Metody spektrofotometryczne do badania metabolizmu glikogenu eukariotycznego

Podsumowanie

Techniki pomiaru aktywności kluczowych enzymów metabolizmu glikogenu są prezentowane przy użyciu prostego spektrofotometru działającego w zakresie widzialnym.

Streszczenie

Glikogen jest syntetyzowany jako forma magazynowania glukozy przez szeroki wachlarz organizmów, od bakterii po zwierzęta. Cząsteczka składa się z liniowych łańcuchów reszt glukozy połączonych α1,4 z rozgałęzieniami wprowadzonymi przez dodanie wiązań α1,6. Zrozumienie, w jaki sposób synteza i degradacja glikogenu są regulowane oraz w jaki sposób glikogen osiąga swoją charakterystyczną rozgałęzioną strukturę, wymaga zbadania enzymów magazynowania glikogenu. Jednak metody najczęściej stosowane do badania tych aktywności enzymatycznych zazwyczaj wykorzystują odczynniki lub techniki, które nie są dostępne dla wszystkich badaczy. W tym miejscu omawiamy zestaw procedur, które są technicznie proste, opłacalne, a mimo to nadal są w stanie dostarczyć cennych informacji na temat kontroli magazynowania glikogenu. Techniki te wymagają dostępu do spektrofotometru, pracującego w zakresie od 330 do 800 nm i są opisane przy założeniu, że użytkownicy będą korzystać z jednorazowych, plastikowych kuwet. Procedury te są jednak łatwo skalowalne i mogą być modyfikowane do użytku w czytniku mikropłytek, co pozwala na wysoce równoległą analizę.

Wprowadzenie

Glikogen jest szeroko rozpowszechniony w przyrodzie, a związek ten występuje w bakteriach, wielu protistach, grzybach i zwierzętach. W mikroorganizmach glikogen jest ważny dla przetrwania komórek, gdy składniki odżywcze są ograniczone, a u organizmów wyższych, takich jak ssaki, synteza i degradacja glikogenu służą do buforowania poziomu glukozy we krwi^1,2,3. Badania nad metabolizmem glikogenu mają zatem znaczenie dla tak różnych dziedzin, jak mikrobiologia i fizjologia ssaków. Zrozumienie metabolizmu glikogenu wymaga zbadania kluczowych enzymów syntezy glikogenu (syntazy glikogenu i enzymu rozgałęziającego) oraz degradacji glikogenu (fosforylaza glikogenu i enzym rozgałęziający). Złote standardy testów syntazy glikogenu, fosforylazy, aktywności enzymów rozgałęziających i rozgałęziających wykorzystują izotopy promieniotwórcze. Na przykład syntazę glikogenu mierzy się na ogół w zatrzymanym teście radiochemicznym po włączeniu glukozy z UDP-[¹⁴C]glukozy (w przypadku enzymów zwierzęcych i grzybowych) lub ADP-[¹⁴C]glukozy (w przypadku enzymów bakteryjnych) do glikogenu^4,5. Podobnie, fosforylaza glikogenu jest mierzona w kierunku syntezy glikogenu, po włączeniu glukozy z [¹⁴C]glukozo-1-fosforanu do glikogenu⁶. Enzym rozgałęziający jest oznaczany przez pomiar zdolności tego enzymu do stymulowania inkorporacji [¹⁴C]glukozy z glukozo-1-fosforanu do łańcuchów połączonych α1,4 przez fosforylazę glikogenu⁷, a aktywność enzymu rozgałęziającego określa się, śledząc zdolność enzymu do włączania [¹⁴C]glukozy do glikogenu⁸. Chociaż substraty radioaktywne są bardzo wrażliwe, co pozwala na ich stosowanie w surowych ekstraktach komórkowych o niskim poziomie aktywności enzymatycznej, są drogie i podlegają wymogom regulacyjnym związanym ze stosowaniem izotopów promieniotwórczych. Bariery te sprawiają, że stosowanie niektórych testów jest poza zasięgiem wielu pracowników. Jednak na przestrzeni wielu lat opisano imponującą różnorodność podejść spektrofotometrycznych do pomiaru tych enzymów. Ogólnie rzecz biorąc, podejścia te ostatecznie opierają się na pomiarze produkcji lub zużycia NADH/NADPH lub wytwarzaniu kolorowych kompleksów między glikogenem a jodem. Dzięki temu są proste i można je przeprowadzić za pomocą prostych spektrofotometrów wyposażonych tylko w wolframowe lub ksenonowe lampy błyskowe.

Testy spektrofotometryczne syntazy glikogenu polegają na pomiarze difosforanu nukleozydu uwalnianego z donora nukleotydów cukrowych, gdy glukoza jest dodawana do rosnącego łańcucha glikogenu9^,10. Procedura pomiaru aktywności syntazy glikogenu opisana w sekcji 1 protokołu, poniżej, jest modyfikacją tej opisanej przez Wayllace et al.¹¹, a schemat sprzężenia jest pokazany poniżej:

(Glukoza)_n + UPD-glukoza → (Glukoza)_n+1 + UDP

UDP + ATP → ADP + UTP

ADP + fosfoenolopirogronian → pirogronian + ATP

Pirogronian + NADH + H⁺ → Mleczan + NAD⁺

Syntaza glikogenu dodaje glukozę z UDP-glucose do glikogenu. Powstający w tym procesie UDP jest przekształcany w UTP przez kinazę difosforanową nukleozydów (kinazę NDP), w reakcji, która generuje ADP. ADP z kolei służy następnie jako substrat dla kinazy pirogronianowej, która fosforyluje ADP przy użyciu fosfoenolopirogronianu jako donora fosforanów. Powstały pirogronian jest przekształcany w mleczan przez enzym dehydrogenazę mleczanową w reakcji, która zużywa NADH. Test można zatem przeprowadzić w sposób ciągły, monitorując spadek absorbancji przy 340 nm w miarę zużywania NADH. Jest łatwo przystosowany do stosowania z enzymami, które wymagają ADP-glukozy jako dawcy glukozy. W tym przypadku etapy sprzęgania są prostsze, ponieważ ADP uwalniany przez działanie syntazy glikogenu jest bezpośrednio oddziaływany przez kinazę pirogronianową.

Dostępne są różne testy spektrofotometryczne do określania aktywności fosforylazy glikogenu. W wersji klasycznej enzym jest napędzany do tyłu, w kierunku syntezy glikogenu, jak pokazano poniżej:

(Glukoza)_n + Glukozo-1-fosforan → (Glukoza)_n+1 + P_i

W określonych odstępach czasu, porcje mieszaniny reakcyjnej są usuwane, a ilość uwolnionego fosforanu jest określana ilościowo^12,13. W naszych rękach test ten miał ograniczone zastosowanie ze względu na obecność łatwo mierzalnego wolnego fosforanu w wielu komercyjnych preparatach glukozo-1-fosforanu, w połączeniu z wysokimi stężeniami glukozo-1-fosforanu wymaganymi do działania fosforylazy. Zamiast tego rutynowo zastosowaliśmy alternatywny test, który mierzy glukozo-1-fosforan uwalniany, gdy glikogen jest degradowany przez fosforylazę¹³. Zastosowano sprzężony schemat reakcji, zilustrowany poniżej.

(Glukoza)_n + P_i → (Glukoza)_n-1 + Glukoza-1-fosforan

Glukozo-1-fosforan → Glukozo-6-fosforan

Glukozo-6-fosforan + NADP⁺ → 6-fosfoglukonolakton + NADPH + H⁺

Glukozo-1-fosforan jest przekształcany w glukozo-6-fosforan przez fosfoglukututazę, a glukozo-6-fosforan jest następnie utleniany do 6-fosfoglukonolaktonu, przy jednoczesnej redukcji NADP⁺ do NADPH. Procedura opisana szczegółowo w sekcji 2 protokołu, poniżej, wywodzi się z metod opisanych przez Mendicino et al.¹⁴ oraz Schreiber & Bowling¹⁵. Test można łatwo przeprowadzić w sposób ciągły, ze wzrostem absorbancji przy 340 nm w czasie, co pozwala na określenie szybkości reakcji.

Spektrofotometryczne określenie aktywności enzymu rozgałęziającego opiera się na pomiarze glukozy uwalnianej przez działanie enzymu na limit fosforylazy dekstryny¹⁶. Związek ten jest wytwarzany przez wyczerpujące traktowanie glikogenu fosforylazą glikogenu. Ponieważ działanie fosforylazy glikogenu zatrzymuje 4 reszty glukozy z dala od punktu rozgałęzienia α1,6, graniczna dekstryna zawiera glikogen, którego zewnętrzne łańcuchy zostały skrócone do ~ 4 reszt glukozy. Przygotowanie dekstryny granicznej fosforylazy opisano tutaj, przy użyciu procedury zaczerpniętej z procedur opracowanych przez Taylora i wsp.¹⁷ oraz Makino & Omichi¹⁸.

Rozgałęzianie to proces dwuetapowy. Aktywność 4-α-glukanotransferazy dwufunkcyjnego enzymu rozgałęziającego najpierw przenosi trzy reszty glukozy z punktu rozgałęzienia na nieredukujący koniec pobliskiego łańcucha glukozowego połączonego α1,4. Pojedyncza, połączona z α1,6 reszta glukozy pozostająca w punkcie rozgałęzienia jest następnie hydrolizowana przez aktywność α1,6-glukozydazy¹⁹. Test jest zwykle wykonywany w sposób zatrzymany, a glukoza uwolniona po określonym czasie (lub serii razy) jest mierzona w sprzężonym teście enzymatycznym, jak pokazano poniżej:

(Glukoza)_n → (Glukoza)_n-1 + Glukoza

Glukoza + ATP → Glukozo-6-fosforan + ADP

Glukozo-6-fosforan + NADP⁺ → 6-fosfoglukonolakton + NADPH + H⁺

Określenie wyprodukowanego NADPH daje miarę produkcji glukozy. Procedura opisana w sekcji 3 protokołu, poniżej, jest oparta na procedurze opisanej przez Nelsona i wsp.¹⁶. Podobnie jak inne metody, które opierają się na zużyciu lub wytwarzaniu NADH/NADPH, test jest dość czuły. Jednak obecność amylaz lub innych glukozydaz, które mogą również uwalniać wolną glukozę z dekstryny granicznej fosforylazy, spowoduje znaczne zakłócenia (patrz Dyskusja).

Kolorymetryczne określenie aktywności rozgałęziającego się enzymu opiera się na fakcie, że łańcuchy glukozy połączone α1,4 przyjmują spiralne struktury, które wiążą się z jodem, tworząc kolorowe kompleksy²⁰. Kolor utworzonego kompleksu zależy od długości łańcuchów połączonych α1,4. Tak więc amyloza, która składa się z długich, w dużej mierze nierozgałęzionych łańcuchów glukozy połączonej z α1,4, tworzy ciemnoniebieski kompleks z jodem. Natomiast glikogeny, których zewnętrzne łańcuchy mają na ogół długość zaledwie 6 do 8 reszt glukozy, tworzą pomarańczowo-czerwone kompleksy. Jeśli roztwór amylozy jest inkubowany z enzymem rozgałęziającym, wprowadzenie rozgałęzień do amylozy powoduje wytworzenie krótszych łańcuchów glukozy połączonych α1,4. W ten sposób maksimum absorpcji kompleksów amylozy/jodu przesuwa się w kierunku krótszych fal. Omawiana tutaj procedura wywodzi się z procedury opisanej przez Boyer & Preiss²¹, a aktywność enzymu rozgałęziającego się jest określana ilościowo jako zmniejszenie wchłaniania kompleksu amylozy/jodu przy 660 nm w czasie.

Jak powinno być łatwo zauważyć z powyższej dyskusji, fakt, że kolory kompleksów utworzonych między łańcuchami jodu i α1,4-glukozy różnią się wraz z długością łańcucha, oznacza, że widma absorbancji kompleksów glikogen/jod powinny zmieniać się wraz ze stopniem rozgałęzienia glikogenu. Tak jest w istocie, a mniej rozgałęzione glikogeny/glikogeny z dłuższymi łańcuchami zewnętrznymi pochłaniają światło o większej długości fali niż glikogeny, które są bardziej rozgałęzione/mają krótsze łańcuchy zewnętrzne. Reakcja barwienia jodem może być zatem wykorzystana do uzyskania szybkich, jakościowych danych na temat stopnia rozgałęzienia glikogenu²². Pomarańczowo-brązowy kolor powstaje, gdy kompleksy glikogenu z jodem nie są szczególnie intensywne. Jednak rozwój koloru można wzmocnić poprzez włączenie nasyconego roztworu chlorku wapnia²². Zwiększa to około 10-krotnie czułość metody i umożliwia łatwą analizę mikrogramowych ilości glikogenu. Test do oznaczania rozgałęzień opisany w sekcji 4 protokołu, poniżej, jest zaadaptowany z procedury opracowanej przez Krisman²². Przeprowadza się go po prostu poprzez połączenie próbki glikogenu z roztworem jodu i chlorkiem wapnia w kuwecie i zebranie widma absorpcji od 330 nm do 800 nm. Maksymalna absorbancja przesuwa się w kierunku dłuższych fal wraz ze spadkiem stopnia rozgałęzienia.

Podsumowując, opisane tutaj metody dostarczają prostych, niezawodnych metod oceny aktywności kluczowych enzymów metabolizmu glikogenu oraz uzyskiwania jakościowych danych na temat stopnia rozgałęzienia glikogenu.

Protokół

1. Oznaczanie aktywności syntazy glikogenu

1. Przygotować roztwory podstawowe wymaganych odczynników, jak wskazano w Tabeli 1 (przed dniem doświadczalnym).

składnik	Wskazówki
50 mM Tris pH 8,0	Rozpuść 0,61 g zasady Tris w ~ 80 ml wody. Schłodzić do 4 °C. Dostosuj pH do 8,0 za pomocą HCl i uzupełnij objętość do 100 ml wodą.
Bufor HEPES 20 mM	Rozpuść 0.477 g HEPES w ~ 80 ml wody. Dostosuj pH do 7,0 za pomocą NaOH i uzupełnij objętość do 100 ml wodą.
132 mM Tris/32 mM KCl bufor pH 7,8	Rozpuść 1,94 g zasady Tris i 0,239 g KCl w ~90 ml wody. Dostosuj pH do 7,8 za pomocą HCl i uzupełnij objętość do 100 ml wodą.
0,8% w/v glikogenu ostrygowego	Odważ 80 mg glikogenu ostrygowego i dodaj do wody. Uzupełnij końcową objętość do 10 ml wodą i delikatnie podgrzej/wymieszaj, aby całkowicie rozpuścić glikogen.
100 mM UDP-glukoza	Rozpuść 0,31 g UDP-glukozy w wodzie i uzupełnij końcową objętość do 1 ml. Przechowywać w porcjach, zamrożonych w temperaturze -20 °C. Stabilny przez kilka miesięcy.
50 mM ATP	Rozpuść 0.414 g ATP w ~ 13 ml wody. Dostosuj pH do 7,5 za pomocą NaOH i uzupełnij objętość do 15 ml wodą. Przechowywać w porcjach zamrożonych w temperaturze -20 °C. Stabilny przez kilka miesięcy.
100 mM glukozo-6-fosforanu o pH 7,8	Rozpuść 0.282 g glukozo-6-fosforanu w ~ 7 do 8 ml wody. Dostosuj pH do 7,8 za pomocą NaOH. Uzupełnij objętość do 10 ml wodą. Przechowywać zamrożone w porcjach w temperaturze -20 °C. Stabilne przez co najmniej sześć miesięcy.
40 mM fosfoenolopirogronian	Rozpuść 4 mg fosfoenolopirogronianu w 0,5 ml 20 mM buforu HEPES o pH 7,0. Przechowywać w temperaturze -20 °C. Stabilny przez co najmniej 1 tydzień.
0,5 mln MnCl2	Rozpuść 9,90 g MnCl2 w końcowej objętości 100 ml wody.
Kinaza NDP	Rozpuść liofilizowany proszek w takiej ilości wody, aby uzyskać 1 U/μl roztworu. Przygotuj porcje, zamroź w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze -80 °C. Stabilny przez co najmniej 1 rok.

Tabela 1: Roztwory podstawowe wymagane do oznaczenia aktywności syntazy glikogenu.

2. W dniu testu należy przygotować świeży roztwór roboczy o stężeniu 4 mM NADH, rozpuszczając 4,5 mg NADH w 1,5 ml 50 mM Tris-HCl, pH 8,0. Przechowywać na lodzie, chronić przed światłem.
3. Rozmrozić na lodzie roztwory podstawowe UDP-glukozy, ATP, fosfoenolopirogronianu i kinazy NDP.
4. Podgrzej łaźnię wodną do temperatury 30 °C.
5. Ustawić każdy test syntazy glikogenu w probówce o pojemności 1,5 ml, dodając odczynniki mieszaniny reakcyjnej wymienione w tabeli 2.

szt. Rozdział szt.

składnik	Objętość (μl)
160 mM Tris/32 mM KCl bufor pH 7,8	Z kolei 250
Woda	Rozdział 179
100 mM glukozo-6-fosforanu, pH 7,8	Rozdział 58
0,8 % w/v glikogenu ostrygowego	67
50 mM ATP	Rozdział 80
4 mM NADH	Rozdział 80
100 mM UDP-glukoza	28
40 mM fosfoenolopirogronian	20
0,5 mln MnCl2	8
Ostatni tom	770

Tabela 2: Skład mieszaniny reakcyjnej do oznaczania aktywności syntazy glikogenu.

UWAGA: Aby ułatwić przygotowanie, można przygotować mieszankę wzorcową zawierającą wystarczającą ilość każdego z wyżej wymienionych odczynników, aby uzupełnić zaplanowaną liczbę testów.

6. Przygotuj ślepą próbę, w której NADH w powyższej mieszaninie zastępuje się wodą. Przenieść do jednorazowej kuwety z metakrylanem i użyć jej do ustawienia zera na spektrofotometrze na 340 nm.
7. Pobrać jedno 770 μl podwielokrotności mieszaniny reakcyjnej do probówki o pojemności 1,5 ml. Dodać 2 μl kinazy NDP i 2 μl mieszaniny kinazy pirogronianowej / dehydrogenazy mleczanowej, delikatnie wymieszać i inkubować w temperaturze 30 °C przez 3 minuty w celu wstępnego ogrzania mieszaniny reakcyjnej.
8. Dodać 30 μl próbki zawierającej syntazę glikogenu do 20 mM buforu Tris o pH 7,8; wymieszać i przenieść mieszaninę reakcyjną do jednorazowej kuwety z metakrylanu.
9. Umieścić kuwetę w spektrofotometrze i rejestrować absorbancję przy 340 nm w określonych odstępach czasu przez 10 do 20 minut. Wykreślić uzyskane absorbancje w czasie.
   UWAGA: Reakcję, w której próbkę syntazy glikogenu zastępuje się 20 mM buforem Tris, należy przeprowadzić w celu kontroli nieenzymatycznego utleniania NADH. W zależności od czystości próbki mogą być wymagane inne reakcje kontrolne. Zobacz Dyskusja, aby uzyskać szczegółowe informacje.
10. Określ szybkość reakcji (szczegółowe informacje można znaleźć w Wynikach).

2. Oznaczanie aktywności fosforylazy glikogenu

1. Przygotować roztwory podstawowe zgodnie z tabelą 3 (przed dniem doświadczalnym).

składnik	Wskazówki
RURY 125 mM pH 6,8	Rozpuść 3.78 g RUR w wodzie. Dostosuj pH do 6,8 za pomocą NaOH i uzupełnij objętość do 100 ml wodą.
8% w/v glikogenu ostrygowego	Odważyć 0,8 g glikogenu ostrygowego i dodać do wody. Uzupełnić końcową objętość do 10 ml wodą i delikatnie podgrzać/wymieszać do rozpuszczenia glikogenu. Przechowywać w stanie zamrożonym w temperaturze -20 °C.
200 mM Na fosforan pH 6,8	Rozpuść 2,63 g Na2HPO4.7H 2O i 1,41 g NaH2PO4. H2O w wodzie. Uzupełnić wodą objętość do 100 ml.
1 mM glukozo-1,6-bisfosforanu	Rozpuść 2 mg glukozo-1,6-bisfosforanu w 4 ml wody. Podwielokrotność i przechowywać w stanie zamrożonym w temperaturze -20 °C. Stabilny przez co najmniej kilka miesięcy.
10 mM NADP	Rozpuść 23 mg NADP w 3 ml wody. Podwielokrotność i przechowuj w stanie zamrożonym w temperaturze -20 °C. Stabilny przez co najmniej kilka miesięcy.

Tabela 3: Roztwory podstawowe wymagane do oznaczenia aktywności fosforylazy glikogenu.

2. Podgrzej łaźnię wodną do temperatury 30 °C
3. Ustawić każdy test fosforylazy glikogenu w probówce o pojemności 1,5 ml, dodając odczynniki mieszaniny reakcyjnej wymienione poniżej (Tabela 4).

szt. Rozdział szt. szt. szt.

składnik	Objętość (μl)
125 mM RURY bufor pH 6,8	160
Woda	70
8% w/v glikogenu ostrygowego	100
200 mM Na fosforan 6,8	400
1 mM glukozo-1,6-bisfosforanu	20
10 mM NADP	20
Ostatni tom	770

Tabela 4: Skład mieszaniny reakcyjnej do oznaczania aktywności fosforylazy glikogenu.

UWAGA: Aby ułatwić przygotowanie, można przygotować mieszankę wzorcową zawierającą wystarczającą ilość każdego z wyżej wymienionych odczynników, aby uzupełnić zaplanowaną liczbę testów.

5. Przygotować ślepą próbę zawierającą składniki wymienione w tabeli 4, ale dodać dodatkowe 30 μl 25 mM buforu PIPES o pH 6,8 (przygotowanym przez rozcieńczenie 125 mM buforu PIPES 1:5 wodą). Przenieść do jednorazowej kuwety z metakrylanem i użyć do ustawienia zera na spektrofotometrze przy długości fali 340 nm.
6. Pobrać jedną podwielokrotność mieszaniny reakcyjnej o objętości 770 μl do probówki o pojemności 1,5 ml. Dodać 1 μl dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej i 1 μl fosfoglukututazy, delikatnie wymieszać i inkubować w temperaturze 30 °C przez 3 minuty w celu wstępnego ogrzania mieszaniny reakcyjnej.
7. Dodać 30 μl próbki zawierającej fosforylazę glikogenu do 25 mM buforu PIPES o pH 6,8. Wymieszać i przenieść mieszaninę reakcyjną do jednorazowej kuwety z metakrylanu.
8. Umieścić kuwetę w spektrofotometrze i rejestrować absorbancję przy 340 nm w określonych odstępach czasu przez 10 do 20 minut. Wykreślić uzyskane absorbancje w czasie.
   UWAGA: Należy uwzględnić reakcję, w której fosforylaza glikogenu jest zastępowana buforem 25 mM PIPES. W zależności od czystości próbki fosforylazy glikogenu mogą być również potrzebne inne kontrole (szczegóły w Dyskusji).
9. Określić szybkość reakcji (szczegółowe informacje można znaleźć w Reprezentatywnych wynikach).

3. Oznaczanie aktywności enzymu rozgałęziającego glikogen

1. Przygotować roztwory podstawowe zgodnie z tabelą 5 (przed dniem doświadczalnym).

składnik	Wskazówki
Bufor maleinianu 100 mM	Rozpuść 1,61 g kwasu maleinowego w ~ 80 ml wody. Dostosuj pH do 6,6 za pomocą NaOH i uzupełnij końcową objętość do 100 ml wodą.
300 mM chlorowodorek trietanoloaminy / 3 mM MgSO4 pH 7,5	Rozpuść 27.85 g chlorowodorku trietanoloaminy i 0.370 g MgSO4.7H2O w ~ 400 ml wody. Doprowadzić pH do 7,5 za pomocą NaOH i uzupełnić wodą do końcowej objętości 500 ml.
150 mM ATP/12 mM NADP	Rozpuść 1.24 g ATP w ~ 10 ml wody. Monitoruj pH i dodaj NaOH, aby utrzymać pH ~ 7.5 podczas rozpuszczania ATP. Dodaj 0.138 g NADP. Dostosuj pH do ~ 7.5 za pomocą NaOH i uzupełnij wodą do końcowej objętości 15 ml. Przechowywać w porcjach w temperaturze – 20 °C. Stabilny przez kilka miesięcy.
50 mM Bufor fosforanowy Na pH 6,8	Rozpuść 32.81 g Na2HPO4.7H 2O i 17.61 g NaH2PO4. H2O w wodzie. Doprowadzić do końcowej objętości 5 l za pomocą wody.

Tabela 5: Roztwory podstawowe wymagane do oznaczenia aktywności enzymu rozgałęziającego glikogen.

2. Przygotować dekstrynę graniczną fosforylazy
   1. Rozpuścić 0,3 g glikogenu ostrygowego w 10 ml 50 mM buforu fosforanowo-sodowego o pH 6,8.
   2. Rozpuścić wystarczającą ilość liofilizowanej fosforylazy A w proszku, aby uzyskać 60 U aktywności w 50 mM buforze fosforanowym o pH 6,8,
      UWAGA: W zależności od zakupionej partii fosforylazy A, potrzebna masa będzie się różnić, ale zwykle wynosi od 5 do 10 mg proszku.
3. Dodać 60 j. fosforylazy A do roztworu glikogenu i przenieść do worka dializacyjnego. Dializować w temperaturze pokojowej w 1 l 50 mM buforu fosforanu sodu o pH 6,8 przez 8 godzin. Zmienić na świeży bufor do dializy i kontynuować inkubację przez noc.
4. Dodać kolejne 10 j. fosforylazy A i zmienić na świeży bufor do dializy. Po 8 godzinach ponownie zmienić na świeży bufor do dializy i kontynuować inkubację przez noc.
5. Przenieść zawartość worka dializacyjnego do probówki wirówkowej i gotować przez 10 minut. Schłodzić na lodzie, a następnie odwirować przy 10 000 x g przez 15 minut.
6. Przenieść supernatant do worka dializacyjnego i dializować przez 8 godzin przy trzech zmianach po 2 l wody destylowanej.
7. Przenieść zawartość worka dializacyjnego do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Zmierzyć objętość i dodać dwie objętości lodowatego absolutnego etanolu, aby wytrącić graniczną dekstrynę. Pozostaw probówkę na lodzie na 30 minut.
   UWAGA: Biały osad powinien zacząć tworzyć się natychmiast po dodaniu etanolu, ale jeśli tak się nie stanie, dodaj kroplę 3 M NaCl.
8. Wirować przy 15 000 x g przez 15 minut i odrzucić supernatant. Dwukrotnie przepłukać białą osadkę dekstryny granicznej etanolem o stężeniu 66% v/v, używając ~30 ml na każde płukanie.
9. Przenieś limit dekstryny do zaprawy i pozostaw do całkowitego wyschnięcia na powietrzu. Gdy graniczna dekstryna wyschnie, zmielić na proszek za pomocą tłuczka i przenieść do odpowiedniego naczynia do przechowywania; suszyć w temperaturze 4 °C.
10. Do stosowania jako substrat enzymu rozgałęziającego należy przygotować 1% roztwór w/v w wodzie.
11. Podgrzej łaźnię wodną do temperatury 30 °C.
12. Podgrzej blok grzewczy lub łaźnię wodną do temperatury 95 °C.
13. Przygotuj cztery probówki o pojemności 1,5 ml każda, z których każda zawiera 100 μl buforu maleinianowego, 80 μl dekstryny granicznej fosforylazy i 10 μl wody. Probówki te zostaną wykorzystane do przeprowadzenia testu enzymu rozgałęziającego. Oznacz dwie probówki jako Reakcja, a pozostałe dwie jako Kontrola.
14. W określonych odstępach czasu dodać 10 μl próbki enzymu rozgałęziającego się do probówek reakcyjnych i 10 μl buforu, który został użyty do przygotowania próbki enzymu rozgałęziającego się do probówek kontrolnych. Inkubować w temperaturze 30 °C.
15. W określonych punktach czasowych (np. 5-, 10- i 20-minutowa inkubacja) pobrać 50 μl z każdej probówki reakcyjno-kontrolnej i natychmiast umieścić w bloku grzewczym lub łaźni wodnej o temperaturze 95 °C. Podgrzewać przez 3 min.
16. Wirować przy 15 000 x g przez 2 minuty w celu usunięcia wytrąconego białka.
    UWAGA: W tym momencie procedurę można zatrzymać w razie potrzeby. Podgrzane próbki można przechowywać w stanie zamrożonym w temperaturze -20 °C do czasu przejścia do pomiaru uwolnionej glukozy (krok 17 poniżej).
17. Pomiar uwolnionej glukozy
    1. Przenieść 40 μl supernatantu z podgrzanych próbek do jednorazowych kuwet z metakrylanu i dodać 833 μl buforu chlorowodorku trietanoloaminy/siarczanu magnezu, 67 μl mieszaniny NADP/ATP i 60 μl wody. Mieszać, delikatnie pipetując w górę i w dół, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza.
       UWAGA: Aby ułatwić przygotowanie, można przygotować mieszankę wzorcową zawierającą wystarczającą ilość każdego z wyżej wymienionych odczynników, aby uzupełnić zaplanowaną liczbę testów.
    2. Przygotować ślepą próbę, łącząc 100 μl buforu maleinianu, 80 μl dekstryny granicznej fosforylazy i 20 μl wody. Dobrze wymieszaj i przenieś 40 μl do jednorazowej kuwety z metakrylanu. Dodać 833 μl chlorowodorku trietanoloaminy/siarczanu magnezu itd., jak opisano w kroku 3.17.1.
    3. Ustaw zero na spektrofotometrze na 340 nm za pomocą ślepej próby.
    4. Dodaj 0,5 μl dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej do każdej kuwety. Delikatnie mieszać, powoli pipetując w górę i w dół. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut, a następnie rejestrować absorbancję przy 340 nm.
       UWAGA: Wartości absorpcji powinny być niskie, co oznacza niewielkie zanieczyszczenie próbek glukozo-6-fosforanem.
    5. Dodaj 0,5 μl heksokinazy do każdej kuwety. Delikatnie mieszać, powoli pipetując w górę i w dół. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut, a następnie odnotować absorbancję przy 340 nm.
    6. Kontynuować inkubację w temperaturze pokojowej przez dodatkowe 5 minut. Ponownie zanotować absorbancję przy długości fali 340 nm. Jeżeli absorpcja wzrosła w stosunku do absorpcji zarejestrowanej po 15 minutach, kontynuować inkubację przez kolejne 5 minut i ponownie sprawdzić absorpcję. Odnotować końcową absorpcję przy otrzymanej długości fali 340 nm.
    7. Dla każdej próbki należy odjąć absorbancję przy długości fali 340 nm zarejestrowaną po dodaniu dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej od końcowej absorbancji otrzymanej po dodaniu heksokinazy. Sporządzić wykres uzyskanych wartości w stosunku do czasu, w którym odpowiednia próbka była inkubowana z enzymem rozgałęziającym.

4. Oznaczanie aktywności enzymu rozgałęziającego glikogen

1. Przed dniem doświadczalnym należy przygotować roztwór jodu/KI, rozpuszczając najpierw 2,6 g KI w 10 ml wody. W dygestorium odważyć 0,26 g jodu i dodać do roztworu KI.
   UWAGA: Jod jest szkodliwy w kontakcie ze skórą lub w następstwie wdychania. Wymieszać do rozpuszczenia jodu i przechowywać w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem. Przygotuj również bufor 125 mM PIPES o pH 6,8 (patrz Tabela 3).
2. Rozpoczynając eksperymenty, przygotuj zapas roboczy z zakwaszonego odczynnika jodowego.
   1. Weź 45,7 ml wody do probówki o pojemności 50 ml i dodaj 150 μl roztworu jodu/KI, a następnie 150 μl 1 M HCl.
   2. Dobrze wymieszać i przechowywać w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem. W tych warunkach roztwór jest stabilny przez co najmniej 3 dni.
3. W dniu eksperymentu przygotuj świeży roztwór amylozy o stężeniu 10 mg/ml.
   1. Odważyć 50 mg amylozy i przenieść do probówki o pojemności 15 ml.
   2. Dodaj 200 μl absolutnego etanolu i delikatnie wstrząśnij.
   3. Dodać 500 μl 2 M KOH i delikatnie wstrząsnąć.
      UWAGA: KOH powoduje poważne oparzenia skóry i uszkodzenia oczu. Stosować odpowiednie środki ochrony osobistej.
   4. Dodaj 0,5 ml wody, delikatnie wstrząsając. Jeśli amyloza nie rozpuści się całkowicie, dodaj dodatkowe 0,5 ml wody.
   5. Dostosuj pH do ~6,5 do 7,0 za pomocą 1 M HCl.
      UWAGA: HCl może powodować podrażnienie oczu, skóry i dróg oddechowych. Stosować odpowiednie środki ochrony osobistej.
   6. Dodaj wodę, aby osiągnąć końcową objętość 5 ml.
   7. Sterylizować przez przejście przez filtr końcowy strzykawki 0,2 μm i przechowywać w temperaturze pokojowej. Nie schładzać ani nie zamrażać.
4. Podgrzej łaźnię wodną do temperatury 30 °C.
5. Przygotuj dwanaście probówek o pojemności 1,5 ml, z których każda zawiera 1 ml zakwaszonego odczynnika jodowego. Odłóż na bok na ławce. Zostaną one wykorzystane do zatrzymania reakcji enzymów rozgałęziających.
6. Przygotuj cztery probówki o pojemności 1,5 ml każda, z których każda zawiera 150 μl amylozy, 150 μl buforu PIPES i 45 μl wody. Probówki te zostaną wykorzystane do przeprowadzenia testu enzymu rozgałęziającego. Oznacz dwie probówki jako Reakcja, a pozostałe dwie jako Kontrola.
7. W określonych odstępach czasu dodać 5 μl próbki enzymu rozgałęziającego się do probówek reakcyjnych i 5 μl buforu, który został użyty do przygotowania próbki enzymu rozgałęziającego się do probówek kontrolnych. Inkubować w temperaturze 30 °C.
8. W określonych punktach czasowych (np. 5, 10 i 15 minut inkubacji) należy pobrać 10 μl z każdej probówki reakcyjnej i kontrolnej i dodać do 1,5 ml probówek zawierających 1 ml zakwaszonego odczynnika jodowego. Dodaj dodatkowe 140 μl wody i dobrze wymieszaj. Przenieś do jednorazowych kuwet.
   UWAGA: Próbki powinny być koloru niebieskiego, a roztwór powinien być wolny od jakichkolwiek osadów. Powstały kolor jest stabilny przez co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej.
9. Przygotować próbkę zawierającą 1 ml zakwaszonego odczynnika jodowego i 150 μl wody. Dobrze wymieszaj i przenieś do kuwety. Użyj tej kuwety, aby ustawić zero na spektrofotometrze na 660 nm.
10. Odczytać absorbancję każdej z dwunastu próbek przy długości fali 660 nm. Określić szybkość reakcji enzymu rozgałęziającego, odejmując absorbancję uzyskaną w obecności enzymu rozgałęziającego (reakcja) od absorbancji, gdy w każdym punkcie czasowym nie występuje żaden enzym rozgałęziający (kontrola). Szczegółowe informacje można znaleźć w sekcji Reprezentatywne wyniki.

5. Jakościowa ocena rozgałęzień glikogenu

1. Przygotować nasycony roztwór chlorku wapnia, dodając 74,5 g bezwodnego chlorku wapnia do ~40 ml wody i mieszając. Dodaj trochę więcej wody i kontynuuj mieszanie. Uzupełnić objętość do 100 ml wodą i kontynuować mieszanie, aż CaCl₂ całkowicie się rozpuści.
2. Przygotować zapas roboczy odczynnika barwnego jodu/CaCl₂ przez zmieszanie 50 μl roztworu podstawowego KI/jod (patrz krok 4.1 powyżej) z 13 ml nasyconego roztworu CaCl₂ w probówce o pojemności 15 ml. Dobrze wymieszać i przechowywać w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem. W tych warunkach roztwór jest stabilny przez co najmniej 1 tydzień.
3. Wyznaczanie rozgałęzień
   1. W probówce o pojemności 1,5 ml połącz 650 μl odczynnika barwiącego jod/CaCl₂ ze 100 μl wody i dokładnie wymieszaj. Przenieść roztwór do jednorazowej kuwety z metakrylanu.
      UWAGA: Roztwór w kuwecie powinien być przezroczysty i bladożółty
   .
   2. Umieść w spektrofotometrze i, pracując w trybie skanowania długości fali, zbierz widmo tła od 330 nm do 800 nm.
   3. W probówce o pojemności 1,5 ml połącz 650 μl roboczego odczynnika barwiącego jod/CaCl₂ z 50 μg glikogenu ostrygowego. Doprowadzić końcową objętość do 750 μl wodą i dokładnie wymieszać. Przenieść roztwór do jednorazowej kuwety z metakrylanu.
      UWAGA: Roztwór w kuwecie powinien być klarowny i mieć głęboki pomarańczowo-brązowy kolor.
   4. Umieścić w spektrofotometrze i zebrać widmo absorpcyjne od 330 nm do 800 nm.
   5. Powtórzyć kroki od 4.4.3 do 4.4.4 z 50 μg amylopektyny i 30 μg amylozy.
      UWAGA: Próbka amylopektyny powinna być żółto-zielona, a próbka amylozy powinna być zielono-niebieska. Obie próbki powinny być czyste. Powstałe barwne kompleksy są stabilne, bez zmiany widma absorpcji, przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
   6. Aby uzyskać wskazanie rozgałęzionej struktury niescharakteryzowanej próbki glikogenu, należy połączyć od 25 μg do 50 μg glikogenu z 650 μl roboczego odczynnika barwiącego jod/CaCl₂. Postępować jak powyżej, doprowadzając objętość do 750 μl wodą, dokładnie mieszając i przenosząc do kuwety z metakrylanu.
      UWAGA: Próbka glikogenu powinna mieć kolor od żółtego/pomarańczowego do pomarańczowego/brązowego w zależności od stopnia rozgałęzienia (długości łańcuchów zewnętrznych) obecnego glikogenu. Ponownie, próbka powinna być czysta. Szczegółowe informacje można znaleźć w sekcji Reprezentatywne wyniki.
   7. Zbierz widmo absorpcyjne.

Wyniki

Oznaczanie aktywności syntazy glikogenu
Rysunek 1 pokazuje reprezentatywne wyniki testów syntazy glikogenu przy użyciu oczyszczonych enzymów. W panelu A, po niewielkim opóźnieniu, nastąpił liniowy spadek absorpcji przy 340 nm w czasie przez okres około 12 minut. Szybkość zmiany absorpcji w Rysunek 1A wynosił ~ 0,12 jednostki absorbancji / min. Szybkość zmiany absorbancji między ~0,010 a ~0,20 jednostek absorbancji/min jest optymalna, a ilość dodanej syntazy gl...

Dyskusja

Ogólnie rzecz biorąc, kluczowymi zaletami wszystkich przedstawionych metod są ich niski koszt, łatwość, szybkość i brak polegania na specjalistycznym sprzęcie. Główną wadą, którą wszystkie dzielą, jest czułość w porównaniu z innymi dostępnymi metodami. Wrażliwość procedur, które wiążą się z produkcją lub zużyciem NADH/NADPH, jest łatwa do oszacowania. Biorąc pod uwagę, że współczynnik ekstynkcji NADH/NADPH wynosi 6,22 ^{M-1 cm-1}, prosta arytmetyka wskazuje, że ~10-20 μM zmian stężenia można łatwo wykr...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Amylopektyna (bez amylozy) z woskowej kukurydzy	Fisher Scientific	A0456
Amylose	Biosynth Carbosynth	YA10257
ATP, sól disodowa	MilliporeSigma	A3377
D-glukozo-1,6-bisfosforan, sól potasowa	MilliporeSigma	G6893
D-glukozo-6-fosforan, sól sodowa	MilliporeSigma	G7879
Dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa, stopień I, z drożdży	MilliporeSigma	10127655001
Glikogen, typ II z ostrygi	MilliporeSigma	G8751
Hexokinase	MilliporeKuwety metakrylanowe Sigma	11426362001
1,5 ml	Fisher Scientific	14-955-128	Metakrylan jest wymagany, ponieważ niektóre procedury są prowadzone przy długości fali 340 nm lub niższej
β-Sól sodowa fosforanu dinukleotydu nikotynamidoadeninowego	MilliporeSigma	N0505
β-dinukleotyd nikotynamidoadeninowy, zredukowana sól disodowa	MilliporeSigma	43420
Kinaza nukleozydowa 5'-difosforanowa	MiliporeSigma	N0379
Fosfoenolopirugronian, sól	monopotasowaMilliporeSigma	P7127
Fosfoglukutaza z mięśni królika	MilliporeSigma	P3397
Fosforylaza A z mięśni królika	MilliporeSigma	P1261
Kinaza pirogronianowa/enzymy dehydrogenazy mlekowej z mięśni królika	MilliporeSigma	P0294
UDP-glukoza, sól disodowa	MiliporeSigma	U4625