Algorytm analizy obrazu oparty na obszarze do ilościowego oznaczania kokultur makrofagów i fibroblastów

Summary

Prezentujemy metodę, która wykorzystuje uogólnioną analizę obrazu opartą na obszarze do identyfikacji liczby komórek. Analiza różnych populacji komórek pozwoliła na wykorzystanie znacznych różnic w wysokości i strukturze komórek między różnymi typami komórek w ramach algorytmu adaptacyjnego.

Abstract

Kwantyfikacja komórek jest niezbędna dla szerokiego zakresu badań biologicznych i biochemicznych. Konwencjonalna analiza obrazu komórek zazwyczaj wykorzystuje metody wykrywania fluorescencji, takie jak barwienie immunofluorescencyjne lub transfekcja białkami fluorescencyjnymi, lub techniki wykrywania krawędzi, które często są podatne na błędy ze względu na szum i inne nieidealne cechy tła obrazu.

Zaprojektowaliśmy nowy algorytm, który mógł dokładnie zliczać i rozróżniać makrofagi i fibroblasty, komórki o różnych fenotypach, które często kolokalizują się podczas regeneracji tkanek. Do implementacji algorytmu wykorzystano MATLAB, który różnicował różne typy komórek na podstawie różnic we wzroście od tła. Podstawowy algorytm został opracowany przy użyciu metody obszarowej, aby uwzględnić różnice w rozmiarze/strukturze komórek i warunkach wysiewu o dużej gęstości.

Nieidealności w strukturach komórkowych zostały uwzględnione za pomocą dodatkowego, iteracyjnego algorytmu wykorzystującego wewnętrzne parametry, takie jak pokrycie komórek, obliczone na podstawie danych eksperymentalnych dla danego typu komórki. Na koniec przeprowadzono analizę środowisk kokulturowych przy użyciu algorytmu izolacji, w którym różne typy komórek zostały selektywnie wykluczone na podstawie oceny względnych różnic wysokości w obrębie obrazu. Stwierdzono, że podejście to pozwala na dokładne zliczanie komórek w granicach 5% marginesu błędu dla komórek monokulturowych i w granicach 10% marginesu błędu dla komórek hodowanych w kokulturze.

Introduction

Oprogramowanie jest rutynowo wdrażane podczas technik analizy obrazu, aby zapewnić, że wyniki są dokładne, wydajne i bezstronne. W przypadku testów komórkowych częstym problemem jest błędna identyfikacja komórek. Obrazy z nieprawidłowymi ustawieniami ogniskowej i kontrastu mogą prowadzić do rozmycia komórek, w którym granice poszczególnych komórek stają się trudne do zidentyfikowania¹. Obecność obcych cech obrazu, takich jak pory, pęcherzyki lub inne niepożądane obiekty, może utrudniać procedury liczenia, spowalniając proces liczenia i prowadząc do błędnej identyfikacji. Co więcej, liczenie komórek może być uciążliwe, a liczenie setek powtórzeń....

Protocol

1. Hodowla komórkowa i akwizycja obrazu

1. Hodowla makrofagów RAW264.7 w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ w zmodyfikowanym pożywce Eagle (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 1% penicyliną-streptomycyną, 1,5 g / l wodorowęglanem sodu i 5 μM β-merkaptoetanolem.
   1. W przypadku obrazowania monokulturowego należy hodować komórki RAW264.7 o gęstości 25 000 komórek/^cm2 w kolbie do hodowli komórkowej o pojemności 5 ml z 1 ml pożywki.
2. Hodowla komórek NIH/3T3 w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ w DMEM uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% penicyliną-strepto....

Results

Analiza niebulwiastych makrofagów RAW264.7 została przeprowadzona w monokulturze na poziomie 25 000 komórek/^cm2. Wykonano reprezentatywne obrazy hodowli komórkowej i przetworzono je w programie MATLAB po konwersji do 8-bitowego formatu tiff w formacie ImageJ. Dane wyjściowe algorytmu w całym procesie zostały zarejestrowane i udokumentowane w Rysunek 2 dla reprezentatywnego obrazu. Na tym obrazie algorytm policzył 226 komórek, a ta liczba obrazów została zweryfikowana przez porówna.......

Discussion

Zaprojektowaliśmy ogólną procedurę opartą na obszarze, która dokładnie i wydajnie zliczała komórki na podstawie ich wysokości, co pozwoliło na ilościowe określenie komórek bez barwienia nawet w systemach kokultury. Kluczowe kroki tej procedury obejmowały wdrożenie systemu względnej intensywności, za pomocą którego można różnicować komórki. Zastosowanie analizy wysokości względnej służyło dwóm celom: nie było potrzeby podawania parametrów zewnętrznych, ponieważ parametry względne były stałe dla danego typu komórki i param.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Axio Observer 7 Mikroskop odwrócony	Zeiss	1028290770
β-merkaptoetanol	Life Technologies	21985023
Skrobaki komórkowe	CellTreat	229310
Zmodyfikowany Eagle Medium firmy Dublecco	Fisher Scientific	12430047
Dublecco
MATLAB Software	MathWorks	2021A
NIH/3T3 Komórki	ATCC	ATCC CRL - 1658
Penicylina– Streptomycyna	Sigma Aldrich	P4333-20ML
RAW264.7 Komórki	ATCC	ATCC TIB - 71
Wodorowęglan sodu	Sigma Aldrich	S6014-25G
T75 Kolba do hodowli komórkowych	Corning	CLS3814-24EA