Artykuł metodologiczny

Cyfrowa metoda kropelkowej PCR do ilościowego oznaczania skuteczności transdukcji AAV w siatkówce myszy

DOI:

10.3791/63038

⸱

25 grudnia 2021

 ,  ,  ,  , 
1Molecular Biology, Genetics and Bioengineering Program, Sabanci University, 2Nanotechnology Research and Application Center (SUNUM), Sabanci University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół pokazuje, jak określić ilościowo skuteczność transdukcji AAV w siatkówce myszy za pomocą cyfrowego kropelkowego PCR (dd-PCR) wraz z produkcją AAV na małą skalę, iniekcją doszklistkową, obrazowaniem siatkówki i izolacją genomowego DNA siatkówki.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wiele laboratoriów biologii komórek siatkówki teraz rutynowo używa wirusów związanych z adenowirusami (AAV) do edycji genów i zastosowań regulacyjnych. Skuteczność transdukcji AAV jest zwykle krytyczna, co wpływa na ogólne wyniki eksperymentu. Jednym z głównych czynników decydujących o skuteczności transdukcji jest serotyp lub wariant wektora AAV. Obecnie dostępne są różne sztuczne serotypy i warianty AAV o różnym powinowactwie do receptorów na powierzchni komórki gospodarza. W przypadku terapii genowej siatkówki skutkuje to różnym stopniem skuteczności transdukcji dla różnych typów komórek siatkówki. Ponadto droga iniekcji i jakość produkcji AAV mogą również wpływać na skuteczność transdukcji AAV w siatkówce. Dlatego ważne jest, aby porównać wydajność różnych wariantów, partii i metodologii. Metoda cyfrowego kropelkowego PCR (dd-PCR) określa ilościowo kwasy nukleinowe z dużą precyzją i pozwala na bezwzględne oznaczanie ilościowe danego celu bez żadnego wzorca lub odniesienia. Za pomocą dd-PCR możliwa jest również ocena skuteczności transdukcji AAV poprzez bezwzględną kwantyfikację liczby kopii genomu AAV w wstrzykniętej siatkówce. W tym miejscu przedstawiamy prostą metodę ilościowego określania szybkości transdukcji AAV w komórkach siatkówki za pomocą dd-PCR. Przy niewielkich modyfikacjach metodologia ta może również stanowić podstawę do ilościowego oznaczania liczby kopii mitochondrialnego DNA, a także oceny wydajności edycji zasad, krytycznej dla kilku chorób siatkówki i zastosowań terapii genowej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wirusy związane z adeno (AAV) są teraz powszechnie używane do różnych badań nad terapią genową siatkówki. AAV zapewniają bezpieczny i skuteczny sposób dostarczania genów przy mniejszej immunogenności i mniejszej liczbie integracji genomu. Wnikanie AAV do komórki docelowej następuje poprzez endocytozę, która wymaga wiązania receptorów i koreceptorów na powierzchni komórki1,2. Dlatego skuteczność transdukcji AAV dla różnych typów komórek zależy głównie od kapsydu i jego interakcji z receptorami komórek gospodarza. AAV mają serotypy, a każdy serotyp może mieć odrębne tropizmy komórkowe/tkankowe i skuteczność transdukcji. Istnieją również sztuczne serotypy i warianty AAV generowane przez chemiczną modyfikację kapsydu wirusa, produkcję kapsydów hybrydowych, insercję peptydów, tasowanie kapsydu, ukierunkowaną ewolucję i racjonalną mutagenezę3. Nawet niewielkie zmiany w sekwencji aminokwasów lub strukturze kapsydu mogą mieć wpływ na interakcje z czynnikami komórkowymi gospodarza i skutkować różnymi tropizmami4. Oprócz wariantów kapsydu, inne czynniki, takie jak droga wstrzyknięcia i zmienność produkcji AAV z partii na partię, mogą wpływać na skuteczność transdukcji AAV w siatkówce neuronalnej. Dlatego konieczne są wiarygodne metody porównywania szybkości transdukcji dla różnych wariantów.

Większość metod określania skuteczności transdukcji AAV opiera się na ekspresji genu reporterowego. Należą do nich obrazowanie fluorescencyjne, immunohistochemia, western blot lub analiza histochemiczna produktu genu reporterowego5,6,7. Jednak ze względu na ograniczenie wielkości AAV, nie zawsze jest możliwe włączenie genów reporterowych w celu monitorowania wydajności transdukcji. Stosowanie silnych promotorów, takich jak hybrydowy wzmacniacz CMV / beta-aktyna kurczaka lub potranskrypcyjny element regulatorowy zapalenia wątroby Woodchuck (WPRE) jako sekwencja stabilizująca mRNA, dodatkowo komplikuje problem rozmiaru8. W związku z tym korzystne będzie również określenie szybkości transdukcji wstrzykiwanych AAV za pomocą bardziej bezpośredniej metodologii.

Cyfrowy kropelkowy PCR (dd-PCR) to potężna technika ilościowego oznaczania docelowego DNA z niewielkich ilości próbek. Technologia dd-PCR polega na enkapsulacji docelowego DNA i mieszaniny reakcji PCR za pomocą kropelek oleju. Każda reakcja dd-PCR zawiera tysiące kropel. Każda kropla jest przetwarzana i analizowana jako niezależna reakcja PCR9. Analiza kropelek umożliwia obliczenie bezwzględnej liczby kopii docelowych cząsteczek DNA w dowolnej próbce za pomocą algorytmu Poissona. Ponieważ skuteczność transdukcji AAV jest skorelowana z liczbą kopii genomów AAV w siatkówce neuronalnej, zastosowaliśmy metodę dd-PCR do ilościowego określenia genomów AAV.

Tutaj opisujemy metodologię dd-PCR do obliczania skuteczności transdukcji wektorów AAV z genomowego DNA siatkówki6,10. Po pierwsze, AAV, które wyrażają tdTomato reporter, zostały wygenerowane przy użyciu protokołu małej skali i zbalansowane metodą dd-PCR11. Po drugie, AAV zostały wstrzyknięte do ciała szklistego do siatkówki neuronalnej. Aby zademonstrować wydajność transdukcji, najpierw określiliśmy ilościowo ekspresję tdTomato za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i oprogramowania ImageJ. Następnie wyizolowano genomowe DNA w celu ilościowego określenia genomów AAV w wstrzykniętych siatkówkach za pomocą dd-PCR. Porównanie poziomów ekspresji tdTomato z transdukowanymi genomami AAV oznaczonymi ilościowo za pomocą dd-PCR wykazało, że metoda dd-PCR dokładnie określiła ilościowo skuteczność transdukcji wektorów AAV. Nasze protokoły wykazały szczegółowy opis metodologii opartej na dd-PCR w celu ilościowego określenia skuteczności transdukcji AAV. W tym protokole pokazujemy również bezwzględną liczbę genomów AAV, które są transdukowane po wstrzyknięciach do ciała szklistego, po prostu używając czynnika rozcieńczającego po izolacji genomowego DNA i wyników dd-PCR. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten zapewnia potężną metodę, która byłaby alternatywą dla ekspresji reporterowej w celu ilościowego określenia skuteczności transdukcji wektorów AAV w siatkówce.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie protokoły eksperymentalne zostały zaakceptowane przez komisję etyki Uniwersytetu Sabanci, a eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z oświadczeniem "Stowarzyszenia Badań nad Widzeniem i Okulistyką" w sprawie wykorzystania zwierząt w badaniach

1. Produkcja AAV na małą skalę12

  1. Hodowla HEK293T komórek za pomocą 15 cm płytek w pełnych 10 ml DMEM/10% FBS aż do 70-80% konfluencji.
  2. Przygotować mieszaninę transfekcji z 20 μg plazmidu pomocniczego (pHGT1-Adeno1), 7 μg plazmidu kapsydu i 7 μg wektora AAV2-CBA-tdPomidor-WPRE oraz 136 μl roztworu PEI (1 mg/ml) w 5 ml DMEM.
  3. Dodać 5 ml przygotowanej mieszaniny do transfekcji do naczynia do hodowli komórkowej zawierającej 10 ml pożywki hodowlanej i inkubować transfekowane komórki przez 48-60 godzin w temperaturze 37 °C.
  4. Zebrać pożywkę w 48-60 godzin po transfekcji i wytrawić ją za pomocą DNazy I w końcowym stężeniu 250 U/ml przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
  5. Odwirować przefermentowane media w temperaturze 4000 x g, 4 °C przez 30 minut, a następnie przefiltrować je za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm do wstępnie zwilżonej membrany z regenerowanej celulozy na 100 kDa.
  6. Odwirować membranę z regenerowanej celulozy w temperaturze 4000 x g, 4 °C przez 30 minut i wyrzucić pożywkę.
  7. Przemyć i odwirować zregenerowaną membranę celulozową PBS zawierającym 0,001% Pluronic F-68 trzykrotnie w temperaturze 4000 x g, 4 °C przez 30 min. Na każdym etapie należy wyrzucić PBS.
  8. Zebrać skoncentrowane AAV z górnej części membrany regenerowanej celulozy i podwielokrotności do dalszych zastosowań.
  9. Trawić 5 μl świeżo przygotowanego AAV z DNazą I (0,2 U/μl) przez 15 minut w temperaturze 37 °C w celu miareczkowania. Następnie następuje 10-minutowa inkubacja w temperaturze 95 °C w celu zarówno inaktywacji DNazy I, jak i degradacji kapsydów wirusa.
  10. Przygotować 10-krotne seryjne rozcieńczenie z strawionych AAV przy użyciu 0,05% Pluronic F-68. Do miareczkowania należy stosować startery AAV2-ITR i WPRE (Tabela 1). Miana obliczono, mnożąc wyniki dd-PCR przez współczynniki rozcieńczenia. Wyniki przeliczono na kopię genomu/ml (GC/ml).
    UWAGA: Oczekuje się, że stężenia AAV przy produkcji AAV na małą skalę wynoszą około 1 x 1012 GC/ml. Ten protokół nie ma zastosowania do szczepów AAV, które nie uwalniają skutecznie AAV do pożywek takich jak AAV213.

2. Iniekcja doszklistkowa AAV

  1. Przygotowanie sprzętu
    1. Przed rozpoczęciem należy przygotować mikrostrzykawkę o pojemności 10 μl z igłą o sile 36 g. Spłukać pięć razy 70% EtOH, pięć razy w ddH2O, a na koniec pięć razy PBS.
    2. Do mikrostrzykawki należy wprowadzić odpowiednią ilość AAV przy każdym wstrzyknięciu.
    3. Przygotuj igłę chirurgiczną (szew, jedwab, 6/0), taśmę, kleszcze i nożyczki.
  2. Iniekcja doszklistkowa
    1. Zastosuj 1 kroplę 0,5% tropikamidu i 2,5% chlorowodorku fenylefryny (np. Mydfrin) zawierającego krople do oczu przed znieczuleniem, aby rozszerzyć źrenice.
    2. Znieczulij myszy izofluranem 5% (1 l/min) i kontynuuj podawanie 1,5% izofluranu (1 l/min) podczas zabiegu. Do pierwszej indukcji używana jest mała komora izofluranu.
    3. Sprawdź głębokość znieczulenia na podstawie utraty odruchu prostowania, odruchu wycofania i reakcji uszczypnięcia ogona.
    4. Przed zabiegiem wstrzyknięcia należy nałożyć 0,3% tobramycyny i 0,1% sterylnego roztworu okulistycznego deksametazonu do każdego oka. Stosowanie kropli do oczu zapobiega przesuszeniu oraz działa przeciwzapalnie i przeciwbakteryjnie.
    5. Użyj haczyka chirurgicznego, aby ustabilizować górną powiekę. Lekko odciągnij do tyłu, aby odsłonić grzbietową część oka. Przyklej haczyk do ławki, aby utrzymać go na miejscu.
    6. Usuń spojówkę (mniej niż 1 mm2) za pomocą zakrzywionych nożyczek do tęczówki, aby odsłonić twardówkę oka pod mikroskopem preparacyjnym. Użyj świeżej i sterylnej strzykawki insulinowej (30 G), aby nakłuć twardówkę.
    7. Wprowadzić igłę mikrostrzykawki przez to samo nakłucie za pomocą mikromanipulatora. Umieść końcówkę igły za soczewką na środku muszli ocznej.
    8. Wstrzyknij 1 μl AAV2/BP2 i AAV2/PHP. Wektory S o stężeniach 1,63 x 1012 GC/ml i 1,7 x 1012 GC/ml powoli docierają do ciała szklistego oka. Regulacja objętości wtrysku odbywa się ręcznie. Pozostawić igłę na miejscu na 1 minutę i powoli ją wyjmować.
    9. Zwolnij powiekę i nałóż przeciwzapalny i przeciwbakteryjny żel do stosowania miejscowego zawierający 0,3% tobramycyny i 0,1% deksametazonu na muszlę oczną. Monitoruj i oceniaj myszy w kolejnych dniach zgodnie z arkuszem wyników pod względem wyglądu (jasne oczy, zadbana sierść, garbienie się), zachowania (aktywność, unieruchomienie, samookaleczenie) i masy ciała w skali od 0 do 3. Każdy warunek ma wynik od 0 do 3, a łączny wynik 3 lub wyższy jest kryterium zakończenia.
    10. Po wyzdrowieniu umieścić zwierzęta w klatce.

3. Fluorescencja i obrazowanie dna oka

  1. Odcedź mysz i rozszerz źrenicę, umieszczając krople 0,5% tropikamidu i 2,5% chlorowodorku fenylefryny w każdym oku.
  2. Znieczulić zwierzę powyższą procedurą izofluranem. Dokładnie oceń głębokość znieczulenia, ściskając łapy.
  3. Umieść mysz na stoliku do obrazowania i sprawdź prawidłowe rozszerzenie, sprawdzając przez kamerę do badania dna oka. Nałóż żel do stosowania miejscowego (0,2% karbomeru 980) na powierzchnię oczu, aby chronić oczy przed odwodnieniem w znieczuleniu i użyć go jako żelu sprzęgającego do obrazowania.
  4. Manipuluj stolikiem obrazowania, aby zrównał się z końcówką obiektywu. Dostosuj stół montażowy zgodnie z potrzebami, aby wyśrodkować oko myszy. Gdy oko zostanie wyśrodkowane, powoli przesuwaj obiektyw, aż zetknie się z okiem.
  5. Wykonaj obrazowanie dna oka i obrazowanie fluorescencyjne na obu oczach, aby śledzić ekspresję tdTomato po 1 tygodniu i 2 tygodniach po wstrzyknięciu do ciała szklistego (Rysunek 3B) < klasa sup = "xref">14. Wykonaj zdjęcia dna oka i fluorescencji w identycznych ustawieniach w celu porównania ekspresji reporterowej.

4. Izolacja siatkówki

  1. Eutanazja zwierząt po obrazowaniu dna oka i obrazowaniu fluorescencyjnym za pomocą wdychania CO2 w celu pobrania siatkówki w ciągu 2 tygodni.
  2. Przesuń gałkę oczną do przodu za pomocą kleszczy rozdwajających o długości 13,5 cm.
  3. Wyjmij soczewkę wraz z resztkami ciała szklistego, delikatnie uciskając kleszcze.
  4. Przetnij połączenie gałki ocznej z nerwem wzrokowym za pomocą precyzyjnych zakrzywionych kleszczy i delikatnie ściśnij siatkówkę tymi samymi zakrzywionymi kleszkami.
  5. Przenieś wypreparowane siatkówki do probówki do mikrowirówki.
  6. Zatrzaskowo zamroź siatkówkę, umieszczając rurki w ciekłym azocie.

5. Izolacja genomowego DNA tkankowego

  1. Wyizoluj genomowe DNA za pomocą skomercjalizowanego zestawu genomowego DNA tkankowego opartego na trawieniu proteinazy K.
  2. Trawić siatkówkę w temperaturze 55 °C, 200 x g przez 30 minut z proteinazą K, która jest już dostarczona w zestawie.
  3. Wykonać etap inkubacji RNazy, etapy przemywania buforem płuczącym I i II, a na koniec etap elucji zgodnie z protokołem producenta.
  4. Dodaj dodatkowy etap wirowania po ostatnim praniu, aby usunąć resztki etanolu.
  5. Zmierzyć stężenie genomowego DNA i przechowywać próbki w temperaturze -20 °C.

6. Kropelkowa cyfrowa analiza PCR próbek siatkówki myszy w celu ilościowego określenia genomów wirusowych

  1. Rozcieńczyć genomowe DNA z wstrzykniętych siatkówk w 0,05% roztworze Pluronic F-68, aby osiągnąć końcowe stężenie 1 ng / μl dla każdej próbki.
  2. Przeprowadzić oddzielne reakcje dla WPRE i 18S przy użyciu starterów specyficznych dla celu o końcowym stężeniu 125 nM dla każdego startera.
  3. Przeprowadź generowanie kropelek w 20 μl mieszaniny reakcyjnej PCR, w tym 1 ng genomowego DNA, starterów 125 nM i 2x supermiksu evagreen.
  4. Załaduj mieszaninę próbek do środkowej części wkładu w celu wytworzenia kropel.
  5. Po załadowaniu próbki do wkładu dodaj 70 μl oleju do wytwarzania kropelek do dolnego rzędu wkładu.
  6. Umieść uszczelkę na górze wkładu i umieść go w generatorze kropel. Upewnij się, że nie ma szczeliny między uszczelką a wkładem.
  7. Delikatnie weź około 40 μl kropelek, które powstają w górnej studzience. Dodać roztwór kropelki do 96-dołkowej płytki reakcyjnej PCR z półspódniczką.
  8. Uszczelnij płytkę PCR za pomocą uszczelniacza do płytek PCR za pomocą aluminiowej folii uszczelniającej.
  9. Umieść płytkę PCR w 96-dołkowym, zgrzewanym termocyklerze. Użyj protokołu PCR; 95 °C przez 5 min, 40 cykli po 95 °C przez 30 s, 60 °C przez 1 min, 4 °C przez 5 min, 90 °C przez 5 min i 4 °C bezstopniowe utrzymywanie. Stosuj prędkość narastania 2 °C/s w każdym cyklu, aby upewnić się, że kropelki osiągną odpowiednią temperaturę dla każdego kroku podczas cyklu
  10. Umieścić płytkę PCR w czytniku kropel, aby określić ilościowo kropelki za pomocą oprogramowania dd-PCR. Szablon jest konfigurowany przy użyciu określonych ustawień dla evagreen.
  11. Analizuj dane za pomocą wykresu 1-D z każdą próbką pod kątem intensywności fluorescencji w funkcji liczby kropel. Wartość progowa jest ułożona w taki sposób, że kropelki powyżej progu są przypisywane jako dodatnie, a poniżej jako ujemne. Następnie stosuje się algorytm Poissona w celu określenia początkowego stężenia docelowego DNA w jednostkach kopii/μl. Stosunek WPRE do 18S jest obliczany w celu pomiaru wydajności transdukcji AAV.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Produkcja AAV na małą skalę to szybka i efektywna metoda, która dostarcza wektorów do iniekcji doszklistkowych (Rysunek 1). Produkcja AAV na małą skalę zwykle daje miana w zakresie 1 x 1012 GC / ml, co jest wystarczające do wykrycia ekspresji reporterowej w siatkówce (Rysunek 2). Miareczkowanie AAV za pomocą dd-PCR daje spójne wyniki. Rutynowo stosuje się startery specyficzne dla ITR2 i WPRE, a początkowe stężenie każdej cząsteczki docelowej obliczono za pomocą...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole wygenerowaliśmy dwa wektory AAV, które mają różne białka kapsydu, a następnie odpowiednio je zbalansowaliśmy. Jednym z najważniejszych etapów tego protokołu jest wytworzenie wystarczającej ilości AAV, które dadzą wykrywalną ekspresję reporterową po transdukcji12,13.

Mianowanie AAV jest również ważnym czynnikiem przy dostosowywaniu dawek AAV do wstrzyknięć doszklistkowych. Po spełnieniu tych ważnych kryteriów możliwe jes...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Oezkan Keles, Josephine Jüttner i Prof. Botond Roska, Institute of Molecular and Clinical Ophthalmology, Basel, Complex Viruses Platform za ich pomoc i wsparcie w produkcji AAV. Chcielibyśmy również podziękować prof. Jean Bennett z Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania za szczep AAV8/BP2. Prace ze zwierzętami wykonywane są w zwierzęcym zakładzie Uniwersytetu Technicznego w Gebze. W tym celu dziękujemy Leyli Dikmetas i prof. Uygarowi Halisowi Tazebayowi za pomoc techniczną i wsparcie dla hodowli zwierząt. Chcielibyśmy również podziękować dr Fatmie Ozdemir za jej uwagi na temat manuskryptu. Prace te są wspierane przez TUBITAK, granty o numerach 118C226 i 121N275 oraz grant integracyjny Uniwersytetu Sabanci.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
96-dołkowe płytki ddPCR z półspódniczkąUszczelki BioRad12001925ddPCR
Amicon FilterMilliporeUFC910096AAV
C1000 TOUCH 96 STUDNI GŁĘBOKICHBioRad1851197ddPCR
C57BL/6JRj szczep myszyJanvierC57BL/6JRj
Uszczelki DG8BioRad1863009ddPCR
DG8BioRad1864008ddPCR
DMEMLonzaBE12-604QAAV
DPBSPAN BIOTECHL 1825AAV
Olej do wytwarzania kropelek eva zielonyBioRad1864006ddPCR
Olej do czytnika kropelekBioRad1863004ddPCR
FBSPAN BIOTECHp30-3306AAV
Uszczelki foliowe do PX1 Uszczelniacz płytek doPCR BioRad1814040ddPCR
Strzykawki insulinoweBD Medical320933Iniekcja doszklistkowa
IzofluranADEKA ILAC SANAYI VE TICARETznieczulający
mikrowstrzykiwacz MM33World Precision Instruments82-42-101-0000Iniekcja doszklistkowa
Micron IVPhoenix Research LabsMicron IVSystem mikroskopowy oparty na kolorowej kamerze 3 CCD, frame grabberze i gotowym oprogramowaniu umożliwia naukowcom obrazowanie siatkówki myszy.
Mydfrin (%2,5 chlorowodorek fenylefryny)AlconS01FB01rozszerzenie źrenicy
Nanofil Strzykawka 10 μ lWorld Precision InstrumentsNANOFILIgła do iniekcji doszklistkowej
RN G36, 25 mm, PST 2World Precision InstrumentsNF36BL-2Iniekcja doszklistkowa
PEI-MAXPolyscience24765-1AAV
Penicylina-StreptomycynaPAN BIOTECHP06-07100Plazmid AAV
pHGT1-Adeno1PlasmidFactoryPF1236AAV
Pluronic F-68Gibco24040032AAV
PX1 System uszczelniania płytek PCRBioRad1814000ddPCR
QX200 ddPCR EvaGreen SupermixCzytnik1864034ddPCR
QX200/generator kropel QX200BioRad1864001ddPCR
SPLITTER KLESZCZYK WATCHER
MAKER - DŁUGOŚĆ = 13,5 CM		endostall medycznyEJN-160-0155Izolacja siatkówki
Sterylny filtr strzykawkowyAISIMOASF33PS22S
AAV Zestaw do genomowego DNA tkankowegoEcoSpinE1070Izolacja gDNA
Tobradex (0,3% tobramycyny / 0,1% deksametazonu)AlconS01CA01przeciwzapalny / antybiotyk
Tropamid (% 0,5 tropikamidu)Bilim Ilac Sanayi ve Ticaret AS.S01FA06rozszerzenie źrenicy
TurbonukleazaAccelagenN0103LAAV
Viscotears (karbomer 2 mg/g)Bausch+LombS01XA20lubrykant do oczu krople do oczu
Wkłady N01AB06 kropel

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Herrmann, A. K., Grimm, D. High-throughput dissection of AAV-host interactions: The fast and the curious. Journal of Molecular Biology. 430 (17), 2626-2640 (2018).
  2. Pillay, S., Carette, J. E. Host determinants of adeno-associated viral vector entry. Current Opinion in Virology. 24, 124-131 (2017).
  3. Castle, M. J., Turunen, H. T., Vandenberghe, L. H., Wolfe, J. H. Controlling AAV tropism in the nervous system with natural and engineered capsids. Methods in Molecular Biology. 1382, 133-149 (2016).
  4. Agbandje-McKenna, M., Kleinschmidt, J. AAV capsid structure and cell interactions. Methods in Molecular Biology. 807, 47-92 (2011).
  5. Han, I. C., et al. Retinal tropism and transduction of adeno-associated virus varies by serotype and route of delivery (intravitreal, subretinal, or suprachoroidal) in rats. Human Gene Therapy. 31 (23-24), 1288-1299 (2020).
  6. Muraine, L., et al. Transduction efficiency of adeno-associated virus serotypes after local injection in mouse and human skeletal muscle. Human Gene Therapy. 31 (3-4), 233-240 (2020).
  7. Cronin, T., et al. Efficient transduction and optogenetic stimulation of retinal bipolar cells by a synthetic adeno-associated virus capsid and promoter. EMBO Molecular Medicine. 6 (9), 1175-1190 (2014).
  8. Higashimoto, T., et al. The woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element reduces readthrough transcription from retroviral vectors. Gene Therapy. 14 (17), 1298-1304 (2007).
  9. Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification. Annals in Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).
  10. Albayrak, C., et al. Digital quantification of proteins and mrna in single mammalian cells. Molecular Cell. 61 (6), 914-924 (2016).
  11. Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR. Hum Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).
  12. Juttner, J., et al. Targeting neuronal and glial cell types with synthetic promoter AAVs in mice, non-human primates and humans. Nature Neuroscience. 22 (8), 1345-1356 (2019).
  13. Vandenberghe, L. H., et al. Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing. Human Gene Therapy. 21 (10), 1251-1257 (2010).
  14. Barben, M., Schori, C., Samardzija, M., Grimm, C. Targeting Hif1a rescues cone degeneration and prevents subretinal neovascularization in a model of chronic hypoxia. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 12(2018).
  15. Chan, K. Y., et al. Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems. Nature Neuroscience. 20 (8), 1172-1179 (2017).
  16. Guiet, R., Burri, O., Seitz, A. Open source tools for biological image analysis. Methods Molecular Biology. 2040, 23-37 (2019).
  17. Parks, M. M., et al. Variant ribosomal RNA alleles are conserved and exhibit tissue-specific expression. Science Advances. 4 (2), (2018).
  18. Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
  19. Maclachlan, T. K., et al. Preclinical safety evaluation of AAV2-sFLT01- a gene therapy for age-related macular degeneration. Molecular Therapy. 19 (2), 326-334 (2011).
  20. Stieger, K., et al. Detection of intact rAAV particles up to 6 years after successful gene transfer in the retina of dogs and primates. Molecular Therapy. 17 (3), 516-523 (2009).
  21. Gyorgy, B., et al. Allele-specific gene editing prevents deafness in a model of dominant progressive hearing loss. Nature Medicine. 25 (7), 1123-1130 (2019).
  22. Cox, D. B. T., et al. RNA editing with CRISPR-Cas13. Science. 358 (6366), 1019-1027 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Terapia genowa siatk wkiilo ciowe oznaczenie bezwzgl dneiniekcja dowitrealnaizolacja genomicznego DNAobrazowanie fluorescencyjne dna okaliczba kopii genomu AAVma oscale produkcja AAV

Powiązane artykuły