Algorytm analizy obrazu oparty na obszarze do ilościowego oznaczania kokultur makrofagów i fibroblastów

Podsumowanie

Prezentujemy metodę, która wykorzystuje uogólnioną analizę obrazu opartą na obszarze do identyfikacji liczby komórek. Analiza różnych populacji komórek pozwoliła na wykorzystanie znacznych różnic w wysokości i strukturze komórek między różnymi typami komórek w ramach algorytmu adaptacyjnego.

Streszczenie

Kwantyfikacja komórek jest niezbędna dla szerokiego zakresu badań biologicznych i biochemicznych. Konwencjonalna analiza obrazu komórek zazwyczaj wykorzystuje metody wykrywania fluorescencji, takie jak barwienie immunofluorescencyjne lub transfekcja białkami fluorescencyjnymi, lub techniki wykrywania krawędzi, które często są podatne na błędy ze względu na szum i inne nieidealne cechy tła obrazu.

Zaprojektowaliśmy nowy algorytm, który mógł dokładnie zliczać i rozróżniać makrofagi i fibroblasty, komórki o różnych fenotypach, które często kolokalizują się podczas regeneracji tkanek. Do implementacji algorytmu wykorzystano MATLAB, który różnicował różne typy komórek na podstawie różnic we wzroście od tła. Podstawowy algorytm został opracowany przy użyciu metody obszarowej, aby uwzględnić różnice w rozmiarze/strukturze komórek i warunkach wysiewu o dużej gęstości.

Nieidealności w strukturach komórkowych zostały uwzględnione za pomocą dodatkowego, iteracyjnego algorytmu wykorzystującego wewnętrzne parametry, takie jak pokrycie komórek, obliczone na podstawie danych eksperymentalnych dla danego typu komórki. Na koniec przeprowadzono analizę środowisk kokulturowych przy użyciu algorytmu izolacji, w którym różne typy komórek zostały selektywnie wykluczone na podstawie oceny względnych różnic wysokości w obrębie obrazu. Stwierdzono, że podejście to pozwala na dokładne zliczanie komórek w granicach 5% marginesu błędu dla komórek monokulturowych i w granicach 10% marginesu błędu dla komórek hodowanych w kokulturze.

Wprowadzenie

Oprogramowanie jest rutynowo wdrażane podczas technik analizy obrazu, aby zapewnić, że wyniki są dokładne, wydajne i bezstronne. W przypadku testów komórkowych częstym problemem jest błędna identyfikacja komórek. Obrazy z nieprawidłowymi ustawieniami ogniskowej i kontrastu mogą prowadzić do rozmycia komórek, w którym granice poszczególnych komórek stają się trudne do zidentyfikowania¹. Obecność obcych cech obrazu, takich jak pory, pęcherzyki lub inne niepożądane obiekty, może utrudniać procedury liczenia, spowalniając proces liczenia i prowadząc do błędnej identyfikacji. Co więcej, liczenie komórek może być uciążliwe, a liczenie setek powtórzeń może być niezwykle czasochłonne. Co więcej, podczas ręcznego liczenia istnieje wrodzona subiektywna stronniczość, a zatem podejmowanie decyzji dotyczących identyfikacji komórek jest często niedokładne². Zautomatyzowane oprogramowanie oferuje ekscytujący potencjał w zakresie ominięcia wszystkich tych problemów poprzez szybkie i precyzyjne odróżnianie komórek od ciał obcych, w tym obiektów znacznie przekraczających ludzkie możliwości precyzyjnego wykrywania, w oparciu o dobrze zdefiniowane kryteria identyfikacji, które zmniejszają wpływ stronniczości badacza. Typowe techniki identyfikacji komórek za pomocą zautomatyzowanego oprogramowania obejmują dwie główne metody: segmentację i progowanie³. W tym miejscu demonstrujemy uogólniony protokół oparty na obszarze, który umożliwia szybkie, dokładne i niedrogie zliczanie komórek w szeroko dostępnej strukturze oprogramowania.

Techniki segmentacji, takie jak wykrywanie krawędzi, starają się izolować pojedyncze komórki, wykorzystując różnice intensywności w obrazie. Zmiany intensywności, które odróżniają komórkę od reszty obrazu, najczęściej polegają na gwałtownych zmianach jasności⁴. Wykrywanie krawędzi obejmuje etap filtrowania regularyzacyjnego, po którym następuje etap różnicowania, w którym wykrywane są zmiany intensywności. Proces różnicowania identyfikuje krawędzie i kontury w obrazie zmian o dużej intensywności, a te krawędzie i kontury są skorelowane z obecnością komórki. Chociaż obrazy z szumem mogą być przetwarzane przez algorytmy odszumiania⁴, techniki wykrywania krawędzi są idealnie stosowane do analizy obrazów o niskim poziomie szumu tła. Proces działa optymalnie, gdy granice komórek są wyraźnie i łatwo rozróżnialne i nie są ograniczane przez kontury jasności niezwiązane z obecnością komórki, rozmyciem komórek, obcymi obiektami lub zdefiniowanymi wewnętrznymi strukturami komórkowymi^1,2. Jeśli obraz jest szczególnie zaszumiony, komórki można dodatkowo rozróżnić poprzez barwienie fluorescencyjne lub transfekcję białkami fluorescencyjnymi^2,5. Chociaż znacznie poprawia to dokładność technik segmentacji, wymaga dodatkowych kosztów i dodatkowych inwestycji czasowych w przygotowanie kultur komórkowych do obrazowania.

Techniki progowania polegają na podziale obrazu na dwie kategorie: pierwszy plan i tło, z komórkami przypisanymi do pierwszego planu³. Techniki te wykorzystują zmiany koloru/kontrastu do zdefiniowania pozornej wysokości obiektu; Obiekty, które są rutynowo "wyższe" niż tło, można łatwo zidentyfikować jako komórki. Transformacja zlewni działa w ten sposób, kojarząc powierzchnie z jasnymi pikselami jako pierwszym planem i tymi z ciemnymi pikselami jako tłem^6,7. Dzięki identyfikacji opartej na wysokości, techniki progowe mogą rutynowo odróżniać hałas od pożądanych obiektów, pod warunkiem, że znajdują się one w tej samej płaszczyźnie ogniskowej. W połączeniu z kwantyfikacją obszarową, transformacja zlewiska może dokładnie identyfikować grupy obiektów w środowiskach, w których typowe techniki segmentacji, takie jak wykrywanie krawędzi, byłyby niedokładne.

Transformacje zlewni są często łączone z technikami segmentacji w celu przygotowania obrazów do dokładniejszej analizy, co skutkuje większą dokładnością zliczania komórek. W tym procesie transformacja zlewni służy do wyróżnienia potencjalnych obszarów zainteresowania przed segmentacją. Transformacja zlewni zapewnia wyjątkowe korzyści poprzez identyfikację komórek na pierwszym planie obrazów, co może poprawić dokładność analizy segmentacji poprzez usunięcie potencjalnych wyników fałszywie dodatnich dla komórek, takich jak nierówne plamy tła. Mogą jednak pojawić się trudności przy próbie dostosowania obrazów opartych na komórkach do transformacji przełomowej. Obrazy o dużej gęstości komórek mogą być nękane niedostateczną segmentacją, w której agregaty komórek są identyfikowane jako pojedyncza grupa, a nie jako pojedyncze składniki. Obecność szumu lub gwałtownych zmian intensywności może również powodować nadmierną segmentację, w której algorytm nadmiernie izoluje komórki, co skutkuje nadmierną i niedokładną liczbą komórek⁸.

Tutaj szczegółowo opisujemy metodę minimalizacji podstawowych wad transformacji zlewni poprzez włączenie komponentów analizy progowej do algorytmu kwantyfikacji opartej na obszarze, jak pokazano w Rysunek 1. Warto zauważyć, że algorytm ten został zaimplementowany za pomocą oprogramowania typu open source i/lub powszechnie dostępnego, a zastosowanie tej struktury liczenia komórek było możliwe bez drogich odczynników lub skomplikowanych technik przygotowania komórek. Makrofagi RAW264.7 zostały wykorzystane do zademonstrowania metody ze względu na ich kluczową rolę w regulacji utrzymania tkanki łącznej i procesów gojenia się ran⁹. Dodatkowo przeanalizowano fibroblasty NIH/3T3 ze względu na ich kluczową rolę w utrzymaniu i naprawie tkanek. Komórki fibroblastów często współistnieją i wspierają makrofagi, co generuje potrzebę rozróżnienia tych fenotypowo odrębnych typów komórek w badaniach kokulturowych.

Liczby komórek na obrazach o wysokiej gęstości żywotnych komórek (VCD) można niezawodnie i efektywnie określić ilościowo, obliczając obszar pokryty przez komórki oraz średni obszar zajmowany przez pojedynczą komórkę. Zastosowanie progowania w przeciwieństwie do segmentacji do identyfikacji komórek umożliwiło również bardziej złożone analizy, takie jak eksperymenty, w których różne typy komórek w kokulturach były analizowane jednocześnie. Stwierdzono, że fibroblasty NIH/3T3, które często kolokalizują się z makrofagami RAW264.7 w miejscu gojenia się ran, rosną w płaszczyźnie ogniskowej, która różniła się od płaszczyzny ogniskowej makrofagów¹⁰. W związku z tym uruchomiono wiele algorytmów progowych w celu zdefiniowania tła i pierwszego planu w zależności od analizowanego typu komórki, umożliwiając dokładne zliczenie dwóch różnych typów komórek na tym samym obrazie.

Protokół

1. Hodowla komórkowa i akwizycja obrazu

1. Hodowla makrofagów RAW264.7 w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ w zmodyfikowanym pożywce Eagle (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 1% penicyliną-streptomycyną, 1,5 g / l wodorowęglanem sodu i 5 μM β-merkaptoetanolem.
   1. W przypadku obrazowania monokulturowego należy hodować komórki RAW264.7 o gęstości 25 000 komórek/^cm2 w kolbie do hodowli komórkowej o pojemności 5 ml z 1 ml pożywki.
2. Hodowla komórek NIH/3T3 w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ w DMEM uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% penicyliną-streptomycyną¹¹.
3. W przypadku obrazowania kokulturowego należy wyhodować makrofagi RAW264.7 i fibroblasty NIH/3T3 razem w różnych proporcjach, przy całkowitej gęstości 25 000 komórek/^cm2. Użyj pożywki do kokultury, która jest 1 częścią pożywki RAW264.7 (DMEM uzupełnioną 10% FBS, 1% penicyliny-streptomycyny, 1,5 g/l wodorowęglanu sodu i 5 μM β-merkaptoetanolu) i 1 częścią pożywki NIH/3T3 (DMEM uzupełnioną 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% penicyliny-streptomycyny).
4. Po wysiewie inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO_{2 ,} aby osiągnąć gęstość żywotnych komórek wynoszącą 80% zbiegu komórek.
5. Komórki obrazowe z odwróconym mikroskopem wyposażonym w obiektyw 40x. Uzyskaj wszystkie obrazy w skali szarości i wyeksportuj je do surowego pliku ".czi".
   1. Określ zdolność algorytmu do dokładnej oceny obrazów o różnych cechach obrazu. Uzyskuj obrazy o różnych ogniskach, tworząc zarówno obrazy "niebulwiaste" (Rysunek 2), jak i "bulwiaste" obrazy (Rysunek 3).
   2. Eksportuj i konwertuj obrazy komórek do 8-bitowego formatu obrazu tiff (.tiff) za pomocą ImageJ za pomocą funkcji "Konwersja wsadowa" na surowych plikach ".czi" przed analizą MATLAB. Przechowuj przekonwertowane obrazy w folderze lokalnym i ręcznie przesyłaj te pliki obrazów do odpowiedniego kosza MATLAB.

2. Analiza obrazu-monokultura z wykorzystaniem przede wszystkim pliku "monoculture.m"

UWAGA: Następujące kroki zostały wykonane przy użyciu MATLAB. W protokole MATLAB użyto trzech plików: "process.m" (Supplemental coding file 1), plik zawierający algorytm, "monoculture.m" (Supplemental coding file 2), plik do uruchomienia do analizy obrazów monokulturowych oraz "coculture_modified.m" (Supplemental coding file 3), plik do uruchomienia do analizy obrazów kokultury.

1. Użyj metody opartej na obszarze, aby uzyskać obrazy komórek pokazujące względne zmiany wysokości. Obraz jest wyprowadzany dla każdego podkroku, wykorzystując funkcję 'imshow()' dla każdego podobrazu. Skopiuj i wklej plik obrazu do analizy do kosza, a następnie wprowadź nazwę pliku w następującym poleceniu. Naciśnij uruchom, aby uruchomić program.
   imread('filename.tiff')
   1. Analizuj obrazy, "otwierając przez rekonstrukcję", a następnie "zamykając przez rekonstrukcję" za pomocą funkcji źródłowych⁸, aby powiększyć pierwszy plan od tła. Użyj pierwszego polecenia, aby otworzyć przez rekonstrukcję, a drugiej i trzeciej sekwencji, aby zakończyć przez rekonstrukcję
      'imopen()'
      'imerode()'
      'imreconstruct()'
2. Binaryzuj zrekonstruowane obrazy na czyste czarne i czysto białe piksele, korzystając z systemu identyfikacji opartego na percentylu. Należy pamiętać, że w tym systemie komórki są konwertowane na wartość czystego białego piksela "255", podczas gdy obiekty tła i obce (niekomórkowe) są konwertowane na wartość czystego czarnego piksela "0".
   1. Odróżnij komórki od tła, używając różnicy percentyla w stosunku do "maksymalnej odpowiedniej wartości piksela", która stanowi największą wartość piksela stanowiącą co najmniej 0,5% danego obrazu.
   2. Analizuj i oceń wartości pikseli dla makrofagów RAW264.7. Jeśli te wartości mieszczą się w granicach 4,5% od maksymalnej odpowiedniej liczby pikseli, oznacz piksel jako komórkowy.
      UWAGA: To polecenie można wydać za pomocą prostej instrukcji if.
   3. W przypadku obrazów zawierających bulwiaste profile komórek, takie jak te widoczne na Rysunek 2, zaimplementuj procedurę iteracyjną, aby skorygować błędną binaryzację w środkach komórek (określanych jako 'wyspy; " patrz poniżej), w następujący sposób.
   4. Określ wstępne przypuszczenie dotyczące całkowitego pokrycia komórek; 60% wykorzystano w tym badaniu. Należy zauważyć, że liczba komórek obecnych na obrazie powinna być zależna od pokrycia komórek - związek między liczbą komórek a pokryciem komórek można zatem określić eksperymentalnie. Korzystając z tej zależności, określ zmienne 'Alpha' i 'kappa'
      UWAGA: "Alfa" reprezentuje wektor 3 x 1 zawierający następujące względne percentyle wysokości: percentyl wysokości, w którym zidentyfikowano komórki, percentyl wysokości, w którym zidentyfikowano tło, oraz percentyl wysokości, na którym zwykle znajdowały się wyspy – regiony, w których wartości intensywności były znacznie niższe niż wartości komórek. "Kappa" oznacza całkowity obszar pokryty przez komórki na obrazie.
   5. Uruchom algorytm, który (i) przeanalizuje obrazy przy użyciu początkowych oszacowań wartości alfa i kappa w celu wypełnienia części wysp oraz (ii) użyje liczby komórek i pokrycia po analizie do ponownego obliczenia kappa. Jeśli wartość kappa mieści się w granicach 10% początkowego przypuszczenia, przejdź do następnego kroku.
      UWAGA: W przypadku obrazów zawierających komórki RAW264.7 i NIH/3T3 stwierdzono, że alfa wynosi [4.3, 5.5, 10]. Innymi słowy, różnica 4,3% w stosunku do maksymalnego odpowiedniego piksela określała percentyl wysokości, w którym identyfikowano komórki, różnica 5,5% w stosunku do maksymalnego odpowiedniego piksela określała percentyl wysokości, w którym identyfikowano tło. Różnica 10% w stosunku do maksymalnej odpowiedniej liczby pikseli określała percentyl wysokości, na którym zwykle znajdowały się wyspy.
3. Po binaryzacji obrazu automatycznie określ średnią powierzchnię komórki za pomocą algorytmu wyszukiwania okręgów typu open source, który wykonuje transformację Hougha na zbinaryzowanym obrazie^12,13,14. Użyj następującego polecenia, aby uzyskać wektor wszystkich położeń środkowych i promieni okręgów znajdujących się na obrazie.
   '[środki, promienie] = imfindcircle(A, [minradius, maxradius])'
   "A" w tym poleceniu to wybrany obraz, a [minradius, maxradius] to zakres promieni, który algorytm będzie próbował wykryć.
   UWAGA: Ta procedura określania średniej powierzchni komórki zakłada, że morfologia komórek makrofagów była zarówno okrągła, jak i spójna między komórkami¹⁰. Z danych eksperymentalnych wynika, że promienie makrofagów wynoszą najczęściej od 30 do 50 pikseli przy 40-krotnym powiększeniu. Ten zakres pikseli jest zdefiniowany jako dopuszczalny zakres dla algorytmu znajdowania okręgu. Promienie mogą się znacznie różnić w przypadku innych typów komórek i wymagałyby określenia za pomocą analizy eksperymentalnej.
   1. Użyj promieni wyjściowych, aby obliczyć średnią powierzchnię komórki przez uśrednienie. Przeanalizuj co najmniej 10 komórek, aby zapewnić dokładną identyfikację obszaru.
4. Określ całkowitą liczbę komórek na obrazie, korzystając ze średniej powierzchni komórki.
   1. Przejrzyj matrycę obrazu w pętli i policz całkowitą liczbę pikseli komórek. Określ całkowite pokrycie komórek, dzieląc liczbę pikseli komórki przez całkowitą liczbę pikseli na obrazie. Określ całkowitą liczbę komórek na obrazie, dzieląc liczbę pikseli komórki przez średnią powierzchnię komórki.

3. Analiza obrazu-kokultura wykorzystująca przede wszystkim plik "coculture_modified.m"

UWAGA: Następujące kroki zostały wykonane przy użyciu MATLAB.

1. Użyj metody opartej na obszarze, aby uzyskać obrazy komórek pokazujące względne zmiany wysokości. Obraz jest wyprowadzany dla każdego podkroku, wykorzystując funkcję 'imshow()' dla każdego podobrazu. Skopiuj i wklej plik obrazu do analizy do kosza, a następnie wprowadź nazwę pliku w następującym poleceniu. Naciśnij uruchom, aby uruchomić program.
   'imread('filename.tiff')"
   1. Analizuj obrazy, "otwierając przez rekonstrukcję", a następnie "zamykając przez rekonstrukcję" za pomocą funkcji źródłowych¹⁰, aby powiększyć pierwszy plan od tła. Użyj pierwszego polecenia, aby otworzyć przez rekonstrukcję, a drugiej i trzeciej sekwencji, aby zakończyć przez rekonstrukcję.
      'imopen ()'
      'imerode()'
      'imreconstruct()'
2. Przeprowadź analizę kokultur zawierających komórki RAW264.7 i NIH/3T3 przy użyciu dwóch selektywnych binaryzacji, uzyskanych przez wykorzystanie różnic wysokości między dwoma typami komórek.
   1. Eksperymentalnie określ parametr "phi" za pomocą obrazów komórek RAW264.7 i NIH/3T3, gdzie phi reprezentuje proporcjonalną różnicę wysokości między dwoma typami komórek. Zgadnij początkową wartość phi i iteruj, aż liczba komórek i pokrycie będą ściśle zgodne z ręcznymi zliczeniami, specyficznymi dla kokultury RAW264.7 i NIH/3T3.
      UWAGA: Stwierdzono, że wartość phi użyta w tych badaniach wynosi 3,2. Phi służy do selektywnego filtrowania obrazu, aby wyglądał tak, jakby zawierał tylko komórki RAW264.7, jak widać na Rysunek 4C.
   2. Określ liczbę komórek RAW264.7 i całkowite pokrycie komórek w podobny sposób, jak w przypadku obrazów monokulturowych.
3. Ponownie przeanalizuj obraz przekształcony w zlewnię bez parametru phi, wykrywając zarówno makrofagi, jak i fibroblasty. Uzyskaj dane fibroblastów NIH/3T3 poprzez selektywne odejmowanie pikseli komórek RAW264.7, uzyskanych przy użyciu standardowych metod progowania i kwantyfikacji opartej na obszarze opisanych w kroku 2.
   1. Po przeanalizowaniu całego obrazu określ całkowitą liczbę pikseli NIH/3T3, odejmując całkowitą liczbę pikseli komórek od liczby pikseli RAW264.7. Oblicz pokrycie komórek NIH/3T3 i RAW264.7, dzieląc przez liczbę pikseli komórek dla każdej linii komórkowej przez całkowitą liczbę pikseli obrazu.

Wyniki

Analiza niebulwiastych makrofagów RAW264.7 została przeprowadzona w monokulturze na poziomie 25 000 komórek/^cm2. Wykonano reprezentatywne obrazy hodowli komórkowej i przetworzono je w programie MATLAB po konwersji do 8-bitowego formatu tiff w formacie ImageJ. Dane wyjściowe algorytmu w całym procesie zostały zarejestrowane i udokumentowane w Rysunek 2 dla reprezentatywnego obrazu. Na tym obrazie algorytm policzył 226 komórek, a ta liczba obrazów została zweryfikowana przez porówna...

Dyskusja

Zaprojektowaliśmy ogólną procedurę opartą na obszarze, która dokładnie i wydajnie zliczała komórki na podstawie ich wysokości, co pozwoliło na ilościowe określenie komórek bez barwienia nawet w systemach kokultury. Kluczowe kroki tej procedury obejmowały wdrożenie systemu względnej intensywności, za pomocą którego można różnicować komórki. Zastosowanie analizy wysokości względnej służyło dwóm celom: nie było potrzeby podawania parametrów zewnętrznych, ponieważ parametry względne były stałe dla danego typu komórki i param...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Axio Observer 7 Mikroskop odwrócony	Zeiss	1028290770
β-merkaptoetanol	Life Technologies	21985023
Skrobaki komórkowe	CellTreat	229310
Zmodyfikowany Eagle Medium firmy Dublecco	Fisher Scientific	12430047
Dublecco
MATLAB Software	MathWorks	2021A
NIH/3T3 Komórki	ATCC	ATCC CRL - 1658
Penicylina– Streptomycyna	Sigma Aldrich	P4333-20ML
RAW264.7 Komórki	ATCC	ATCC TIB - 71
Wodorowęglan sodu	Sigma Aldrich	S6014-25G
T75 Kolba do hodowli komórkowych	Corning	CLS3814-24EA