Wzmocnienie relaksacji paramagnetycznej do wykrywania i charakteryzowania samoasocjacji wewnętrznie nieuporządkowanych białek

Podsumowanie

Przedstawiono protokół zastosowania spektroskopii NMR wzmacniającej relaksację paramagnetyczną do wykrywania słabych i przejściowych interakcji między- i wewnątrzcząsteczkowych w białkach wewnętrznie nieuporządkowanych.

Streszczenie

Nieuporządkowane wewnętrznie białka i wewnętrznie nieuporządkowane regiony w białkach stanowią dużą i funkcjonalnie znaczącą część ludzkiego proteomu. Wysoce elastyczny charakter tych sekwencji pozwala im na tworzenie słabych, dalekosiężnych i przejściowych interakcji z różnymi partnerami biomolekularnymi. Specyficzne, ale o niskim powinowactwie interakcje sprzyjają rozwiązłemu wiązaniu i umożliwiają pojedynczemu, wewnętrznie nieuporządkowanemu segmentowi interakcję z wieloma miejscami docelowymi. Ze względu na przejściowy charakter tych interakcji, mogą być one trudne do scharakteryzowania za pomocą metod biologii strukturalnej, które opierają się na białkach w celu utworzenia pojedynczej, dominującej konformacji. NMR wzmacniający relaksację paramagnetyczną jest użytecznym narzędziem do identyfikacji i definiowania strukturalnych podstaw słabych i przejściowych oddziaływań. Opisano szczegółowy protokół wykorzystania wzmocnienia relaksacji paramagnetycznej do scharakteryzowania słabo zaludnionych kompleksów spotkań, które tworzą się między wewnętrznie nieuporządkowanymi białkami a ich białkiem, kwasem nukleinowym lub innymi partnerami biomolekularnymi.

Wprowadzenie

Zaburzenie wewnętrzne (ID) opisuje białka (IDP) lub regiony w białkach (IDR), które nie składają się spontanicznie w stabilne struktury drugorzędowe lub trzeciorzędowe, ale są biologicznie aktywne. Ogólnie rzecz biorąc, funkcją IDP/IDR jest ułatwianie specyficznych, ale odwracalnych interakcji z biomolekułami w warunkach fizjologicznych¹. Tak więc IDP i IDR są zaangażowane w szereg funkcji komórkowych, w tym rekrutację, organizację i stabilizację kompleksów wielobiałkowych, na przykład montaż i aktywność spliceosomu ², rekrutację i organizację składników w miejscach uszkodzenia DNA³, organizację i stabilizację rekrutacji kompleksów transkrypcyjnych⁴, lub remodelera chromatyny BAF⁵. Dodatkowo, IDP znajdują się w węzłach sygnalizacyjnych, gdzie ich promiskuityzm dla różnych partnerów wiążących umożliwia im pośredniczenie w przekazywaniu informacji przez sieci białek komórkowych⁶. Niedawne prace ujawniły również skłonność regionów IDR do samokojarzenia się tworzących kondensaty biomolekularne w procesie separacji faz ciecz-ciecz⁷. Obecnie uważa się, że wiele z wyżej wymienionych funkcji związanych z ID wiąże się z jakimś aspektem tworzenia kondensatu⁸. Pomimo znaczenia ID dla składania kompleksów biomolekularnych, stabilizacji, rusztowania i transdukcji sygnału, szczegóły atomowe ich specyficznych oddziaływań są trudne do zidentyfikowania, ponieważ IDP i IDR zazwyczaj nie są podatne na badania strukturalne przy użyciu krystalografii rentgenowskiej lub kriogenicznej mikroskopii elektronowej.

Magnetyczny rezonans jądrowy (NMR) jest idealną techniką do badania ID, ponieważ nie jest zależny od obecności sztywnych lub jednorodnych zespołów strukturalnych, ale informuje o bezpośrednim lokalnym środowisku poszczególnych jąder. Na częstotliwość rezonansową lub przesunięcie chemiczne jądra w danej cząsteczce wpływają słabe pola magnetyczne indukowane przez lokalny rozkład elektronowy, który z kolei zależy od długości wiązań, kątów, bliskości innych jąder, oddziaływań z partnerami wiążącymi i innych czynników⁹. W ten sposób każde jądro działa jak unikalna, specyficzna dla danego miejsca sonda strukturalna wrażliwa na zmiany w lokalnym środowisku chemicznym. Pomimo tych zalet, NMR jest techniką masową, a obserwowane przesunięcie chemiczne jest średnią ze wszystkich środowisk pobranych przez dane jądro. Szereg technik NMR, z których wiele opisano w tym wydaniu, został opracowany w celu odzyskania strukturalnych, dynamicznych i kinetycznych informacji o wysokoenergetycznych, słabo zaludnionych konformacjach biomolekularnych zawartych w uśrednionym przesunięciu chemicznym^10,11. Chociaż są one przejściowo zaludnione, identyfikacja i kwantyfikacja tych stanów są ważne dla określenia szczegółów mechanizmów funkcjonalnych¹². Na przykład, w przypadku IDP i IDR, zespół konformacyjny może być stronniczy w kierunku preferencyjnego próbkowania konformacji, które są produktywne dla tworzenia kompleksów spotkań z fizjologicznymi partnerami wiążącymi. Wykrywanie tych stanów, jak również identyfikacja specyficznych dla reszt interakcji między- i wewnątrzcząsteczkowych oraz dynamiki, są ważne dla określenia podstawowych mechanizmów strukturalnych funkcji białek i tworzenia kompleksów.

Opisano protokół do wykorzystania NMR z rozszerzeniem relaksacji paramagnetycznej (PRE) do badania przejściowych, nisko zaludnionych stanów ważnych dla tworzenia kompleksów biomolekularnych za pośrednictwem IDP/IDR¹³. Podejście to jest przydatne do badania przejściowych interakcji białko-białko, takich jak te, które promują składanie włókienek amyloidowych z α-synukleiny^14,15 lub samoasocjacji FUS¹⁶, a także do charakteryzowania specyficznych interakcji białko-białko, takich jak między białkami sygnałowymi¹⁷. Przedstawiono przykład samoasocjującego się IDP, w którym określone interakcje między- i wewnątrzcząsteczkowe skutkują preferencyjnie zagęszczonymi stanami, a także interakcjami specyficznymi dla miejsca, które napędzają samoasocjację.

PRE powstaje w wyniku magnetycznego oddziaływania dipolarnego jądra do centrum paramagnetycznego z izotropowym tensorem g, zwykle dostarczanym w postaci niesparowanego elektronu na grupie nitroksydowej lub jako paramagnetyczny atom metalu¹⁸ (Rysunek 1). Podczas gdy atomy z anizotropowymi tensorami g również wywołują efekt PRE, analiza tych układów jest trudniejsza ze względu na efekty zakłócające powodowane przez przesunięcia pseudokontaktowe (PCS) lub szczątkowe sprzężenie dipolarne (RDC)^13,19. Siła oddziaływania między jądrem a centrum paramagnetycznym zależy od odległości <^r-6> między nimi. Oddziaływanie to powoduje wzrost szybkości relaksacji jądrowej, co powoduje wykrywalne poszerzenie linii nawet dla oddziaływań dalekiego zasięgu (~10-35 A), ponieważ moment magnetyczny niesparowanego elektronu jest tak silny^20,21. Wykrywanie stanów przejściowych za pomocą PRE jest możliwe, jeśli spełnione są następujące dwa warunki; (1) oddziaływanie przejściowe zachodzi w szybkiej wymianie w skali czasowej NMR (obserwowane przesunięcie chemiczne jest średnią ważoną populacją stanów wymiany); oraz (2) odległość jąder od środka paramagnetycznego jest krótsza w stanie przejściowo zaludnionym niż w stanie głównym¹¹. Poprzeczny PRE jest oznaczony Γ₂ i ze względów praktycznych oblicza się go na podstawie różnicy w szybkościach ^relaksacjipoprzecznej 1 H między próbką zawierającą centrum paramagnetyczne a kontrolą diamagnetyczną. W celu dogłębnego omówienia teorii PRE i związanych z nią pseudokontaktowych przesunięć w reżimach szybkiej i wolnej wymiany, czytelnik jest odsyłany do obszernych recenzji autorstwa Clore i współpracowników^13,22. Tutaj rozważana jest tylko sytuacja, w której ¹H N-Γ₂ znajduje się w reżimie szybkiej wymiany, gdzie ze względu na zależność PPOD od ^r-6, obserwowana szybkość relaksacji jest związana zarówno z odległością, na jaką centrum paramagnetyczne zbliża się do jądra, jak i z ilością czasu, jaki spędza w tej konformacji. Dlatego przejściowe konformacje, które nie obejmują bliskiego zbliżenia, wytwarzają małe PRE, podczas gdy bliższe interakcje, nawet jeśli krótkotrwałe, wytworzą większe PRE.

Dla IDPs, PRE służy do mierzenia i różnicowania interakcji zachodzących w obrębie pojedynczej cząsteczki (wewnątrzcząsteczkowej) i między oddzielnymi cząsteczkami (międzycząsteczkowej). Poprzez przyłączenie centrum paramagnetycznego do widocznego (np. 15 N-znakowanego ¹⁵N) lub niewidocznego NMR (np. naturalna obfitość ¹⁴N), można określić źródło (między- lub wewnątrzcząsteczkowe) PRE (Rysunek 2). Mutageneza ukierunkowana na miejsce, która wprowadza resztę cysteiny, jest wygodnym podejściem do przyłączenia centrum paramagnetycznego (etykiety spinowej) do białka²³. Zaproponowano kilka typów cząsteczek do wykorzystania jako znaczniki spinowe, w tym chelatujące metale (na bazie EDTA) i wolne rodniki (na bazie nitroxide)²⁴. Opisano różne etykiety spinowe nitrosydu, które są dostępne z różnymi substancjami chemicznymi reagującymi z cysteiną, takimi jak metanotiosulfonian, maleimid i jodoacetamid^25,26 (Rysunek 1). Nieodłączna elastyczność znacznika lub łącznika może być problematyczna w niektórych analizach, a w takich sytuacjach zaproponowano różne strategie ograniczania ruchu znacznika, takie jak dodanie dużych grup chemicznych lub użycie drugiego łącznika do zakotwiczenia znacznika w białku (przyłączenie dwóch miejsc)^{27, 28}. Dodatkowo, dostępne na rynku znaczniki mogą zawierać białka diastereomeryczne, ale generalnie nie przyczyni się to do obserwowanego PRE²⁹. Opisano zastosowanie 3-Maleimido-PROXYL przyłączonego do wolnej cysteiny za pomocą chemii maleimidu, ponieważ jest on łatwo dostępny, opłacalny, nieodwracalny, a środek redukujący tris(2-karboksyetylo)fosfinę (TCEP) może być utrzymywany w roztworze przez cały czas reakcji znakowania. Ponieważ 3-Maleimido-PROXYL ma izotropowy tensor g, nie indukowane są PCS ani RDC, a te same przypisania przesunięć chemicznych mogą być stosowane zarówno dla próbek paramagnetycznych, jak i diamagnetycznych¹³.

1 H_{N-T 2} jest mierzone za pomocą strategii dwóch punktów czasowych (T_a, T_b), która wcześniej okazała się tak dokładna, jak zebranie pełnej serii ewolucji składającej się z 8 do 12 punktów czasowych³⁰. Pierwszy punkt czasowy (T a) jest ustawiony tak blisko _zera, jak to tylko możliwe, a optymalna długość drugiego punktu czasowego zależy od wielkości największego oczekiwanego PRE dla danej próbki i można go oszacować ze wzoru: T_b ~ 1,15/(R_2,dia + Γ₂), gdzie R_2,dia reprezentuje R₂ próbki diamagnetycznej¹³. Jeśli wielkość największych PLAST jest nieznana, ustawienie T_b na ~ jednokrotność ¹H T₂ białka jest dobrym wstępnym oszacowaniem i dalej optymalizowane przez dostosowanie T₂ w celu poprawy sygnału do szumu. Ta dwupunktowa strategia pomiarowa znacznie skraca czas eksperymentu wymagany do pomiaru PPOD i daje czas na większe uśrednianie sygnału, zwłaszcza że stosunkowo rozcieńczone próbki są używane w celu zminimalizowania skutków niespecyficznych kontaktów między cząsteczkami. Sekwencja impulsów oparta na HSQC jest używana do pomiaru ¹H_{N-T 2} i została szczegółowo opisana w innym miejscu³⁰. W celu poprawy czułości, twarde impulsy transferów INEPT do przodu i do tyłu można zastąpić impulsami kształtowymi; alternatywnie, sekwencję można łatwo przekształcić w oparty na TROSY readout³¹. Ponieważ IDP zazwyczaj mają znacznie dłuższe współczynniki relaksacji poprzecznej, co skutkuje węższymi szerokościami linii (ze względu na nieodłączne zaburzenie) niż białka globularne o podobnej wielkości, długie czasy akwizycji w wymiarze pośrednim można wykorzystać do poprawy rozdzielczości widmowej i złagodzenia ograniczenia dyspersji przesunięcia chemicznego nieodłącznie związanego z IDP.

PRE jest użytecznym narzędziem do badania interakcji białko-białko i białko-kwas nukleinowy, szczególnie interakcji przejściowych lub słabo zaludnionych. Dostarczony jest szczegółowy protokół przygotowania próbki NMR odpowiedniej do pomiaru PRE, w tym etapy oczyszczania białka, znakowanie wirowe w miejscu, ustawianie i kalibracja programu impulsowego, przetwarzanie i interpretacja danych NMR. W całym tekście zwrócono uwagę na ważne względy eksperymentalne, które mogą mieć wpływ na jakość danych i wynik eksperymentu, w tym stężenie próbki, wybór znacznika spinowego i usunięcie składników paramagnetycznych.

Protokół

Ogólne wymagania dotyczące protokołu: urządzenia do oczyszczania białek, spektrometr UV-Vis, spektrometr NMR wysokiego pola i oprogramowanie operacyjne, oprogramowanie do analizy końcowej, w tym; NMRPipe³², Sparky³³, (lub CCPN Analysis³⁴, lub NMRViewJ³⁵).

1. Rekombinowana ekspresja i oczyszczanie białka do pomiarów PRE

1. Zaprojektuj konstrukt wyrażenia dla białka będącego przedmiotem zainteresowania, tak aby obecna była pojedyncza reszta cysteiny. Do wprowadzenia wolnej cysteiny w różnych pozycjach w białku będącym przedmiotem zainteresowania, wymagane będą liczne mutacje³⁶.
2. Odekspresuj i oczyść naturalną obfitość (¹⁴N) lub ¹⁵N znakowaną próbką białka będącego przedmiotem zainteresowania przy użyciu ustalonego protokołu³⁷.
   UWAGA: Systemy ekspresji E. coli zapewniają opłacalną i solidną metodę ekspresji białek rekombinowanych, ponieważ wzbogacenie izotopowe ¹⁵N jest minimalnym wymogiem dla biomolekularnej heterojądrowej spektroskopii NMR. Typowymi etapami są ekspresja w minimalnym pożywce, oczyszczanie chromatograficzne i usuwanie znacznika oczyszczania powinowactwa. Protokół ten zakłada, że ustanowiono solidny protokół ekspresji i oczyszczania, który może wyprodukować wystarczającą ilość białka o odpowiedniej jakości do badań NMR.
   1. Utrzymuj 1 mM środek redukujący (DTT lub TCEP) w na wszystkich etapach oczyszczania, aby zapobiec reakcji wolnej cysteiny i tworzeniu międzycząsteczkowych wiązań dwusiarczkowych dla IDPs.
      UWAGA: Niektóre systemy mogą być bardziej tolerancyjne i mniej podatne na agregację w warunkach nieredukcyjnych, w zależności od specyficznych cech białka, a także temperatury, pH i systemu buforowego wybranego do oczyszczania³⁸.
   2. Przed kontynuowaniem usuń znaczniki powinowactwa używane do oczyszczania, ponieważ mogą one niespecyficznie oddziaływać z białkiem w nieprzewidywalny sposób lub zawierać reaktywne reszty cysteiny, które mogą nieumyślnie służyć jako niezamierzone miejsce przyczepu.
   3. Przygotować próbkę referencyjną znakowaną ¹⁵N bez mutacji cysteiny zmieszanej z rozpuszczalną wersją znakowania spinowego w celu oceny udziału pre rozpuszczalnika.

2. Sprzężenie etykiety spinowej 3-Maleimido-PROXYL nitroxide

1. Oczyszczone białko należy przechowywać lub wymieniać w odgazowanym buforze zawierającym 50 mM Tris pH 7 i 1 mM TCEP; bufor może również zawierać do 8 M mocznika, jeśli jest to konieczne do poprawy rozpuszczalności białek.
   Alternatywnie, szybko rozcieńczyć podstawowy roztwór białka do co najmniej 10 równoważników objętości odgazowanego 50 mM Tris pH 7 i 1 mM buforu TCEP. Upewnij się, że stężenie białka przed dodaniem spin-label wynosi co najmniej 100 μM.
2. Dodaj proxyl 3-Maleimido z roztworu podstawowego do 20-krotnego molowego nadmiaru interesującego nas białka. Chronić próbkę przed światłem i tlenem i inkubować przez noc w temperaturze pokojowej lub 4 °C; Delikatne kołysanie lub nutacja mogą poprawić wydajność etykietowania.
3. Przygotować roztwory podstawowe spin-labelu, rozpuszczając proksyl 3-maleimido w proszku w 95% etanolu. Podwielokrotności materiału mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C przez okres krótszy niż 6 miesięcy.
4. Etap krytyczny: Usunąć nieprzereagowaną wolną etykietę wirową, aby zapobiec powstawaniu niespecyficznych pre-enzymów rozpuszczalnikowych. Osiągnąć to poprzez filtrację żelową lub (najlepiej) intensywną dializę próbki białka. Ten etap spowoduje również wprowadzenie białka do buforu odpowiedniego dla NMR.
   UWAGA: Środki redukujące powinny być przygotowywane na świeżo i należy wziąć pod uwagę kompatybilność między składnikami bufora; Na przykład TCEP ulega szybkiej degradacji w opartych na fosforanach i należy unikać tej kombinacji³⁹.
5. Wszystkie stosowane od tego etapu należy traktować żywicą chelatującą selektywną dla metali dwuwartościowych i przejściowych w celu usunięcia jonów paramagnetycznych lub wygaszaczy na etykiecie spinowej. Jeżeli białko nie może być przechowywane w buforze NMR, należy skoncentrować białko, które ma być szybko rozcieńczone, w buforze odpowiednim dla NMR.
6. Monitorowanie efektywności inkorporacji spin-label.
   1. Użyj odczynnika Ellmana (5,5-dithio-bis-(kwas 2-nitrobenzoesowy) do ilościowego oznaczania wolnych grup sulfhydrylowych w roztworze⁴⁰.
      UWAGA: Szczegółowe protokoły dostępne są u producenta. Do celów niniejszego artykułu ważne jest określenie włączenia znakowania spinowego, stężenie wolnych grup sulfhydrylowych jest porównywane z całkowitym stężeniem białka. Procent wolnych grup sulfhydrylowych to procent cząsteczek, które nie mają dołączonej etykiety spinowej nitroksydu.
   2. Monitoruj intensywność piku odpowiadającego znakowanej resztce cysteiny, aby ocenić włączenie znacznika spinowego do białka będącego przedmiotem zainteresowania.
      UWAGA: Jest to szybkie i skuteczne podejście do określenia stopnia znakowania spinowego białka. Całkowite włączenie znacznika spinowego spowoduje zniknięcie piku z widma. Przy słabej dyspersji charakterystycznej dla IDPs, pik odpowiadający zmutowanej reszcie cysteiny może nie zawsze być łatwo zidentyfikowany, dlatego zaleca się użycie odczynnika Ellmana (krok 2.6.1).

3. Przygotuj próbkę NMR do pomiaru wewnątrz- lub międzycząsteczkowego PRE

1. Przygotowanie próbki do pomiaru wewnątrzcząsteczkowego PRE
   1. Przygotować ¹⁵N wzbogacone izotopowo, znakowane spinowo białko o stężeniu co najmniej 100 μM, ale nie większym niż 300 μM w buforze odpowiednim dla NMR. Całkowita objętość próbki (w tym_D2O) wynosi 500 - 550 μL.
      UWAGA: Typowe NMR obejmują fosforany, octan, (dwu)węglan i TRIS. Odpowiednie mogą być również Good, takie jak MES, HEPES. Zachowaj ostrożność podczas wybierania, aby upewnić się, że nie ma reaktywności krzyżowej z innymi składnikami roztworu.
   2. Upewnij się, że pH wynosi ~7,2 lub mniej, aby zminimalizować skutki wymiany protonów amidowych z wodą. Utrzymuj stężenie soli na jak najniższym poziomie (zwykle poniżej 150 mM), chociaż głównym celem jest utrzymanie stabilności białka.
      UWAGA: Podejścia do przeprowadzania eksperymentów NMR w warunkach wysokiej zawartości soli zostały opisane gdzie indziej⁴¹.
2. Przygotowanie próbki do pomiaru międzycząsteczkowego PRE
   1. Wykonaj ten krok lub krok 3.1; nie są one wykonywane jednocześnie. Przygotuj ¹⁴N naturalnego białka znakowanego spinowo w wybranej postaci buforu NMR.
   2. Przygotować próbkę białka przez zmieszanie ¹⁵N wzbogaconego izotopowo białka nieznakowanego spinowo z 1%-50% ¹⁴N naturalnym białkiem znakowanym spinowo, tak aby końcowe stężenie było identyczne z próbką przygotowaną w ppkt 3.1.1. Całkowita objętość próbki (w tym_D2O) wynosi 500 - 550 μL.
   3. Empirycznie zoptymalizuj stosunek ^{białek 15}N i ¹⁴N dla każdego badanego białka. Dobre punkty wyjścia stanowią proporcje 1%, 5% i 20% ¹⁴białek znakowanych N-spinem.
      UWAGA: Nagromadzenie PRE w funkcji dodanego białka znakowanego ¹⁴N-spinem wskazuje na specyficzny efekt; obserwowany PRE jest specyficzny dla próbki, ponieważ zależy od odległości i populacji (jak omówiono powyżej), a zatem wymagane będą wyższe proporcje białka znakowanego ¹⁴N-spinem, jeśli interakcja jest szczególnie przejściowa¹⁷.
3. Przenieś próbkę NMR (wewnątrz- lub międzycząsteczkową) do rurki NMR o średnicy 5 mm, która jest odpowiednia do stosowania w magnesach o wysokim polu, za pomocą szklanej pipety lub mikropipety z długim trzpieniem (9 cali). Upewnij się, że wszystkie próbki NMR zawierają 5%-10%_D2O, aby ułatwić blokowanie w terenie.
   UWAGA: Probówki NMR, które wykorzystują zatyczki polimerowe w celu zmniejszenia niezbędnej objętości próbki, nie są zalecane do pomiarów PRE ze względu na trudności związane ze skutecznym podkładkowaniem próbki.

4. Ustaw spektrometr NMR i parametry specyficzne dla eksperymentu

1. Zachowaj szczególną ostrożność podczas pracy w pobliżu nadprzewodzących, wysokopolowych spektrometrów NMR.
   UWAGA: Zagrożenia obejmują urazy spowodowane nagłym przyspieszeniem metalowych przedmiotów w kierunku magnesu, zakłócenia z wszczepionymi urządzeniami medycznymi oraz uduszenie z powodu nagłego uwolnienia gazu N₂ i He₂ w przypadku wygaszenia magnesu. Poniższe kroki zakładają, że czytnik przeszedł wymagane szkolenie, jest świadomy tych i innych lokalnych zagrożeń oraz otrzymał zgodę kierownika obiektu na obsługę spektrometru NMR. W razie wątpliwości co do kroku lub instrukcji skonsultuj się z kierownikiem obiektu lub doświadczonym użytkownikiem, aby zapobiec potencjalnym obrażeniom ciała lub uszkodzeniu spektrometru.
2. W poniższych krokach założono, że komercyjny spektrometr NMR działa z nowoczesną wersją oprogramowania do kontroli akwizycji. Pobierz plik programu impulsowego i parametrów i umieść je w odpowiednich katalogach.
   UWAGA: Program impulsowy i zestaw parametrów odpowiedni do użytku ze spektrometrem Bruker i TopSpin (3.2 lub nowszym) są dostępne na życzenie u autorów.
   1. Krok krytyczny: Zakłada się znajomość instalacji nienatywnych programów impulsowych NMR; w razie potrzeby skonsultuj się z kierownikiem obiektu lub doświadczonym użytkownikiem.
3. Umieść próbkę w magnesie, zablokuj sygnał ²H za pomocą polecenia Lock, dostrój i dopasuj kanał ¹H zgodnie z protokołami urządzenia (dokładna procedura będzie zależeć od tego, czy sonda jest wyposażona w moduł zdalnego dostrajania i dopasowywania).
4. Wyreguluj podkładki regulacyjne za pomocą podprogramu topshim, aby zoptymalizować tłumienie sygnału rozpuszczalnika.
5. Kalibruj impulsy ¹H i ¹⁵N 90° przy użyciu standardowych metod.
   1. Skalibruj impuls ¹H za pomocą programu popt (najpierw użyj pulsecal, aby oszacować długość impulsu).
   2. Skalibruj impuls ¹⁵N w stosunku do próbki wzorcowej; upewnij się, że wartość ta została niedawno skalibrowana, rozmawiając z dyrektorem technicznym lub doświadczonym użytkownikiem.
   3. Alternatywnie, skalibruj impuls ¹⁵N na próbce, zmieniając jeden z impulsów 90° w eksperymencie HMQC, aż do uzyskania sygnału zerowego.
   4. Określ prawidłowe tłumienie dla impulsów kształtowych za pomocą podprogramu narzędzia kształtu (stdisp).
   5. Otwórz odpowiedni plik kształtu impulsu, klikając ikonę folderu. Ukształtowane impulsy znajdują się w sekcji parametrów impulsów w ACQUPARS.
   6. Załaduj plik definicji impulsu i kliknij Analizuj przebieg > Zintegruj kształt. Wprowadź skalibrowany twardy impuls ¹H 90°, żądaną długość impulsu kształtowego i obrót (90° lub 180°).
   7. Oblicz poziom mocy kształtowanego impulsu, dodając zmianę poziomu mocy do tłumienia dla skalibrowanego impulsu 90°.
6. Nagraj standardowy ¹H, ¹⁵N HSQC (hsqcetfpf3gpsi), aby zoptymalizować szerokość przeciągnięcia, częstotliwość nośnej i sprawdzić tłumienie wody²⁵.
7. Dostosuj szerokość wyciągnięcia po ścieżce i liczbę przyrostów wymiarów pośrednich za pomocą poleceń sw i td lub bezpośrednio w odpowiednich oknach dialogowych. Zazwyczaj do zbierania PRO szerokości widma są dobierane tak, aby widmo nie było zagięte.

5. Przygotuj eksperyment ¹H_{N-T 2}

1. Skalibrować impulsy kształtowe zgodnie z powyższym opisem (4.4.5-4.5.7). Pliki parametrów impulsu kształtowego dla eksperymentu PRE to Eburp2.1000 (impuls 90°), Reburp.1000 i Iburp2.1000. Wprowadź skalibrowane długości impulsów w sekcji parametrów impulsów na karcie ACQUPARS.
2. W tym eksperymencie mierzy ^{się 1}H N-T₂ przy użyciu podejścia z dwoma punktami opóźnienia czasowego³⁰.
   1. Ustaw opóźnienia czasowe, edytując plik vdlist, pierwsze opóźnienie (T_a) jest ustawione na 0,01 ms.
   2. Wybierz drugie opóźnienie, (T_b) używając relacji do oczekiwanego maksimum PRE (T_b ~ 1,15/(R_2,dia + Γ₂), gdzie R_2,dia reprezentuje R₂ próbki diamagnetycznej¹³. Bez wcześniejszej wiedzy na temat wielkości wkładu PRE w obserwowane rozluźnienie, dobrym punktem wyjścia jest ustawienie T_b na ~1x ¹H T₂.
   3. Następnie określ odpowiednią wartość, porównując pierwsze przyrosty (przetworzone za pomocą polecenia epp) widm T_a i T_b i dostosowując T_b tak, aby sygnał zanikał do 40%-50% swojej wartości początkowej.
      UWAGA: Takie podejście optymalizuje stosunek sygnału do szumu spektralnego, co jest niezbędne w przypadku próbek, które nie mogą być wysoce skoncentrowane (< 50 μM). Odpowiednie wartości T_b są zależne od próbki, ale zwykle wahają się od 8 do 40 ms dla białka średniej wielkości.
3. Określ liczbę złożonych punktów do zarejestrowania i liczbę skanów, aby uzyskać wystarczające uśrednienie sygnału. Ponieważ białka IDP mają dłuższe ¹⁵N T 2_niż pofałdowane białka o porównywalnej wielkości, można zastosować dłuższe czasy akwizycji w wymiarze pośrednim.
   UWAGA: Wartość ta zależy od specyficznych cech białka, ale można ją z grubsza oszacować na podstawie ¹⁵N T 2 i zoptymalizować poprzez monitorowanie zaniku sygnału w FID. W przypadku wymiaru bezpośredniego dla większości próbek wystarczające są punkty złożone 1024* (szerokość przemiatania 13 ppm, czas akwizycji 112,6 ms).
4. Użyj polecenia expt, aby obliczyć czas eksperymentu, a następnie rozpocznij eksperyment za pomocą polecenia zg.

6. Zrób próbkę diamagnetyczną, redukując znacznik spinowy kwasem askorbinowym

1. Rozpuść askorbinian sodu w buforze NMR i dostosuj pH do oryginalnego buforu NMR.
2. Obliczyć stężenie askorbinianu sodu w taki sposób, aby można było dodać 10-krotny molowy nadmiar askorbinianu w stosunku do stężenia spin-markera przy najmniejszej zmianie objętości próbki. Na przykład dla próbki białka o wielkości 100 μM odpowiedni jest zapas askorbinianu o wielkości 100 mM. Zmniejszenie ilości wirowania będzie wymagało dodania 5,5 μl roztworu podstawowego kwasu askorbinowego, co stanowi zaledwie 1 % całkowitej objętości próbki.
3. Dodaj wymaganą ilość kwasu askorbinowego do probówki NMR, umieszczając kroplę poniżej krawędzi probówki, zakryj probówkę, ostrożnie odwróć probówkę do wymieszania, a następnie wiruj z prędkością 200-400 x g przez 10-20 s w ręcznie obracanej wirówce, aby osadzić próbkę na dnie probówki.
4. Owiń probówkę NMR folią w celu ochrony przed światłem i pozwól reakcji postępować przez co najmniej 3 godziny.
5. Zapisać ¹H_{N-T 2} na próbce diamagnetycznej, stosując te same parametry, co dla próbki paramagnetycznej.
6. Ponownie skalibruj impulsy. Nie powinny one jednak ulec zmianie w stosunku do pomiarów paramagnetycznych; Jeśli różnią się one znacząco (różnica > 0,5 μs), należy wziąć pod uwagę jakość próbki (np. degradacja, wytrącanie).
7. Upewnij się, że wszystkie parametry akwizycji, w tym określone opóźnienia relaksacji (vdlist), liczba skanów fikcyjnych, liczba zebranych skanów, liczba zebranych punktów złożonych, czas akwizycji, szerokości przemiatania i częstotliwości nośne pozostają takie same dla próbek diamagnetycznych i paramagnetycznych.

7. Widma paramagnetyczne i diamagnetyczne procesowe

1. Skopiuj dane do komputera lokalnego lub stacji roboczej z zainstalowanymi i skonfigurowanymi programami NMRPipe i Sparky. Utwórz folder o nazwie proc w katalogu danych eksperymentu, który zawiera plik ser.
2. Skopiuj skrypty NMRPipe fid.com, p3d.com i nmrproc.com do proc (skrypty przetwarzania są dostępne na żądanie autorów).
   1. Użyj skryptu fid.com, aby przekonwertować format danych Bruker (ser) na format NMRPipe.
   2. Użyj skryptu p3D.com, aby podzielić płaszczyzny pseudo3D na indywidualne widma.
   3. Użyj skryptu nmrproc.com, aby odczytać dane wyjściowe skryptu fid.com, zastosować tłumienie rozpuszczalnika, funkcję okna, dołączyć zera do surowych danych (wypełnienie zerem), zastosować korekcję fazy, wykonać transformację Fouriera, przyciąć dane do wyświetlenia i zapisać przetworzone dane na dysku. Skrypt wypisze jeden plik dla każdego zarejestrowanego opóźnienia relaksacji (T_a i _{T b}).
      UWAGA: Każdy z tych skryptów można dostosować w celu zoptymalizowania przetwarzania pod kątem określonych szczegółów każdego eksperymentu. Samouczki i przykładowe zestawy danych są zawarte w dystrybucji NMRPipe dostępnej na stronie NMRPipe³². NMRDraw może być używany do obserwacji spektralnej podczas przetwarzania (np. ustawianie odpowiednich kątów fazowych itp.). Opcje dostępne dla poleceń NMRPipe można wyświetlić za pomocą polecenia nmrPipe -help.

8. Przenoszenie przypisań rezonansu i wyodrębnianie wysokości pików

1. Zmień informacje nagłówka pliku dla każdego pliku widma (T_a, T_b zarówno dla próbek paramagnetycznych, jak i diamagnetycznych) za pomocą polecenia sethdr [nazwa pliku] -ndim 2.
2. Użyj Sparky, aby wyodrębnić szczyty heights³³, wykonując kroki 8.3-8.5. Inne pakiety oprogramowania, w tym NMRPipe (NMRDraw)³², CCPN Analysis³⁴ i NMRViewJ³⁵ są również odpowiednie.
3. Wczytaj pliki widmowe do Sparky'ego. Na tym etapie zbiór danych będzie składał się z jednego widma dla każdego punktu czasowego widma (T_a, T_b), zarówno dla próbek paramagnetycznych, jak i diamagnetycznych, mierzonych dla każdej pozycji znacznika spinowego w białku.
4. Użyj narzędzia Sparky, aby wybrać szczyty (polecenie: F8, a następnie kliknij i przeciągnij) i przenieść przypisania za pomocą narzędzia do przesyłania listy szczytów z referencyjnej listy szczytów.
   UWAGA: Przypisania rezonansu białka będącego przedmiotem zainteresowania są niezbędne do specyficznej dla sekwencji interpretacji obserwowanych PREs³⁶.
   1. Ustaw kontury zarówno w widmach paramagnetycznych, jak i diamagnetycznych na tym samym poziomie. Upewnij się, że kontury są ustawione w taki sposób, aby widma zebrane po opóźnieniu czasowym nie wykluczały celowo pików, ale były wystarczająco wysokie, aby _{widma T a} nie były nadmiernie zaszumione.
5. Zapisz nowe listy pików dla każdego widma i dołącz zmierzoną intensywność piku oraz obliczony stosunek sygnału do szumu Sparky'ego (polecenie: lt, aby otworzyć listę szczytów, kliknij opcje, aby uwzględnić kolumny intensywności i SNR, polecenie: zapisz).

9. Wyodrębnij ¹H N-T₂ dawki dla każdej pozostałości i oblicz PRE

1. Zaimportuj listy szczytów do arkusza kalkulacyjnego lub preferowanego języka programowania, takiego jak Python.
   UWAGA: Dla każdej pozycji znacznika spinowego na białku, zestaw danych będzie składał się z czterech list pików z powiązanymi intensywnościami pików, po jednej z T_a i _{T b} zarówno dla eksperymentów paramagnetycznych, jak i diamagnetycznych.
2. Obliczyć ¹H_N R₂ zarówno dla próbek paramagnetycznych, jak i diamagnetycznych, korzystając z równania:
   
   
3. Użyj powyższego równania, aby określić szybkość relaksacji dla każdej pozostałości dla próbek paramagnetycznych i diamagnetycznych.
4. Określić szybkość ¹H_{N-Γ 2} dla każdej pozostałości, stosując równanie:
   
5. Użyj obliczonego przez Sparky'ego stosunku sygnału do szumu (SNR), aby obliczyć niepewność wysokości piku dla każdej pozostałości.
6. Propaguj błąd za pomocą równania:
   
7. Wykres ¹H_{N-Γ 2} w funkcji liczby pozostałości przy użyciu wykresu punktowego z uwzględnieniem błędu obliczonego w ppkt 9.6.

Wyniki

Wewnątrzcząsteczkowe ¹H N-Γ₂ POR zarejestrowano na samoasocjującym, wewnętrznie nieuporządkowanym fragmencie (reszty 171-264) pochodzącym z domeny o niskiej złożoności białka wiążącego RNA EWSR1⁴² (Rysunek 3). Oczekuje się, że pozostałości znajdujące się w bliskiej sekwencyjnej bliskości punktu przyczepiania znacznika spinowego (np. reszta 178 lub 260 w Rysunek 3) zostaną znacznie poszerzone i nie będą wykrywalne w s...

Dyskusja

Przedstawiono metodę charakteryzowania przejściowych oddziaływań, które występują w niskich populacjach między wewnętrznie nieuporządkowanymi białkami a różnymi partnerami wiążącymi za pomocą PRE. W pokazanym przykładzie białko samo się asocjuje, a zatem PRE może powstać z połączenia oddziaływań międzycząsteczkowych i wewnątrzcząsteczkowych. Metodę tę można łatwo rozszerzyć na próbki niejednorodne, w których można scharakteryzować interakcje między dwoma różnymi białkami. Uzupełniające informacje o tym, jak różne regiony...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,45 &mikro; m oraz 0,22 &mikro; m filtry strzykawkowe	Millipore Sigma	SLHVM33RS SLGVR33RS	Filtruj lizat przed pierwszym etapem oczyszczania i przed chromatografią wykluczania wielkości.
Szalka Petriego 100 mm	Fisher	FB0875713	Płytki agarowe do transformacji bakteryjnej.
14N Chlorek amonu	Sigma Aldrich	576794	Użycie 15N w pożywce M9 spowoduje wytworzenie widocznego białka NMR, 14N wytworzy niewidoczne białko NMR
15N Chlorek amonu	Sigma Aldrich	299251	Użycie 15N w pożywce M9 spowoduje wytworzenie białka widzialnego dla NMR, 14N wytworzy niewidoczne białko NMR
3 L Kolba z przegrodami Fernbach	Corning	431523	Kultura ekspresji bakterii
3-Maleimido-Proxyl	Sigma Aldrich	253375	Etykieta spinowa nitroksydu
50 ml stożkowe probówki wirówkowe	Thermo Fisher	14-432-22	Roztwór/białko przechowywanie
Filtr odśrodkowy Amicon	Millipore Sigma	UFC900308	Stężenie białka
Ampicillan	Sigma Aldrich	A5354	Antybiotyk do markera selektywnego, dokładny wybór zależy od konstruktu ekspresji plazmid
Waga analityczna	Oahus	30061978	Explorer Pro, do ważenia odczynników
Kwas askorbinowy	Sigma Aldrich	AX1775	Zmniejsza wirowanie etykiety nitroksydu
Autoklaw			Sterylizuj szkło i pożywki
hodowlane Chlorek wapnia	Sigma Aldrich	C4901	M9 składnik podłoża
Butelki wirówkowe	Thermo Fisher	010-1459	Zbieranie komórek E. coli po rekombinowanej ekspresji białka
Wirówka, korba ręczna	Thomas Scientific	0241C68	Ręcznie napędzana, wolnoobrotowa wirówka Boekel z wiadrami o pojemności 15 ml, które mogą pomieścić probówki NMR
Chelex 100	Sigma Aldrich	C7901	Usuwanie zanieczyszczających związków paramagnetycznych z roztworów buforowych
Komputerowa stacja			lub Mac OS kompatybilna z pakietami oprogramowania do przetwarzania i analizy danych NMR, takimi jak NMRPipe i Sparky
Tlenek deuteru	Sigma	Aldrich 151882	Potrzebne do sygnału blokady NMR
Dekstroza	Sigma Aldrich	D9434	M9 składnik mediów
Dizasadowy fosforan sodu	Sigma Aldrich	S5136	M9 składnik podłoża
Odczynnik Ellmana (kwas 5,5-dithio-bis-(2-nitrobenzoesowy)	Thermo Fisher	22582	Kwantyfikacja wolnych pozostałości cystynu Probówki
wirówkowe o dużej prędkości	Thermo Fisher	3114-0050	Służy do usuwania lizatu bakteryjnego.
Przyrząd do NMR wysokiego pola (600 - 800 MHz)	Bruker		Wyposażony w wielokanałową sondę kriogeniczną i
kolumnę IMAC do kontroli temperatury, HisTrap FF	Cytvia	17528601	Wstępne frakcjonowanie surowego lizatu bakteryjnego
Izopropyl B-D-tiogalaktozyd (IPTG)	Sigma Aldrich	I6758	Indukuje ekspresję białka dla genów pod kontrolą operatora lac
LB agar	Thermo Przedmioty Fisher	22700025	są używane do przekształcania E. coli w celu wyrażenia białka będącego przedmiotem zainteresowania, dopuszczalne są przesądy dla któregokolwiek z tych produktów z podobnymi produktami.
Bulion LB	Thermo Fisher	12780052
System chromatografii niskociśnieniowej	Bio-Rad	7318300	BioRad BioLogic służy do niskociśnieniowych chomatografów, takich jak kolumny IMAC
Siarczan magnezu	Sigma Aldrich	M7506	M9 składnik
Średniociśnieniowy system chromatograficzny	Bio-Rad	7880007	BioRad NGC wyposażony w detektor wielu długości fal, monitory pH i przewodności oraz automatyczny kolektor frakcji
Roztwór witaminowy MEM	Sigma Aldrich	M6895	M9 składnik mediów
Mikrofluidyzator	Avestin	EmulsiFlex-C3	Zapewnia szybką i wydajną lizę komórek bakteryjnych
Mikropipety	Thermo Fisher		Skalibrowany zestaw mikropipeterów z odpowiednio dopasowanymi jednorazowymi końcówkami (dostępne u wielu producentów, np. Eppendorf)
Jednozasadowy fosforan potasu	Sigma Aldrich	1551139	M9 składnik pożywki
Pipety NMR	Sigma Aldrich	255688	Do pobierania próbki z probówki
NMR Probówka NMR	NewEra	NE-SL5	Nadaje się do wysokopolowych spektrometrów
NMRWirówka preparatywna	Beckman Coulter	Avanti J-HC	Harvest Komórki E. coli po rekombinowanej ekspresji białka
Probówki wirówkowe z polistyrenu okrągłodennego	Corning	352057	Klarowny lizat bakteryjny
Inkubator z wytrząsaniem	Eppendorf	S44I200005	Kontrolowany temperaturowo wzrost kultur starterowych i ekspresyjnych E. coli
Chlorek sodu	Sigma Aldrich	S5886	Składnik pożywki M9
Kąpiel wodna sonikująca i źródło próżni	Thomas Scientific		Służy do odgazowywania roztworów buforowych
Sonicator	Thermo Fisher	FB505110	Służy do lizy komórek bakteryjnych lub ścinania bakteryjnego DNA
Spektrofotometr	Implen	OD600 Dilufotometr	Monitoruj wzrost kultur ekspresji białka E.coli
Odróżnienie rozmiaru Superdex 200 16/600 colum	Cytvia	28989333	Końcowy etap oczyszczania białka
Oprogramowanie Topspin, wersja 3.2 lub nowsza	Bruker		Oprogramowanie operacyjne dla instrumentu NMR
Transformacja kompetentne komórki E. coli	Thermo Fisher	C600003	One Shot BL21 Star (DE3) chemicznie kompetentny E. coli, inne szczepy mogą być kompatybilne Tris
(2-karboksyetylo)fosfina (TCEP)	ThermoFisher	20490	Środek redukujący kompatybilny z niektórymi sprzęgami sulfhydrylowo-reaktywnymi
Spektrofotometr UV-Vis	Implen	NP80	Pomiar stężenia białka.
Łaźnia wodna o kontrolowanej temperaturze	ThermoFisher	FSGPD25	Do etapu szoku termicznego przemiany bakteryjnej
Ekstrakt drożdżowy	Sigma Aldrich	Y1625	W razie potrzeby uzupełnienie pożywki M9