Techniki pomiaru aktywności kluczowych enzymów metabolizmu glikogenu są prezentowane przy użyciu prostego spektrofotometru działającego w zakresie widzialnym.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Metody spektrofotometryczne do badania metabolizmu glikogenu eukariotycznego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Glikogen jest syntetyzowany jako forma magazynowania glukozy przez szeroki wachlarz organizmów, od bakterii po zwierzęta. Cząsteczka składa się z liniowych łańcuchów reszt glukozy połączonych α1,4 z rozgałęzieniami wprowadzonymi przez dodanie wiązań α1,6. Zrozumienie, w jaki sposób synteza i degradacja glikogenu są regulowane oraz w jaki sposób glikogen osiąga swoją charakterystyczną rozgałęzioną strukturę, wymaga zbadania enzymów magazynowania glikogenu. Jednak metody najczęściej stosowane do badania tych aktywności enzymatycznych zazwyczaj wykorzystują odczynniki lub techniki, które nie są dostępne dla wszystkich badaczy. W tym miejscu omawiamy zestaw procedur, które są technicznie proste, opłacalne, a mimo to nadal są w stanie dostarczyć cennych informacji na temat kontroli magazynowania glikogenu. Techniki te wymagają dostępu do spektrofotometru, pracującego w zakresie od 330 do 800 nm i są opisane przy założeniu, że użytkownicy będą korzystać z jednorazowych, plastikowych kuwet. Procedury te są jednak łatwo skalowalne i mogą być modyfikowane do użytku w czytniku mikropłytek, co pozwala na wysoce równoległą analizę.
Wprowadzenie
Glikogen jest szeroko rozpowszechniony w przyrodzie, a związek ten występuje w bakteriach, wielu protistach, grzybach i zwierzętach. W mikroorganizmach glikogen jest ważny dla przetrwania komórek, gdy składniki odżywcze są ograniczone, a u organizmów wyższych, takich jak ssaki, synteza i degradacja glikogenu służą do buforowania poziomu glukozy we krwi1,2,3. Badania nad metabolizmem glikogenu mają zatem znaczenie dla tak różnych dziedzin, jak mikrobiologia i fizjologia ssaków. Zrozumienie metabolizmu glikogenu wymaga zbadania kluczowych enzymów syntezy glikogenu (syntazy glik....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Oznaczanie aktywności syntazy glikogenu
- Przygotować roztwory podstawowe wymaganych odczynników, jak wskazano w Tabeli 1 (przed dniem doświadczalnym).
| składnik | Wskazówki | |
| 50 mM Tris pH 8,0 | Rozpuść 0,61 g zasady Tris w ~ 80 ml wody. Schłodzić do 4 °C. Dostosuj pH do 8,0 za pomocą HCl i uzupełnij objętość do 100 ml wodą. | |
| Bufor HEPES 20 mM | Rozpuść 0.477 g HEPES .... | |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Oznaczanie aktywności syntazy glikogenu
Rycina 1 przedstawia reprezentatywne wyniki testów syntazy glikogenu z użyciem oczyszczonych enzymów. Na panelu A, po krótkiej fazie opóźnienia, zaobserwowano liniowy spadek absorbancji przy 340 nm w czasie przez okres około 12 min. Szybkość zmiany absorbancji na Rycina 1A wynosiła ~0,12 jednostek absorbancji/min. Optymalna szybkość zmiany absorbancji mieści się w przedziale od ~0,010 do ~0,20 jednoste.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Ogólnie rzecz biorąc, kluczowymi zaletami wszystkich przedstawionych metod są ich niski koszt, łatwość, szybkość i brak polegania na specjalistycznym sprzęcie. Główną wadą, którą wszystkie dzielą, jest czułość w porównaniu z innymi dostępnymi metodami. Wrażliwość procedur, które wiążą się z produkcją lub zużyciem NADH/NADPH, jest łatwa do oszacowania. Biorąc pod uwagę, że współczynnik ekstynkcji NADH/NADPH wynosi 6,22 M-1 cm-1, prosta arytmetyka wskazuje, że ~10-20 μM zmian stężenia można łatwo wykr.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie są znane żadne konflikty interesów związane z tymi pracami i nie zapewniono im wsparcia finansowego, które mogłoby wpłynąć na ich wynik.
Podziękowania
Autor chciałby podziękować Karoline Dittmer i Andrew Brittinghamowi za ich spostrzeżenia i wiele pomocnych dyskusji. Praca ta była częściowo wspierana przez granty z Iowa Osteopathic Education and Research Fund (IOER 03-17-05 i 03-20-04).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Amylopektyna (bez amylozy) z woskowej kukurydzy | Fisher Scientific | A0456 | |
| Amylose | Biosynth Carbosynth | YA10257 | |
| ATP, sól disodowa | MilliporeSigma | A3377 | |
| D-glukozo-1,6-bisfosforan, sól potasowa | MilliporeSigma | G6893 | |
| D-glukozo-6-fosforan, sól sodowa | MilliporeSigma | G7879 | |
| Dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa, stopień I, z drożdży | MilliporeSigma | 10127655001 | |
| Glikogen, typ II z ostrygi | MilliporeSigma | G8751 | |
| Hexokinase | MilliporeKuwety metakrylanowe Sigma | 11426362001 | |
| 1,5 ml | Fisher Scientific | 14-955-128 | Metakrylan jest wymagany, ponieważ niektóre procedury są prowadzone przy długości fali 340 nm lub niższej |
| β-Sól sodowa fosforanu dinukleotydu nikotynamidoadeninowego | MilliporeSigma | N0505 | |
| β-dinukleotyd nikotynamidoadeninowy, zredukowana sól disodowa | MilliporeSigma | 43420 | |
| Kinaza nukleozydowa 5'-difosforanowa | MiliporeSigma | N0379 | |
| Fosfoenolopirugronian, sól | monopotasowaMilliporeSigma | P7127 | |
| Fosfoglukutaza z mięśni królika | MilliporeSigma | P3397 | |
| Fosforylaza A z mięśni królika | MilliporeSigma | P1261 | |
| Kinaza pirogronianowa/enzymy dehydrogenazy mlekowej z mięśni królika | MilliporeSigma | P0294 | |
| UDP-glukoza, sól disodowa | MiliporeSigma | U4625 |
Bibliografia
- Wilson, W. A., et al. Regulation of glycogen metabolism in yeast and bacteria. FEMS Microbiology Reviews. 34 (6), 952-985 (2010).
- Ralton, J. E., Sernee, M. F., McConville, M. J. Evolution and function of carbohydrate reserve biosynthesis in parasiti....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
