Artykuł metodologiczny

Stereotaktyczne wstrzyknięcie wirusa i implantacja soczewek o indeksie gradientowym w celu obrazowania głębokiego mózgu in vivo wapnia

9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63049

⸱

8 października 2021

 ,  ,  , 
1Department of Zoology and Physiology, University of Wyoming, 2School of Electrical Engineering & Computer Science, University of North Dakota, 3Department of Mathematics and Statistics, University of Wyoming

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

Miniskopowe obrazowanie wapnia in vivo to potężna technika do badania dynamiki neuronów i mikroobwodów u swobodnie zachowujących się myszy. Protokół ten opisuje wykonywanie operacji mózgu w celu uzyskania dobrego obrazowania wapnia in vivo za pomocą miniskopu.

Streszczenie

Miniaturowy mikroskop fluorescencyjny (miniskop) jest potężnym narzędziem do obrazowania in vivo wapnia od swobodnie zachowujących się zwierząt. Ma kilka zalet w porównaniu z konwencjonalnymi wielofotonowymi systemami obrazowania wapnia: (1) kompaktowy; (2) lekkie; (3) przystępne cenowo; oraz (4) umożliwia nagrywanie swobodnie zachowujących się zwierząt. Protokół ten opisuje operacje mózgu w celu głębokiego obrazowania wapnia in vivo mózgu przy użyciu specjalnie opracowanego systemu rejestracji miniskopu. Procedura przygotowania składa się z trzech etapów, w tym: (1) stereotaktycznego wstrzyknięcia wirusa do pożądanego obszaru mózgu myszy w celu oznaczenia określonej podgrupy neuronów za pomocą genetycznie kodowanego czujnika wapnia; (2) wszczepienie soczewki o indeksie gradientu (GRIN), która może przekazywać obraz wapnia z głębokiego obszaru mózgu do systemu miniskopu; oraz (3) przymocowanie uchwytu miniskopu do czaszki myszy, gdzie miniskop można przymocować później. Aby wykonać obrazowanie wapnia in vivo, miniskop jest mocowany na uchwycie, a obrazy wapnia neuronów są zbierane wraz z jednoczesnymi zapisami zachowania. Obecny protokół chirurgiczny jest kompatybilny z dowolnymi komercyjnymi lub niestandardowymi systemami obrazowania pojedynczych i dwufotonowych do głębokiego obrazowania wapnia mózgu in vivo.

Wprowadzenie

Wewnątrzkomórkowa sygnalizacja Ca2+ jest niezbędnym regulatorem wzrostu, proliferacji, różnicowania, migracji, transkrypcji genów, wydzielania i apoptozy1. W neuronach sygnalizacja Ca2 + jest precyzyjnie kontrolowana, ponieważ jej przestrzenno-czasowy wzorzec jest związany z kluczowymi funkcjami, takimi jak pobudliwość błony, uwalnianie neuroprzekaźników i plastyczność synaptyczna2.

Obrazowanie wapnia in vivo jest potężną techniką, która może być wykorzystana do dekodowania reprezentacji obwodów neuronowych elementarnych do normalnych zachowań zwierząt, identyfikowania nieprawidłowych aktywności neuronalnych w zwierzęcych modelach zaburzeń mózgu i odkrywania potencjalnych celów terapeutycznych, które mogą normalizować te zmienione obwody. Dwa popularne systemy obrazowania wapnia in vivo to dwufotonowa laserowa skaningowa mikroskopia fluorescencyjna 3,4,5,6 oraz miniaturyzowana mikroendoskopia montowana na głowie (miniscope)7,8,9,10,11,12,13. Konwencjonalna mikroskopia dwufotonowa oferuje imponujące korzyści, takie jak lepsza rozdzielczość, niższy poziom szumów i mniejsze fotowybielanie; Jednak zwierzęta doświadczalne muszą mieć unieruchomioną głowę, co ogranicza badania zachowania, które można przeprowadzić3,4,5,6. Z kolei system miniskopów montowany na głowie jest mały i przenośny, dzięki czemu można badać szeroką gamę testów behawioralnych przy użyciu swobodnie zachowujących się zwierząt7,8,9,10,11,12,13.

Istnieją dwa wiodące wskaźniki Ca2+, wskaźniki chemiczne5,14 i genetycznie kodowane wskaźniki wapnia (GECIs)15,16. Obrazowanie Ca2+ zostało ułatwione dzięki zastosowaniu wysoce czułych GECI dostarczanych z wektorami wirusowymi, które umożliwiają specyficzne znakowanie neuronów w docelowym obwodzie. Nieustanne wysiłki mające na celu zwiększenie czułości, długowieczności i zdolności do oznaczania nawet przedziałów subkomórkowych sprawiają, że GECI są idealne do różnych badań obrazowania wapnia in vivo17,18,19.

Rozpraszanie światła w tkance mózgowej podczas obrazowania ogranicza penetrację optyczną w głąb, nawet przy użyciu mikroskopii dwufotonowej. Jednak soczewka Gradient Index (GRIN) rozwiązuje ten problem, ponieważ soczewka GRIN może być bezpośrednio osadzona w tkankach biologicznych i przekazywać obrazy z głębokiego obszaru mózgu do obiektywu mikroskopu. W przeciwieństwie do konwencjonalnych soczewek wykonanych z optycznie jednorodnego materiału i wymagających skomplikowanej powierzchni do ustawiania ostrości i tworzenia obrazów, działanie soczewki GRIN opiera się na stopniowej zmianie współczynnika załamania światła w materiale soczewki, która osiąga ostrość z płaską powierzchnią20. Soczewka GRIN może być produkowana o średnicy do 0,2 mm. Dlatego zminiaturyzowaną soczewkę GRIN można wszczepić do głębokiego mózgu, nie powodując zbyt dużych uszkodzeń.

W tym artykule przedstawiono kompletny protokół chirurgiczny dla głębokiego obrazowania wapnia w mózgu in vivo. W celu demonstracji opisujemy operacje mózgu ukierunkowane konkretnie na przyśrodkową korę przedczołową (mPFC) mózgu myszy oraz rejestrację obrazowania wapnia in vivo za pomocą specjalnie zbudowanego systemu miniskopowego opracowanego przez grupę dr Lina w National Institute on Drug Abuse (NIDA/IRP)7,12. Procedura eksperymentalna obejmuje dwie poważne operacje mózgu. Pierwszą operacją jest stereotaktyczne wstrzyknięcie wektora wirusowego wykazującego ekspresję GCaMP6f (GECI) w mPFC. Drugą operacją jest wszczepienie soczewki GRIN w ten sam obszar mózgu. Po powrocie do zdrowia po tych operacjach mózgu, kolejną procedurą jest przymocowanie uchwytu (podstawy) miniskopu do czaszki myszy za pomocą cementu dentystycznego. In vivo (in vivo) Obrazowanie Ca2+ można wykonać w dowolnym momencie po zamontowaniu miniskopu na jego podstawie. Protokół chirurgiczny do wstrzykiwania wirusa i implantacji soczewek GRIN jest kompatybilny z dowolnymi komercyjnymi lub niestandardowymi systemami obrazowania pojedynczych i dwufotonowych do obrazowania wapnia w głębokim mózgu in vivo.

Protokół

Protokół eksperymentalny jest zgodny z wytycznymi University of Wyoming dotyczącymi opieki nad zwierzętami. Mysz użyta w tym badaniu to 6-miesięczny samiec C57BL/6J. Procedura może być stosowana do celowania w dowolne głębokie obszary mózgu w celu obrazowania wapnia in vivo. Tutaj, dla demonstracji, docelowym obszarem mózgu jest mPFC myszy (przedni i tylny (A / P): 1,94 mm, przyśrodkowy i boczny (M / L): 0,5 mm, grzbietowy i brzuszny (D / V): 1,8 mm). Protokół ten jest modyfikowany w oparciu o wcześniej opublikowany protocol21.

1. Stereotaktyczne wstrzyknięcie wirusa do mPFC (Rysunek 1)

  1. Przygotowanie do zabiegu
    1. Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne za pomocą autoklawu i umieść je na sterylnej powierzchni.
    2. Przygotuj strzykawkę o pojemności 10 μl, zalewając ją solą fizjologiczną i napełniając 5 μl soli fizjologicznej. Podłączyć strzykawkę do mikropompy (patrz Tabela Materiałów).
    3. Włącz poduszkę grzewczą i utrzymuj temperaturę na poziomie 35 °C.
  2. Umieść mysz w komorze indukcyjnej (5" x 10" x 4", długość x szerokość x wysokość) z 5% izofluranem i natężeniem przepływu tlenu 1 l/min. Uważnie obserwuj i policz częstość oddechów myszy. Wyjmij mysz, gdy jej częstość oddechów spadnie do 1 oddechu/s.
    UWAGA: Częstość oddechów myszy można łatwo monitorować, obserwując ruchy mięśni pleców w dół i w górę podczas każdego wdechu.
  3. Pozwól myszy osiąść na blacie oddzielonym od obszaru operacyjnego. Za pomocą maszynki do golenia zgol włosy od głowy myszy aż do pierwszych kręgów szyjnych.
  4. Ustaw mysz na stoliku stereotaktycznym (patrz Tabela materiałów) i zabezpiecz jej pozycję za pomocą nauszników i klipsa na nos. Utrzymać przepływ izofluranu do etapu stereotaktycznego na poziomie 1,5% izofluranu i 0,5 l/min natężenia przepływu tlenu.
  5. Nałóż nawilżającą maść okulistyczną na oba oczy za pomocą czystego bawełnianego wacika, aby zapobiec wysuszeniu oczu podczas zabiegu. Oceń odruchy pedałowania myszy, aby potwierdzić, że mysz jest w pełni znieczulona przed rozpoczęciem operacji.
  6. Zdezynfekuj obszar bez włosów 7,5% roztworem jodu powidonu (patrz tabela materiałów) i 70% etanolem trzy razy za pomocą sterylnych wacików.
  7. Wstrzyknąć niewielką objętość (50 μl) 2% lidokainy pod skórę obszaru bez włosów.
  8. Wykonaj 2 cm nacięcie przez skórę wzdłuż linii środkowej za pomocą skalpela, aby odsłonić lambdę i bregmę czaszki.
  9. Usuń powięź z czaszki za pomocą suchych wacików i spiczastych kleszczy.
  10. Po tym, jak bregma i lambda są widoczne, użyj końcówki wiertła dentystycznego (o średnicy 0.5 mm), aby zmierzyć współrzędne Z bregmy i lambdy (patrz Tabela materiałów). Wyreguluj wysokość uchwytu nosowego, aż bregma i lambda znajdą się w tej samej pozycji Z.
  11. Umieść wiertło dentystyczne 0.5 mm w pozycji A/P: 1.94 mm, M/L: 0.5 mm od bregmy. Przewiercić czaszkę.
    UWAGA: Tutaj, dla demonstracji, docelowym regionem mózgu jest mPFC myszy. Ten protokół może być używany do celowania w dowolny inny głęboki obszar mózgu. Na przykład, jeśli docelowym obszarem mózgu jest jądro półleżące (NAc), odpowiednia pozycja powinna wynosić A/P: 0,9 mm, M/L: 1,2 mm.
  12. Usuń oponę twardą za pomocą końcówki igły 30 G i wyczyść wszystkie kawałki kości za pomocą ostrych kleszczy pod kątem 45°.
    UWAGA: Krwawienie jest powszechne, ponieważ małe naczynia krwionośne mogą ulec pęknięciu podczas czyszczenia. Użyj sterylnych bawełnianych wacików, aby zatrzymać krwawienie i nałóż sól fizjologiczną, aby umyć obszar. Nałóż sól fizjologiczną na odsłonięty obszar czaszki, aby była wilgotna.
  13. Załadować wirusa do strzykawki o pojemności mikrolitrów za pomocą panelu sterowania mikropompy. Pobrać 500 nL pęcherzyków powietrza, a następnie 800 nL wirusa przy natężeniu przepływu 50 nL/s.
    UWAGA: W celu demonstracji, w tym przypadku, do mPFC wstrzykuje się serotyp 1 wirusa związanego z adenowirusem (AAV1) z ekspresją GCaMP6f (GECI), AAV1-CamKII-GCamp6f (patrz Tabela materiałów). Miano wirusa wynosi 2,8 x 1013 GC/ml. Przed wstrzyknięciem rozcieńcza się go w stosunku 1:2 w soli fizjologicznej.
  14. Umieść końcówkę igły na górze bregmy, aby dotknąć bregmy i zanotuj współrzędną Z bregmy. Przesunąć igłę nad wywiercony otwór i wstrzyknąć 100 nl wirusa, aby upewnić się, że igła nie jest zatkana.
  15. Powoli przesuwaj igłę w dół do tkanki mózgowej do docelowej współrzędnej Z D/V: 1,75 mm, a następnie lekko przesuń ją w górę do współrzędnej Z D/V: 1,65 mm.
    UWAGA: Ma to na celu stworzenie małej kieszeni do podania roztworu wirusowego. Jeśli docelowym obszarem mózgu jest NAc, odpowiednia docelowa współrzędna Z D/V powinna wynosić 4,2 mm, a następnie nieznacznie przesunąć się do 4,1 mm.
  16. Użyj panelu sterowania, aby ustawić mikropompę na wstrzykiwanie 500 nL wirusa przy natężeniu przepływu 50 nL/min. Naciśnij przycisk RUN na panelu sterowania, aby wstrzyknąć wirusa.
    UWAGA: Wstrzyknięcie trwa około 10 minut. Po zakończeniu wstrzyknięcia należy odczekać dodatkowe 5-10 minut przed wyjęciem igły z mózgu. Często stosuj sól fizjologiczną, aby utrzymać odsłonięty obszar czaszki wilgotny w okresie wstrzyknięcia.
  17. Przesuń igłę w górę i wyjmij ją z mózgu. Wstrzyknąć dwukrotnie objętość 500 nL przy natężeniu przepływu 50 nL/s.
    UWAGA: Ten krok potwierdza, że odpowiednia objętość wirusa została podana do mózgu. Podczas pierwszych wstrzyknięć o wartości 500 ml wirus jest uwalniany, a następnie pojawiają się pęcherzyki powietrza. Podczas drugiego wstrzyknięcia o wartości 500 nL najpierw pojawiają się pęcherzyki powietrza, a następnie sól fizjologiczna. Strzykawka jest teraz gotowa do załadowania wirusa dla następnej myszy. Po zakończeniu operacji mikrolitrową strzykawkę i igłę dokładnie czyści się acetonem, a następnie solą fizjologiczną.
  18. Wyrównaj krawędzie skóry i ostrożnie zamknij nacięcie szwem (rozmiar 4.0). Nałóż maść z antybiotykiem na zszyty obszar, aby zapobiec infekcji.
  19. Wyjmij mysz ze stolika stereotaktycznego i umieść ją z powrotem w klatce domowej. Umieść klatkę domową w inkubatorze o temperaturze 33 °C, aż mysz zacznie chodzić.
    UWAGA: Zwykle mysz potrzebuje 10-15 minut, aby obudzić się ze znieczulenia izofluranem, zanim zacznie się poruszać.
  20. Po tym, jak mysz zacznie się poruszać, podawaj niesteroidowe leki przeciwzapalne przez 3 dni po operacji (patrz Tabela materiałów). Pozwól myszy dojść do siebie po operacji przez 14 dni przed przystąpieniem do implantacji soczewek GRIN.

2. Implantacja soczewki GRIN w mPFC (Rysunek 1)

  1. Przygotowanie do zabiegu
    1. Przygotować sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ACSF) zawierający 124 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 1,2 mM MgCl2, 25 mM glukozy, 26 mMNaHCO3 i 2,4 mM CaCl2.
    2. Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne za pomocą autoklawu i umieść je na sterylnej powierzchni.
    3. Włącz poduszkę grzewczą i utrzymuj temperaturę na poziomie 35 °C.
    4. Rozpuść 1% agarozy i przechowuj ją w łaźni wodnej w temperaturze 42 °C do momentu użycia.
      UWAGA: Stopioną agarozę można przechowywać w łaźni wodnej przez kilka godzin.
    5. Zdezynfekuj soczewkę GRIN (1 mm średnicy, 4,38 mm długości, Rysunek 2A) w 70% etanolu przez 15 minut, przenieś ją do probówki wypełnionej solą fizjologiczną, aby ją odpowiednio wypłukać przed wszczepieniem.
      UWAGA: Soczewki GRIN (patrz Tabela Materiałów) są produkowane poprzez wymianę srebra i jonów litu w specjalnych okularach, dzięki czemu są nietoksyczne i przyjazne dla neuronów6,7. Jednak wiele dostępnych na rynku soczewek GRIN może wypłukiwać toksyczne pozostałości, powodując neurodegenerację, co czyni je nieodpowiednimi do implantacji w żywym mózgu w przypadku długoterminowych badań obrazowych in vivo. Te soczewki GRIN mogą wymagać pokrycia biokompatybilnymi środkami, takimi jak parylene-C, aby zapobiec toksycznym skutkom ubocznym na sąsiednie neurony22.
  2. Zważyć mysz i znieczulić ją przez dootrzewnowe wstrzyknięcie mieszaniny ketaminy/ksylazyny (patrz tabela materiałów) (ketamina: 100 mg/kg; Ksylazyna: 15 mg/kg).
    UWAGA: Mysz o wadze 30 g wymaga 300 μl mieszaniny ketaminy/ksylazyny (ketamina 100 mg/ml i ksylazyna 1,5 mg/ml) jako dawka początkowa i 150 μl ketaminy (10 mg/ml) dla dodatkowych dawek podczas operacji. Aby mysz pozostała w znieczuleniu podczas całego procesu chirurgicznego, dodatkowe dawki ketaminy (50 mg / kg) należy podawać co najmniej raz na godzinę. Etap znieczulenia myszy musi być często monitorowany poprzez ocenę odruchów pedałowania.
  3. Zgolić włosy w obszarze operacyjnym golarką i oczyść włosy wilgotnym ręcznikiem papierowym.
  4. Umieść mysz w stereotaktycznym stage i zabezpiecz jej pozycję, dokręcając klips na nos i nauszniki. Nałóż nawilżającą maść okulistyczną na oba oczy za pomocą sterylnego wacika. Upewnij się, że mysz jest w pełni znieczulona, oceniając odruchy pedałowania.
  5. Zdezynfekuj bezwłose miejsce 7,5% roztworem jodu powidonu i 70% etanolem trzy razy za pomocą sterylnych wacików. Należy podawać 2 mg/kg deksametazonu domięśniowo w udo, aby zmniejszyć ryzyko obrzęku i stanu zapalnego związanego z zabiegiem chirurgicznym.
  6. Wstrzyknąć 50 μl 2% lidokainy pod skórę w obszarze operacyjnym.
  7. Użyj cienkich nożyczek, aby wyciąć trójkątny obszar skóry o wymiarach 1,5 cm (wysokość) x 1,0 cm (podstawa), od przedniej strony między oczami do tylnej strony za lambdą.
  8. Usuń tkankę okostnej z czaszki za pomocą cienkich kleszczy, mikroostrzy i wacików.
    UWAGA: Czaszka powinna być dokładnie oczyszczona i wysuszona przed przystąpieniem do następnego kroku.
  9. Nałóż cyjanoakrylan (patrz Tabela materiałów) na krawędzie skóry i przymocuj skórę do czaszki. Odczekaj 5 minut, aż cyjanoakrylan wyschnie.
  10. Za pomocą końcówki z zadziorami o średnicy 0,5 mm wyrównaj bregmę i lambdę w tej samej płaszczyźnie poziomej, regulując wysokość zacisku nosowego.
  11. Umieść wiertło dentystyczne (o średnicy 1.2 mm) w pozycji A/P: 1.94 mm, M/L: 0.8 mm od bregmy. Przewiercić czaszkę. Usuń oponę twardą za pomocą końcówki igły 30 G i oczyść wszystkie kawałki kości za pomocą ostrych kleszczy pod kątem 45°.
    UWAGA: Te szczątki kości mogą blokować kolejny etap aspiracji, jeśli nie zostaną całkowicie usunięte.
  12. Przymocuj ręcznie polerowaną igłę o końcu o wadze 27 G (Rysunek 2B) do uchwytu igły połączonej z ramieniem robota nachylonym pod kątem 10° (Rysunek 2C). Podłącz drugi koniec uchwytu igły do domowego systemu próżniowego.
    UWAGA: Ramię robota (patrz Tabela Materiałów) zostało opracowane przez grupę dr Lina w NIDA/IRP i jest kontrolowane przez specjalnie opracowane, obecnie dostępne oprogramowanie, AutoStereota (https://github.com/liang-bo/AutoStereota)23
  13. Zlokalizuj końcówkę igły, aby po prostu dotknąć bregmy. Ustaw współrzędną Z bregma na 0, klikając przycisk Bregma w AutoStereota.
  14. Ustaw wartość wejściową X na 0,8, wartość wejściową Y na 1,94, wartość wejściową Z na 1,0, a następnie kliknij przycisk Znajdź, aby przesunąć igłę na wierzch wywierconego otworu w czaszce.
  15. Dostosuj położenie igły do środka odsłoniętego obszaru tkanki mózgowej za pomocą AutoStereota.
    UWAGA: Aby przesunąć igłę w kierunku bocznym lub środkowym, wprowadź wartość Step i kliknij przycisk Lateral lub Medial w AutoStereota. Podobnie, aby przesunąć igłę w kierunku przednim lub tylnym i grzbietowym lub brzusznym, kliknij odpowiednio przyciski rostralne lub ogonowe i grzbietowe lub brzuszne.
  16. Włącz odkurzacz i rozpocznij płukanie odsłoniętego obszaru mózgu za pomocą ACSF przez sterowany grawitacyjnie system rurek (patrz Tabela materiałów) podłączony do igły 30 G z wygiętą końcówką. ACSF jest w sposób ciągły bąbelkowany mieszaniną gazów 95%O2 i 5% CO2 i filtrowany przez filtr 0,2 μm.
    UWAGA: Natężenie przepływu ACSF wynosi ~ 1,5 ml/min. Ciśnienie wyjściowe mieszaniny gazów jest utrzymywane na poziomie ~3 psi.
  17. Odsysanie tkanki mózgowej warstwa po warstwie za pomocą oprogramowania AutoStereota (Rysunek 3).
    UWAGA: Aspiracja tkanki mózgowej jest zakończona w 4 rundach, tak aby powstała kieszeń kolumnowa (1,8 mm głębokości i 1 mm średnicy).
    1. W sesji "zStep" kliknij i zaznacz pierwszy i drugi wiersz. Ustaw wartości w pierwszym wierszu na 0,2 i 1. Ustaw wartości dla drugiego wiersza na 0,15 i 4 (Rysunek 3A).
    2. W sesji "Mode" ustaw rozmiar igły 27 Gauge i 1.2, ustaw Dims 0.9. Wszystkie inne wartości używają wartości domyślnych (Rysunek 3A).
    3. Kliknij kolejno przyciski Set, Keep Zero i Start, aby rozpocząć aspirację.
      UWAGA: To jest1 runda aspiracji. Wartości wejściowe wskazują, że głębokość aspiracji wynosi 0,2 mm (od współrzędnej Z 0) podczas pierwszego kroku z 1 warstwą; W drugim etapie głębokość aspiracji wynosi 0,15 mm, powtarzana w sposób ciągły przez 4 warstwy. Rozdzielczość aspiracji wynosi 1,2, a średnica 0,9 mm. Podczas aspiracji natychmiastowa lokalizacja końcówki igły może być monitorowana za pomocą panelu wykresu ścieżki. Po zakończeniu tej rundy aspiracyjnej generowana jest kieszeń kolumnowa o głębokości 0,8 mm i średnicy 1 mm. Końcówka igły powróci do środka ze współrzędną Z równą 0.
    4. W sesji "zStep" kliknij i zaznacz pierwszy i drugi wiersz. Ustaw wartości w pierwszym wierszu na 1 i 1. Ustaw wartości dla drugiego wiersza na 0,15 i 4 (Rysunek 3B).
    5. W sesji "Mode" wszystkie wartości powinny być takie same jak w poprzedniej rundzie (Rysunek 3B).
    6. Kliknij kolejno przyciski Set, Keep Zero i Start, aby rozpocząć aspirację.
      UWAGA: To jest2 runda aspiracji. Wartości wejściowe wskazują, że głębokość aspiracji wynosi 1 mm (od współrzędnej Z równej 0) podczas pierwszego etapu z 1 warstwą; W drugim etapie głębokość aspiracji wynosi 0,15 mm, powtarzana w sposób ciągły przez 4 warstwy. Po zakończeniu tej rundy zasysającej generowana jest kieszeń kolumny o głębokości 1,6 mm i średnicy 1 mm.
    7. W sesji "zStep" kliknij i zaznacz tylko pierwszy wiersz. Ustaw wartości dla pierwszego wiersza na 1,8 i 1 (Rysunek 3C).
    8. W sesji "Mode" ustaw rozmiar igły 27 Gauge i 2.2. Wszystkie inne wartości pozostają takie same jak w poprzedniej rundzie (Rysunek 3C).
    9. Kliknij kolejno przyciski Set, Keep Zero i Start, aby rozpocząć aspirację.
      UWAGA: To jest3 runda aspiracji. Wartości wejściowe wskazują, że głębokość aspiracji wynosi 1,8 mm (ze współrzędnej Z 0) przy 1 warstwie. Rozdzielczość aspiracji wynosi 2,2. Po zakończeniu tej rundy aspiracyjnej generowana jest kieszeń kolumny o głębokości 1,8 mm i średnicy 1 mm.
    10. W sesji "zStep" kliknij i zaznacz tylko pierwszy wiersz. Ustaw wartości dla pierwszego wiersza na 1,6 i 1 (Rysunek 3D).
    11. W sesji "Mode" ustaw rozmiar igły 27 Gauge i 2.2, ustaw Dims 0.6 (Rysunek 3D).
    12. Kliknij kolejno przyciski Set, Keep Zero i Start, aby rozpocząć aspirację.
      UWAGA: To jest4 runda aspiracji. Celem tego kroku jest oczyszczenie krwi nagromadzonej w kieszeni. Krwawienie jest powszechne, ponieważ małe naczynia krwionośne pękają podczas procesu aspiracji. Aby dokładnie usunąć krew, przerwij nawadnianie ACSF na 5 minut, a następnie ponownie włącz irygację. Powtórz4 rundę aspiracji wiele razy, aż kieszeń będzie wolna od krwi. Protokół ten może być używany do celowania w dowolne inne głębokie obszary mózgu. Na przykład, jeśli docelowym obszarem mózgu jest NAc, końcowa odpowiednia współrzędna Z D/V powinna wynosić 4,4 mm.
  18. Zatrzymaj podciśnienie i nawadnianie ACSF. Ustawić igłę na współrzędnej Z +2 mm i 0,5 mm przed środkiem narządu. Umieść sterylną soczewkę GRIN 1 mm w kieszeni.
  19. Utrzymuj końcówkę igły w kontakcie z naświetloną soczewką GRIN, aby upewnić się, że soczewka GRIN jest osadzona pod kątem 10°. Delikatnie dociśnij górną powierzchnię soczewki GRIN sterylną miękką bibułką, aby upewnić się, że dolna powierzchnia soczewki GRIN styka się z tkanką mózgową.
  20. Nałóż stopioną agarozę w szczelinę między soczewką GRIN a tkanką mózgową za pomocą szpatułki. Po tym, jak agaroza utworzy żel, usuń nadmiar agarozy za pomocą mikroostrza.
  21. Dokładnie oczyść czaszkę solą fizjologiczną i wacikami. Pozostaw czaszkę do wyschnięcia przed kolejnym nałożeniem cementu dentystycznego (patrz Tabela materiałów).
  22. Wyjmij dobrze mieszanie z zamrażarki -20 °C. Wymieszaj proszek cementu dentystycznego i płyn katalizatora i nałóż warstwę samoutwardzalnego cementu z żywicy adhezyjnej na czaszkę; najpierw otocz soczewkę GRIN, a następnie zakryj całą odsłoniętą czaszkę.
  23. Odczekaj 5 minut i pozwól mu całkowicie stwardnieć. Ostrożnie wyjąć igłę do aspiracji.
  24. W czystej plastikowej studzience wymieszaj sproszkowany cement dentystyczny, węgiel drzewny z płynem i nałóż cienką warstwę mieszanki na 1. warstwę cementu dentystycznego. Odczekaj 5 minut, aby stwardniał.
  25. Chroń odsłoniętą soczewkę GRIN, zakrywając ją niestandardową nasadką wykonaną z probówki PCR (Rysunek 2D). Zastosuj cyjanoakrylan, aby przymocować nasadkę do cementu dentystycznego.
  26. Wstrzyknąć podskórnie 1 ml podskórnie podgrzanej soli fizjologicznej, a następnie 0,1 mg/kg buprenorfiny. Umieść mysz z powrotem w klatce domowej. Umieść klatkę domową w inkubatorze o temperaturze 33 °C i monitoruj mysz do momentu, gdy zacznie chodzić. Zwykle mysz potrzebuje 20-40 minut, aby obudzić się ze znieczulenia, zanim zacznie się poruszać.
  27. Podawaj niesteroidowe leki przeciwzapalne i monitoruj mysz przez co najmniej 3 dni po operacji. Pozwól myszy dojść do siebie po operacji przez 30 dni.

3. Mocowanie uchwytu miniskopu (podstawy) do czaszki myszy (Rysunek 1)

  1. Znieczulij mysz w komorze indukcyjnej z 5% izofluranem i natężeniem przepływu tlenu 1 l/min, aż częstość oddechów spadnie do 1 oddechu/s.
  2. Umieść mysz w stereotaktycznym stage i zabezpiecz jej pozycję za pomocą nauszników i klipsów na nos. Utrzymuj ciągły przepływ izofluranu (1,5%) i tlenu (0,5 l/min).
  3. Nałóż maść okulistyczną na oczy, aby były wilgotne. Włącz poduszkę grzewczą i utrzymuj temperaturę na poziomie 35 °C. Upewnij się, że mysz jest w pełni znieczulona, oceniając odruchy pedałowania.
  4. Delikatnie zdejmij nasadkę zakrywającą soczewkę GRIN za pomocą spiczastych kleszczy. Całkowicie odwiercić wysuszone pozostałości cyjanoakrylanu z cementu dentystycznego za pomocą mikrowiertła (patrz Tabela materiałów).
  5. Przytnij włosy wokół obszaru cementu dentystycznego małymi nożyczkami. Usuń zanieczyszczenia za pomocą miotełki do kurzu na sprężone powietrze. Użyj bawełnianego wacika nasączonego acetonem, aby wyczyścić górną powierzchnię soczewki GRIN.
  6. Przygotuj miniskop wraz z uchwytem (podstawą).
    1. Umieść nakrętkę sześciokątną #00-90 (patrz Tabela materiałów) w szczelinie znajdującej się w podstawie i nałóż cyjanoakryl, aby ją tam zabezpieczyć (Rysunek 2E).
    2. Przyłóż taśmę politetrafluoroetylenową (PTFE) ciasno wokół gwintu miniskopu i odetnij dodatkową taśmę (Rysunek 2F).
    3. Przymocuj miniskop do podstawy i użyj blokującej, aby przymocować miniskop do podstawy (Rysunek 2G).
    4. Podłącz miniskop do i włącz specjalnie opracowane, obecnie ogólnodostępne oprogramowanie NeuView (patrz tabela materiałów).
      UWAGA: Oprogramowanie NeuView zostało opracowane specjalnie do obrazowania wapnia in vivo w miniskopie przez grupę dr Lin w NIDA/IRP7,12. Jest to otwarty dostęp (https://github.com/giovannibarbera/miniscope_v1.0).
    5. W NeuView kliknij Sprzęt, zaznacz LED1 i kliknij przycisk Strumień, aby wyświetlić obrazy na żywo (Rysunek 4A). Aby zatrzymać transmisję na żywo, kliknij przycisk Zatrzymaj.
    6. Umieść miniskop w specjalnie zbudowanym ramieniu trzymającym miniskop (Rysunek 2H), którego pozycją XYZ można manipulować za pomocą zmotoryzowanych kontrolerów (Rysunek 2I).
  7. Umieść miniskop tuż nad naświetloną soczewką GRIN i ustaw go równolegle do powierzchni soczewki. Powoli opuść miniskop w kierunku obiektywu GRIN i dostosuj jego pozycję Z, aż zostanie znaleziona najlepsza płaszczyzna ostrości.
    UWAGA: Najlepszą płaszczyznę ogniskowej określa się poprzez porównanie kilku możliwych pozycji Z i wybranie płaszczyzny ogniskowej z wyraźną wizualizacją większości ciał komórek.
  8. Ostrożnie nałóż pierwszą warstwę cementu dentystycznego wokół podstawy miniskopu, nie zmieniając położenia miniskopu. Po stwardnieniu cementu delikatnie zdejmij ramię przytrzymujące, tak aby miniskop mógł samodzielnie stanąć na główce myszy.
    UWAGA: Cement dentystyczny ma tendencję do kurczenia się po stwardnieniu i będzie ciągnął miniskop w dół od pierwotnej płaszczyzny ostrości. Zazwyczaj pozycja Z miniskopu jest nieznacznie uniesiona ponad pierwotną płaszczyznę ogniskowej przed nałożeniem cementu dentystycznego w celu skompensowania potencjalnej zmiany.
  9. Nałóż drugą warstwę cementu dentystycznego wokół podstawy, aby wypełnić wszystkie szczeliny i upewnić się, że nie ma wycieku światła LED ze szczelin. Pozwól cementowi dentystycznemu stwardnieć.
  10. Usuń mysz ze sceny stereotaktycznej. Poluzuj blokującą i odłącz miniskop od podstawy. Umieść wydrukowaną w 3D nasadkę ochronną do podstawy, aby chronić odsłoniętą soczewkę GRIN i dokręć blokującą w podstawie (Rysunek 2J).
  11. Umieść mysz z powrotem w klatce domowej.
    UWAGA: Zwykle mysz potrzebuje 10-15 minut, aby obudzić się ze znieczulenia izofluranem, zanim zacznie się poruszać.

4. Montaż miniskopu i obrazowanie in vivo Ca2+ (Rysunek 1)

  1. Zamontuj miniskop na podstawie
    1. Znieczulij mysz na krótko w komorze indukcyjnej (5% izofluranu i natężenie przepływu tlenu 1 l/min). Umieść mysz na czystej powierzchni ławki.
    2. Poluzuj blokującą małym śrubokrętem, zdejmij nasadkę ochronną i wyczyść powierzchnię soczewki GRIN wacikiem nasączonym acetonem.
    3. Owiń szczelnie gwint miniskopu taśmą PTFE i przymocuj miniskop do podstawy na główce myszy.
    4. Podłącz miniskop do (Rysunek 2K), włącz oprogramowanie NeuView.
    5. W NeuView kliknij Sprzęt, zaznacz LED1 i kliknij przycisk Strumień, aby wyświetlić obrazy na żywo (Rysunek 4A).
    6. Zidentyfikuj najlepszą płaszczyznę ogniskowej, regulując położenie miniskopu względem podstawy, lekko dokręcając lub poluzowując za pomocą kleszczy.
      UWAGA: Najlepszą płaszczyznę ogniskowej określa się poprzez porównanie kilku możliwych lokalizacji i wybranie tej z wyraźną wizualizacją większości ciał komórek.
    7. Dokręć blokującą i umieść mysz z powrotem w klatce domowej.
    8. W NeuView dostosuj moc światła LED do optymalnego poziomu. Kliknij przyciski Przechwyć, a następnie Wyzwalaj, aby rozpocząć nagrywanie i naciśnij Stop po 150 klatkach.
      UWAGA: Najniższa możliwa moc określa optymalny poziom mocy diody LED w celu uzyskania wystarczająco jasnego obrazu. Celem nagrania krótkiego filmu jest ułatwienie identyfikacji tej samej płaszczyzny ogniskowej w przyszłości w celu powtarzalnego obrazowania.
    9. Odłącz od miniskopu. Pozwól myszy dojść do siebie przez co najmniej 30 minut przed rozpoczęciem eksperymentu.
      UWAGA: Aby chronić miniskop, zazwyczaj w tym krótkim czasie wyjmuje się butelkę z wodą i druciany podajnik żywności. Jeśli mysz musi pozostać w klatce domowej przez dłuższy czas, zaleca się zaopatrzenie się w dostępny w handlu żel dietetyczny (patrz Tabela materiałów) w klatce domowej.
  2. Pozyskiwanie danych do obrazowania wapnia in vivo
    UWAGA: Obrazowanie wapnia in vivo może być przeprowadzane jednocześnie wraz z dowolnymi testami zachowania, których życzy sobie badacz. W celach demonstracyjnych posłużono się obrazowaniem Ca2+ in vivo podczas badania w terenie otwartym. Aby osiągnąć ten cel, potrzebne są dwa komputery. Jeden komputer jest wyposażony w komercyjne oprogramowanie (patrz Spis materiałów) do sterowania kamerą w celu automatycznego rejestrowania zachowania myszy. Drugi komputer jest wyposażony w NeuView do sterowania miniskopem i rejestrowania obrazów Ca2+.
    1. Włącz oprogramowanie kamery behawioralnej (patrz Spis materiałów), aby wyświetlić arenę zachowania myszy za pomocą funkcji transmisji na żywo. Ręcznie wyreguluj ostrość górnego aparatu (Rysunek 2L).
    2. Wybierz Trigger/Strobe i zaznacz "Włącz/wyłącz wyzwalacz" (Rysunek 4B). Kliknij przycisk Nagraj, użyj Przeglądaj, aby wybrać lokalizację, w której zostaną zapisane nagrania zachowań, wybierz żądany format obrazu.
      UWAGA: Funkcja "Trigger Control" jest włączona, aby umożliwić wyzwalanie rejestracji zachowania przez oprogramowanie NeuView, tak aby ramki zachowania i odpowiadające im ramki obrazowania wapnia były czasowo sprzężone ze sobą. Nagranie zachowania można zapisać w dowolnym formacie. Zapis zachowania jest zazwyczaj zapisywany w formacie JPEG w wyznaczonym folderze.
    3. Zbliż mysz do areny i podłącz miniskop do podłączonego do Systemu Akwizycji Danych (Rysunek 2L) (patrz Tabela Materiałów). Mysz jest następnie umieszczana na środku areny.
    4. Dzięki funkcji Livestream w oprogramowaniu NeuView dostosuj moc diody LED, aby zoptymalizować jasność obrazu wapniowego.
      UWAGA: W przypadku obrazowania wapniowego szybkość nagrywania wynosi domyślnie 10 klatek/s.
    5. W NeuView odznacz LED1, kliknij przyciski Przechwyć, a następnie Wyzwalaj, aby rozpocząć nagrywanie, i naciśnij Stop po 100 klatkach.
      UWAGA: Ma to na celu nagrywanie obrazów tła przez około 100 klatek przy wyłączonym świetle LED.
    6. W oprogramowaniu kamery behawioralnej kliknij przycisk Rozpocznij nagrywanie (Rysunek 4C). W NeuView sprawdź LED1, kliknij Capture, a następnie Trigger przyciski, aby rozpocząć nagrywanie. Naciśnij Stop po 3000 klatek.
      UWAGA: Ma to na celu jednoczesne rejestrowanie obrazowania i zachowania wapnia. Test w terenie otwartym trwa 15 minut, zwykle jest podzielony na trzy sesje nagraniowe po 5 minut, z których każda trwa 5 minut. Ma to na celu zapobieżenie przegrzaniu miniskopu w wyniku ciągłego użytkowania.
    7. Zapisz zarówno obrazowanie wapnia, jak i nagrania zachowania w wyznaczonych folderach. Powtórz nagrywanie przez dwie kolejne sesje, nagrywając tło przed każdą sesją i zapisz wszystkie nagrania w wyznaczonym folderze.
  3. Odłącz miniskop od podstawy.
    1. Po zakończeniu nagrywania odłącz od miniskopu.
    2. Znieczulij mysz na krótko w komorze indukcyjnej (5% izofluranu i 1 l/min natężenia przepływu tlenu). Umieść mysz na czystej, ciepłej powierzchni.
  4. Odkręć blokującą w podstawie i odłącz miniskop od podstawy. Załóż z powrotem nasadkę ochronną na podstawę i dokręć blokującą. Umieść mysz z powrotem w klatce domowej.

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia schematyczną procedurę eksperymentalną, obejmującą iniekcję wirusa, implantację soczewki GRIN, mocowanie podstawy miniskopu do czaszki myszy oraz in vivo obrazowanie poziomu wapnia poprzez miniskop. Cała procedura trwa około 2 miesięcy. Rycina 2 przedstawia główne komponenty opisane w protokole dla miniskopu in vivo obrazowanie wapnia Rysunek 3 prezentuje interfejsy oprogramowania AutoStereota podczas implantacji soczewki GRIN. Rysunek 4 prezentuje interfejsy programu NeuView oraz oprogramowania do rejestracji zachowań podczas in vivo obrazowanie wapnia

Wynik obrazowania wapnia in vivo zależy od powodzenia zarówno operacji wstrzyknięcia wirusa, jak i implantacji soczewki GRIN. Rysunek 5 przedstawia zakres wyników (tj. niepowodzenia, wyników suboptymalnych i dobrych) z rejestracji obrazowania wapnia in vivo. W przypadkach niepowodzeń obraz wapnia może być ciemny lub jasny, ale zazwyczaj nie wykazuje żadnych lub bardzo niewielu aktywnych neuronów. Zazwyczaj nie kontynuujemy eksperymentów z rejestracją wapnia in vivo, jeśli liczba aktywnych neuronów jest mniejsza niż pięć. Dobre obrazowanie wapnia in vivo zazwyczaj ujawnia kilkaset aktywnych neuronów. Jeśli rejestracja obejmuje mniej niż sto aktywnych neuronów, uznajemy ją za suboptymalną.

W przypadku zarówno suboptimalnych, jak i dobrych nagrań przeprowadzono eksperymenty obrazowania wapnia in vivo, a następnie wykonano analizę danych. Film 1 przedstawia reprezentatywne nagranie z obrazowania wapnia in vivo z obszaru mPFC myszy. Nagrania behawioralne oraz dane z obrazowania wapnia są zazwyczaj przetwarzane oddzielnie. Filmy przedstawiające zachowanie myszy mogą być oceniane ręcznie. Pliki z obrazowania wapnia są przetwarzane przy użyciu zestawu narzędzi do przetwarzania obrazów wapnia CaImAn24. Rysunek 6 przedstawia reprezentatywną mapę komórek oraz kilka przebiegów stężeń wapnia z dobrego nagrania z obrazowania wapnia in vivo .

Po zakończeniu obrazowania wapnia in vivo, ostatnim krokiem jest potwierdzenie, czy wstrzyknięcie wirusa oraz implantacja soczewki GRIN odbyły się w pożądanym obszarze mózgu. W tym celu mysz poddano perfuzji solą fizjologiczną w buforze fosforanowym (PBS), a następnie 4% paraformaldehydem (PFA). Mózg myszy został pobrany, utrwalony dodatkowo w 4% PFA przez 12 h i przechowywany w PBS w temperaturze 4 °C. Następnie mózg myszy pocięto na plastry o grubości 50 µm przy użyciu wibrotomu. Przekroje mózgu barwiono DAPI i obserwowano pod mikroskopem (nieopisane w protokole)12. Rysunek 7 przedstawia przekrój mózgu myszy eksperymentalnej z poziomu ok. 1,94 mm przed bregma, ukazujący tor implantacji soczewki GRIN. Obszar zielonej fluorescencji pod i wokół toru soczewki GRIN wskazuje na ekspresję GCaMP6f w obszarze mPFC.

Schemat wstrzykiwania stereotaktycznego, ekspresji GCaMP6f, implantacji soczewki GRIN oraz obrazowania Ca²⁺ in vivo.
Rysunek 1: Schematyczny przegląd procedury eksperymentalnej. (A) Stereotaktyczne wstrzyknięcie wirusa do mPFC. (B) Implantacja soczewki GRIN w mPFC. (C) Mocowanie podstawy miniskopu do czaszki myszy. (D) Montaż miniskopu i obrazowanie wapnia in vivo. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Układ spektroskopowy z komponentami wzbudzenia optycznego i sprzętem analitycznym do badań emisji.
Rycina 2: Główne komponenty niezbędne do obrazowania wapnia in vivo. (A) Soczewka GRIN o średnicy 1 mm i długości 4,38 mm. (B) Ręcznie polerowana igła tępokutna 27 G używana do aspiracji tkanki mózgowej. (C) Ramię robotyczne połączone z uchwytem igły. (D) Specjalnie wykonany korek z probówki PCR służący do ochrony odsłoniętej soczewki GRIN do momentu przymocowania podstawy miniskopu do czaszki myszy. (E) Uchwyt (podstawa) miniskopu z nakrętką sześciokątną. (F) Miniskop, którego część gwintowana jest owinięta taśmą PTFE. (G) Miniskop przymocowany do podstawy za pomocą śruby blokującej. (H) Ramię podtrzymujące miniskop. (I) Specjalnie zbudowany 3D sterownik zmotoryzowany ułatwiający przemieszczanie miniskopu w pozycjach XYZ. (J) Kapturek ochronny przymocowany do podstawy, chroniący odsłoniętą soczewkę GRIN w czasie, gdy mysz nie poddawana jest obrazowaniu wapnia in vivo. (K) Miniskop podłączony do kabla. (L) System akwizycji danych do obrazowania Ca2+ in vivo. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Interfejs parametrów optymalizacji; symulacja komputerowa; zmienne procesowe; diagram; analiza danych.
Rysunek 3: Interfejsy oprogramowania AutoStereota podczas warstwowej aspiracji tkanki mózgowej. (A) Interfejs odpowiadający krokom 2.17.1 do 2.17.3. (B) Interfejs odpowiadający krokom 2.17.4 do 2.17.6. (C) Interfejs odpowiadający krokom 2.17.7 do 2.17.9. (D) Interfejs odpowiadający krokom 2.17.10 do 2.17.12. Czerwone ramki wyróżniają wartości wejściowe. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Pomiar wzbudzenia optycznego, obraz mikroskopowy w interfejsie oprogramowania, układ absorpcji przejściowej.
Rysunek 4: Interfejsy oprogramowania NeuView oraz oprogramowania do rejestracji zachowań podczas obrazowania wapnia in vivo. (A) Interfejs programu NeuView. (B,C) Interfejsy oprogramowania do rejestracji zachowań. Czerwone ramki wyróżniają przyciski, które należy kliknąć. Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Seria obrazów mikroskopowych z analizy struktury komórek; obejmuje porównanie w jasnym polu oraz szczegóły spektralne.
Rycina 5: Mapy fluorescencyjne komórek z maksymalną projekcją obrazu, pokazujące zakres możliwych wyników. (A,B) Nieudane obrazowanie wapnia in vivo, które nie nadaje się do późniejszej analizy danych. (A) obraz ciemny, zawierający mniej niż 5 aktywnych neuronów. (B) obraz jasny, ale pozbawiony aktywnych neuronów. (C) Mapa komórek z suboptimalnego obrazowania wapnia in vivo, zawierająca niektóre aktywne neurony. (D) Mapa komórek z dobrego obrazowania wapnia in vivo, obejmująca kilkaset aktywnych neuronów. Pasek skali: 100 μm. Kalkuluj tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Wizualizacja aktywności neuronów, obraz z mikroskopii fluorescencyjnej i ślady sygnału wapniowego do analizy danych.
Rysunek 6: Reprezentatywna mapa komórek i przejściowe zmiany stężenia wapnia z udanego obrazowania wapniowego in vivo. Panel lewy przedstawia mapę fluorescencyjną komórek (maksymalna projekcja) z rejestracji obrazowania wapniowego in vivo w mPFC podczas testu otwartego pola. Rejestracja trwa 5 min. Panel prawy pokazuje przejściowe zmiany stężenia wapnia z 15 obszarów zainteresowania (dopasowane kolorystycznie). Pasek skali: 100 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Przekrój mózgu z torbacją soczewki GRIN, obrazowanie fluorescencyjne, kora przedczołowa, schemat badania optycznego.
Rysunek 7: Ocena pośmiertna myszy eksperymentalnej. Ocena pośmiertna ekspresji GCaMP6f oraz implantacji soczewki GRIN w mPFC myszy eksperymentalnej. Prostokątny obszar wskazuje tor implantacji soczewki GRIN. Zielony obszar poniżej miejsca implantacji soczewki GRIN potwierdza ekspresję GCaMP6f oraz precyzyjną implantację soczewki GRIN w pożądanym regionie mózgu. Cg, kora obręczy; PrL, kora przedlimbiczna; IL, kora podlimbiczna. Pasek skali: 400 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Porównanie systemu miniskopu zbudowanego na zamówienie w NIDA z innymi systemami miniskopów 7,8,9,10,11,13,25,26. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Film 1: in vivo obrazowanie wapnia w mPFC myszy podczas testu otwartego pola. W celach demonstracyjnych w tym filmie przedstawiono jedynie 1 min nagrania. Pierwotna częstotliwość odświeżania klatek nagrania wynosi 10 frames/s. Prędkość odtwarzania filmu jest 6-krotnie większa niż w oryginalnym nagraniu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Dyskusja

Centralnym pytaniem w neurobiologii jest zrozumienie, w jaki sposób dynamika i obwody neuronalne kodują i przechowują informacje oraz jak są zmieniane w chorobach mózgu. Za pomocą miniskopowego systemu obrazowania Ca2+ in vivo, można jednocześnie monitorować aktywność neuronalną z kilkuset neuronów w lokalnym mikroukładzie z poziomu swobodnie zachowującego się zwierzęcia. W tym miejscu opisano szczegółowy protokół chirurgiczny dotyczący iniekcji wirusa i implantacji soczewek GRIN w celu przygotowania gryzoni do głębokiego obrazowania mózgu in vivo Ca 2+ za pomocą specjalnie opracowanego systemu rejestracji miniskopu. Tabela 1 przedstawia porównanie naszego systemu miniskopowego z innymi dostępnymi na rynku i wykonanymi na zamówienie systemami miniskopowymi 7,8,9,10,11,13,25,26. Warto zauważyć, że implantacja soczewki GRIN przy użyciu obecnego protokołu chirurgicznego jest kompatybilna z dowolnymi komercyjnymi lub niestandardowymi systemami obrazowania pojedynczych i dwufotonowych w celu głębokiego obrazowania mózgu in vivo wapnia.

Od wstrzyknięcia wirusa do pozyskania danych za pomocą miniskopowego obrazowania wapnia in vivo , cała procedura eksperymentalna trwa co najmniej 2 miesiące. Jest to skomplikowany i pracochłonny proces. Ostateczny sukces eksperymentu zależy od wielu czynników, w tym właściwego doboru GECI, dokładnego wstrzyknięcia wirusa w docelowy obszar mózgu, wystarczającej ekspresji wirusa w pożądanej populacji neuronalnej, implantacji soczewki GRIN dokładnie w pożądanym miejscu, odpowiedniej rekonwalescencji po operacjach, a także od tego, czy po operacji wystąpi ciężki stan zapalny i czy operacje poważnie wpływają na zachowanie zwierzęcia, i tak dalej.

Dwa krytyczne etapy obejmują stereotaktyczne wstrzyknięcie wirusa i implantację soczewki GRIN. W celu demonstracyjnym przeprowadzono stereotaktyczną mikroiniekcję w mysim mPFC, z wirusem związanym z adenowirusem (AAV1) kodującym GCaMP6f pod kontrolą promotora CaMKII, który selektywnie znakuje neurony piramidowe w mPFC. Wybrano GCaMP6f, ponieważ jest to jeden z najszybszych i najbardziej czułych wskaźników wapnia o czasie połowicznego rozpadu wynoszącym 71 ms15. Ponadto ekspresja wirusa AAV GCaMP6f jest długotrwała (tj. kilka miesięcy), co czyni ją idealną do wykonywania powtarzalnych obrazowań Ca2 + in vivo przez długi czas w badaniach podłużnych na mysich modelach chorób neurodegeneracyjnych27. Obecny protokół chirurgiczny można dostosować do celowania w różne populacje komórek w dowolnym innym regionie mózgu. Różne dostępne narzędzia wirusowe umożliwiają selektywne znakowanie określonych populacji neuronów w pożądanym regionie mózgu w pożądanym wieku. Ponadto naukowcy mogą wykorzystać system rekombinacji Cre-LoxP i różne dostępne modele myszy transgenicznych do przeprowadzania modyfikacji genetycznych i badania wyników behawioralnych i obwodów neuronalnych28,29.

Unikalną cechą prezentowanego protokołu jest to, że przed implantacją soczewki GRIN (o średnicy 1 mm) wykonano automatyczną aspirację tkanki mózgowej warstwa po warstwie. Osiąga się to za pomocą igły o sile 27 G podłączonej do systemu próżniowego, sterowanej przez specjalnie skonstruowane ramię robota i oprogramowanie23. Opierając się na naszym doświadczeniu, metoda ta generuje jednolitą powierzchnię, z którą soczewka GRIN może się zetknąć i powoduje mniejsze uszkodzenia sąsiedniej tkanki niż ręczna aspiracja tkanek23. Z tego powodu zabieg ten przynosi oczywistą zaletę w przypadku soczewek GRIN o stosunkowo większej średnicy (np. 1 mm). Jednak aspiracja tkanek może nie być konieczna do wszczepienia soczewki GRIN o mniejszej średnicy (0,5 mm lub 0,25 mm). Zamiast tego można go sadzić bezpośrednio wzdłuż toru prowadzącego wykonanego za pomocą igły 30 G21.

Oprócz dwóch krytycznych kroków omówionych powyżej, wiele innych czynników musi być dokładnie rozważonych, aby operacja zakończyła się sukcesem. (1) Wszystkie narzędzia, które mają kontakt z mózgiem, powinny być wysterylizowane, aby zapobiec infekcji. (2) Wszystkie kroki chirurgiczne muszą być wykonane, aby zminimalizować uszkodzenia mózgu, aby zapobiec dalszemu zapaleniu i nadmiernemu tworzeniu się tkanki bliznowatej. (3) Należy dokładnie rozważyć dawki znieczulenia podawane początkowo i utrzymywane podczas zabiegu, zwłaszcza te podawane dootrzewnowo. Dawki znieczulenia mogą być modyfikowane w zależności od różnych szczepów myszy, ponieważ niektóre mogą być bardziej wrażliwe. (4) Stan myszy musi być stale monitorowany podczas operacji. Wreszcie, (5) myszy muszą być regularnie monitorowane po operacji, ponieważ po operacji może wystąpić wiele powikłań.

Chociaż fragment tkanki mózgowej jest usuwany jednostronnie podczas etapu implantacji soczewki GRIN, nie zaobserwowaliśmy żadnych oczywistych deficytów zachowania 7,12. Waga miniskopu wynosi około 2 gramów, a kabel został specjalnie zaprojektowany, aby był lekki i aby mysz mogła go łatwo przenosić. Miniskop i kabel są mocowane do zwierzęcia tylko przed obrazowaniem in vivo i odłączane po obrazowaniu. Cały proces obrazowania trwa zwykle nie dłużej niż 30 minut. Dlatego te oprzyrządowanie nie przeszkadza myszy w swobodnym zachowywaniu się. Etapy instalacji i deinstalacji miniskopu wymagają krótkiego znieczulenia (mniej niż 2 minuty) izofluranem w celu unieruchomienia zwierząt. Zazwyczaj pozwalamy myszy dojść do siebie po krótkiej ekspozycji na izofluran przez 30 minut przed wykonaniem obrazowania in vivo. Wykonywaliśmy miniskopowe obrazowanie wapnia in vivo raz w tygodniu przez kilka tygodni, nie zauważając żadnego wpływu na zdrowie myszy i zachowania społeczne myszy12.

Jednym z głównych ograniczeń obecnego systemu rejestracji miniskopowej jest konieczność podłączenia mikroskopu do kabla w celu akwizycji danych. Obecność kabla czasami ogranicza wydajność zadania myszy i ogranicza nagrywanie jednego zwierzęcia na raz. Ostatnio opracowano miniskop bezprzewodowy25,26. Zwiększy to wydajność zadań i umożliwi jednoczesne obrazowanie in vivo wielu zwierząt w grupie. Co więcej, opracowanie bardziej czułych GECI o spektralnie rozdzielalnych długościach fal w połączeniu z dwukolorowym miniskopem stworzy bardziej ekscytujące możliwości dla badań neurobiologicznych.

Oświadczenia

Autorzy nie informują o żadnych sprzecznych interesach finansowych.

Podziękowania

Ta praca jest wspierana przez granty z National Institute of Health (NIH) 5P20GM121310, R61NS115161, and UG3NS115608.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Frezy 0,6 mm i 1,2 mmTechnologia KF8000037800Do kraniotomii
Igła 27-G i 30-GBD Igła PrecisionGlideREF 305109 i REF305106Do obu operacji
45 kleszczy kątowychNarzędzia Fine Science11251-35Do operacji
7,5% roztwór jodu powidonu (Betadine)Purdue Products L.P.NDC 67618-151-17Płyn do dezynfekcji powierzchni
AcetonSigma-Aldrich179124-1LGRIN środek do czyszczenia soczewek
AgarozaSigma-AldrichA9539-25GDo implantacji soczewek GRIN
Maść antybiotykowaHeliDerm Technology81073087Do wstrzykiwań wirusów
Lek przeciwzapalny (Ibuprofen)Johnson & Johnson Consumer Inc30043308Działa jako środek przeciwbólowy po operacjach
AutoStereotaNIDA/IRPgithub.com/liang-bo/autostereotaDo implantacji soczewek GRIN
Oprogramowanie do kodowania zachowań (Point Grey FlyCap2)Point GreyPoint Grey Research Blackfly BFLY-PGE-12A2CDo nagrywania zachowania
Mosiężna nakrętka sześciokątnaMcMASTER-CARR92736A112Do implantacji soczewek GRIN
BuprenorfinaPar PharmaceuticalsNDC 4202317905Do implantacji soczewek GRIN
Chlorek wapniaSigma10043-52-4Do przygotowania komutatora CSF
NIDA/IRPSpecjalnie zaprojektowanykomponent systemu akwizycji obrazu
Zbiornik sprężonego tlenu i CaxbondioxideRocky Mountain Air SolutionsBI-OX-CD5C-KDo soczewek GRIN implantacja
Zbiornik sprężonego tlenuRocky Mountain Air SolutionsOX-M-KDo wstrzykiwania wirusa
Bezprzewodowa wiertarkaTechnologia KF8000037800Do kraniotomii
CyjanoakrylanHenkel Coorporation# 1811182 Doimplantacji soczewek GRIN Kontroler
akwizycji danychNIDA/IRPSpecjalnie zaprojektowanykomponent akwizycji obrazu System
do transmisji danychNIDA/IRPSpecjalnie zaprojektowanyelement systemu akwizycji obrazu
Zestaw cementu dentystycznegoC& B Metabond i katalizatorA00253revA306 i A00168revB306Do implantacji soczewek GRIN
Zestaw cementu dentystycznegoDuralay2249DDo implantacji soczewek GRIN
DeksametazonVEToneNDC 1398503702Do implantacji soczewek GRIN
DekstrozaSigma50-99-7Do przygotowania żelu
dietetycznegoClear H2072-06-5022Suplement diety do myszy,
soczewka GRINTECHNEM-100-25-10-860-SDo implantacji soczewek GRIN
Poduszka grzewczaPhysitemp Instruments LLC.#10023Aby utrzymać ciepło ciała myszy podczas operacji
IsofluraneVEToneV1 502017Anesthesia
KetamineVEToneV1 501072Do implantacji soczewek GRIN
LidokainaWEST-WARDNDC 0143-9575-01Znieczulenie miejscowe
Sześciowodny chlorek magnezuSigma7791-18-6Do przygotowania CSF
Mikrolitr strzykawka (Hamilton)Hamilton7653-01Do wstrzykiwania wirusa
Kontroler pompy mikrostrzykawkowejWorld Precision Instrument#178647Do wstrzykiwania wirusa
MiniskopNIDA/IRPSpecjalnie zaprojektowanydo obrazowania
Baza miniskopuProtolabsSpecjalnie zaprojektowany Domontażu podstawy
Ramię trzymające miniskopNIDA/IRPZaprojektowany na zamówienieDo montażu podstawy
Nasadka ochronna miniskopuProtolabsSpecjalnie zaprojektowanaDo ochrony miniskopu
Sterownik z napędem silnikowymThorlabsKMTS50EDo montażu podstawy
NeuViewNIDA/IRPhttps://github.com/giovannibarbera/miniscope_v1.0Do obrazowania in vivo
Maść okulistycznaPuralube Vet MaśćNDC 17033-211-38
Okulistyczna probówka do PCRThermo ScientificAB-0622Do implantacji soczewek GRIN
Zacisk zaciskowyWorld Precision Instrument14040Do zaciskania rurki
Taśma politetrafluoroetylenowa (PTFE)TegaSeal Taśma PTFEA-A-58092Do mocowania lunety miniScope do podstawy
Chlorek potasuSigma7447-40-7Do przygotowania aCSF
Ramię robotyczneNIDA/IRPSpecjalnie zaprojektowane Doimplantacji soczewek GRIN
SalineHospiraRL 7302Do obu operacji
Śruba ustalającaDECORAH LLC.3BT-P9005-00-0025Do przykręcania mosiężnej nakrętki sześciokątnej w podstawie miniskopu
  Rurki z gumy silikonowej, 0.062"ID, 1/8" ODMcMaster2124T3Do nawadniania aCSF
Wodorowęglan soduSigma144-55-8Do przygotowania aCSF
Chlorek soduSigma7647-14-5Do przygotowania aCSF
Fosforan sodu jednozasadowySigma7558-80-7Do przygotowania
CSF Stopień stereotaktycznyKOPFModel 962 Podwójny ultra precyzyjny stereotaktyczny dla małych zwierzątDo obu operacji
Sterylny wacik bawełnianyPuritanREF 806-WCDo obu operacji
Narzędzia chirurgiczneNarzędzia do nauk ścisłych11251-35Do operacji
Szew SofsilkREF SS683Do wstrzykiwań wirusów
  Filtr strzykawkowy (0,22 &mikro; m)MillexSLGVR33RSDo filtrowania aCSF podczas implantacji soczewek GRIN
Zawiesina wirusowa (AAV1-CamKII-GCamp6f)Addgene100834-AAV1Do wstrzykiwania wirusa
Miano: 2,8 X 10^13 GC/ml
KsylazynaVEToneV1 510650Do implantacji soczewek GRIN
CSF

Bibliografia

  1. Clapham, D. E. Calcium signaling. Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).
  2. Brini, M., Cali, T., Ottolini, D., Carafoli, E. Neuronal calcium signaling: function and dysfunction. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (15), 2787-2814 (2014).
  3. Chen, T. W., Li, N., Daie, K., Svoboda, K. A Map of Anticipatory Activity in Mouse Motor Cortex. Neuron. 94 (4), 866-879 (2017).
  4. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  5. Komiyama, T., et al. Learning-related fine-scale specificity imaged in motor cortex circuits of behaving mice. Nature. 464 (7292), 1182-1186 (2010).
  6. Peters, A. J., Lee, J., Hedrick, N. G., O'Neil, K., Komiyama, T. Reorganization of corticospinal output during motor learning. Nature Neuroscience. 20 (8), 1133-1141 (2017).
  7. Barbera, G., et al. Spatially compact neural clusters in the dorsal striatum encode locomotion relevant information. Neuron. 92 (1), 202-213 (2016).
  8. Cai, D. J., et al. A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time. Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).
  9. de Groot, A., et al. NINscope, a versatile miniscope for multi-region circuit investigations. Elife. 9, 49987(2020).
  10. Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
  11. Jacob, A. D., et al. A compact head-mounted endoscope for in vivo calcium imaging in freely behaving mice. Current Protocols in Neuroscience. 84 (1), 51(2018).
  12. Liang, B., et al. Distinct and Dynamic ON and OFF neural ensembles in the prefrontal cortex code social exploration. Neuron. 100 (3), 700-714 (2018).
  13. Liberti, W. A., et al. Unstable neurons underlie a stable learned behavior. Nature Neuroscience. 19 (12), 1665-1671 (2016).
  14. Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7319-7324 (2003).
  15. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  16. Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).
  17. Bassett, J. J., Monteith, G. R. Genetically encoded calcium indicators as probes to assess the role of calcium channels in disease and for high-throughput drug discovery. Advances in Pharmacology. 79, 141-171 (2017).
  18. Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
  19. Tian, L., Akerboom, J., Schreiter, E. R., Looger, L. L. Neural activity imaging with genetically encoded calcium indicators. Progress in Brain Research. 196, 79-94 (2012).
  20. Moore, D. T. Gradient-index optics: A review. Applied Optics. 19 (7), 1035-1038 (1980).
  21. Zhang, L., et al. Miniscope GRIN Lens System for Calcium Imaging of Neuronal Activity from Deep Brain Structures in Behaving Animals. Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56(2019).
  22. Yang, Y., et al. A two-step GRIN lens coating for in vivo brain imaging. Neuroscience Bulletin. 35 (3), 419-424 (2019).
  23. Liang, B., Zhang, L., Moffitt, C., Li, Y., Lin, D. T. An open-source automated surgical instrument for microendoscope implantation. Journal of Neuroscience Methods. 311, 83-88 (2019).
  24. Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, 38173(2019).
  25. Barbera, G., Liang, B., Zhang, L., Li, Y., Lin, D. T. A wireless miniScope for deep brain imaging in freely moving mice. Journal of Neuroscience Methods. 323, 56-60 (2019).
  26. Shuman, T., et al. Breakdown of spatial coding and interneuron synchronization in epileptic mice. Nature Neuroscience. 23 (2), 229-238 (2020).
  27. Werner, C. T., Williams, C. J., Fermelia, M. R., Lin, D. T., Li, Y. Circuit mechanisms of neurodegenerative diseases: A new frontier with miniature fluorescence microscopy. Frontiers in Neuroscience. 13, 1174(2019).
  28. Brault, V., Besson, V., Magnol, L., Duchon, A., Herault, Y. Cre/loxP-mediated chromosome engineering of the mouse genome. Handbook of Experimental Pharmacology. (178), 29-48 (2007).
  29. McLellan, M. A., Rosenthal, N. A., Pinto, A. R. Cre-loxP-mediated recombination: General principles and experimental considerations. Current Protocols in Mouse Biology. 7 (1), 1-12 (2017).

Przedruki i uprawnienia

Sprostowanie


Formal Correction: Erratum: Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging
Posted by JoVE Editors on 5/05/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging. The Discussion was updated.

The following paragraph was added to the end of the Discussion:

Although a chunk of brain tissue is removed unilaterally during the GRIN lens implantation step, we did not observe any obvious behavior deficits7,12. The weight of the miniscope is around 2 grams and the cable is custom-designed to make it light and to ensure that the mouse can easily carry it. The miniscope and cable are only attached to the animal prior to in vivo imaging and detached after imaging. The entire imaging process usually takes no longer than 30 minutes. Therefore, these instrumentations do not prevent the mouse from freely behaving. The miniscope installation and deinstallation steps need a brief anesthesia (less than 2 minutes) with isoflurane for the purpose of animal restraining. We typically let the mouse recover from the brief exposure of isoflurane for 30 minutes before performing in vivo imaging. We have performed miniscope in vivo calcium imaging once per week for a few weeks without noticing any impact on mouse health and mouse social behavior12.

Tagi

Implantacja soczewki GRINobrazowanie miniskopoweobrazowanie g bokich struktur m zgugenetycznie kodowany czujnik wapniamyszy w stanie swobodnego zachowaniaanaliza obwod w neuronalnychobrazowanie jednofotonoweobrazowanie dwufotonowe
Stereotaktyczne wstrzyknięcie wirusa i implantacja soczewek o indeksie gradientowym w celu obrazowania głębokiego mózgu in vivo wapnia
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.