszar MIP i krętość) w folderze zapisu. Makro generuje również trzy pliki . Pliki TIF, które odpowiadają obwodowi Drawing_MaxprojX.tif barwienia α-BTX, DrawingJunctionX.tif i MaxprojX.tif MIP. Te pliki TIFF są generowane w celu sprawdzenia jakości akwizycji i upewnienia się, że przetwarzanie obrazu zostało wykonane prawidłowo.
      Postsynaptyczna objętość NMJ (V): Makro oddzieli obrazy od pojedynczego NMJ i utrzyma kanał F488 α-bungarotoksyny odpowiadający postsynaptycznej płytce końcowej. Stos jest podzielony na segmenty za pomocą Otsu threshold30 na pośrednim wycinku stosu. Wynikowy obraz binarny jest rozszerzany o 1 piksel, a funkcja Analizuj cząstki służy do pomiaru obszaru płyty końcowej każdego wykrytego obiektu. Aby uzyskać postsynaptyczną objętość NMJ, makro sumuje wszystkie zmierzone obszary płytki końcowej stosu i mnoży ją przez wartość kroku Z (z) w μm.
      figure-protocol-1
      Obszar płyty końcowej projekcji o maksymalnej intensywności (MIP): Po progowaniu stosu uzyskuje się projekcję maksymalnej intensywności (MIP) za pomocą funkcji Z-project ImageJ. Funkcja Analizuj cząstki jest następnie używana do ilościowego określenia obszaru płyty końcowej MIP.
      Krętość NMJ MIP (T): Krętość NMJ, która odzwierciedla stopień złożoności postsynaptycznej płytki końcowej motorycznej, w tym fałd i perforacji31, jest obliczana na podstawie każdego MIP przy użyciu następującego wzoru, gdzie dObj(AB) to odległość między A i B wzdłuż obwodu obiektu, a dEuc(AB) to odległość euklidesowa między A i B (linia prosta).
      figure-protocol-2
    7. Ustaw najwyższą wartość krętości w grupie typu dzikiego dla każdego warunku doświadczalnego na 100% i znormalizuj wszystkie inne wartości warunków eksperymentalnych do tej wartości, aby uzyskać względną krętość NMJ.
  2. Uruchom ImageJ i niestandardowe makro, aby określić ilościowo akumulację presynaptycznych neurofilamentów i barwienie glikoproteiny pęcherzyków synaptycznych 2.
    UWAGA: Akumulacja neurofilamentów (tutaj, NF-M) i/lub zmieniona dystrybucja pęcherzyków synaptycznych (tutaj, SV2) są markerami nieprawidłowego transportu aksonalnego i/lub upośledzonego transportu pęcherzyków i były wcześniej obserwowane w NMJ różnych modeli myszy SMA32,33,34.
    1. Przeciągnij i upuść plik Macro_NMJ_ACCU_Marinelloetal.ijm (custom made, Supplementary Coding File 2) do okna ImageJ; makro otworzy się w drugim oknie. W tym nowym oknie kliknij Makra > Uruchom makro.
      UWAGA: Makro może przetwarzać zarówno zastrzeżone formaty plików, jak i pliki TIFF. Pliki muszą spełniać kryteria wskazane w UWAGA poniżej kroku 4.1.2.
    2. Wybierz folder natywny zawierający podfoldery Skrzyżowanie, które mają zostać przeanalizowane, a następnie kliknij przycisk Wybierz.
    3. W nowym menu podręcznym o nazwie Zapisywanie folderu wybierz folder przechowywania i kliknij Wybierz.
    4. W nowym menu podręcznym o nazwie Typ obrazu wybierz format akwizycji stosu Z.
    5. W wyskakującym okienku Staining Infos wskaż etykietę i kolor presynaptyczny i postsynaptyczny, a następnie kliknij OK. Na przykład znacznik presynaptyczny: SV2 lub NF, kolor presynaptyczny: R, znacznik postsynaptyczny: BTX, kolor postsynaptyczny: G.
      UWAGA: W przypadku zastrzeżonych formatów plików należy wskazać etykiety i odpowiadające im kanały (C1, C2 lub C3).
    6. W wyskakującym okienku Rozmiar piksela wskaż rozmiar piksela XY 0,072 μm i krok Z 0,5 μm (z) i kliknij OK. Makro automatycznie wykona analizę.
      UWAGA: Ten parametr odpowiada rozmiarowi obrazu 1024 x 1024 pikseli (73,7 x 73,7 μm) wybranemu przed akwizycją w mikroskopie konfokalnym i jest skorelowany z ustawieniami obiektywu i zoomu. Jeśli wybrano zastrzeżone formaty plików, makro bezpośrednio odczytuje rozmiar piksela i krok Z (z). Makro będzie przechowywać w folderze zapisu arkusz danych (.csv) woluminów presynaptycznych i postsynaptycznych wielostronicowy obraz TIFF bieżącego wykrywania dla każdego etykietowania (pre- i postsynaptycznego). Jak wskazano powyżej, te pliki TIFF są generowane w celu sprawdzenia jakości akwizycji i upewnienia się, że przetwarzanie obrazu zostało wykonane prawidłowo.
      Makro oblicza objętość barwienia aksonalnym neurofilamentem M (objętość NF) z kanału NF-M-F594, który kolokalizuje się z znakowaniem α-bungarotoxin-F488 oraz objętość barwienia glikoproteiny 2 pęcherzyków synaptycznych NMJ (objętość SV2) z kanału SV2-F594, który kolokalizuje się z znakowaniem α-BTX-F488. Akumulację NF-M określa się ilościowo, obliczając stosunek objętości NF do objętości postsynaptycznej płytki końcowej (α-BTX) i zajętości końca aksonu NMJ przez stosunek objętości SV2 i α-BTX, jak pokazano poniżej.
      figure-protocol-3
      figure-protocol-4

5. Analiza obrazu- mikroskopia STED

UWAGA: Przetwarzanie obrazu zostało przeprowadzone za pomocą oprogramowania offline producenta mikroskopu STED.

  1. Uruchom oprogramowanie mikroskopu.
  2. Otwórz projekt, klikając przycisk Otwórz projekt. Wybierz plik projektu (.lif) i otwórz go. Obrazy są wyświetlane na ekranie wraz z ich nazwami.
  3. W oknie Proces: Kliknij Redukcja szumów > mediana. U dołu środkowego okna ustaw Promień na 5,00 i Iterację na 1,00 i odznacz opcję Filtrowanie 3D.
  4. Następnie wybierz kartę Otwórz projekty w lewym górnym rogu okna i wybierz obraz.
  5. Kliknij Zastosuj, aby sprawdzić poprawność parametrów. Zostanie utworzony nowy obraz o nazwie "nameofimage_median001".
    UWAGA: Możliwe jest kliknięcie opcji Podgląd przed zastosowaniem, aby monitorować efekt filtra mediany, który poprawi kontrast obrazu i wygładzi profile linii używane do kwantyfikacji.
  6. Zastosuj filtr do wszystkich obrazów, jak pokazano w krokach 5.4-5.5.
  7. W zakładkach Otwórz projekty kliknij ikonę stacji dyskietek, aby zapisać wszystkie projekty, w tym nowo utworzone filtrowane images.
    UWAGA: Następny krok zostanie wykonany przy użyciu przefiltrowanego obrazu o nazwie "nameofimage_median001".
  8. Obliczanie odległości między paskami AChR
    UWAGA: Zmiany w morfologii fałdów postjunctional są często obserwowane w zaburzeniach nerwowo-mięśniowych jako oznaka patologii NMJ (niedojrzałość lub zwyrodnienie). Odległość (d) między paskami AChR, które są wykrywane przez barwienie α-bungarotoksyną, oblicza się poprzez wygenerowanie profili intensywności i ilościowe określenie odległości między każdym szczytem maksymalnej intensywności poprzez narysowanie profilu linii (rysunek uzupełniający 5).
    1. Korzystając z oprogramowania mikroskopu, wybierz menu Quantify w górnej części środkowego okna.
    2. Kliknij kartę Narzędzia w lewym górnym rogu. Wybierz Intensywność w lewym górnym panelu i kliknij ikonę Profil linii. Ustaw nadpróbkowanie na 1 i zaznacz opcję Sortuj kanały.
    3. Kliknij zakładkę Otwórz projekty i wybierz przefiltrowany obraz do analizy.
      UWAGA: Możliwe jest powiększenie obrazu poprzez przewijanie za pomocą myszy komputerowej. Zakres dynamiczny obrazu można modyfikować za pomocą paska znajdującego się po lewej stronie obok wyświetlanego obrazu, co ułatwia wizualizację pasków.
    4. Następnie kliknij ikonę Rysuj linię w górnym menu prawego okna i narysuj linię przecinającą prostopadle kilka pasków/zagięć skrzyżowania.
      UWAGA: Profil intensywności jest wyświetlany w środkowym oknie.
    5. Kliknij na wierzchołek pierwszego szczytu i przesuń wskaźnik myszy, trzymając wciśnięty lewy przycisk myszy, aż zostanie osiągnięty następny szczyt maksymalny.
      UWAGA: Informacje są wyświetlane w profilu intensywności, natomiast odległość między dwoma szczytami jest wyświetlana pod wykresem z nominałem "dx".
    6. Kliknij prawym przyciskiem myszy, będąc na obrazie po prawej stronie i wybierz Zapisz zwrot z inwestycji. Otwórz zapisane ROI (Regions of Interest), klikając Załaduj ROI.
    7. Kliknij ikonę strzałki w lewym górnym rogu prawego okna, kliknij ROI i usuń go, klikając ikonę kosza.
    8. Powtórz tę operację tyle razy, ile potrzeba z różnych profili intensywności, aby uzyskać przewidywaną liczbę odległości pasków AChR, które będą reprezentować globalną wartość w analizowanym mięśniu.
      UWAGA: Optymalna wartość N może być obliczona z góry na podstawie szacowanej różnicy między grupami, α ryzykiem, mocą oraz testem jednostronnym lub dwustronnym. W obecnym projekcie eksperymentalnym zastosowano jednostronny test Manna-Whitneya (ryzyko α = 10%; moc = 80%), a wartość N oszacowano na co najmniej pięć odległości pasków AChR na NMJ w celu porównania dwóch grup zwierząt.
  9. Szerokość paska AChR
    UWAGA: Szerokość paska (w) odpowiada połowie maksimum na całej szerokości (FWHM) profilu intensywności, czyli odległości między punktami, w których wartość fluorescencji sygnału α-BTX jest równa połowie jego maksymalnej intensywności (rysunek uzupełniający 5).
    1. Korzystając z oprogramowania mikroskopu, wybierz menu Quantify w środkowym oknie.
    2. Kliknij kartę Narzędzia w lewym górnym rogu. Wybierz Intensywność w lewym górnym panelu i kliknij ikonę Określ FWHM. Zaznacz opcję Sortuj kanały.
      UWAGA: Aby zoptymalizować wykrywanie szczytów przez oprogramowanie, ustaw próg i szerokość odpowiednio na 50 i 3. Dostosuj te wartości do każdego eksperymentu i poproś o radę doświadczonego naukowca zajmującego się obrazowaniem.
    3. Kliknij zakładkę Otwórz projekty i wybierz przefiltrowany obraz do analizy.
      UWAGA: Istnieje możliwość powiększenia wyświetlanego obrazu w prawym oknie poprzez przewijanie myszką komputerową. Jak wskazano powyżej (UWAGA po kroku 5.8.3), zakres dynamiczny obrazu można modyfikować w celu uzyskania optymalnej wizualizacji pasków.
    4. Następnie kliknij ikonę Rysuj prostokąt w górnym menu prawego okna. Zaznacz pasek, który jest poziomy lub pionowy, a następnie narysuj prostokąt prostopadle do paska. W środkowym oknie pojawi się profil.
    5. Kliknij opcję Pionowo lub Poziomo w menu Projekcja średnia znajdującym się w lewym panelu, w zależności od tego, czy orientacja paska jest pionowa czy pozioma.
    6. Kliknij Statystyki w środkowym oknie i odczytaj wartość FWHM.
    7. Kliknij prawym przyciskiem myszy na obrazie wyświetlanym w prawym oknie i wybierz Zapisz ROIs.
      UWAGA: Otwórz zapisane ROI, klikając Załaduj ROI.
    8. Kliknij ikonę strzałki w lewym górnym rogu prawego okna, kliknij ROI i usuń go, klikając ikonę kosza.
    9. Powtórz tę operację tyle razy, ile potrzeba z różnych prostokątnych ROI, aż do uzyskania przewidywanej liczby szerokości pasków AChR, która będzie reprezentatywna dla globalnej wartości w analizowanym mięśniu.

6. Projekt eksperymentalny i testy statystyczne

  1. Wykonuj analizy statystyczne za pomocą specjalnego oprogramowania.
    UWAGA: Dane zebrano od N ≥ 3 kontrprób biologicznych i co najmniej 20 NMJ na genotyp do obrazowania mikroskopem konfokalnym oraz N ≥ 5 kontrprób biologicznych i N = 5 NMJ na genotyp do obrazowania STED w każdej grupie eksperymentalnej. Istotność oceniono za pomocą niesparowanego testu Manna-Whitneya (nieparametrycznego), a wartości p są wskazane w odpowiednich legendach rycin.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby ułatwić analizę morfologiczną połączeń nerwowo-mięśniowych na poziomie pre- i postsynaptycznym w powtarzalny sposób, opracowano przepływ pracy od pobierania mięśni do obrazowania i kwantyfikacji za pomocą oprogramowania mikroskopowego i niestandardowych makr ImageJ (Rysunek 1). Aby zilustrować użyteczność tego protokołu, oceniono morfologię NMJ w dwóch mysich modelach zaburzeń genetycznych, Smn2B / - i ColQDex2 / Dex2 myszy dotkniętych odpowiednio rdzeniowym zanikiem mięśni (SMA) i wrodzonym zespołem miastenicznym (CMS), a dane porównano z rólniami kontrolnymi dopasowanymi do wieku.

Struktura NMJ została oceniona na podstawie mięśni piszczelowych przednich i brzuchatych łydki odpowiednio 3- i 6-tygodniowych myszy Smn2B/- (tło C57Bl/6) i ColQDex2/Dex2 (tło B6D2F1/J), gdy objawy choroby są już obecne u tych zwierząt. W wieku 3 tygodni myszy Smn2B/- wykazują oznaki opóźnionego rozwoju mięśni szkieletowych i odnerwienia, takie jak atrofia i utrata NMJ35,36. Myszy CMS mają pierwotną patologię w NMJ i przejawiają zmniejszenie masy ciała od pierwszego tygodnia życia oraz wyraźne osłabienie mięśni20 (dane nie pokazane). Jak pokazano w Rysunek 2A, postsynaptyczna płytka końcowa silnika oznaczona fluorescencyjną α-bungarotoksyną wydawała się mniejsza i/lub pofragmentowana w mutantach dwóch linii myszy za pomocą mikroskopii konfokalnej. Kwantyfikacja stosów Z NMJ przy użyciu tych niestandardowych makr ImageJ ujawniła wyraźne spadki objętości płytki końcowej, projekcji maksymalnej intensywności (MIP) i względnej krętości zarówno u myszy SMA, jak i CMS w porównaniu z kontrolami, jako oznaki defektów dojrzewania NMJ32 (Rysunek 2B-D). Postsynaptyczna objętość płytki końcowej i MIP były zmniejszone u chorych zwierząt (zmiana fałdowania o 2,7 i 2,0 dla objętości oraz 2,5 i 2,0 dla MIP, odpowiednio u myszy Smn2B / - i ColQDex2 / Dex2). Względna krętość była również mniejsza w mięśniach z niedoborem SMN i ColQ niż w WT (16,97% ± 1,33% w SMA w porównaniu z 48,84% ± 5,90% myszy WT i 13,29% ± 2,79% w CMS w porównaniu z 30,20% ± 4,44% myszy kontrolnych). Ponadto kwantyfikacja rozkładu presynaptycznych gałęzi końcowych aksonów przy użyciu niestandardowego makra ImageJ ujawniła zmieniony wzór dystrybucji neurofilamentu M w dwóch modelach zwierzęcych, ze zwiększonym znakowaniem immunologicznym (84,65% ± 0,32% w porównaniu z 16,57% ± 2,03% i 23,64% ± 2,78% w porównaniu z 18,77% ± 1,73% u myszy Smn2B/- i ColQDex2/Dex2 w porównaniu z kontrolami, odpowiednio) (Rysunek 3A-D). Poprzez barwienie SV2 zaobserwowano również 43% zmniejszenie współczynnika zajętości, tj. procentu regionów zawierających AChR z sąsiednimi strefami aktywnymi zakończeń nerwowych, zaobserwowano również u myszy Smn2B / - (49,36% ± 3,76% w SMA w porównaniu z 85,69% ± 2,34% myszy WT) (Rysunek 3E,F). Ten parametr NMJ został również obliczony w GA mutantów ColQDex2/Dex2, ale nie stwierdzono statystycznie istotnej różnicy w porównaniu z rodzeństwem z miotu kontrolnego (dane nie pokazane).

Dalej analizowaliśmy charakterystykę błony postsynaptycznej, określając ilościowo odległość między fałdami połączeniowymi i szerokość pasków AChR, które znajdują się na grzbiecie tych fałdów, w mięśniach z niedoborem ColQ za pomocą mikroskopii STED (stymulowanej emisją o wysokiej rozdzielczości). Jak pokazano na Rysunek 4, aspekt tych struktur może być wyraźnie zobrazowany przez fluorescencyjne znakowanie α-bungarotoksyną i analizę profilu intensywności. Oceniliśmy te parametry NMJ i stwierdziliśmy wzrost odległości fałdu połączeniowego (d) i szerokości (w) pasków AChR w mięśniu brzuchatym łydki mutantów (358,3 nm ± 11,97 nm i 320,8 nm ± 10,90 nm dla odległości oraz 216,9 nm ± 10,51 nm i 186,3 nm ± 7,015 nm dla szerokości, w ColQDex2/Dex2 w porównaniu z myszami typu dzikiego, odpowiednio, p < 0,05) (Rysunek 4C,D).

figure-results-1
Rysunek 1: Schemat blokowy protokołu wideo do wieloskalowej charakterystyki NMJ 3D za pomocą mikroskopii konfokalnej i STED. Mięśnie piszczelowe przedni (TA) i brzuchaty łydki (GA) pobrano od myszy, a włókna mięśniowe drażniono przed znakowaniem α-bungarotoksyną-F488 lub α-bungarotoksyną-F633, DAPI, pierwszorzędowymi przeciwciałami skierowanymi przeciwko neurofilamentowi M (NF-M) i glikoproteinie pęcherzyków synaptycznych 2 (SV2) oraz przeciwciałom drugorzędowym sprzężonym z fluoroforem (F488 lub F594). Stosy obrazów uzyskano za pomocą mikroskopii konfokalnej i przetworzono w celu zmierzenia postsynaptycznej objętości NMJ, presynaptycznej akumulacji NF-M, zajętości końca aksonu NMJ, obszaru końcowej projekcji postsynaptycznej maksymalnej intensywności (MIP) i krętości (dObj(AB) to odległość między A i B wzdłuż obwodu obiektu (czerwona linia), podczas gdy dEuc(AB) to odległość euklidesowa między A i B (zielona linia)). Do analizy mikroskopowej STED szerokość pasków receptora acetylocholiny (AChR) i odległość między fałdami złącznymi określono ilościowo na podstawie profili intensywności barwienia α-BTX-F633. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Wieloparametrowa postsynaptyczna charakterystyka NMJ w mysich modelach rdzeniowego zaniku mięśni (SMA) i wrodzonego zespołu miastenicznego (CMS) związanego z ColQ. (A) Reprezentatywne obrazy postsynaptycznych płytek końcowych motorycznych z mięśni TA i GA znakowanych α-bungarotoxin-F488 (α-BTX). (B) Kwantyfikacja postsynaptycznej objętości płytki końcowej NMJ, (C) obszar projekcji maksymalnej intensywności (MIP) i (D) względna krętość w TA 3-tygodniowych myszy typu dzikiego (WT) i Smn2B/- (lewe wykresy, N = 3 zwierzęta na genotyp, n = 37 i n = 56 NMJ, odpowiednio) oraz 6-tygodniowych WT i ColQDex2/Dex2 myszy (wykresy po prawej, N = 5 myszy na genotyp, n = 89 i n = 97 NMJ, odpowiednio). Dane są wyrażone jako średnia na mysz (kropka) ± SEM. Różnice między grupami analizowano za pomocą testu Manna-Whitneya (*, p, < 0,05). Podziałka wynosi 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Analiza morfometryczna rozkładu końcówek aksonów presynaptycznych w mięśniach myszy WT i zmutowanych. Wzorzec unerwienia NMJ w mięśniach piszczelowych przednich (TA) i brzuchatych łydki (GA) myszy CMS typu dzikiego, SMA i związanych z ColQ. (A, B) Reprezentatywne połączenia nerwowo-mięśniowe z TA myszy WT i Smn2B / - w wieku 21 dni znakowane przeciwciałami przeciwko neurofilamentowi M (NF-M, czerwony) i α-bungarotoksynie-F488 (α-BTX, zielony) (A) oraz wyniki analizy ilościowej akumulacji neurofilamentów (B); (C, D) Reprezentatywne połączenia nerwowo-mięśniowe z GA 6-tygodniowych myszy WT i ColQDex2 / Dex2 znakowanych przeciwciałami przeciwko neurofilamentowi M (NF-M, czerwony) i α-bungarotoksynie-F488 (α-BTX, zielony), wykazujące fragmentaryczne i niedojrzałe postsynaptyczne płytki końcowe (C) oraz wyniki akumulacji neurofilamentów w dwóch grupach zwierząt (D). W eksperymentach analizowano N = 4 (n = 34 NMJ) (B) i N = 3 (n = 54 NMJ) (D) zwierzęta WT oraz N = 3 (n = 36 NMJ) Smn2B / - i N = 3 (n = 55 NMJ) myszy ColQDex2 / Dex2 (B, D). (E, F) Reprezentatywne obrazy zajętości końców aksonów w NMJ z TA 3-tygodniowych myszy WT i Smn2B / - znakowanych przeciwciałami przeciwko glikoproteinie pęcherzyków synaptycznych 2 (SV2, czerwony) i α-bungarotoksynie-F488 (α-BTX, zielony) (E) oraz wyniki zajętości NMJ (stosunek objętości SV2 / AChR) (F). Analizowano mięśnie myszy N = 3 (n = 50 NMJ) typu dzikiego i N = 4 (n = 62 NMJ) Smn2B/-. Dane wyrażono jako średnią wartość na mysz (kropkę) ± SEM. Różnice między grupami analizowano za pomocą testu Manna-Whitneya (*p < 0,05). Podziałka skali wynosi 20 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Obrazowanie STED postsynaptycznych płytek końcowych NMJ. (A) Reprezentatywny obraz STED NMJ oznaczonego α-bungarotoxin-F633 (α-BTX) z brzuchatego łydki 6-tygodniowej myszy typu dzikiego wykazującej postjunctionalne paski AChR (skala wynosi 5 μm). (B) Większe powiększenie obszaru z paskami AChR (dolny panel), który został użyty do wygenerowania profilu intensywności. Szerokość (w) pasków AChR oraz odległość między dwoma sąsiednimi paskami (d) tego obszaru zostały określone ilościowo i przedstawione na wykresie słupkowym. Schematyczne przedstawienie postsynaptycznej płytki końcowej w celu zilustrowania szerokości paska AChR (w) i odległości (d). Parametry te, (C) odległość pasków AChR i (D) szerokość, zostały zmierzone u myszy ColQDex2/Dex2 i kontrolnych rodzeństwa z miotu w wieku 6 tygodni. NMJ od 5 zwierząt WT (łącznie n = 29 NMJ) i 6 ColQDex2/Dex2 (łącznie n = 43 NMJ) analizowano na ślepo. Dane są wyrażone jako średnia na mysz (kropka) ± SEM. Różnice statystyczne między grupami analizowano za pomocą testu Manna-Whitneya (*p < 0,05). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1: Uruchomienie oprogramowania LAS X i parametrów do akwizycji konfokalnej. Poszczególne etapy uzyskiwania obrazów konfokalnych opisano w sekcjach 3.1.2 do 3.1.7 protokołu. Dla każdej akwizycji stosu NMJ otwierany jest projekt (krok 3.1.4) i wybierane są parametry rozmiaru obrazu, szybkości akwizycji, osi X, Y i Z (krok 3.1.7), ze wskazaniem każdego skanu sekwencyjnego (Seq.1, laser 405 dla DAPI; Seq.2, laser 488 do α-BTX-F488; i Seq.3, laser 552 dla sprzężonych przeciwciał drugorzędowych F594). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2: Uruchomienie oprogramowania LAS X i parametrów do akwizycji STED. Kroki w celu uzyskania obrazów STED są opisane w sekcjach 3.2.2 do 3.2.8 protokołu. Mikroskop jest uruchamiany w trybie konfiguracyjnym STED ON (krok 3.2.2) i otwierany jest projekt (krok 3.2.3). Parametry akwizycji obrazu (krok 3.2.7) (rozmiar obrazu, szybkość akwizycji, współczynnik powiększenia, oś X) dla każdego skanowania sekwencyjnego są wskazane (sekwencja 1 dla α-BTX-F633; Seq.2 dla sprzężonych przeciwciał drugorzędowych F488). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 3: Obrazy fałdów połączeniowych wybarwionych α-BTX uzyskane za pomocą mikroskopii STED. Przykłady obrazów postsynaptycznej płytki końcowej oznaczonej α-BTX-F633 od 6-tygodniowej myszy typu dzikiego, które zostały pozyskane z prawidłową (po lewej) lub niewłaściwą ostrością (po prawej). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 4: Wyskakujące okienka systemu Windows opisujące dane wejściowe i wyjściowe uzyskane przez niestandardowe makra ImageJ. Przykłady danych wejściowych (pliki .tif i .lif) obrazów NMJ są pokazane w lewej kolumnie. Dane wyjściowe z makr (prawa kolumna) są zapisywane w folderach (Save_Volume, Save_Accu), które zawierają obrazy skrzyżowania (.tif) oraz arkusze danych zawierające wyniki (pliki .csv). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 5: Analiza odległości i szerokości pasów AChR z akwizycji STED przy użyciu oprogramowania LAS X. Kroki analizy obrazów NMJ STED są opisane w sekcji 5 protokołu. A) Obraz oznakowanego postsynaptycznego regionu płytki końcowej zawierającego paski AChR. Obszar zainteresowania do analizy pasków wybiera się, rysując prostopadłą linię (zielona linia, dla odległości paska) lub prostopadły prostokąt (fioletowy prostokąt, dla szerokości paska). (B, C) Pokazane są profile intensywności wybranych regionów oraz pomiary służące do obliczenia odległości między paskami AChR (B) a szerokością pasa AChR (C). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dodatkowy plik kodowania 1: Macro_NMJ_VOL_Marinelloetal. Niestandardowe makro ImageJ do wyodrębniania pomiarów parametrów NMJ (objętość NMJ, obszar płyty końcowej MIP i krętość NMJ). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dodatkowy plik kodowania 2: Macro_NMJ_ACCU_Marinelloetal. Niestandardowe makro ImageJ do ekstrakcji akumulacji NF-M i barwienia SV2. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany protokół wideo zapewnia szczegółową metodę ilościowego określania struktury 3D połączeń nerwowo-mięśniowych poprzez połączenie mikroskopii konfokalnej i STED, które można wykorzystać do scharakteryzowania zmian patologicznych na poziomie pre- i postsynaptycznym. Wysoka rozdzielczość mikroskopii STED umożliwia wizualizację i analizę morfometryczną nanostruktur, których nie można zidentyfikować za pomocą konwencjonalnego obrazowania konfokalnego. Procedura ta umożliwiła nam zmierzenie zmian strukturalnych NMJ w dwóch mięśniach wyrostka robaczkowego, piszczelowym przednim i brzuchatym łydki, myszy CMS związanych z SMA i ColQ.

Aby uzyskać wiarygodne wyniki za pomocą tej techniki, bardzo ważne jest, aby prawidłowo rozciąć i drażnić mięśnie, zwracając szczególną uwagę na powięź otaczającą mięsień i siłę przyłożoną do oddzielenia wiązek mięśniowych; w przeciwnym razie wzorzec unerwienia może zostać zakłócony, utrudniając prawidłową ocenę presynaptycznego NMJ. Chociaż szczegółowe informacje są dostarczane do analizy NMJ z TA i GA, w zasadzie protokół ten można dostosować do innych mięśni, w tym mięśni płaskich, takich jak przepona lub poprzeczny brzuch37, które nie wymagają kroku drażnienia. Utrwalenie tkanek ma również kluczowe znaczenie dla zapewnienia dobrej jakości barwienia; dlatego zaleca się stosowanie wysokiej jakości PFA w odpowiedniej objętości (15-20 razy większej niż w mięśniu). Ponadto czas ekspozycji na utrwalacz jest ważnym krokiem, ponieważ artefakty, takie jak kurczenie się i zbrylanie, mogą pojawić się z powodu nadmiernej fiksacji i wpływać na cechy NMJ. Biorąc pod uwagę wielkość próbek i szybkość penetracji roztworu paraformaldehydu w tkankach38, dla tego typu mięśni zaleca się czas utrwalenia 18-24 godzin. W przypadku, gdy etap barwienia jest planowany później niż tydzień po pobraniu tkanek, sugeruje się utrzymywanie mięśni utrwalonych PFA w PBS uzupełnionych azydkiem sodu w temperaturze 4 °C, aby zapobiec namnażaniu się bakterii.

Protokół ten przedstawia podejście wykorzystujące α-BTX-F488 do obrazowania konfokalnego i α-BTX-F633 do obrazowania STED. Fluorofory te zostały dobrane tak, aby pasowały do opisanego projektu eksperymentalnego, ale mogą być modyfikowane w zależności od dostępnego sprzętu i materiałów. Na przykład etykietowanie α-BTX F488 można wybrać w przypadku korzystania z lasera STED CW 592 nm do akwizycji obrazu i kwantyfikacji. Wydaje się jednak, że konfiguracja, która została zastosowana w niniejszym badaniu (wzbudzenie impulsowe bramkowane STED, zubożenie 775 nm) wykazuje wyższą wydajność i lepszą rozdzielczość niż inne podejścia, takie jak STED39 z falą ciągłą, co czyni ją bardziej odpowiednią do obecnego zastosowania. Ważne jest również, aby starannie dobrać ustawienia mocy lasera, zwłaszcza dla STED (zarówno wzbudzenia, jak i zubożenia), ponieważ charakterystyka profilu intensywności nie może być zmierzona w przypadku nasycenia, a zatem każdy nasycony sygnał na obrazie NMJ może zagrozić całej analizie.

Ten szczegółowy przepływ pracy, w tym akwizycja i analiza obrazu przy użyciu oprogramowania mikroskopowego i makr ImageJ, został opracowany w celu ułatwienia autonomicznej analizy morfometrycznej NMJ za pomocą mikroskopii konfokalnej i STED z pojedynczego mięśnia. Wcześniej opisane przepływy pracy dla analizy konfokalnej NMJ, takie jak NMJ-morph2 lub NMJ-Analyser14, utorowały drogę do zaprojektowania półautomatycznych metod, które ułatwiają analizę morfologiczną NMJ i badania porównawcze. NMJ-morph (i jego zaktualizowana wersja aNMJ-morph15) to darmowa platforma oparta na ImageJ, która wykorzystuje projekcję maksymalnej intensywności do pomiaru 21 cech morfologicznych, a NMJ-Analyser wykorzystuje skrypt opracowany w Pythonie, który generuje 29 istotnych parametrów z całej struktury 3D NMJ. Ręczne progowanie jest jedynym krokiem podczas przetwarzania obrazu w tych dwóch metodach, który wymaga analizy użytkownika. Ten zintegrowany protokół szczegółowo opisuje etapy przygotowania tkanki, akwizycji obrazów konfokalnych 3D i przetwarzania NMJ z całych mięśni szkieletowych w oparciu o ImageJ i zapewnia uproszczony przegląd pięciu ważnych parametrów postsynaptycznych (objętość, maksymalny obszar projekcji i krętość) i presynaptycznych (zajętość końców aksonów i akumulacja neurofilamentów). Dodatkowy parametr o znaczeniu biologicznym, wzorzec organizacji AChR postsynaptycznych fałdów połączeniowych, został włączony do analizy morfometrycznej na poziomie nanoskali za pomocą superrozdzielczej mikroskopii STED (rozdzielczość 20-30 nm)40. Co ciekawe, przygotowanie tkanek do obrazowania STED jest prostsze niż inne metody stosowane w badaniach ultrastrukturalnych NMJ, takie jak konwencjonalna transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM)9, która jest dość złożoną i czasochłonną procedurą, która wymaga wykwalifikowanego manipulatora w celu uzyskania ultracienkich odcinków odpowiedniego obszaru mięśniowego. Ponadto dane ilościowe z wielu zagięć złączy można uzyskać automatycznie za pomocą oprogramowania powiązanego z STED.

Protokół ten został zastosowany w celu zilustrowania wcześniej znanych defektów NMJ w mięśniach z niedoborem SMN i ColQ 20,36,41,42. Wspólne zmiany stwierdzono w dwóch modelach mysich za pomocą mikroskopii konfokalnej, takie jak zmniejszona objętość postsynaptycznej płytki końcowej, obszar MIP i względna krętość oraz zwiększona akumulacja neurofilamentów, podczas gdy niektóre bardziej szczegółowe wyniki (zmniejszone zajętość NMJ) zaobserwowano tylko u myszy SMA, jako wskaźnik upośledzonego transportu pęcherzyków36. Wreszcie, wzrost odległości i szerokości pasków AChR wykryto w ColQ-KO za pomocą analizy STED, które są oznakami defektów ultrastrukturalnych w postsynaptycznych fałdach połączeniowych, jak wcześniej zaobserwowano w TEM20. Co ważne, protokół ten może pomóc w bardziej dogłębnej charakterystyce morfologicznej połączeń nerwowo-mięśniowych podczas rozwoju, utrzymania i w różnych stanach patologicznych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują, że nie ma konfliktu interesów związanego z tą pracą.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy "Centralnemu Ośrodku Obrazowania i Cytometrii" firmy Genethon, a także służbie histologicznej, które są częściowo wspierane przez fundusze sprzętowe z Regionu Ile-de-France, Conseil General de l'Essonne, Genopole Recherche z Evry, Uniwersytetu Evry Val d'Essonne i INSERM we Francji. Jesteśmy również wdzięczni dr Rashmi Kothary za dostarczenie linii myszy Smn2B/2B (University of Ottawa, Kanada) oraz dr Ericowi Krejci za linię myszy ColQDex2/+ (niepublikowanej, Uniwersytet Paryski, Francja). Dziękujemy Guillaume'owi Corre za jego wsparcie w analizie statystycznej. Przeciwciała monoklonalne 2H3 (opracowane przez Jessel, TM i Dodd, J.) i SV2 (opracowane przez Buckley, KM) uzyskano z Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB), utworzonego przez NICHD NIH i utrzymywanego na Uniwersytecie Iowa, Wydział Biologii, Iowa City, IA 52242. Prace te były wspierane przez Association Française contre les Myopathies (AFM-Telethon), INSERM i Uniwersytet w Evry Val d'Essonne.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Buffers and Reagents
Alexa Fluor 488 kozia anty-mysia IgG (F488)Life Technologies, ThermofisherA-11001
Alexa Fluor 488 α-bungarotoxin (F488-a-BTX)Life Technologies, ThermofisherB13422
Alexa Fluor 594 kozia anty-mysia IgG (F594)Life Technologies, ThermofisherA-11032
ATTO-633 α-bungarotoksyna (F633-a-BTX)Alomone LabsB-100-FR
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)SigmaA2153
DAPI Fluoromount-GSouthern Biotech00-4959-52
DPBSGibco, Invitrogen14190-169
Absolutny etanol VWR20821.296
Olejek immersyjny, n = 1.518THORLABSMOIL-10LF Niska autofluorescencja
Przeciwciało neurofilamentowe (NF-M) DSHBAB_531793
Paraformaldehyd (PFA)MERCK1.04005
Przeciwciało przeciwko glikoproteinie pęcherzyków synaptycznych 2 (SV2)DSHBAB_2315387
Triton X-100SigmaT8787
Materiały
Alnico Magnesy cylindryczneFarnell FranceE822średnica 19,1 mm przy maksymalnym uciągu 1,9 Kg
63x 1,4 NA magnitudo olejek immersyjny  HCX Plan Apo CS obiektywLeica Microsystems
100x 1.4 NA HC PL APPO CS2 ObiektywZeiss
Zakrzywione cienkie kleszcze-Kleszczyki do tęczówki MoriaFine Science Tools11370-31
Ekstra cienkie nożyczki - Vannas-Tü Bingen Nożyczki sprężynoweFine Science Tools15-003-08
Kleszcze drobno ząbkowaneEuronexiaP-95-AA
Końcówka ładująca żel okrągła 1-200 i mikro; LCOSTAR4853
Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny Leica TCS SP8Leica Microsystems
Leica Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny TCS SP8 bramkowany STED 775 nmLeica Microsystems
Chusteczka do czyszczenia soczewek Whatman (GE Healthcare)2105-841
Kleszcze średnio ząbkowaneEuronexiaP-95-AB
Okulary nakrywkowe do mikroskopu 24x50 nm Nr 1,5H 170± 5 & mikro; mMarienfield107222Precyzyjna
powierzchnia delta Nunclon (płytki 12-dołkowe)Thermo Scientific 
Powierzchnia delta nunclon (płytki 24-dołkowe)Thermo Scientific 
Skalpel SafeshieldFeather02.001.40.023
Ostro-nożyczki - drobne Nożyczki - martenzytyczne Stal nierdzewnaFine Science Tools14094-11
Prowadnice Superfrost plusThermo Scientific J1800AMNZ
Software
GraphPad Prism, San Diego (US)Wydanie N° 6.07Oprogramowanie statystyczne
Oprogramowanie ImageJNational Institutes of HealthRelease N° 1.53f
Oprogramowanie Leica Application Suite XLeica MicrosystemsN° 3.7.2.2283Darmowe oprogramowanie mikroskopowe dostępne na https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/downloads/ 
150628142475 Wydanie

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Slater, C. R. Postnatal maturation of nerve-muscle junctions in hindlimb muscles of the mouse. Developmental Biology. 94 (1), 11-22 (1982).
  2. Jones, R. A., et al. NMJ-morph reveals principal components of synaptic morphology influencing structure-function relationships at the neuromuscular junction. Open Biology. 6 (12), (2016).
  3. Willadt, S., Nash, M., Slater, C. Age-related changes in the structure and function of mammalian neuromuscular junctions. Annals of the New York Academy of Sciences. 1412, 41-53 (2018).
  4. Boehm, I., et al. Comparative anatomy of the mammalian neuromuscular junction. Journal of Anatomy. 237 (5), 827-836 (2020).
  5. Nishimune, H., Shigemoto, K. Practical anatomy of the neuromuscular junction in health and disease. Neurologic Clinics. 36 (2), 231-240 (2018).
  6. Moloney, E. B., de Winter, F., Verhaagen, J. ALS as a distal axonopathy: molecular mechanisms affecting neuromuscular junction stability in the presymptomatic stages of the disease. Frontiers in Neuroscience. 8, (2014).
  7. Lovering, R. M., Iyer, S. R., Edwards, B., Davies, K. E. Alterations of neuromuscular junctions in Duchenne muscular dystrophy. Neuroscience Letters. 737, 135304(2020).
  8. Koneczny, I., Herbst, R. Myasthenia Gravis: Pathogenic effects of autoantibodies on neuromuscular architecture. Cells. 8 (7), 671(2019).
  9. Dowling, J. J., et al. Myotubular myopathy and the neuromuscular junction: a novel therapeutic approach from mouse models. Disease Models & Mechanisms. 5 (6), 852-859 (2012).
  10. Gibbs, E. M., et al. Neuromuscular junction abnormalities in DNM2-related centronuclear myopathy. Journal of Molecular Medicine. 91 (6), 727-737 (2013).
  11. Swoboda, K. J., et al. Natural history of denervation in SMA: Relation to age, SMN2 copy number, and function. Annals of Neurology. 57 (5), 704-712 (2005).
  12. Rodríguez Cruz, P. M., Palace, J., Beeson, D. The neuromuscular junction and wide heterogeneity of congenital myasthenic syndromes. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1677(2018).
  13. Tse, N., et al. The neuromuscular junction: Measuring synapse size, fragmentation and changes in synaptic protein density using confocal fluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (94), e52220(2014).
  14. Mejia Maza, A., et al. NMJ-Analyser identifies subtle early changes in mouse models of neuromuscular disease. Scientific Reports. 11 (1), 12251(2021).
  15. Minty, G., et al. aNMJ-morph: a simple macro for rapid analysis of neuromuscular junction morphology. Royal Society Open Science. 7 (4), 200128(2020).
  16. Modla, S., Mendonca, J., Czymmek, K. J., Akins, R. E. Identification of neuromuscular junctions by correlative confocal and transmission electron microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 191 (2), 158-165 (2010).
  17. Kittel, R. J., et al. Bruchpilot promotes active zone assembly, Ca2+ channel clustering, and vesicle release. Science. 312 (5776), 1051-1054 (2006).
  18. York, A. L., Zheng, J. Q. Super-resolution microscopy reveals a nanoscale organization of acetylcholine receptors for trans-synaptic alignment at neuromuscular synapses. eNeuro. 4 (4), (2017).
  19. Bowerman, M., Murray, L. M., Beauvais, A., Pinheiro, B., Kothary, R. A critical smn threshold in mice dictates onset of an intermediate spinal muscular atrophy phenotype associated with a distinct neuromuscular junction pathology. Neuromuscular Disorders. 22 (3), 263-276 (2012).
  20. Feng, G., Krejci, E., Molgo, J., Cunningham, J. M., Massoulié, J., Sanes, J. R. Genetic analysis of collagen Q: Roles in acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase assembly and in synaptic structure and function. Journal of Cell Biology. 144 (6), 1349-1360 (1999).
  21. Sigoillot, S. M., et al. Neuromuscular junction immaturity and muscle atrophy are hallmarks of the ColQ-deficient mouse, a model of congenital myasthenic syndrome with acetylcholinesterase deficiency. The FASEB Journal. 30 (6), 2382-2399 (2016).
  22. Vanhaesebrouck, A. E., Beeson, D. The congenital myasthenic syndromes: expanding genetic and phenotypic spectrums and refining treatment strategies. Current Opinion in Neurology. 32 (5), 696-703 (2019).
  23. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  24. ImageJ. , Available from: http://imagej.nih.gov/ij (2021).
  25. Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
  26. Bio-Formats. , Available from: http://www.openmicroscopy.org/bio-formats/downloads/ (2021).
  27. Legland, D., Beaugrand, J. Automated clustering of lignocellulosic fibres based on morphometric features and using clustering of variables. Industrial Crops and Products. 45, Supplement C 253-261 (2013).
  28. ImageJ documentation. , Available from: http://imagejdocu.tudor.lu/plugin/analysis/geodesic_distances/start (2021).
  29. GitHUb. , Available from: https://github.com/Genethon/ImCy (2021).
  30. Otsu, N. A Threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9 (1), 62-66 (1979).
  31. Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Induction, assembly, maturation and maintenance of a postsynaptic apparatus. Nature Reviews Neuroscience. 2 (11), 791-805 (2001).
  32. Kong, L., et al. Impaired synaptic vesicle release and immaturity of neuromuscular junctions in spinal muscular atrophy mice. The Journal of Neuroscience. 29 (3), 842-851 (2009).
  33. Cifuentes-Diaz, C., et al. Neurofilament accumulation at the motor endplate and lack of axonal sprouting in a spinal muscular atrophy mouse model. Human Molecular Genetics. 11 (12), 1439-1447 (2002).
  34. Murray, L. M., Comley, L. H., Thomson, D., Parkinson, N., Talbot, K., Gillingwater, T. H. Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre- and post-synaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy. Human Molecular Genetics. 17 (7), 949-962 (2008).
  35. Boyer, J. G., et al. Myogenic program dysregulation is contributory to disease pathogenesis in spinal muscular atrophy. Human Molecular Genetics. 23 (16), 4249-4259 (2014).
  36. Ling, K. K. Y., Gibbs, R. M., Feng, Z., Ko, C. -P. Severe neuromuscular denervation of clinically relevant muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy. Human Molecular Genetics. 21 (1), 185-195 (2012).
  37. Murray, L., Gillingwater, T. H., Kothary, R. Dissection of the transversus abdominis muscle for whole-mount neuromuscular junction analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (83), e51162(2014).
  38. Baker, J. R. Principles of biological microtechnique; a study of fixation and dyeing. , Wiley. London Methuen; New York. at http://archive.org/details/principlesofbiol01bake (1958).
  39. Vicidomini, G., et al. STED Nanoscopy with time-gated detection: Theoretical and experimental aspects. PLoS ONE. 8 (1), 054421(2013).
  40. Badawi, Y., Nishimune, H. Super-resolution microscopy for analyzing neuromuscular junctions and synapses. Neuroscience Letters. 715, 134644(2020).
  41. Thomson, S. R., et al. Morphological characteristics of motor neurons do not determine their relative susceptibility to degeneration in a mouse model of severe spinal muscular atrophy. PLoS ONE. 7 (12), 052605(2012).
  42. McMacken, G. M., et al. Salbutamol modifies the neuromuscular junction in a mouse model of ColQ myasthenic syndrome. Human Molecular Genetics. 28 (14), 2339-2351 (2019).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikroskopia konfokalnamikroskopia STEDrozdzielanie w kien mi niowychprotok immunoznakowaniareceptor acetylocholinyblaszka motorycznaanaliza w programie Image Jglikoproteina p cherzyk w synaptycznych

Powiązane artykuły