Artykuł metodologiczny

Technika otrzymywania mezenchymalnych komórek macierzystych z tkanki tłuszczowej i charakterystyka frakcji naczyniowej zrębu w długoterminowej kriokonserwacji

DOI:

10.3791/63036

⸱

30 grudnia 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Genetics Division, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2TechLife Biotech, São Lucas Cell Therapy Group, 3Division of Plastic Surgery, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół opisuje ulepszoną metodologię izolacji ADSC, co skutkuje ogromną wydajnością komórkową z zyskiem czasu w porównaniu z literaturą. Badanie to dostarcza również prostej metody uzyskiwania stosunkowo dużej liczby żywotnych komórek po długotrwałej krioprezerwacji.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej stają się coraz bardziej atrakcyjne, ponieważ wykazują odpowiednie cechy i są dostępnym źródłem do regeneracyjnych zastosowań klinicznych. Do pozyskiwania komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej zastosowano różne protokoły. W tym artykule opisano różne etapy ulepszonego protokołu oszczędzającego czas w celu uzyskania bardziej znaczącej ilości ADSC, pokazując, jak kriokonserwować i rozmrażać ADSC w celu uzyskania żywych komórek do ekspansji hodowli. Sto mililitrów lipoaspiratu pobrano za pomocą liposukcji strzykawkowej kalibru 3 mm o średnicy 26 cm i 3 mm z okolic brzucha dziewięciu pacjentów, którzy następnie przeszli planową abdominoplastykę. Izolację komórek macierzystych przeprowadzono za pomocą serii płukań roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco uzupełnionym wapniem i przy użyciu kolagenazy. Komórki zrębu frakcji naczyniowej (SVF) poddano kriokonserwacji, a ich żywotność sprawdzono za pomocą immunofenotypowania. Wydajność komórkowa SVF wynosiła 15,7 x 105 komórek/ml, w zakresie 6,1-26,2 komórek/ml. Przylegające komórki SVF osiągnęły konfluencję średnio po 7,5 (±4,5) dni, przy średniej wydajności komórkowej 12,3 (± 5,7) x 105 komórek/ml. Żywotność rozmrożonego SVF po 8 miesiącach, 1 roku i 2 latach wahała się między 23,06%-72,34%, przy średniej 47,7% (±24,64), przy czym najniższa żywotność korelowała z przypadkami dwuletniego zamrożenia. Zastosowanie roztworu DPBS uzupełnionego wapniem i czasem spoczynku w worku w celu wytrącenia tłuszczu przy krótszym czasie trawienia kolagenazy spowodowało zwiększenie końcowej wydajności komórkowej komórek macierzystych. Szczegółowa procedura uzyskiwania wysokich plonów żywotnych komórek macierzystych była bardziej efektywna pod względem czasu i wydajności komórkowej niż techniki z poprzednich badań. Nawet po długim okresie krioprezerwacji, w SVF znaleziono żywotne komórki ADSC.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste są korzystne zarówno w badaniach podstawowych, jak i stosowanych. Wykorzystanie tego dorosłego typu komórek wykracza poza kwestie etyczne - w porównaniu z wykorzystaniem komórek embrionalnych lub innych - będąc jednym z najbardziej obiecujących obszarów badań w inżynierii autologicznej regeneracji tkanek i terapii komórkowej1, takich jak obszar nowotworowy, leczenie chorób zwyrodnieniowych i zastosowania terapeutyczne w obszarze chirurgii rekonstrukcyjnej2,3,4,5. Wcześniej informowano, że we frakcji komórek naczyniowych zrębu tkanki tłuszczowej znajduje się obfite źródło mezenchymalnych komórek macierzystych multipotencjalnych i pluripotencjalnych6,7. Te ADSC są uważane za doskonałych kandydatów do stosowania w terapii komórkowej i transplantacji/infuzji, ponieważ znaczna liczba komórek o dużej zdolności do ekspansji ex vivo może być łatwo uzyskana z wysoką wydajnością z minimalnie inwazyjnej procedury5,8.

Wykazano również, że tkanka tłuszczowa wykazuje większą zdolność do dostarczania mezenchymalnych komórek macierzystych niż dwa inne źródła (szpik kostny i tkanka pępowiny)9. Oprócz tego, że jest słabo immunogenny i ma wysoką zdolność do integracji z tkanką gospodarza i interakcji z otaczającymi tkankami4,10, ADSC ma wielosilną zdolność różnicowania się w linie komórkowe, z doniesieniami o różnicowaniu chondrogenicznym, osteogennym i miogennym w odpowiednich warunkach hodowli11,12,13oraz do komórek, takich jak trzustka, hepatocyty i komórki neurogenne14,15,16.

Społeczność naukowa zgadza się, że immunomodulacyjny efekt mezenchymalnych komórek macierzystych jest bardziej istotnym mechanizmem działania dla terapii komórkowej17,18,19 niż ich właściwość różnicowania. Jedną z najważniejszych zalet stosowania ADSC jest możliwość autologicznej infuzji lub szczepienia, stając się alternatywnym sposobem leczenia wielu chorób. W medycynie regeneracyjnej ADSC były już stosowane w przypadkach uszkodzenia wątroby, rekonstrukcji mięśnia sercowego, regeneracji tkanki nerwowej, poprawy funkcji mięśni szkieletowych, regeneracji kości, terapii nowotworów i leczenia cukrzycy20,21.

Do dnia dzisiejszego na stronie internetowej Narodowych Instytutów Zdrowia Stanów Zjednoczonych zarejestrowano 263 badania kliniczne mające na celu ocenę potencjału ADSC, wymienione na stronie internetowej Narodowych Instytutów Zdrowia Stanów Zjednoczonych22. Ustalono różne protokoły pobierania tkanki tłuszczowej, ale w literaturze nie ma zgody co do ustandaryzowanej metody izolacji ADSC do użytku klinicznego23,24. Metody przetwarzania lipoaspiratu w trakcie i po operacji mogą bezpośrednio wpływać na żywotność komórek, końcową wydajność komórkową25 oraz jakość populacji ADSC20. Jeśli chodzi o chirurgiczne leczenie wstępne, nie jest dobrze ustalone, która technika chirurgicznego leczenia wstępnego daje większą liczbę żywych komórek po izolacji, czy też roztwór znieczulający wstrzyknięty do tkanki tłuszczowej wpływa na wydajność komórek i ich funkcje26. Podobnie, różnica między technikami pozyskiwania komórek tłuszczowych może prowadzić nawet do 70% spadku liczby żywotnych ADSC20. Zgodnie z literaturą, należy unikać zabiegów mechanicznych mających na celu uzyskanie populacji komórek o wysokiej żywotności - w tym ultradźwięków - ponieważ mogą one rozbić tkankę tłuszczową20. Jednak metoda ręcznego aspiracji tłuszczu za pomocą strzykawek jest mniej szkodliwa, powodując mniejsze niszczenie komórek, a liposukcja tumescencyjna daje znaczną liczbę komórek o najlepszej jakości26.

Ta technika wykorzystuje roztwór soli fizjologicznej z lidokainą i epinefryną, który jest wstrzykiwany do obszaru liposukcji. Na każde 3 ml wstrzykniętej objętości roztworu odsysa się 1 ml. W tym badaniu przeprowadzono technikę liposukcji na mokro, w której na każdy wstrzyknięty 1 ml adrenaliny i roztworu soli fizjologicznej odsysane jest 0,2 ml tkanki tłuszczowej. Stosowanie enzymów trawiennych, zwłaszcza kolagenazy, jest powszechne w procesie izolacji ADSC.

Po pierwszym etapie izolacji w laboratorium, końcowy granulat nazywany jest frakcją naczyniową zrębu (SVF). Zawiera różne typy komórek27, w tym komórki prekursorowe śródbłonka, komórki śródbłonka, makrofagi, komórki mięśni gładkich, limfocyty, perycyty, preadipocyty i ADSC, które są zdolne do adhezji. Po zakończeniu ostatecznej izolacji z kultur in vitro, komórki, które nie przylegały do tworzywa sztucznego, są eliminowane w wyniku wymiany pożywki. Po ośmiu tygodniach ekspansji, zmian pożywki i pasażów, ADSC reprezentują większość populacji komórek w kolbach20. Jedną z najważniejszych zalet wykorzystania wyizolowanych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej do ewentualnej przyszłej terapii jest możliwość kriokonserwacji. Wykazano, że kriokonserwowany lipoaspirat jest potencjalnym źródłem komórek SVF nawet po 6 tygodniach zamrażania28, z aktywnością biologiczną nawet po 2 latach krioprezerwacji29, oraz pełną zdolnością do wzrostu i różnicowania w hodowli30. Jednak podczas procesu rozmrażania znaczny procent komórek jest zwykle tracony31. Dlatego proces usuwania lipoaspiratu i następujące po nim metody izolacji komórek muszą zapewnić najwyższą wydajność komórek.

To badanie opisuje szybszą metodologię zbierania i izolowania ADSC, wykazując wysoką wydajność komórkową i żywotność dla lepszej skuteczności terapii komórkowych. Ponadto oceniono wpływ tej ulepszonej techniki po długotrwałej kriokonserwacji SVF.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejsze badanie zostało zatwierdzone przez Komitet Etyki UNIFESP (numer protokołu: 0029/2015 CAAE: 40846215.0.0000.5505), przeprowadzone po uzyskaniu pisemnej świadomej zgody pacjentów zgodnie z Deklaracją Helsińską (2004). Próba niniejszego badania składa się z dziewięciu pacjentek w wieku 33-50 lat (średnia wieku 41,5 lat) i średnim początkowym wskaźnikiem masy ciała (BMI) 24,54 (w zakresie 22,32-26,77) (Tabela 1), które przeszły estetyczną abdominoplastykę z powodu nadmiaru skóry po ciąży, na Wydziale Chirurgii Plastycznej Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), Brazylia. Aby zmniejszyć stronniczość, pacjenci zostali wybrani jako jednorodna grupa pod względem płci, wieku i BMI. Zestawy danych wykorzystane i/lub przeanalizowane podczas tego badania są dostępne u autora korespondencyjnego na uzasadnione żądanie.

1. Kolekcja lipoaspiratu

UWAGA: Ten krok musi być wykonany w centrum chirurgicznym.

  1. Użyj 4% glukonianu chlorheksydyny (patrz tabela materiałów) do przygotowania skóry i aseptyki.
    1. Wykonać podskórne nacięcie skóry o średnicy 2 mm (między skórą właściwą a rozcięgnem). Wprowadzić kaniulę Kleina o kalibrze 3 mm 3 mm i 3 mm oraz strzykawkę, aby wstrzyknąć całkowitą objętość 500 ml roztworu adrenaliny (1 mg/ml) (patrz tabela materiałów) rozcieńczonego w roztworze soli fizjologicznej (1:1 000 000) w okolicy podpępkowej.
  2. Podłącz strzykawkę o pojemności 60 ml do kaniuli do liposukcji 26 mm 3 G z trzema otworami i kalibrem 3 mm i włóż ją przez nacięcie skóry, blokując tłok w celu wytworzenia podciśnienia.
    1. Wykonuj ruchy pchania i ciągnięcia, tak aby po wytworzeniu podciśnienia lipoaspirat pozostał w strzykawce o pojemności 60 ml.
  3. Za pomocą sterylnego łącznika z zaworem przenieś 100 ml zebranego lipoaspiratu do worka transferowego z polichlorku winylu o pojemności 150 ml (patrz tabela materiałów).
    1. Zapakuj worek transferowy w styropianowe pudełko w temperaturze pokojowej (~25 °C) i natychmiast zanieś go do laboratorium. Nie należy poświęcać więcej niż 30 minut na rozpoczęcie przetwarzania tkanki.

2. Przetwarzanie lipoaspiratu

UWAGA: Ten krok ma być wykonany w laboratorium.

  1. Najpierw zważ worek, zmierz temperaturę za pomocą cyfrowego bezdotykowego termometru klinicznego na podczerwień i pozostaw worek na 5 minut w komorze przepływu laminarnego w celu wytrącenia bardziej tłustych warstw (pęcherzyków) i oddzielenia tkanek zawierających interesujące komórki.
    1. Wykonaj serię płukania chusteczek. Pierwsze mycie: wstrzyknąć 100 ml DPBS z wapniem (1x) do worka transferowego i wymieszać z rękami.
    2. Odstaw na 5 minut i usuń większość wytrącającego się płynu podstawowego.
    3. Wyrzuć podstawowy płyn za pomocą strzykawki o pojemności 60 ml dołączonej do adaptera worka. Ten proces należy powtórzyć dwukrotnie.
  2. Dodać 100 ml roztworu trawiącego do torebki (93 ml DPBS bez wapnia + 60 μl chlorku wapnia (1 g/l) + 7 ml 0,075% sterylnej kolagenazy, patrz tabela materiałów) i pozostawić w temperaturze 37 °C na 30 minut przy powolnym mieszaniu.
  3. Przenieść całą zawartość worka do czterech stożkowych probówek o pojemności 50 ml i odwirować je w temperaturze 400 x g w temperaturze 22 °C przez 10 minut.
    1. Usuń i wyrzuć supernatant i dodaj 5 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco o niskiej zawartości glukozy uzupełnionego 20% FBS (płodowa surowica bydlęca) do osadu komórkowego (Ryc. 1).

3. Liczenie komórek SVF

  1. Świeży roztwór 10 μl błękitu trypanowego o stężeniu 0,05% mieszać w wodzie destylowanej z 10 μl zawiesiny komórkowej przez 5 minut.
  2. Policz żywe komórki w komorze do liczenia komórek Neubauera32 za pomocą mikroskopu światła odwróconego (patrz Tabela materiałów) przy 20-krotnym powiększeniu.
  3. Zawiesić osad komórkowy w podłożu krioprotrotanckim (5 ml FBS + 10% dimetylosulfotlenku - DMSO) w stężeniu 1 x 106 komórek/ml.
  4. Umieść 1 ml tej mieszanki w kriowialach. Użyć pojemnika do zamrażania (patrz tabela materiałów) o szybkości chłodzenia (od 1 °C/min do -80 °C).
    1. Przechowywać w temperaturze -80 °C przez 1 rok.
    2. Po tym czasie przechowywać w standardowych kasetach zanurzonych w fazie parowej ciekłego azotu (-165 °C).

4. Proces rozmrażania komórek

  1. Wyjąć fiolki z ciekłego azotu i natychmiast umieścić je w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 1 minutę.
  2. Umieścić komórki SVF w stożkowej probówce z 4 ml DMEM (niska glukoza uzupełniona 20% FBS) podgrzanej do 37 °C.
  3. Wirować przy 400 x g w temperaturze 22 °C przez 5 min.
  4. Usuń supernatant i dodaj 1 ml DMEM (niski poziom glukozy) + 10% FBS. Wykonaj immunofenotypowanie, wykonując poniższe czynności.

5. Technika cytometrii przepływowej (wielokrotne znakowanie immunofenotypu)

  1. Umieść 1 ml osadu komórkowego (stężenie 1 000 komórek/μl) w pięciu probówkach cytometrycznych (po 200 μl każda).
  2. Wirować przy 400 x g w temperaturze 22 °C przez 5 minut i odrzucić supernatant za pomocą pipety.
  3. Dodać 300 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (10x), odwirować przy 400 x g w temperaturze 22 °C i odrzucić supernatant za pomocą pipety.
  4. Przygotować pięć probówek dla różnych kombinacji markerów w następujący sposób: 5 μl CD11B/5 μl CD19/20 μl CD45; 5 μl CD73/20 μL CD90/5 μL CD105/20 μL CD45; 20 μL CD34/5 μL HLA-DR/20 μL CD45; Test żywotności komórek-5 μl fluorescencyjnego barwnika reaktywnego. (patrz tabela materiałów) oraz probówkę z niebarwionymi komórkami i PBS jako kontrolą ujemną. Homogenizować w wirze i inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut.
    1. Wirować przy 400 x g w temperaturze 22 °C przez 5 minut, odrzucić supernatant za pomocą pipety, dodać 500 μl PBS (10x) i przystąpić do sortowania komórek.
      UWAGA: Pięć tysięcy zdarzeń jest rejestrowanych na zestaw przeciwciał w cytometrze przepływowym o czterech kolorach i pięciu parametrach i analizowanych za pomocą oprogramowania CellQuest.

6. Zasiewanie przejścia 1 (P1)

  1. Wysiew 2 x 105 komórek w kolbie hodowlanej o średnicy 75cm2.
  2. Dodaj 12 ml DMEM o niskiej stężeniu glukozy + 20% FBS + 10% antybiotyku/antybiotyku (z 10 000 jednostek penicyliny, 10 mg streptomycyny i 25 μg amfoterycyny B na ml, 0,1 μm).
  3. Gdy komórki osiągną zbieżność między 80% -90%, wykonuj trypsynizację przylegających komórek za pomocą 2 ml 0,25% EDTA-trypsyny przez 3 minuty.
  4. Ponownie policz komórki (jak wspomniano w kroku 3).
  5. Ponownie wykonaj immunofenotypowanie (jak wspomniano w kroku 5).

7. Analiza statystyczna

  1. Użyj kalkulatora Rho Spearmana33, aby zmierzyć siłę powiązania między następującymi zmiennymi o P < 0,05, jak wspomniano poniżej.
    1. Wybierz wydajność komórkową SVF i liczbę dni, przez które SVF pozostaje w kulturze w pierwszym pasażu (P1) do 80%-90% konfluencji (dni do P1).
    2. Wybierz wydajność komórkową SVF przed i po przejściu do P1.
    3. Weź pod uwagę dni do P1 i wydajność komórkową przed przejściem do P1.
    4. Wybierz wydajność komórkową SVF ze średnim procentem potwierdzonego ADSC.
    5. Oblicz procent potwierdzonego ADSC i wydajność komórkową przed przejściem do P1.
    6. Określ BMI i wydajność komórkową SVF.

8. Test różnicowania

  1. Przeprowadzić test różnicowania zgodnie z protokołem zestawu do różnicowania (patrz tabela materiałów). Rysunek 4 przedstawia wyniki dla przypadku 1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Charakterystyka dziewięciu badanych osób, w tym ich wiek, waga, wzrost i BMI, jest pokazana w Tabeli 1.

Zgodnie z początkowo przedstawioną wydajnością komórkową, objętość komórek zaszczepionych w hodowli została obliczona tak, aby była jak najbardziej zbliżona do pojemności kolby hodowlanej o średnicy 75cm2. Objętość próbki wysiewanej w każdym przypadku jest opisana w tabeli 2. Następnie, zgodnie z początkową wydajnością komórkową, określono zmienną...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wydajność izolacji
Powszechnie wiadomo, że proces kriokonserwacji, często wymagany w terapii komórkowej, powoduje znaczną utratę komórek, czasami większą niż 50%29,30,35. W związku z tym zasadnicze znaczenie ma ulepszenie techniczne w celu uzyskania wysokiej początkowej wydajności komórkowej w izolacji. Metoda pobierania lipoaspiratu i metoda izolacji komórek muszą koncentrować się na zachowaniu większej li...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy pacjentom, którzy zgłosili się do udziału oraz personelowi medycznemu i pielęgniarskiemu Szpitala São Paulo. Badanie to było wspierane przez Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) i Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) w Brazylii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,8 ml kriowialeNunc Thermo Fisher Scientific340711
150 ml worek transferowy z polichlorku winyluJP FARMA80146150059
2% roztwór czerwieni alizarynowej S, pH 4,2Sigma AldrichA5533
Adrenalina (1 mg / ml)HipolaborNA
Alcian Blue roztwórSigma Aldrich1,01,647
Antybiotyk-Antybiotyk Przeciwgrzybiczy 100xGibco15240062
BD FACSCalibur Cytometr przepływowy przy użyciu BD CellQues Pro AnalysisBD BioSciencesNA
Chlorek wapnia 10%Merck102379
Glukonian chlorheksydyny 4%VIC PHARMANA
Kolagenaza, Typ I, proszekGibco17018029
DMEM (zmodyfikowana pożywka Eagle's Modified Eagle's Sole)Gibco11966025
DPBS bez wapnia, bez magnezu (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems)GibcoA1285801
DPBS z wapniem (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems)GibcoA1285601
Płodowa surowica bydlęcaGibco10500056
Formaldehyd 4%Sigma Aldrich1,00,496
Mikroskop światła odwróconegoNikon Eclipse TS100NA
Test żywych i martwych komórekThermofisher01-3333-41 | 01-3333-42
Przeciwciało monoklonalne: CD105BD BioSciences745927
Przeciwciało monoklonalne: CD11BBD BioSciences746004
Przeciwciało monoklonalne: CD19BD BioSciences745907
Przeciwciało monoklonalne: CD34BD BioSciences747822
Przeciwciało monoklonalne: CD45DAKOM0701
Przeciwciało monoklonalne: CD73BD BioSciences746000
Przeciwciało monoklonalne: CD90BD BioSciences553011
Przeciwciało monoklonalne: HLA-DRBD BioSciences340827
Mr. Frosty Pojemnik do zamrażaniaThermo Fisher Scientific5100-0001
PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami) 1x pH 7,4Gibco 
Zestaw do różnicowania adipogenezy StemPro Zestaw do różnicowania adipogenezyGibcoA1007001
StemPro Zestaw do różnicowania w zakresieKości GibcoA1007101
StemPro Zestaw do różnicowania osteogenezyGibcoA1007201
Sterylny łącznik z jednym szpikulcem z miejscem wstrzyknięcia igłyOrigen Biomedical Connector, USANAOznaczenie kodowe: IBS
Roztwór błękitu trypanowego 0,4%Sigma Aldrich93595
Trypsyna-EDTA 0,25% 1x, czerwień fenolowaGibco25200056
10010023 ewolucji

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Frese, L., Dijkman, P. E., Hoerstrup, S. P. Adipose tissue-derived stem cells in regenerative medicine. Transfusion Medicina and Hemotherapy. 43 (4), 268-274 (2016).
  2. Alperovich, M., et al. Adipose stem cell therapy in cancer reconstruction: a critical review. Annals of Plastic Surgery. 73, Suppl 1 104-107 (2014).
  3. Forcales, S. V. Potential of adipose-derived stem cells in muscular regenerative therapies. Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 123(2015).
  4. Bateman, M. E., Strong, A. L., Gimble, J. M., Bunnell, B. A. Concise review: using fat to fight disease: a systematic review of nonhomologous adipose-derived stromal/stem cell therapies. Stem Cells. 36 (9), 1311-1328 (2018).
  5. Gentile, P., Cervelli, V. Adipose-derived stromal vascular fraction cells and platelet- rich plasma: basic and clinical implications for tissue engineering therapies in regenerative surgery. Methods in Molecular Biology. 1773, 107-122 (2018).
  6. Schäffler, A., Büchler, C. Concise review: adipose tissue-derived stromal cells- basic and clinical implications for novel cell-based therapies. Stem Cells. 25 (4), 818-827 (2007).
  7. Witkowska-Zimny, M., Walenko, K. Stem cells from adipose tissue. Cellular & Molecular Biology Letters. 16, 236-257 (2011).
  8. Liew, L. J., Ong, H. T., Dilley, R. J. Isolation and culture of adipose-derived stromal cells from subcutaneous fat. Methods in Molecular Biology. 1627, 193-203 (2017).
  9. Fazzina, R., et al. Potency testing of mesenchymal stromal cell growth expanded in human platelet lysate from different human tissues. Stem Cell Research & Therapy. 7 (1), 122(2016).
  10. Yarak, S., Okamoto, O. K. Human adipose-derived stem cells: Current challenges and clinical perspectives. Brazilian Annals of Dermatology. 85 (5), 647-656 (2010).
  11. Mizuno, H. Adipose-derived stem cells for tissue repair and regeneration: ten years of research and a literature review. Journal of Nippon Medical School. 76 (2), 56-66 (2009).
  12. Makarov, A. V., Arutyunyan, I. V., Bol'Shakova, G. B., Volkov, A. V., Gol'Dshtein, D. V. Morphological changes in paraurethral area after introduction of tissue engineering constructo on the basis of adipose tissue stromal cells. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 148 (4), 719-724 (2009).
  13. Simonacci, F., Bertozzi, N., Raposio, E. Off-label use of adipose-derived stem cells. Annals of Medicina and Surgery. 24, 44-51 (2017).
  14. Scanarotti, C., et al. Neurogenic-committed human pre-adipocytes express CYP1A isoforms. Chemico-Biological Interactions. 184 (3), 474-483 (2010).
  15. Aluigi, M. G., et al. Pre-adipocytes commitment to neurogenesis 1: Preliminary localisation of cholinergic molecules. Cell Biology International. 33 (5), 594-601 (2009).
  16. Coradeghini, R., et al. A comparative study of proliferation and hepatic differentiation of human adipose-derived stem cells. Cells Tissues Organs. 191 (6), 466-477 (2010).
  17. Xishan, Z., et al. Jagged-2 enhances immunomodulatory activity in adipose derived mesenchymal stem cells. Scientific Reports. 5, 14284(2015).
  18. Debnath, T., Chelluri, L. K. Standardization and quality assessment for clinical grade mesenchymal stem cells from human adipose tissue. Hematology, Transfusion and Cell Therapy. 41 (1), 7-16 (2019).
  19. El-Sayed, M., et al. Immunomodulatory effect of mesenchymal stem cells: Cell origin and cell quality variations. Molecular Biology Reports. 46 (1), 1157-1165 (2019).
  20. Harasymiak-Krzyzanowska, I., et al. Adipose tissue-derived stem cells show considerable promise for regenerative medicine applications. Cellular & Molecular Biology Letters. 18 (4), 479-493 (2013).
  21. Lindroos, B., Suuronen, R., Miettinen, S. The potential of adipose stem cells in regenerative medicine. Stem Cell Reviews and Reports. 7 (2), 269-291 (2011).
  22. US National Institutes of Health Website. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ (2019).
  23. Baer, P. C., Geiger, H. Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: Tissue localization, characterization, and heterogeneity. Stem Cells International. 2012, 812693(2012).
  24. Raposio, E., Bertozzi, N. Isolation of ready-to-use adipose-derived stem cell (ASC) pellet for clinical applications and a comparative overview of alternate methods for ASC isolation. Current Protocols in Stem Cell Biology. 41, 1-12 (2017).
  25. Cucchiani, R., Corrales, L. The effects of fat harvesting and preparation, air exposure, obesity, and stem cell enrichment on adipocyte viability prior to graft transplantation. Aesthetic Surgery Journal. 36 (10), 1164-1173 (2016).
  26. Muscari, C., et al. Comparison between stem cells harvested from wet and dry lipoaspirates. Connective Tissue Research. 54 (1), 34-40 (2013).
  27. Bora, P., Majumdar, A. S. Adipose tissue-derived stromal vascular fraction in regenerative medicine: a brief review on biology and translation. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 145(2017).
  28. Zanata, F., et al. Effect of cryopreservation on human adipose tissue and isolated stromal vascular fraction cells: in vitro and in vivo analyses. Plastic and Reconstructive Surgery. 141 (2), (2018).
  29. Harris, D. Long-term frozen storage of stem cells: challenges and solutions. Journal of Biorepository Science for Applied Medicina. 4, 9-20 (2016).
  30. Minonzio, G., et al. Frozen adipose-derived mesenchymal stem cells maintain high capability to grow and differentiate. Cryobiology. 69 (2), 211-216 (2014).
  31. Devitt, S. M., et al. Successful isolation of viable adipose-derived stem cells from human adipose tissue subject to long-term cryopreservation positive implications for adult stem cell-based therapeutics in patients of advanced age. Stem Cells International. 2015, 146421(2015).
  32. Freshney, R. I. Culture of animal cells: a manual of basic technique. 3rd Ed. , Wiley-Liss. New York. (2001).
  33. Spearman's Rho Calculator. , Available from: https://www.socscistatistics.com/tests/spearman/ (2020).
  34. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  35. Irioda, A. C., et al. Human adipose-derived mesenchymal stem cells cryopreservation and thawing decrease α4-integrin expression. Stem Cells International. 2016, 2562718(2016).
  36. Aust, L., et al. Yield of human adipose-derived adult stem cells from liposuction aspirates. Cytotherapy. 6 (1), 7-14 (2004).
  37. Pérez, L. M., et al. Altered metabolic and stemness capacity of adipose tissue-derived stem cells from obese mouse and human. PLoS One. 10 (4), 0123397(2015).
  38. Yoshimura, K., et al. Characterization of freshly isolated and cultured cells derived from the fatty and fluid portions of liposuction aspirates. Journal of Cellular Physiology. 208 (1), 64-76 (2006).
  39. Mojallal, A., et al. Influence of age and body mass index on the yield and proliferation capacity of adipose-derived stem cells. Aesthetic Plastic Surgery. 35 (6), 1097-1105 (2011).
  40. Tevlin, R., et al. A novel method of human adipose-derived stem cell isolation with resultant increased cell yield. Plastic and Reconstructive Surgery. 138 (6), (2016).
  41. Tsekouras, A., et al. Comparison of the viability and yield of adipose-derived stem cells (ASCs) from different donor areas. In Vivo. 31 (6), 1229-1234 (2017).
  42. Varghese, J., Griffin, M., Mosahebi, A., Butler, P. Systematic review of patient factors affecting adipose stem cell viability and function: implications for regenerative therapy. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 45(2017).
  43. Mitchell, J. B., et al. Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers. Stem Cells. 24 (2), 376-385 (2006).
  44. Huss, R. Perspectives on the morphology and biology of CD34-negative stem cells. Journal of Hematotherapy and Stem Cell Research. 9 (6), 783-793 (2000).
  45. Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics (IFATS) and Science and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
  46. Scherberich, A., Di Maggio, N., Mcnagny, K. M. A familiar stranger: CD34 expression and putative functions in SVF cells of adipose tissue. World Journal of Stem Cells. 5 (1), 1-8 (2013).
  47. Yu, G., et al. Yield and characterization of subcutaneous human adipose-derived stem cells by flow cytometric and adipogenic mRNA analyzes. Cytotherapy. 12 (4), 538-546 (2010).
  48. Meyerrose, T. E., et al. In vivo distribution of human adipose-derived mesenchymal stem cells in novel xenotransplantation models. Stem Cells. 25 (1), 220-227 (2007).
  49. Pilgaard, L., Lund, P., Rasmussen, J. G., Fink, T., Zachar, V. Comparative analysis of highly defined proteases for the isolation of adipose tissue-derived stem cells. Regenerative Medicina. 3 (5), 705-715 (2008).
  50. Browne, S. M., Al-Rubeai, M. Defining viability in mammalian cell cultures Defining viability in mammalian cell cultures. Biotechnolology Letters. 33, 1745-1749 (2011).
  51. Pogozhykh, D., et al. Influence of temperature fluctuations during cryopreservation on vital parameters, differentiation potential, and transgene expression of placental multipotent stromal cells. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 66(2017).
  52. Shaik, S., Wu, X., Gimble, J., Devireddy, R. Effects of decade long freezing storage on adipose derived stem cells functionality. Scientific Reports. 8 (1), 8162(2018).
  53. Weissbein, U., Benvenisty, N., Ben-David, U. Genome maintenance in pluripotent stem cells. Journal of Cell Biology. 204 (2), 153-163 (2014).
  54. Francis, M. P., Sachs, P. C., Elmore, L. W., Holt, S. E. Isolating adipose-derived mesenchymal stem cells from lipoaspirate blood and saline fraction. Organogenesis. 6 (1), 11-14 (2010).
  55. Palumbo, P., et al. Methods of isolation, characterization and expansion of human Adipose-Derived Stem Cells (ASCs): An overview. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 1897(2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mezenchymalne kom rki macierzystekriokonserwacja kom rekizolacja kom rek macierzystychcytometria przep ywowatest z b kitem trypanuekspansja hodowli kom rkowychmarkery kom rek macierzystychtrawienie kolagenaz

Powiązane artykuły