Method Article

Zmodyfikowana prosta metoda indukcji zawału mięśnia sercowego u myszy

DOI:

10.3791/63042

⸱

December 3rd, 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College, 2Department of Cardiology, Ren Ji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pod odpowiednim znieczuleniem, serce myszy zostało uzewnętrznione przez przestrzeń międzyżebrową, a zawał mięśnia sercowego został skutecznie wywołany przez podwiązanie lewej przedniej tętnicy zstępującej (LAD) przy użyciu materiałów łatwo dostępnych w większości laboratoriów.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zawał mięśnia sercowego (MI) stanowi jedną z głównych przyczyn zgonów. Modele zawału mięśnia sercowego są szeroko stosowane do badania patomechanizmów przebudowy po zawale mięśnia sercowego i oceny nowych metod leczenia. Do wywołania zawału mięśnia sercowego stosowano różne metody (np. leczenie izoproterenolem, kriouraz, podwiązanie tętnic wieńcowych itp.). W porównaniu z leczeniem izoproterenolem i kriouszkodzeniem, podwiązanie tętnicy wieńcowej może lepiej odzwierciedlać odpowiedź niedokrwienną i przewlekłą przebudowę po zawale mięśnia sercowego. Jednak tradycyjne metody podwiązywania naczyń wieńcowych u myszy są technicznie trudne. Obecne badanie opisuje prosty i skuteczny proces indukcji MI u myszy przy użyciu łatwo dostępnych materiałów. Skóra klatki piersiowej myszy została rozcięta w stabilnym znieczuleniu. Serce zostało natychmiast uzewnętrznione przez przestrzeń międzyżebrową po oddzieleniu mięśnia piersiowego większego i piersiowego mniejszego. Lewa przednia gałąź zstępująca (LAD) została podwiązana szwem 6-0 w odległości 3 mm od jej początku. Po podwiązaniu LAD barwienie chlorkiem 2,3,5-trifenylotetrazolu (TTC) wykazało pomyślną indukcję MI i czasowe zmiany wielkości blizny po zawale mięśnia sercowego. Tymczasem wyniki analizy przeżycia wykazały jawną śmiertelność w ciągu 7 dni po zawale serca, głównie z powodu pęknięcia serca. Ponadto ocena echokardiograficzna po zawale mięśnia sercowego wykazała skuteczną indukcję dysfunkcji skurczu i przebudowy komór. Po opanowaniu, model MI można ustalić u myszy w ciągu 2-3 minut przy użyciu łatwo dostępnych materiałów.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zawał mięśnia sercowego (MI) stanowi jedną z najczęstszych przyczyn zgonów i niepełnosprawności na całym świecie1,2,3,4,5. Pomimo szybkiej reperfuzji, obecnie brakuje skutecznych terapii leczenia przebudowy serca po zawale mięśnia sercowego. W związku z tym włożono znaczne wysiłki w celu mechanistycznego zbadania i wykorzystania terapii dla MI6,7,8. Warto zauważyć, że ustanowienie modeli MI jest warunkiem wstępnym do osiągnięcia tych celów.

Zaproponowano kilka metod (np. leczenie izoproterenolem, kriouszkodzenia, podwiązanie tętnic wieńcowych, itp.) w celu wywołania modeli MI u małych zwierząt. Leczenie izoproterenolem jest prostą metodą indukcji zawału mięśnia sercowego, ale nie może wywołać zawału obszaru docelowego9. Kriouraz prowadzi do martwicy mięśnia sercowego poprzez wytwarzanie kryształków lodu i przerwanie błony komórkowej, a nie bezpośrednie niedokrwienie10. Natomiast podwiązanie tętnicy wieńcowej pozwala na precyzyjną kontrolę miejsca okluzji i zasięgu obszaru zawału oraz wiernie odwzorowuje odpowiedź remodelacyjną po zawale 11,12. Podwiązanie tętnic wieńcowych jest zwykle wykonywane po intubacji, wentylacji mechanicznej i torakotomii, co jest technicznie trudne13,14. Zgłoszono kilka zmodyfikowanych protokołów podwiązania tętnic wieńcowych (np. bez wentylacji), które nasiliły indukcję zawału serca, ale brakuje szczegółowych demonstracji wizualnych15,16,17. Zagadnienia te stanowią istotną barierę finansową i techniczną dla grup chcących zaangażować się w badania z wykorzystaniem modeli MI. W niniejszym raporcie przedstawiono podejście do indukcji zawału mięśnia sercowego u myszy. Obecna metoda jest łatwa, oszczędza czas i wykorzystuje narzędzia i sprzęt chirurgiczny, które można łatwo znaleźć w większości laboratoriów.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperymenty z udziałem zwierząt są przeprowadzane za zgodą Komisji Etyki Laboratorium Dobrostanu Zwierząt Szpitala Renji, Uniwersytetu Jiao Tong w Szanghaju, Szkoły Medycznej (R52021-0506). W badaniu wykorzystano samice i samce myszy C57BL/6J w wieku od 8 do 10 tygodni.

1. Przygotowanie uproszczonego sprzętu do znieczulenia (OPCJONALNIE)

UWAGA: Jest to opcjonalna konfiguracja przedoperacyjna i może być zastąpiona znieczuleniem miareczkowym, jak wspomniano w sekcji 2. Przed dostosowaniem tego układu do procedur dotyczących zwierząt należy skonsultować się z instytucjonalną komisją etyczną ds. zwierząt i lekarzem weterynarii.

  1. Weź probówkę wirówkową o pojemności 15 ml i wykonaj nacięcie prostopadłe do długiej osi probówki w odległości około 3 cm od otworu.
    UWAGA: Upewnij się, że nacięcie jest większe niż połowa okrągłego obwodu światła rurki, aby można było pomyślnie włożyć zawór.
  2. Wywierć otwory (średnica, 2 mm) w ściance probówki wirówkowej między nacięciem a otworem probówki.
  3. Wytnij odpowiedniej wielkości kawałek zaworu z plastikowego arkusza i włóż zawór do nacięcia w ściance rury.
    UWAGA: Zawór może być używany do kontrolowania szybkości uwalniania izofluranu poprzez zmianę głębokości wstrzyknięcia.
  4. Wewnątrz dygestorium rozetnij spód rurki i podłącz ją do źródła tlenu. Umieść wacik w pobliżu dolnego końca probówki, dodaj 0,5 ml izofluranu (jak otrzymano, patrz Tabela materiałów) na wacik i zamknij zawór.
  5. Przetestuj skuteczność znieczulenia, maskując myszy rurkami przygotowanymi zgodnie z powyższym opisem. Monitoruj częstość oddechów i głębokość znieczulenia za pomocą reakcji na uszczypnięcie palca.
    UWAGA: Częstość oddechów mniejsza niż 10 razy/10 s sugeruje nadmierne znieczulenie, a głębokość wsunięcia zastawki powinna być dostosowana. Do wszystkich zabiegów związanych ze znieczuleniem należy użyć filtra gazowego wypełnionego arkuszami węgla aktywnego (Rysunek 1A-i), a zabieg chirurgiczny powinien być wykonany w kapturze.

2. Przygotowanie operacyjne i znieczulenie

  1. Przygotuj i wysterylizuj wszystkie potrzebne narzędzia w dniu operacji, w tym parę kleszczy, hemostat z mikrokomarów, nożyczki chirurgiczne, dwie pary uchwytów do igieł, jedwabny szew chirurgiczny 4-0, jedwabny szew chirurgiczny 6-0, filtr gazowy i źródło światła (patrz tabela materiałów) (Rysunek 1A).
  2. Załóż maskę chirurgiczną i sterylne rękawiczki.
  3. Nałóż krem do depilacji na klatkę piersiową myszy i odczekaj 1 min. Delikatnie zetrzyj krem do depilacji i włosy wilgotną gazą.
  4. Po depilacji przytrzymaj mysz dominującą ręką. Wywołaj znieczulenie poprzez wdychanie odparowanego izofluranu (4%) z dopływem tlenu (1 l/min) i utrzymuj na poziomie 2-3% izofluranu.
  5. Potwierdź odpowiednie znieczulenie poprzez brak reakcji na uszczypnięcie palca u nogi.
  6. Nałóż sterylny krem pod oczy na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu rogówki.
  7. Zabezpiecz myszy na platformie chirurgicznej w pozycji leżącej. Nałóż trzykrotnie waciki z jodonem powidonu (patrz tabela materiałów) na klatkę piersiową i przykryj zdezynfekowaną klatkę piersiową sterylnym serwetem.

3. Indukcja zawału mięśnia sercowego

  1. Zmienić zanieczyszczone rękawice, aby zapewnić sterylność.
  2. Wykonaj 0,5 cm nacięcie skóry wzdłuż linii łączącej mieczyk mieczykowaty i pachę po miejscowym bloku z lidokainą.
  3. Tępo oddziel mięśnie piersiowe większe i piersiowe mniejsze za pomocą kleszczy i hemostatu mikrokomara, aby odsłonić czwartą przestrzeń międzyżebrową.
  4. Otwórz czwartą przestrzeń międzyżebrową za pomocą hemostatu mikrokomara.
  5. Uzewnętrznij serce, popychając je w kierunku czwartej przestrzeni międzyżebrowej palcem wskazującym lewej ręki.
  6. Zabezpiecz serce lewą ręką i podwiąż lewą przednią gałąź zstępującą szwem 6-0 3 mm od jej początku.
  7. Szybko umieść serce z powrotem w jamie klatki piersiowej.
    UWAGA: Bezpiecznie jest uzewnętrznić serce na mniej niż 30 sekund.
  8. Usunąć powietrze z jamy klatki piersiowej poprzez delikatne ręczne naciśnięcie jamy klatki piersiowej.
  9. Zamknij warstwę mięśniową nad żebrami za pomocą jedwabnego szwu 6-0.
  10. Zamknij skórę jedwabnym szwem 4-0.
  11. Umieść myszy na podkładce (37 °C) natychmiast po operacji.
  12. Buprenorfinę (0,05-0,1 mg/kg) należy wstrzykiwać podskórnie co 4-6 godzin, aby zmniejszyć ból pooperacyjny przez okres do 72 godzin.
  13. Po całkowitym wyzdrowieniu należy umieścić operowane myszy w klatkach.
    UWAGA: Myszy zostaną w pełni wyleczone w ciągu 3-5 minut po zabiegu.
  14. Uważnie monitoruj myszy i podawaj mokrą karmę przez okres do 7 dni.

4. Pobieranie tkanek

  1. Poświęć myszy w różnych punktach czasowych po ustaleniu zawału mięśnia sercowego przez zwichnięcie szyjki macicy.
  2. Zabezpiecz złożone w ofierze myszy na platformie operacyjnej w pozycji leżącej.
  3. Wykonaj nacięcie brzuszne (~3-4 cm) w górnej części brzucha. Odetnij żebra po obu stronach jamy klatki piersiowej i wyjmij membranę.
  4. Ukrwić serce 10 ml zimnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (1x PBS, 4 °C) we wstrzyknięciu dokomorowym.
  5. Pobrać serce, odcinając korzeń aorty i natychmiast przechowywać je w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Zgodnie z doświadczeniem autorów, możliwe jest wykonanie barwienia TTC w ciągu dwóch tygodni od przechowywania.
  6. Zabarwić serce chlorkiem 2,3,5-trifenylotetrazolu (TTC).
    1. Zamrożone serce pokrój na kawałki o grubości 1 mm na lodzie za pomocą żyletek.
    2. Przygotowane plastry serca inkubować w 1% roztworze TTC (rozpuszczonym w 1x PBS) w temperaturze 37 °C przez 10-15 min.
      UWAGA: Po 15 minutach inkubacji wyrzuć roztwór TTC i zanurz barwione plastry serca w 1x PBS.
  7. Sfotografuj plasterki za pomocą aparatu cyfrowego.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół eksperymentalny i niektóre z krytycznych kroków są pokazane w Rysunek 1. Uproszczony sprzęt anestezjologiczny indukował znieczulenie. Jak pokazano w Rysunek 2A, znieczulenie indukowane było stabilne, co odzwierciedlały regularne częstości oddechów (wahały się od 90 do 107 oddechów/min u badanych myszy). Po podwiązaniu tętnicy wieńcowej analiza barwienia TTC wykazała pomyślną indukcję zawału mięśnia sercowego i zmiany skroniowe wielkości blizny po zawale mięśnia s...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejszy raport zademonstrował prosty protokół indukcji MI u myszy z łatwo dostępnymi materiałami, który został zmodyfikowany w stosunku do metody opisanej przez Gao16. Mysie modele MI są niezbędne do eksploracji mechanistycznej i badań przesiewowych leków pod kątem dysfunkcji i przebudowy po zawale mięśnia sercowego12. Spośród istniejących technik indukcji zawału mięśnia sercowego podwiązanie tętnic wieńcowych jest najczęściej praktykowane. Podwiązanie tętnicy wieńcowej w...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (81930007, 81625002, 81800307, 81470389, 81500221, 81770238), Shanghai Outstanding Academic Leaders Program (18XD1402400), Komisji Nauki i Technologii Gminy Shanghai (201409005200), Shanghai Pujiang Talent Program (2020PJD030) oraz China Postdoctoral Science Foundation (2020M671161, BX20190216).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Chlorek 2,3,5-trifenylotetrazoluSIGMAT8877-25GBarwienie TTC
4-0 szew jedwabnyYUANKANG4-0Autoklaw chirurgiczny
HIRAYAMAHVE-50Sterylizacja stałej
buprenorfinyQinghai FACTORY Co., Ltd.H10940181zmniejszyć ból pooperacyjny
Probówka wirówkowaBiological Hope1850-K15ML
Krem do depilacjiZIKER BIOTECHNOLOGYZK-L2701Środek do depilacji zwierząt laboratoryjnych
KleszczRWDF12028Instrument chirurgiczny
Filtr gazowyZHAOXINSA-493Ochrona operatora
IzofluranRWD20071302Używany do znieczulenia Źródło
światłaBeijing PDVLG-150BLampa operacyjna
Mikro-komar hemostatFST13011-12Instrument chirurgiczny
Igła BINXIONG42180104Instrument chirurgiczny
Igła i jedwabny szew 6-0JIAHESC086Instrument chirurgiczny
Uchwyt na igłęShangHaiJZJ32030Instrument chirurgiczny
Uchwyt igłyShangHaiJZJ32010Instrument chirurgiczny
Waciki powidonowo-jodoweSingleLadyGB26368-2010Nożyczki do dezynfekcji skóry
CNSTRONGJYJ1030Instrument chirurgiczny
Sterylny krem pod oczyShenyang Xingqi Pharmaceutical Co., Ltd.H10940177zapobiegają wysuszeniu rogówki
System obrazowania ultrasonograficznego o ultrawysokiej rozdzielczości dla małych zwierzątVisualSonicsVevo 2100Analiza echokardiograficzna

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fu, Y., et al. A simple and efficient method for in vivo cardiac-specific gene manipulation by intramyocardial injection in mice. Journal of Visualized Experiments. (134), e57074(2018).
  2. Pell, S., Fayerweather, W. E. Trends in the incidence of myocardial infarction and in associated mortality and morbidity in a large employed population. The New England Journal of Medicine. 312 (16), 1005-1011 (1985).
  3. Ramunddal, T., Gizurarson, S., Lorentzon, M., Omerovic, E. Antiarrhythmic effects of growth hormone--in vivo evidence from small-animal models of acute myocardial infarction and invasive electrophysiology. Journal of Electrocardiology. 41 (2), 144-151 (2008).
  4. Tabrizchi, R. β-blocker therapy after acute myocardial infarction. Expert Review of Cardiovascular Therapy. 11 (3), 293-296 (2013).
  5. Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 141 (9), 139(2020).
  6. Cahill, T. J., Choudhury, R. P., Riley, P. R. Heart regeneration and repair after myocardial infarction: Translational opportunities for novel therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (10), 699-717 (2017).
  7. Froese, N., et al. Anti-androgenic therapy with finasteride improves cardiac function, attenuates remodeling and reverts pathologic gene-expression after myocardial infarction in mice. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 122, 114-124 (2018).
  8. Wang, W., et al. Defective branched chain amino acid catabolism contributes to cardiac dysfunction and remodeling following myocardial infarction. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 311 (5), 1160-1169 (2016).
  9. Acikel, M., et al. Protective effects of dantrolene against myocardial injury induced by isoproterenol in rats: Biochemical and histological findings. International Journal of Cardiology. 98 (3), 389-394 (2005).
  10. vanden Bos, E. J., Mees, B. M. E., de Waard, M. C., de Crom, R., Duncker, D. J. A novel model of cryoinjury-induced myocardial infarction in the mouse: A comparison with coronary artery ligation. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 289 (3), 1291-1300 (2005).
  11. Guo, Y., et al. Demonstration of an early and a late phase of ischemic preconditioning in mice. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 275 (4), 1375-1387 (1998).
  12. Kumar, M., et al. Animal models of myocardial infarction: Mainstay in clinical translation. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 76, 221-230 (2016).
  13. Das, S., MacDonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. Journal of Visualized Experiments. (73), e50318(2013).
  14. Johns, T. N., Olson, B. J. Experimental myocardial infarction. I. A method of coronary occlusion in small animals. Annals of Surgery. 140 (5), 675-682 (1954).
  15. Ahn, D., et al. Induction of myocardial infarcts of a predictable size and location by branch pattern probability-assisted coronary ligation in C57BL/6 mice. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 286 (3), 1201-1207 (2004).
  16. Gao, E., Koch, W. J. A novel and efficient model of coronary artery ligation in the mouse. Methods in Molecular Biology. 1037, 299-311 (2013).
  17. Most, P., et al. Cardiac S100A1 protein levels determine contractile performance and propensity toward heart failure after myocardial infarction. Circulation. 114 (12), 1258-1268 (2006).
  18. Christia, P., et al. Systematic characterization of myocardial inflammation, repair, and remodeling in a mouse model of reperfused myocardial infarction. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 61 (8), 555-570 (2013).
  19. Frantz, S., Bauersachs, J., Ertl, G. Post-infarct remodelling: Contribution of wound healing and inflammation. Cardiovascular Research. 81 (3), 474-481 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Myocardial InfarctionCoronary Artery LigationMouse MI ModelVentricular RemodelingTTC StainingPost MI RemodelingContractile DysfunctionEchocardiographic AssessmentCardiac RuptureIntramyocardial Injection

Related Articles