Artykuł metodologiczny

Mysi model bezpośredniego zespolenia drogą przedrdzeniową do chirurgii krzyżowania się transferu nerwów

4.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63051

⸱

19 października 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Hand Surgery, Huashan Hospital, Fudan University, 2Department of Hand and Upper Extremity Surgery, Jing‘an District Central Hospital, Fudan University, 3The National Clinical Research Center for Aging and Medicine, Fudan University, 4Institutes of Brain Science, Fudan University, 5State Key Laboratory of Medical Neurobiology, Collaborative Innovation Center of Brain Science, Fudan University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Przeprowadziliśmy symulację kliniczną chirurgii, aby ustalić protokół bezpośredniego zespolenia obustronnych nerwów splotu ramiennego drogą przedrdzeniową u myszy, przyczyniając się do badania mechanizmów neuronalnych leżących u podstaw rehabilitacji po skrzyżowaniu transferu nerwów po urazach ośrodkowego i obwodowego układu nerwowego.

Streszczenie

Chirurgia transferu nerwów była skutecznym podejściem do naprawy uszkodzonych kończyn górnych u pacjentów z uszkodzeniami zwichnięcia splotu ramiennego. Ostatnio operacja ta została twórczo zastosowana w klinicznym leczeniu urazów mózgu i doprowadziła do znacznej rehabilitacji sparaliżowanej ręki. Ta funkcjonalna regeneracja po operacji sugeruje, że obwodowa interwencja sensomotoryczna indukuje głęboką neuroplastyczność, aby zrekompensować utratę funkcji po uszkodzeniu mózgu; Jednak leżący u podstaw mechanizm neuronalny jest słabo poznany. W związku z tym wymagany jest emergentny kliniczny model zwierzęcy. Tutaj przeprowadziliśmy symulację chirurgii klinicznej, aby ustalić protokół bezpośredniego zespolenia obustronnych nerwów splotu ramiennego drogą przedrdzeniową u myszy. Eksperymenty neuroanatomiczne, elektrofizjologiczne i behawioralne pomogły zidentyfikować, że przeniesione nerwy tych myszy skutecznie unerwiły uszkodzoną kończynę przednią i przyczyniły się do przyspieszenia regeneracji motorycznej po urazie mózgu. W związku z tym model mysi ujawnił mechanizmy neuronalne leżące u podstaw rehabilitacji po skrzyżowaniu transferu nerwów po urazach ośrodkowego i obwodowego układu nerwowego.

Wprowadzenie

Splot ramienny (BP) składa się z pięciu nerwów z różnymi segmentami kręgosłupa (C5-T1) odpowiedzialnych za czucie i ruch w ramieniu, dłoni i palcach. Po wyjściu tych pięciu nerwów BP z rdzenia kręgowego, łączą się one, tworząc trzy pnie nerwowe: górny (powstały w wyniku połączenia C5 i C6), przyśrodkowy (z C7) i dolny (gałęzie C8 i T1). Poważne urazy, zwłaszcza spowodowane wypadkami drogowymi, często prowadzą do zwichnięcia korzeni nerwowych BP, a taka dysfunkcja ma niszczący wpływ na pacjentów1. Jako potężne podejście kliniczne, operacja skrzyżowania nerwów została wykonana w celu naprawy uszkodzeń awulsyjnych ciśnienia tętniczego poprzez ponowne połączenie uszkodzonych końców nerwowych ze zdrową stroną klasy BP2,3. Operacja ta skutkuje poprawą funkcjonalną uszkodzonych rąk i bezpośrednią reorganizacją kory sensomotorycznej w obu półkulach u pacjentów4. Badania na zwierzętach wykazały, że drastyczna reorganizacja obwodów korowych została wywołana po skrzyżowaniu transferu nerwów5. Ponieważ obwodowa modyfikacja sensomotoryczna może reaktywować uśpioną plastyczność dojrzałego mózgu, chirurgia krzyżowania nerwów wykazuje również ogromny potencjał w naprawie uszkodzeń mózgu6.

Niedawno potwierdziliśmy możliwość kreatywnego wykorzystania krzyżowego transferu nerwów jako nowej strategii zmiany nerwów obwodowych w przypadku problemów z ośrodkowym układem nerwowym. Rodzaj operacji krzyżowania się nerwów, kontralateralny transfer siódmego nerwu szyjnego (CC7), został zastosowany w celu osiągnięcia znacznej poprawy funkcjonalnej sparaliżowanego ramienia poprzez przeniesienie nerwu C7 ze strony niesparaliżowanej na stronę sparaliżowaną u pacjenta po urazie mózgu7. Unikalną cechą tej operacji chirurgicznej jest to, że sygnały czuciowe i motoryczne sparaliżowanej kończyny górnej są przekazywane do półkuli przeciwległej przez przemieszczony nerw "skrzyżowanie lewo-prawo". Warto zauważyć, że poprawa funkcjonalności spowodowana operacją CC7 nie ogranicza się do funkcji unerwionej przez sam nerw C78. Ponadto chirurgia CC7 może być stosowana nie tylko w leczeniu dzieci z porażeniem mózgowym, ale także w rehabilitacji u pacjentów po udarze w średnim i starszym wieku. Dlatego istnieją wystarczające powody, aby sądzić, że krzyżowanie się nerwów może stymulować neuroplastyczność, aby przyspieszyć regenerację motoryczną po uszkodzeniu mózgu poprzez modulację obwodowego układu sensomotorycznego.

Chociaż chirurgia krzyżowania nerwów osiągnęła znaczną rehabilitację w klinicznym leczeniu zarówno urazów splotu ramiennego (BPI), jak i urazów mózgu, mechanizmy neuronalne leżące u podstaw tej operacji pozostają słabo poznane. Brak odpowiedniego modelu zwierzęcego z cechami klinicznymi ograniczył badania nad mechanizmami wewnętrznymi. Tradycyjnie, w klinice, korzeń nerwowy C7 przeciwległy do zmiany jest przenoszony na uszkodzoną stronę przez przeszczep nerwowy (np. nerw łokciowy, nerw łydkowy lub nerw odpiszczelowy) i połączony z dotkniętym splotem ramiennym (np. nerwem pośrodkowym, korzeniem C7 lub dolnym tułowiem)2,3,9. Stosunkowo nowa modyfikacja tej operacji polega na tym, że nieuszkodzony korzeń C7 jest bezpośrednio przenoszony do dotkniętego nerwu C7 drogą przedrdzeniową bez żadnej przerwy, co sugeruje optymalne rozwiązanie7. Obecnie myszy wykazują przewagę w specyficzności typu komórki i różnorodności szczepów genetycznych i są bardziej odpowiednie do badania mechanizmów neurofizjologicznych. W związku z tym przeprowadzono symulację chirurgii klinicznej w celu ustalenia protokołu bezpośredniego zespolenia obustronnych korzeni nerwowych C7 drogą przedrdzeniową u myszy i przyczynienia się do badania mechanizmów neuronalnych leżących u podstaw rehabilitacji po skrzyżowaniu transferu nerwów.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Doświadczalnymi Uniwersytetu Fudan oraz Chińską Akademię Nauk zgodnie z wytycznymi Narodowego Instytutu Zdrowia (National Institute of Health). Wykorzystano dorosłe samce myszy C57BL/6N w wieku ośmiu tygodni.

1. Przygotowanie przedoperacyjne

  1. Zapewnić odpowiedni zapas autoklawowanych, sterylnych instrumentów chirurgicznych, sprzętu, leków przeciwbólowych oraz środków znieczulających.
  2. Zapewnić odpowiednią przestrzeń roboczą na stole operacyjnym.
  3. Przygotować stół operacyjny, wykorzystując dostosowaną chirurgiczną płytę piankową przykrytą pieluchą jako podłoże dla myszy. Przymocować matę grzewczą do płyty piankowej za pomocą taśmy medycznej przykrytej sterylną gazą.
  4. Wykonać retraktory poprzez zgięcie igły do akupunktury za pomocą kleszczyków naczyniowych, złożenie jej na pół, a następnie zagięcie końcówki złożonej igły w haczyk. Przymocować gumkę do końca igły do akupunktury, a następnie za pomocą pineski przymocować koniec gumki do płyty piankowej.
  5. Kalibrować stereomikroskop; wybrać stereomikroskop o odpowiedniej odległości ogniskowej. Przykryć przyciski zoomu/ostrości sterylną folią aluminiową, aby chirurg mógł nimi manipulować podczas operacji. Sterylna folia aluminiowa została umieszczona na przyciskach zoomu/ostrości, umożliwiając chirurgowi ich obsługę w sterylnych rękawiczkach.

2. Znieczulenie i przygotowanie myszy

  1. Zważ mysz i podaj znieczulenie odpowiednio do masy ciała (izofluran 3%). Aby potwierdzić głębokość znieczulenia, upewnij się, że mysz nie reaguje na uciśnięcie przestrzeni międzykopytkowych łapy. Przez cały czas trwania procedury należy utrzymywać odpowiednią głębokość znieczulenia (1% izofluranu).
  2. Nałóż obustronnie do oczu maść oftalmiczną, aby zapobiec podrażnieniu lub wysuszeniu rogówki podczas operacji.
  3. Przygotuj miejsce operacyjne, goląc futro na szyi i klatce piersiowej za pomocą automatycznej maszynki do strzyżenia. Usuń i oczyść luźne włosy.
  4. Umieść mysz w pozycji na plecach na podgrzewającej podkładce przykrytej sterylną gazą. Przez cały czas trwania operacji utrzymuj temperaturę ciała myszy na poziomie 37 °C. Unieruchom mysz za pomocą taśmy medycznej tak, aby przednie kończyny były odwiedzione poziomo, a kończyny tylne oraz ogon nie mogły się poruszać. Na myszy nałożono sterylną jednorazową draperię chirurgiczną z odpowiednim otworem. 

3. Procedura operacyjna

  1. Wstrzyknij  tramadol jako analgezję wyprzedzającą (20 mg/kg, i.p.). Zaznacz nacięcie poprzeczne na górnej krawędzi obojczyka. Odkaź pole operacyjne, stosując trzy cykle naprzemiennego mycia roztworem odkażającym na bazie jodoforu i etanolem. Przed operacją potwierdź głębokość znieczulenia, uciskając palec u stopy.
  2. Pracując pod mikroskopem, wykonaj nacięcie poprzeczne o długości 4 mm wzdłuż zaznaczenia, używając sterylnego skalpela. W razie potrzeby powiększ nacięcie w trakcie procedury.
  3. Wykonaj tępe rozczłonkowanie przez powięź podskórną i zidentyfikuj dolną krawędź ślinianki podżuchwowej. Odsuń śliniankę podżuchwową ku górze, aby odsłonić dołek nadobojczykowy i mostek.
    UWAGA: W tym obszarze mogą znajdować się naczynia krwionośne o małym kalibrze. Do tamowania krwawienia można użyć elektrokoagulacji.
  4. Wykonaj częściową nacięcie sternotomii pośrodkowej (~4 mm), rozcinając mostek od strony głowy w stronę ogona wzdłuż linii środkowej. Podczas sternotomii chroń opłucną, serce i naczynia krwionośne.
  5. Zidentyfikuj mięsień mostkowo-gnykowy. Delikatnie odsuń mostek za pomocą dwóch małych, dostosowanych rozieraczy wykonanych z igieł do akupunktury i zlokalizuj mięsień mostkowo-gnykowy nad tchawicą i przełykiem. Odsuń ten mięsień, aby odsłonić tętnicę szyjną, żyłę wewnętrzną szyjną, nerw przeponowy, nerw błędny, tchawicę i przełyk.
    UWAGA: Delikatnie odsuń mostek, aby uniknąć otwartego odmy opłucnowej. W przeciwieństwie do ludzi, przełyk myszy nie znajduje się za tchawicą, lecz obok niej, po lewej stronie.
  6. Zidentyfikuj lewy splot ramienny. Na bocznej krawędzi lewej żyły wewnętrznej szyjnej odsuń powięź i tkankę tłuszczową na zewnątrz, aby odsłonić splot ramienny. Znajdź pień górny, składający się z nerwów C5 i C6, który posiada trzy odgałęzienia. Zidentyfikuj pień środkowy, składający się z nerwu C7, oraz pień dolny, składający się z nerwów C8 i T1, wzdłuż pnia górnego w kierunku ogona myszy.
    UWAGA: Na powierzchni splotu ramiennego znajdują się podłużne naczynia krwionośne. Użyj elektrokoagulacji, aby zapobiec krwawieniu. Podczas oddzielania lewego splotu ramiennego chroń przewód chłonny, aby uniknąć powstania przetoki chylous.
  7. Pobierz lewy nerw C7. Wykonaj preparację przedniej i tylnej gałęzi pnia środkowego (nerw C7) dystalnie od poziomu podziału na sznury pod obojczykiem i zablokuj nerw C7, podając 0,1 mL 2% lidokainy poprzez infuzję miejscową do pnia nerwu. Wycięcie nerwu C7 wykonaj nożyczkami typu Vannas Spring w punktach jego złączenia ze sznurem bocznym i sznurem tylnym. Przytnij nerw C7 tak, aby długość każdej gałęzi była zbliżona.
    UWAGA: Przednie i tylne gałęzie nerwu C7 oraz przednie i tylne gałęzie pni górnego i dolnego biegną na długim odcinku przed złączeniem, dlatego nerw C7 powinien zostać odpowiednio uwolniony przed resekcją. W rzeczywistości nerw C7 nie zawsze dzieli się na dwie gałęzie; czasami dzieli się na trzy, a w rzadkich przypadkach nawet na cztery gałęzie.
  8. Usuń lewą lamina ventralis C6. Ostrożnie chroń nerw przeponowy i przetnij mięsień przedni szyi na poziomie segmentu C6, aby odsłonić pierścień nerwu C7. Przetnij mikrochwytakiem małe odgałęzienia nerwu C7 unerwiające mięśnie przykręgosłupowe. Delikatnie wyciągnij nerw C7 i ostrożnie wycinaj lewą lamina ventralis C6.
    UWAGA: Pomiędzy stroną przyśrodkową lewej tętnicy szyjnej a stroną boczną przełyku znajduje się wypukłość kostna. Wypukłość ta jest lamina ventralis 6go kręgu szyjnego. Mięśniem podłużnym bocznej krawędzi lamina ventralis C6 jest mięsień przedni szyi, a na jego powierzchni biegnie nerw przeponowy.
  9. Pobierz prawy nerw C7. Przetnij mięsień przedni szyi po prawej stronie, analogicznie jak po lewej, i przetnij prawy pierścień nerwu C7 blisko otworu międzykręgowego. Wypreparuj prawy nerw C7 od poziomu jego podziału.
    UWAGA: Ostrożnie przetnij prawy nerw C7, aby zapobiec uszkodzeniu naczyń krwionośnych pod nerwem.
  10. Przesuń lewy nerw C7.
    1. Usuń częściowo mięsień długi szyi obok ciał kręgów po obu stronach. Tępym sposobem oddziel i poszerz przestrzeń między kompleksem tchawica-przełyk a ciałem kręgu.
    2. Przełóż półzgiętą sznurkę nylonową 5-0 z prawej strony ciała kręgu na lewą stronę drogą przedkręgosłupową.
    3. Przymocuj lewy nerw C7 do rurki infuzyjnej i poprowadź nerw na prawą stronę drogą przedkręgosłupową.
    4. Delikatnie odsuń tchawicę i przełyk, a następnie skojarz przednią i tylną gałąź lewego nerwu C7 z prawym pierścieniem nerwu C7 bez napięcia, używając szwów nylonowych 12-0. Zaszyj epineurium wokół nerwów, wykonując 4-5 szwów, aby silnie połączyć nerwy.
      UWAGA: Kluczowe jest wybranie plastikowej rurki infuzyjnej o odpowiedniej grubości. Zbyt cienka rurka może uszkodzić nerw, a zbyt gruba rurka może uszkodzić tchawicę i przełyk. Ponadto przestrzeń między kompleksem tchawica-przełyk a ciałem kręgu ma kształt litery „V”, a wycięcie części mięśnia długiego szyi może skrócić drogę transferu.

4. Zamknięcie rany

  1. Przemyj ranę sterylną solą fizjologiczną i osusz ją sterylną gazą.
  2. Zszyj mostek i zamknij skórę, używając jednowłóknistych szwów 5-0. 

5. Opieka pooperacyjna

  1. Należy odczekać, aż mysz wybudzi się z anestezji. Następnie przenieść mysz do czystej klatki bez materiału ściółkowego, ogrzanej za pomocą koca grzewczego. Obserwować mysz do momentu odzyskania przez nią zdolności poruszania się. W celu zapewnienia przeciwbólowego działania pooperacyjnego zastosowano tramadol (20 mg/kg, i.p.).
  2. Umieść myszy w klatce do rekonwalescencji i monitoruj ich stan. do czasu powrotu do zdrowia. Przywrócić myszom dostęp do wody i pokarmu po operacji. Codziennie monitoruj myszy po zabiegu pod kątem objawów zaburzeń funkcji organizmu lub infekcji, w tym niedożywienia, przygarbionej postawy oraz zjeżonej sierści. Usunięcie szwów powinno nastąpić dwa tygodnie po operacji.
    UWAGA: Należy aplikować maść z erytromycyną na powierzchnię rany codziennie przez trzy kolejne dni.
  3. W przypadku wystąpienia jakichkolwiek powikłań, takich jak obrzęk rany, należy je niezwłocznie usunąć.

6. Analiza behawioralna

UWAGA: Wszystkie testy behawioralne i analizy zostały przeprowadzone przez obserwatora, który nie znał przynależności zwierząt do grup eksperymentalnych.

  1. Test cylindra
    UWAGA: Test cylindra ocenia wykorzystanie przednich kończyn podczas spontanicznej eksploracji pionowej wewnątrz cylindra w 4  i 8 tygodniu po operacji21. 
    1. Umieść myszy w przezroczystym cylindrze (średnica 9 cm, wysokość 15 cm) na podwyższonej ramie.
    2. Aby ułatwić obserwację i rejestrację, zamocuj lustro pod kątem 45° pod cylindrem.
    3. Rejestruj spontaniczne wspięcie się każdej myszy obserwowanej za pomocą lustra przez 10 min.
      1. Ręcznie określ czas, przez który (i) prawa łapa, (ii) lewa łapa lub (iii) obie łapy miały kontakt ze szklanymi ściankami. Policz łącznie 20 ruchów podczas każdej sesji. Wyklucz z analizy myszy, które nie wykazują aktywności podczas testu.
    4. Oceń wynik testu według wzoru:
      figure-protocol-1
  2. Test chodzenia po kratce (grid-walk test)
    UWAGA: Test chodzenia po kratce ocenia precyzję stawiania przednich łap na szczeblach kratki podczas spontanicznej eksploracji w 4  i 8 tygodniu po operacji.22.
    1. Umieść myszy na drucianej kratce (20 cm x 24 cm) z kwadratowymi otworami o boku 25 mm i pozwól im na swobodną eksplorację przez 10 min, rejestrując ich zachowanie za pomocą kamery wideo.
    2. Zapisz poślizg łapy w każdym z następujących przypadków:
      1. W sytuacjach, gdy łapa całkowicie mija szczebel (wówczas kończyna wpada między szczeble, a zwierzę traci równowagę).
      2. W sytuacjach, gdy łapa jest prawidłowo ustawiona na szczeblu, ale ześlizguje się podczas przenoszenia ciężaru ciała.
    3. Wyraź wynik testu jako: poślizgi prawej przedniej kończyny / całkowita liczba poślizgów. Chociaż ani test cylindra, ani test chodzenia po kratce nie wymagają treningu, uzyskaj wyniki bazowe, testując każde zwierzę raz przed operacją.

Wyniki

Jednostronne uszkodzenie mózgu często powoduje trwałe dysfunkcje kończyny przeciwstawnej z powodu ograniczeń kompensacyjnej plastyczności neuronalnej u dorosłych10,1. Wcześniej zgłaszaliśmy, że operacja CC7 może być stosowana w leczeniu hemiplegii kończyn górnych u dorosłych pacjentów po urazie mózgu7. Aby ocenić skuteczność protokołu bezpośredniej anastomozy obustronnych nerwów C7 drogą przedkręgową, przeprowadziliśmy operację skrzyżowanego przeszczepu nerwów u myszy po jednostronnym urazie czaszkowo-mózgowym (TBI). Rycina 1 opisuje procedury TBI oraz weryfikuje zakres i efekt uszkodzenia. Najpierw użyto elektrycznego uderzeniowego urządzenia do kontuzji kory (eCCI), aby uszkodzić korę mózgową lewej półkuli (przód-tył = +1,0 mm do -2,0 mm, przyśrodkowo-bocznie = 0,5 mm do 3,5 mm) u dorosłych myszy, co doprowadziło do jednostronnego uszkodzenia mózgu. Po 2 tygodniach badania struktur anatomicznych potwierdziły, że ten protokół TBI niemal całkowicie zniszczył korę czuciowo-ruchową, która jest kluczowym obszarem inicjowania ruchów. Myszy z jednostronnym TBI wykazywały znaczne deficyty ruchowe prawej przedniej kończyny.

Rycina 2 przedstawia procedury CC7. Schemat dróg operacji CC7 wykazał, że droga A, reprezentująca drogę przedkręgową, była najkrótszym podejściem w porównaniu z pozostałymi. Długość drogi A jest nawet mniejsza niż długość pobranego nerwu C7 po stronie lewej (stronie niesparaliżowanej). Wynik ten dostarczył podstaw anatomicznych do wyboru drogi przedkręgowej w celu przeprowadzenia operacji transferu nerwu. Operację CC7 wykonano poprzez bezpośrednią anastomozę drogą przedkręgową w drugim tygodniu po TBI. Nerw szyjny 7 (C7) po stronie niesparaliżowanej został przeniesiony bezpośrednio na stronę sparaliżowaną zamiast tworzenia jego pierwotnych połączeń z mózgiem. Rycina 3 prezentuje wyniki mikroskopii elektronowej, które wykazały, że przeniesiony nerw C7 uległ skutecznej regeneracji. Grubość osłonki mielinowej przeniesionego nerwu C7 stopniowo zwiększała się, zaczynając od 4. tygodnia po operacji CC7, i była niemal porównywalna z wartościami w grupie kontrolnej w 8. tygodniu po operacji CC7. Rycina 4 potwierdza reinnerwację mięśni przez przeniesiony nerw C7 za pomocą zapisów elektromiograficznych. Stymulacja elektryczna proksymalnego końca anastomozy nerwu C7 stabilnie indukowała potencjały czynnościowe w wielu mięśniach dotkniętej kończyny przedniej w 4. tygodniu po operacji, co jest zgodne z wynikami mikroskopii elektronowej. Rycina 5 pokazuje, że przeniesiony nerw C7 zawiera włókna ruchowe z rogu przedniego i włókna czuciowe zwojów rdzeniowych segmentu C7 rdzenia kręgowego po zdrowej stronie, co wykazano za pomocą retrogradnego znakowania podjednostką B toksyny cholerycznej (CTB).

Rysunek 6 pokazuje, że w modelu mysim również zaobserwowano znaczną poprawę funkcji motorycznych po jednostronnym TBI, co jest zgodne z wynikami badań klinicznych. Aby zweryfikować wpływ operacji CC7 na regenerację uszkodzonych funkcji motorycznych po TBI, utworzono grupę TBI + Sham oraz grupę Control + Sham. Myszy w grupie TBI + Sham i grupie TBI + CC7 zostały poddane tym samym procedurom wywołania urazu TBI w tym samym czasie, podczas gdy myszy w grupie Control + Sham przeszły jedynie operację pozorowaną. W przypadku myszy z grupy TBI + CC7 przeprowadzono operację transferu nerwu, natomiast myszy z grupy TBI + sham oraz Control + Sham poddano obustronnej resekcji nerwów szyjnych C7 (C7). W testach cylindra grupa TBI + CC7 wykazała znacząco wyższy wskaźnik wykorzystania uszkodzonej kończyny przedniej niż grupa TBI zarówno w 4., jak i 8. tygodniu po operacji CC7 (p < 0,01). W testach chodzenia po kratce grupa TBI + CC7 wykazała niższy wskaźnik błędów niż grupa TBI w 4. tygodniu po operacji CC7. Co więcej, wskaźnik błędów w grupie TBI + CC7 był znacząco niższy niż w grupie TBI w 8. tygodniu po operacji CC7 (p < 0,05). Te wyniki behawioralne wykazały, że operacja CC7 może poprawić funkcje motoryczne dotkniętej kończyny u myszy z TBI. Wspólnie wyniki te sugerują, że przeniesiony nerw C7, odtworzony w ramach operacji CC7 drogą przedrdzeniową, uległ pomyślnej regeneracji i ponownie zenerwował uszkodzoną kończynę przednią, przyczyniając się do przywrócenia funkcji motorycznych u dorosłych myszy z jednostronnym TBI.

figure-results-1
Rysunek 1: Charakterystyka jednostronnego urazowego uszkodzenia mózgu. (A)  Schemat przedstawiający ułożenie myszy podczas eCCI. (B) Parametry i zakres uszkodzeń w metodzie eCCI. (C) Reprezentatywny przekrój wieńcowy przedstawiający uszkodzoną korę (2 tygodnie po TBI, pasek skali = 50 µm). Skrót: eCCI = electric cortical contusion impactor. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: Schematyczny rysunek chirurgiczny. (A) Schemat przedstawiający projekt eksperymentalny przeprowadzenia przeciwstronnego transferu nerwu C7 u myszy z TBI. Czerwone koło wskazuje miejsce urazu. Czerwone podwójne kreski wewnątrz przerywanego prostokąta oznaczają zszyty nerw. (B) Przekrój poprzeczny przedstawia trzy alternatywne drogi przeciwstronnego transferu nerwu C7 u myszy. Ścieżka A (linia niebieska) przedstawia drogę przedkręgową przetransferowanego nerwu; ścieżka B (linia zielona) przedstawia drogę przedtchawiczą przetransferowanego nerwu; ścieżka C (linia czerwona) przedstawia tunel podskórny przetransferowanego nerwu. (C) Wykres przedstawia długość ścieżek oraz pobranego nerwu C7 w punkcie (B). Długość ścieżki A (3.3 ± 0.10 mm) była znacząco mniejsza niż długość pobranego nerwu C7 (4.05 ± 0.1 mm; * p < 0.05, jednoczynnikowa ANOVA, n = 20 w każdej grupie). Długość ścieżki C (14.15 ± 0.20 mm) była znacząco większa niż długość pobranego nerwu C7 (*** p < 0.01, jednoczynnikowa ANOVA, n = 20 w każdej grupie). Długość ścieżki B wynosiła 4.2 ± 0.08 mm (n=20). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-3
Rycina 3: Analiza z użyciem mikroskopii elektronowej przekroju nerwu. (A,B) Obrazy nerwu u myszy kontrolnych. Pasek skali = 5 µm (A) i 1 µm (B). (C,D) Obrazy zregenerowanego nerwu miesiąc po operacji. Pasek skali = 5 µm (C) i 1 µm (D). (E, F) Obrazy zregenerowanego nerwu w 1,5 miesiąca po operacji. Pasek skali = 5 µm (E) i 1 µm (F). (G, H) Obrazy zregenerowanego nerwu w dwa miesiące po operacji. Pasek skali = 5 µm (G) i 1 µm (H). Powiększenie A, C, E i G: 2 0x; powiększenie B, D, F i H: 15 0x. (I) Współczynnik G (stosunek średnicy wewnętrznej do zewnętrznej osłonki mielinowej) jest niższy w próbkach grupy kontrolnej niż w próbkach z 4. tygodnia i równy próbkom z 6–8 tygodni po operacji (***: p < 0,01; porównanie aksonów z różnych grup za pomocą testu t; n = 3 myszy w każdej grupie). Skróty: CC7 = kontralateralny transfer siódmego nerwu szyjnego; CC7-XW = X tygodni po operacji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-4
Rycina 4: Analiza elektromiograficzna po kontralateralnym transferze nerwu C7 wskazuje tempo regeneracji nerwu. (A) Schemat przedstawiający elektroniczną stymulację transferu i rejestrację elektromiograficzną in vivo. Intensywność stymulacji była stała w trakcie całego badania (2 mA). Miejsce stymulacji to nerw C7 proksymalnie w stosunku do anastomozy. (B, C) Zdjęcia przedstawiające potencjał czynnościowy zarejestrowany w mięśniu piersiowym większym w drugim tygodniu (B) oraz czwartym tygodniu (C) po operacji. (D, E) EMG zarejestrowano w mięśniu prostowniku palców 4 tygodnie (D) i 8 tygodni (E) po operacji. (F) W trzecim tygodniu w mięśniu trójgłowym ramienia pojawiły się CMAP. (G) W czwartym i ósmym tygodniu CMAP mięśnia trójgłowego ramienia wzrosły. (H) Średnia amplituda mięśnia piersiowego większego osiągnęła ~0,25 mV ± 0,16 mV w 4 tygodniu w porównaniu do 0,45 mV ± 0,03 mV w 8 tygodniu, co wykazuje istotną różnicę między tymi dwoma punktami czasowymi (*** p < 0,01, t-test, n = 6 w każdej grupie). (I) Średnia amplituda mięśnia trójgłowego ramienia osiągnęła ~0,15 mV ± 0,01 mV w 4 tygodniu w porównaniu do 0,46 mV ± 0,02 mV w 8 tygodniu, co wykazuje istotną różnicę między tymi dwoma punktami czasowymi (***: p < 0,01, t-test, n = 6 w każdej grupie). (J) Średnia amplituda mięśnia prostownika palców osiągnęła ~0,1 mV ± 0,01 mV w 4 tygodniu w porównaniu do 0,29 mV ± 0,02 mV w 8 tygodniu, co wykazuje istotną różnicę między tymi dwoma punktami czasowymi (***: p < 0,01, t-test, n = 6 w każdej grupie). Skróty: EMG = elektromiografia; CMAP = złożony potencjał czynnościowy mięśnia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-5
Rycina 5: Retrogradne znakowanie CTB neuronów ruchowych i czuciowych w przemieszczonym nerwie C7. (A-C) CTB wstrzyknięto do dystalnego końca anastomozy nerwu C7 w 4. tygodniu po operacji CC7. (A) Znakowanie neuronów czuciowych w obrębie DRG. (B, C) Znakowanie neuronów ruchowych przemieszczonego nerwu C7 w przednim rogu rdzenia kręgowego. Powiększenie, 20x. Pasek skali = 20 µm (A, B); 10 µm (C). Skróty: CTB = podjednostka B toksyny cholerycznej; DRG = zwoje korzeni grzbietowych; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenyloindol. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

figure-results-6
Rysunek 6: Zmiany behawioralne po operacji CC7. (A) Zdjęcia przedstawiają test cylindra u myszy. (B) Wykres podsumowujący wpływ transferu CC7 w 4. i 8. tygodniu po operacji u myszy z TBI (n = 6 myszy). p = 0.01; nieparzysty test t. Średnie wykorzystanie uszkodzonej przedniej kończyny wynosiło 54,17% ± 3,01% w grupie Control + Sham versus 2,5% ± 2,14% w grupie TBI + Sham oraz 35,83% ± 2,39% w grupie TBI + CC7 w 4. tygodniu po operacji CC7, co wskazuje na istotną różnicę (jednoczynnikowa analiza ANOVA; p < 0.05, n = 6 w każdej grupie). W 8. tygodniu po transferze CC7 wykorzystanie wynosiło odpowiednio 53,3% ± 3,80%, 24,17% ± 3,01% i 40,0% ± 1,83% w grupach Control + Sham, TBI + Sham oraz TBI + CC7, co stanowi istotną różnicę (*p < 0.05, jednoczynnikowa analiza ANOVA, n = 6 w każdej grupie). (C) Zdjęcia przedstawiają test chodzenia po kratce (grid walk test). (D) Wykres pokazuje, że średni odsetek błędów uszkodzonej przedniej kończyny w grupie TBI + Sham wynosił 85,41% ± 1,59% (n = 6), co odpowiadało grupie TBI + CC7 z wynikiem 80,17% ± 2,19% (n = 6), a oba wyniki były wyższe niż w grupie Control + Sham (50,99% ± 1,69%). W 8. tygodniu po operacji odsetek błędów w grupie TBI + CC7 wynosił 76,87 ± 1,07% (n = 6), co jest wartością istotnie niższą niż w grupie TBI + Sham (83,06% ± 1,41%; p < 0.05, jednoczynnikowa analiza ANOVA, n = 6 w każdej grupie). Skróty: CC7 = transfer przeciwstawnego siódmego nerwu szyjnego; TBI = urazowe uszkodzenie mózgu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

W klinice chirurgia transferu nerwów krzyżowych jest stosowana w leczeniu pacjentów z uszkodzeniem zwichnięcia splotu ramiennego oraz po uszkodzeniu mózgu, takim jak udar mózgu i TBI 7,9,12. Warto zauważyć, że uszkodzenie mózgu jest poważnym stanem neurologicznym, który może prowadzić do kilku powikłań, w tym epilepsji, przepukliny mózgoweji infekcji. Nie wszyscy pacjenci z jednostronnym uszkodzeniem mózgu nadają się do operacji CC7. Ogólnie rzecz biorąc, operacja CC7 była wykonywana u pacjentów z centralną porażeniem połowiczym w stadium przewlekłym (6 miesięcy po urazie), aby w jak największym stopniu uniknąć wpływu obrzęku mózgu. Pacjenci z zaburzeniami poznawczymi i porażeniem czterokończynowym po urazach mózgu są wyłączeni z leczenia chirurgicznego CC7.

W większości badań podawano zastosowanie dostępu podskórnego i zespolenia przeszczepu nerwu łydkowego lub łokciowego w celu przeniesienia przeciwległego korzenia nerwowego C714,15. Jednak regeneracja nerwów takimi metodami wymaga sześciu miesięcy, co może utrudnić proces regeneracji motorycznej, a nawet potencjalnie wpłynąć na plastyczność mózgu14. W poprzednich badaniach kontralateralny transfer C7 wykonywano u szczurów, a obustronny nerw C7 był używany za pośrednictwem 4 nici interpozycyjnego autoprzeszczepionego nerwu łydkowego. Nie ma jednak doniesień o przenoszeniu nerwów C7 drogą przedrdzeniową u myszy. Przeprowadziliśmy operację CC7 zmodyfikowanej drogi przedrdzeniowej u myszy i zweryfikowaliśmy szybkość powrotu do sprawności funkcjonalnej po transferze nerwu C7. W tym badaniu kontralateralny transfer nerwu C7 drogą przedrdzeniową poprawił sparaliżowaną funkcję kończyny miesiąc po operacji, odzwierciedlając krótszy czas rekonwalescencji modelu zwierzęcego przeszczepionego nerwu. W związku z tym model ten mógł precyzyjnie symulować sytuacje kliniczne i stanowić podstawę do dalszych eksperymentów.

Jak wypreparować korzeń nerwowy i zmniejszyć ryzyko, to podstawowe kwestie związane z transferem C7. W przeciwieństwie do ludzi, splot ramienny myszy znajduje się w klatce piersiowej poniżej obojczyka 5,16. W związku z tym strategia dostępu musiała zostać zmieniona, aby umożliwić obserwację korzenia nerwu i kręgosłupa C717. Sternotomia jest bezpiecznym i skutecznym podejściem operacyjnym i jest powszechnie stosowana w eksperymentach na myszach w kardiochirurgii18,19. Blaszka brzuszna C6 jest również przeszkodą w przenoszeniu nerwów. W związku z tym przeprowadzono operację sternotomii w celu wypreparowania korzenia nerwowego C7 i przecięcia blaszki brzusznej C6 w celu skrócenia drogi przenoszenia.

Chociaż droga przedrdzeniowa może znacznie zwiększyć wskaźnik powodzenia bezpośredniego zespolenia operacji transferu nerwów, nie wszystkie myszy mogą być zespolone bezpośrednio. Wynika to głównie z różnic anatomicznych u tych myszy. Środkowy pień (nerw C7) łączy się z górnym lub dolnym tułowiem w miejscu bardzo blisko otworu międzykręgowego. W związku z tym długość nerwów C7 dostępnych do zbioru jest niewystarczająca. Obecnie jedynym podejściem jest przeszczep nerwów lub wymiana myszy. Model ten jest zwykle stosowany u 8-tygodniowych myszy (20-25 g), ponieważ myszy są dojrzałe, a nerwy C7 są odpowiedniej wielkości, aby można było się z nimi obchodzić. Chociaż ten protokół chirurgiczny ma również zastosowanie do młodych myszy, trudność operacji znacznie wzrośnie u młodszych myszy.

Funkcja motoryczna kończyn przednich myszy w grupie TBI + CC7 była znacznie zwiększona po jednym miesiącu i dwóch miesiącach, co sugeruje, że przeniesiony nerw C7 przyczynił się do odzyskania upośledzonej kończyny przedniej. Remielinizacja ma kluczowe znaczenie dla funkcjonalnej regeneracji neuronów. Poprzednie badanie wykazało, że osłonki mielinowe uszkodzonych nerwów regenerowały się po miesiącu, co jest zgodne z tymi wynikami20. W tym przypadku przenoszony nerw stopniowo dojrzewał, co było zgodne z testem behawioralnym. Elektromiografia została wykorzystana do dalszego zbadania tempa powrotu do sprawności funkcjonalnej po transferze nerwów. Wyniki wykazały, że przeniesiony nerw unerwił chory mięsień 4 tygodnie po operacji. Warto zauważyć, że badanie to jest pierwszym, które określa punkt czasowy reinerwacji z bezpośrednim zespoleniem po operacji krzyżowego transferu nerwów.

Podsumowując, przeprowadziliśmy symulację chirurgii klinicznej w celu ustalenia protokołu bezpośredniego zespolenia obustronnych nerwów splotu ramiennego drogą przedrdzeniową u myszy i potwierdziliśmy funkcję przemieszczonego nerwu. Model mysi przyczynił się do wyjaśnienia mechanizmów neuronalnych leżących u podstaw rehabilitacji po skrzyżowaniu transferu nerwowego po urazach ośrodkowego i obwodowego układu nerwowego.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (82071406, 81902296 i 81873766).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Strzykawka 1 mlKDLK-20200808
12-0 nici nylonoweChenghe20082
5-0 jedwabny plecionyMERSILK, ETHICONQK312
75% etanoluODCZYNNIK OGÓLNYP1762077
Igła do akupunkturyChengzhen190420Służy do robienia zwijaczy
Automatyczna maszynka do strzyżeniaCodosCHC-332
C57BL / 6N myszySLAC laboratorium (Szanghaj)C57BL / 6Slac
Elektrokaagulacyjnynóż guttaSD-GG01
Maść erytromycynaBaiyunshanH1007
Roztwór do dezynfekcji JodophorLionser20190220
Taśma medycznaTranspore, 3M1527C-0
Mikro uchwyt na igłyChengheX006-202003
MikrokleszczeChengheB001-201908
Mikronożyczki66VT1911-2S276
Mikroskop operacyjnyOLYMPUSSZX7
Nożyczki okulistyczneChengheX041D1251
Pentobarbital sodowySigma20170608
Plastikowa rurka infuzyjnaKDLC-20191225
Sterylna sól fizjologiczna KLL121021109
Kleszcze naczynioweJinzhongJ31020
Podkładka rozgrzewającaRWD69027

Bibliografia

  1. Aszmann, O. C., et al. Bionic reconstruction to restore hand function after brachial plexus injury: a case series of three patients. Lancet. 385 (9983), 2183-2189 (2015).
  2. Gu, Y., Xu, J., Chen, L., Wang, H., Hu, S. Long term outcome of contralateral C7 transfer: a report of 32 cases. Chinese Medical Journal. 115 (6), 866-868 (2002).
  3. Gu, Y. D., et al. Long-term functional results of contralateral C7 transfer. Journal of Reconstructive Microsurgery. 14 (1), 57-59 (1998).
  4. Feng, J. T., et al. Brain functional network abnormality extends beyond the sensorimotor network in brachial plexus injury patients. Brain Imaging and Behavior. 10 (4), 1198-1205 (2016).
  5. Stephenson, J. B. t, Li, R., Yan, J. G., Hyde, J., Matloub, H. Transhemispheric cortical plasticity following contralateral C7 nerve transfer: a rat functional magnetic resonance imaging survival study. The Journal of Hand Surgery. 38 (3), 478-487 (2013).
  6. Hübener, M., Bonhoeffer, T. Neuronal plasticity: beyond the critical period. Cell. 159 (4), 727-737 (2014).
  7. Zheng, M. X., et al. Trial of contralateral seventh cervical nerve transfer for spastic arm paralysis. The New England Journal of Medicine. 378 (1), 22-34 (2018).
  8. Spinner, R. J., Shin, A. Y., Bishop, A. T. Rewiring to regain function in patients with spastic hemiplegia. The New England Journal of Medicine. 378 (1), 83-84 (2018).
  9. Hua, X. Y., et al. Contralateral peripheral neurotization for hemiplegic upper extremity after central neurologic injury. Neurosurgery. 76 (2), 187-195 (2015).
  10. Robertson, C. S., et al. Effect of erythropoietin and transfusion threshold on neurological recovery after traumatic brain injury: a randomized clinical trial. Journal of the American Medical Association. 312 (1), 36-47 (2014).
  11. Skolnick, B. E., et al. A clinical trial of progesterone for severe traumatic brain injury. The New England Journal of Medicine. 371 (26), 2467-2476 (2014).
  12. Wang, G. B., et al. Contralateral C7 to C7 nerve root transfer in reconstruction for treatment of total brachial plexus palsy: anatomical basis and preliminary clinical results. Journal of Neurosurgery. Spine. 29 (5), 491-499 (2018).
  13. Wilson, L., et al. The chronic and evolving neurological consequences of traumatic brain injury. The Lancet. Neurology. 16 (10), 813-825 (2017).
  14. Hua, X. Y., et al. Enhancement of contralesional motor control promotes locomotor recovery after unilateral brain lesion. Scientific Reports. 6, 18784(2016).
  15. Hua, X. Y., et al. Interhemispheric functional reorganization after cross nerve transfer: via cortical or subcortical connectivity. Brain Research. 1471, 93-101 (2012).
  16. Pan, F., Wei, H. F., Chen, L., Gu, Y. D. Different functional reorganization of motor cortex after transfer of the contralateral C7 to different recipient nerves in young rats with total brachial plexus root avulsion. Neuroscience Letters. 531 (2), 188-192 (2012).
  17. Yamashita, H., et al. Restoration of contralateral representation in the mouse somatosensory cortex after crossing nerve transfer. PLoS One. 7 (4), 35676(2012).
  18. Tavakoli, R., Nemska, S., Jamshidi, P., Gassmann, M., Frossard, N. Technique of minimally invasive transverse aortic constriction in mice for induction of left ventricular hypertrophy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (127), e56231(2017).
  19. Melhem, M., et al. A Hydrogel construct and fibrin-based glue approach to deliver therapeutics in a murine myocardial infarction model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (100), e52562(2015).
  20. Liu, B., et al. Myelin sheath structure and regeneration in peripheral nerve injury repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (44), 22347-22352 (2019).
  21. Overman, J. J., et al. A role for ephrin-A5 in axonal sprouting, recovery, and activity-dependent plasticity after stroke. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (33), 2230-2239 (2012).
  22. Yoshikawa, A., Nakamachi, T., Shibato, J., Rakwal, R., Shioda, S. Comprehensive analysis of neonatal versus adult unilateral decortication in a mouse model using behavioral, neuroanatomical, and DNA microarray approaches. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 22492-22517 (2014).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Uraz splotu ramiennegotransfer nerwu C7regeneracja nerwówanaliza elektromiograficznapowrót funkcji behawioralnychmechanizmy neuroplastyczności
Mysi model bezpośredniego zespolenia drogą przedrdzeniową do chirurgii krzyżowania się transferu nerwów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.