Prosta i skuteczna metoda konsekwentnego izolowania kardiomiocytów myszy

Summary

Złotym standardem w kardiologii dla komórkowych i molekularnych eksperymentów funkcjonalnych są kardiomiocyty. W artykule opisano adaptacje techniki innej niż Langendorff do izolowania kardiomiocytów myszy.

Abstract

Potrzeba powtarzalnych, ale technicznie prostych metod dających wysokiej jakości kardiomiocyty jest niezbędna do badań w biologii serca. Komórkowe i molekularne eksperymenty funkcjonalne (np. skurcze, elektrofizjologia, obieg wapnia itp.) na kardiomiocytach są złotym standardem w ustalaniu mechanizmów choroby. Mysz jest gatunkiem wybieranym do eksperymentów funkcjonalnych, a opisana technika służy w szczególności do izolacji kardiomiocytów myszy. Dotychczasowe metody wymagające aparatu Langendorffa wymagały wysokiego poziomu wyszkolenia i precyzji kaniulacji aorty, co często prowadziło do niedokrwienia. Dziedzina ta przesuwa się w kierunku metod izolacji wolnych od Langendorffa, które są proste, powtarzalne i dają żywotne miocyty do pozyskiwania danych fizjologicznych i hodowli. Metody te znacznie skracają czas niedokrwienia w porównaniu z kaniulacją aorty i skutkują wiarygodnym uzyskaniem kardiomiocytów. Nasza adaptacja do metody Langendorffa obejmuje wstępną perfuzję z lodowatym roztworem czyszczącym, zastosowanie platformy stabilizującej, która zapewnia stabilną igłę podczas perfuzji, oraz dodatkowe etapy trawienia w celu zapewnienia wiarygodnego uzyskania kardiomiocytów do wykorzystania w pomiarach funkcjonalnych i hodowli. Ta metoda jest prosta i szybka do wykonania i wymaga niewielkich umiejętności technicznych.

Introduction

Przez dziesięciolecia, podstawową ideą w literaturze biologii serca był molekularny mechanizm działania. Należy ustalić mechanizm działania w celu opublikowania wiarygodnych badań. Ugruntowaną strategią określania mechanizmu molekularnego są izolowane badania kardiomiocytów, które wymagają wysokiej jakości kardiomiocytów w celu uzyskania wiarygodnych danych. Eksperymenty komórkowe i molekularne przeprowadzane na kardiomiocytach w celu określenia mechanizmu działania są złotym standardem w badaniu skurczu¹, elektrofizjologia², cykl wapnia (Ca²⁺)³, czułość miofilamentu Ca²⁺⁴, cytoskeleton⁵, metabolizm^{6, wpływ} hormonów⁷, sygnalizacja molekuły⁸, badania leków⁹, itd. Mysz stała się gatunkiem wybieranym przez większość eksperymentów biologii serca ze względu na łatwość manipulacji genetycznej, jej niewielkie rozmiary, stosunkowo krótką żywotność, niski koszt itp¹⁰. Jednak niezawodna izolacja wysokiej jakości kardiomiocytów myszy nie jest trywialna przy obecnych technikach.

Labs izoluje kardiomiocyty od prawie 70 lat¹¹. Praktycznie wszystkie techniki izolacji kardiomiocytów opierają się na trawieniu serca za pomocą różnych enzymów (kolagenazy, proteazy, trypsyny itp.). We wczesnych okresach (1950-1960) stosowano metodę chunkową, która polegała na usunięciu serca, pokrojeniu na znacznie mniejsze kawałki i inkubacji w roztworze z kolagenazą/proteazą/trypsyną¹². W latach siedemdziesiątych laboratoria wdrożyły ulepszoną metodę "Langendorffa"¹³, która izolowała kardiomiocyty za pomocą techniki izolacji opartej na perfuzji tętnic wieńcowych (wsteczna perfuzja enzymu za pomocą aparatu Langendorffa); Ta technika pozostaje dominującą metodą izolacji miocytów w tej dziedzinie dzisiaj, ~ 50 lat później^14,15,16. Ostatnie prace przeniosły się na kaniulację serca in vivo w celu ograniczenia czasu niedotlenienia i uszkodzeń niedokrwiennych, co skutkuje lepszymi izolacjami kardiomiocytów (lepsza wydajność i wyższa jakość)¹⁷. Ostatnio przekształciło się to w wykonywanie in vivo, perfuzji serca bez Langendorffa^{18,19,20,21,22}. Rozwinęliśmy technikę izolacji kardiomiocytów bez Langendorffa w oparciu o technikę Ackers-Johnson et al.¹⁸ i dostosowaliśmy różne elementy z wielu poprzednich technik izolacji. Te kluczowe adaptacje obejmują wstrzyknięcie lodowatego bufora oczyszczającego i włączenie platformy nośnej w celu ustabilizowania igły, co pozwala na zmniejszenie manipulacji sercem. Szczegółowa w tej technice jest również kontrola temperatury wstrzykiwanych (37 °C), która skróciła czas między wstrzyknięciem in vivo a trawieniem ze względu na mniejszą perfuzję EDTA, jak wcześniej opublikowano¹⁸. Zmniejszając manipulację serca, a tym samym minimalizując rozmiar miejsca nakłucia, uzyskuje się dokładną i stałą perfuzję tętnic wieńcowych. Udoskonaliliśmy również technikę za pomocą wtórnej metody roztwarzania w kawałkach, ilości EDTA w wstrzykniętym buforze czyszczącym i zmieniliśmy pH. Opisana przez nas technika jest bardziej niezawodna, bardziej wydajna i nie wymaga intensywnego szkolenia/praktyki w porównaniu z użyciem aparatu Langendorffa (Tabela 1).

Protocol

Wszystkie procedury przeprowadzone w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Stanowym Ohio zgodnie z wytycznymi NIH.

1. Przygotowanie roztworu

UWAGA: Proszę zobaczyć Tabelę 2 dla stężeń.

1. Izolacja wstępna (do 2 tygodni przed izolacją miocytów)
   1. Baza buforowa perfuzyjna: Przygotuj 1 l perfuzyjnej bazy buforowej (NaCl, KCl, NaH₂PO₄, HEPES, glukoza i BDM) w 1 l ultraczystej 18,2 MΩ·cm H₂O. Dostosuj do pH 7,4 przed sterylną filtracją 0,22 μm. Przechowywać w temperaturze 4 °C do dnia izolacji.
   2. Bufor czyszczący: Przygotować 1 l buforu czyszczącego (NaCl, KCl, NaH₂PO₄, HEPES, glukoza, EDTA i BDM) w 1 l ultraczystego 18,2 MΩ·cm H₂O. Dostosować do pH 7,4 przed sterylną filtracją 0,22 μm. Przechowywać w temperaturze 4 °C do dnia izolacji.
   3. 100 mM roztwór podstawowy CaCl₂: Odważyć 1,11 g CaCl₂ i rozpuścić w 100 ml ultraczystego 18,2 MΩ·cm H₂O. Przechowywać w temperaturze pokojowej do dnia izolacji.
   4. Podwielokrotności liberazy: Rozpuść 5 mg enzymów trawiennych w 5 ml sterylnej, wolnej od RNaz wody. Przygotować porcje o objętości 0,8 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C do dnia izolacji.
   5. Laminowanie naczyń: Nałóż 100 μl 40 μg/ml mysiej lamininy na sterylne płytki Petriego o pojemności 30 ml ze szklanym dnem. Pozostaw na 30 minut i usuń nadmiar lamininy. Umieść lamininę na szalce Petriego z inkubacją UV w temperaturze pokojowej na 30 minut. Przechowywać w temperaturze 4 °C do dnia izolacji (laminowane szalki Petriego mogą być używane do 2 tygodni).
   6. Pożywki DMEM: W komorze bezpieczeństwa biologicznego dodaj 2,5 ml FBS, 0,5 ml penicyliny-streptomycyny (50 U/mL-50 μg) i 1 ml 500 mM BDM do 46 ml DMEM. Przechowywać w temperaturze 4 °C do dnia izolacji (podłoże można stosować do 2 tygodni).
   7. Pożywka M199: Przygotuj 1 l pożywki M199 (NaHCO₃, HEPES, L-glutation, M199, BDM i BSA) w 1 l ultraczystej pożywki 18,2 MΩ·cm H₂O. Dostosuj do pH 7,4 przed sterylną filtracją (filtr 0,22 μm). Przechowywać w temperaturze 4 °C do dnia izolacji.
   8. 500 mM bulionu BDM: Dodać 0,5 g BDM do 10 ml ultraczystego 18,2 MΩ·cm H₂O. Przechowywać w temperaturze 4 °C do dnia izolacji.
   9. Tworzenie platformy stabilizującej: Uformuj ciastolinę wokół podstawy igły wkręconej w kran Luer. Uformuj do szalki Petriego, która będzie zawierała serce i upewnij się, że igła znajduje się na odpowiedniej wysokości do wstrzyknięcia komory (~ 5 mm nad dnem naczynia).
2. Dzień izolacji
   1. Bufor perfuzyjny: W dniu izolacji dodać 9,5 mg MgCl₂ do 100 ml perfuzyjnej bazy buforowej. Pozostawić do całkowitego wymieszania przed wyjęciem 30 ml gotowego buforu perfuzyjnego i umieścić w czystej, szklanej butelce o pojemności 100 ml z szerokim otworem i zakrętką (bufor do wytrawiania).
      UWAGA: Dodatki te można wykonać w dniu izolacji bez dodatkowych korekt pH, ponieważ ich dodatek nieznacznie zmienia pH.
      1. Usunąć 12 ml buforu perfuzyjnego i odłożyć na bok (bufor zatrzymujący). Wlej pozostałe 58 ml buforu perfuzyjnego do innej czystej, szklanej butelki o pojemności 100 ml z szerokim otworem i zakrętką. Przechowywać pozostały bufor perfuzyjny w temperaturze 37 °C przez cały czas izolacji.
   2. Bufor do wytrawiania: Dodać 7,5 μl 100 mM CaCl₂ do 30 ml buforu perfuzyjnego, aby uzyskać końcowe stężenie 25 μM. Bezpośrednio przed izolacją dodać 770 μl liberazy do buforu wytrawiającego dla końcowego stężenia 26 μg/ml.
   3. Bufor zatrzymujący: Rozpuścić 240 mg BSA w 12 ml buforu perfuzyjnego. Przechowywać w temperaturze 37 °C przez cały czas izolacji.
   4. Bufor czyszczący: Przygotować strzykawkę o pojemności 3 ml z buforem czyszczącym i usunąć igłę z pęcherzyków. Przechowywać na lodzie do momentu izolacji.

2. Przygotowanie rozmaitości

1. Wyczyść kolektor o kontrolowanej temperaturze świeżo przygotowanym buforem perfuzyjnym, uważając, aby nie pozostały żadne pęcherzyki. Za pomocą złącza Luer lock wkręć igłę 27 G i usuń pęcherzyki powietrza. Oczyszczony kolektor jest niezbędny do udanej izolacji.

3. Przygotowanie zwierząt

1. Wstrzyknąć myszowi dootrzewnowo 100 mg/kg ketaminy i 20 mg/kg ksylazyny w przeliczeniu na masę ciała bezpośrednio przed izolacją. W procedurze wykorzystano samca, 4-miesięczną mysz C57Bl/6.
2. W razie potrzeby umieść mysz na podgrzewanej podkładce chirurgicznej, aby zachęcić do sedacji. Zwiń ramiona myszy i przyklej kończyny i podstawę ogona do niebieskiej pieluchy laboratoryjnej. Upewnij się, że zwierzę jest w pełni znieczulone przez wycofanie odruchu szczypania palców u stóp. Nałóż sterylną serwetkę wokół obszaru operacyjnego.

4. Procedura izolacji kardiomiocytów

1. Odsłoń mostek myszy i, bocznie do linii środkowej, przetnij proksymalnie przez żebra i do pachy. Delikatnie przeciąć całkowicie przeponę, zapewniając płytkie cięcia, aby uniknąć serca. Zaciśnij mostek hemostatem i złóż żebra do tyłu, aby odsłonić klatkę piersiową.
2. Delikatnie usuń osierdzie z serca i całkowicie przetnij żyłę główną dolną, bezpośrednio dystalnie do serca. Użyj strzykawki o pojemności 3 ml z igłą 27 G, aby szybko wstrzyknąć 3 ml lodowatego buforu oczyszczającego do prawej komory serca w ciągu 1 minuty.
3. Delikatnie przytrzymaj serce za pomocą pęsety i odsuń się od ciała, odsłaniając jak najwięcej aorty. Za pomocą hemostatu zaciśnij aortę wstępującą, uważając, aby nie zacisnąć przedsionków, i wytnij serce z klatki piersiowej.
4. Szybko przenieś zaciśnięte serce na pokrywkę polipropylenowej szalki Petriego z około 10 ml ciepłego buforu perfuzyjnego. Umieścić zaciśnięte serce na platformie nośnej i za pomocą stabilizowanej igły 27 G przymocowanej do kolektora wstrzyknąć 10 ml buforu perfuzyjnego o kontrolowanej temperaturze 37 °C do lewej komory w ciągu 5 minut.
5. Przenieść zaciśnięte serce i platformę nośną na szalkę Petriego z około 5 ml buforu wytrawiającego. Zamień strzykawki wejściowe na strzykawkę o pojemności 50 ml z 25 ml buforu wytrawiającego.
6. Przed wstrzyknięciem oczyścić kolektor z pęcherzyków i pozostałego buforu perfuzyjnego. Ostrożnie umieścić igłę w tym samym położeniu igły w wierzchołku lewej komory.
7. Za pomocą pompy perfuzyjnej wstrzyknąć bufor wytrawiający o kontrolowanej temperaturze 37 °C do lewej komory na 15 minut za pomocą strzykawki o pojemności 50 ml. Kontrolować temperaturę roztworu za pomocą płaszcza wodnego uprzednio skalibrowanego w taki sposób, aby wyrzucał roztwór o temperaturze 37 °C na koniec igły.
8. Usunąć komory z przedsionków i przenieść do zlewki o pojemności 10 ml. Dodać 3 ml buforu wytrawiającego do zlewki i ostrymi nożyczkami pokroić komory na duże kawałki. Przykryj zlewkę folią aluminiową i umieść w roztrząsającej łaźni wodnej podgrzanej do 37 °C na 5 minut.
9. Wyrzucić supernatant, uważając, aby nie usunąć żadnych kawałków tkanki. Ponownie zawiesić fragmenty tkanki w 3 ml buforu wytrawiającego i rozcierać przez około 4 minuty lub do uzyskania jednorodnej mieszaniny.
10. Przefiltruj komórki przez nylonowe sitko o średnicy 70 μm do probówki polipropylenowej o pojemności 50 ml.
11. Umieścić filtrat z powrotem w okrągłodennej probówce polipropylenowej o pojemności 14 ml i odwirowywać przez 1 minutę przy 100 obr./min. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 3 ml buforu zatrzymującego.
12. Dodać 54 μl 100 mM CaCl₂ do zawieszonych komórek, aby uzyskać końcowe stężenie CaCl₂ 1,8 mM. Ten krok można również wykonać stopniowo, aby zwiększyć wydajność komórek.
13. Pozostawić żywe komórki do osadzenia się grawitacyjnie przez 10 minut przed usunięciem supernatantu zawierającego martwe komórki. Zawiesić osad w roztworze do przechowywania (roztwór perfuzyjny z 200 μM CaCl₂). Komórki te mogą być teraz wykorzystywane do eksperymentów funkcjonalnych (tj. obrazowanie/kurczenie wapnia, zacisk łaty itp.), hodowli itp.
    UWAGA: Komórki mogą być również ponownie zawieszone w roztworach zależnych od laboratorium lub eksperymentu.

5. Hodowla komórkowa

1. Policz komórki za pomocą hemocytometru lub za pomocą widoku pola za pomocą szkiełka nakrywkowego w siatkę. Ponieważ miocyty są bardzo duże, liczenie za pomocą hemocytometru nie zawsze jest dokładne. Służy to do zorientowania się, ile w przybliżeniu komórek uzyskano z izolacji.
2. Rozcieńczyć komórki do ~ 25 000 komórek/ml za pomocą pożywki DMEM. Dodaj 1 ml roztworu komórkowego do każdej studzienki.
3. Inkubować w temperaturze 37 °C, 95%_O2, 5% CO₂ przez 2 godziny.
4. Delikatnie odessać pożywkę DMEM z każdej studzienki i dodać 2 ml pożywki M199.
5. Inkubować w temperaturze 37 °C, 95%_O2, 5% CO₂ przez okres do 24 godzin.

Results

Jest kilka elementów do zbadania przy określaniu sukcesu izolacji. Po pierwsze, kardiomiocyty muszą mieć kształt pręcików bez pęcherzyków błonowych, takich jak komórki wyizolowane w Rysunek 1. Typowa izolacja da ~ 80% miocytów w kształcie pręcików. Jeśli izolacja daje mniej niż 50% komórek w kształcie pręcików, uważa się, że izolacja jest nieudana i kardiomiocyty nie są używane. Wreszcie, kardiomiocyty powinny być w stanie spoczynku. Spontanicznie skurczowe miocyty wykazują nietolerancję Ca2+ i dostar...

Discussion

Główną zaletą naszej techniki izolacji kardiomiocytów bez użycia metody Langendorffa jest to, że ogranicza ona niedotlenienie i czas niedokrwienia, ponieważ nie wymaga kaniulacji do aparatu Langendorffa. W przeciwieństwie do klasycznych technik Langendorffa, które zajmują kilka minut na usunięcie, oczyszczenie i zawieszenie serca, często powodując niedokrwienne uszkodzenie miocytów, nasza metoda obejmuje oczyszczanie krwi in vivo za pomocą lodowatego roztworu oczyszczającego. Lodowaty bufor oczyszczając...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cc Bd Luer-Lok Strzykawka	Fisher Sci	14-827-52
10 ml Pyrex Low-Form Beaker	Cole-Palmer	UX-34502-01
100 mL polipropylenowa nakrętka szklana butelka do przechowywania mediów	DWK Life Sciences	UX-34523-00
14 ml Probówki polipropylenowe z okrągłym dnem z nakrętką	Fisher Sci	14-959-11B
Monoksymus 2,3-butanodionu	Sigma	B0753	>98%
3 cc BD Luer-Lok Strzykawka	Fisher Sci	14-823-435
35 mm naczynia ze szklanym dnem	MatTek Corporation	P35G-1.0-20-C
50 mL BD Strzykawka bez igły	Fisher Sci	13-689-8
50 mL Stożkowe probówki	Cole-Palmer	EW-22999-84
95% O2 5% CO2
AIMS Kosmiczna żelowa poduszka grzewcza	Fisher Sci	14-370-223
BD PrecisionGlide 27 G X 1/2" Igły podskórne	Becton Dickinson	305109
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma	A3803 Frakcja	szoku cieplnego, liofilizowany proszek, zasadniczo bez kwasów tłuszczowych, >98%
dwuwodny chlorek wapnia	Sigma	C7902	>99%
D-(+)-Glucose	Sigma	G7021	Nadaje się do hodowli komórkowych, >99,5%
DMEM	Fisher Sci	11965092
EDTA	Fisher Sci	AAA1071336
Falcon 100 mm Naczynie do hodowli komórkowych z powłoką TC	Corning	353003
FBS	R& D Systems (Bio-techne)	S11195
Fisherbrand Isotemp Podgrzewane cyrkulatory zanurzeniowe	Fisher Sci	13-874-432
Kleszcze hemostatyczne Hartman Mosquito	World Precision Instruments	15921
Zestaw studzienek liczeniowych Hausser Scientific Hy-Lite	Fisher Sci	02-671-11
HEPES	Sigma	H4034	>99,5%
Taśma do etykietowania	Fisher Sci	15-901-10R
Legato 100 Pompa strzykawkowa	kdScientific	788100
L-glutation	Fisher Sci	ICN19467980
Liberase TH Research Grade	Sigma	5401135001	Wysokie stężenie termolizyny
M199	Fisher Sci	MT10060CV
Chlorek	magnezuInvitrogen	AM9530G
Mouse Laminin	Corning	354232
Pen/Strep	Fisher Sci
Chlorek potasu	Sigma	P5405	>99%
Precyzyjna cyfrowa kąpiel wodna posuwisto-zwrotna	ThermoFisher Scientific	TSCIR19
Wodorowęglan sodu	Sigma	S5761	Nadaje się do komórek kultura
Chlorek sodu	Sigma	S5886	>99%
Fosforan sodu jednozasadowy	Sigma	S5011	>99%
Sterylne sitko komórkowe 70 i mikro; m	Fisher Sci	22-363-548
Cienkie nożyczki studenckie	Fine Science Tools	91460-11
Podkłady chłonne VWR	Fisher Sci	NC9481815