Poprawa odtwarzalności w celu uzyskania minimalnych informacji do badań pęcherzyków zewnątrzkomórkowych Wytyczne z 2018 r. dotyczące analizy śledzenia nanocząstek

Podsumowanie

Analiza śledzenia nanocząstek (NTA) jest powszechnie stosowaną metodą do charakteryzowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. W artykule przedstawiono parametry eksperymentalne i kontrolne NTA oraz jednolitą metodę analizy i charakterystyki próbek i rozcieńczalników niezbędną do uzupełnienia wytycznych zaproponowanych przez MISEV2018 i EV-TRACK w zakresie odtwarzalności między laboratoriami.

Streszczenie

Analiza śledzenia nanocząstek (NTA) jest jedną z kilku metod charakteryzacji używanych do badań nad pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi (EV) od 2006 roku. Wiele osób uważa, że przyrządy NTA i ich pakiety oprogramowania mogą być łatwo wykorzystywane po minimalnym szkoleniu, a kalibracja rozmiaru jest możliwa we własnym zakresie. Ponieważ zarówno akwizycja NTA, jak i analiza oprogramowania stanowią charakterystykę EV, zostały one omówione w Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 (MISEV2018). Ponadto były one monitorowane w ramach Przejrzystego Raportowania i Centralizacji Wiedzy w Badaniach nad Pęcherzykami Zewnątrzkomórkowymi (EV-TRACK) w celu poprawy niezawodności eksperymentów EV (np. zminimalizowania zmienności eksperymentalnej spowodowanej niekontrolowanymi czynnikami).

Pomimo wysiłków mających na celu zachęcenie do raportowania metod i kontroli, wiele opublikowanych prac badawczych nie informuje o krytycznych ustawieniach potrzebnych do odtworzenia oryginalnych obserwacji NTA. Niewiele prac opisuje charakterystykę NTA kontroli ujemnych lub rozcieńczalników, najwyraźniej zakładając, że dostępne na rynku produkty, takie jak sól fizjologiczna buforowana fosforanami lub ultraczysta woda destylowana, są wolne od cząstek stałych. Podobnie, kontrole pozytywne lub normy wielkości są rzadko zgłaszane przez badaczy w celu weryfikacji wielkości cząstek. Równanie Stokesa-Einsteina obejmuje zmienne lepkości i temperatury próbki w celu określenia przemieszczenia cząstek. Raportowanie stabilnej temperatury w komorze laserowej podczas całego pobierania próbek wideo jest zatem niezbędnym środkiem kontrolnym dla dokładnej replikacji. Filtracja próbek lub rozcieńczalników również nie jest rutynowo raportowana, a jeśli tak, rzadko podaje się specyfikę filtra (producent, materiał membrany, wielkość porów) i warunki przechowywania. Minimalne standardy Międzynarodowego Towarzystwa Pęcherzyków Zewnątrzkomórkowych (ISEV) dotyczące akceptowalnych szczegółów eksperymentalnych powinny obejmować dobrze udokumentowany protokół NTA dotyczący charakterystyki EV. Poniższy eksperyment dostarcza dowodów na to, że protokół analizy NTA musi zostać ustalony przez indywidualnego badacza i włączony do metod publikacji, które wykorzystują charakterystykę NTA jako jedną z opcji spełnienia MISEV2018 wymagań dotyczących charakterystyki pojedynczego pęcherzyka.

Wprowadzenie

Dokładna i powtarzalna analiza EV i innych cząstek o skali nanometrowej stanowi liczne wyzwanie dla badań i przemysłu. Powielanie badań nad pojazdami elektrycznymi było trudne, częściowo ze względu na brak jednolitości w raportowaniu niezbędnych parametrów związanych z gromadzeniem danych. Aby zaradzić tym niedociągnięciom, ISEV zaproponował wytyczne branżowe jako minimalny zestaw standardów biochemicznych, biofizycznych i funkcjonalnych dla badaczy pojazdów elektrycznych i opublikował je jako oświadczenie o stanowisku, powszechnie określane jako MISEV2014¹. Przyspieszające tempo badań nad pojazdami elektrycznymi wymagało zaktualizowanej wytyczne, a "MISEV2018: oświadczenie o stanowisku ISEV" rozszerzyło MISEV2014 wytyczne². Dokument MISEV2018 zawierał tabele, zarysy sugerowanych protokołów i kroków, które należy wykonać, aby udokumentować konkretną charakterystykę związaną z EV. Jako kolejny środek ułatwiający interpretację i replikację eksperymentów, projekt EV-TRACK został opracowany jako baza wiedzy typu crowd-sourcing (http://evtrack.org), aby umożliwić bardziej przejrzyste raportowanie biologii EV i metodologii stosowanej do publikowania wyników³. Pomimo tych zaleceń dotyczących ustandaryzowanego raportowania metod, dziedzina ta nadal cierpi z powodu replikacji i potwierdzania opublikowanych wyników.

Zgodnie z dążeniami National Institutes of Health i National Science Foundation do oceny jakości, ten artykuł sugeruje, że ISEV wymaga ustandaryzowanego raportowania metod i szczegółów, aby można było zastosować narzędzia do oceny danych w celu replikacji wyników między laboratoriami. Raportowanie źródeł komórek, procedury hodowli komórkowych i metody izolacji EV są ważnymi czynnikami określającymi cechy populacji EV. Wśród instrumentów NTA czynniki takie jak ustawienia detekcji, współczynnik załamania światła płynu nośnego, niejednorodne populacje cząstek przyczyniające się do polidyspersyjności, brak ustandaryzowanych wymagań dotyczących raportowania oraz brak wyników pomiarów wewnątrz i między obserwatorami utrudniają lub uniemożliwiają porównanie NTA między laboratoriami.

Używana od 2006 roku, NTA to popularna metoda określania wielkości i stężenia nanocząstek, która jest obecnie używana przez około 80% badaczy EV⁴. Wytyczne MISEV2018 wymagają dwóch form analizy pojedynczych pęcherzyków, z których NTA jest jedną z popularnych opcji. NTA jest nadal powszechnie stosowana do charakteryzowania pojazdów elektrycznych ze względu na jej szeroką dostępność, niski koszt na próbkę i prostą teorię założycielską (równanie Stokesa-Einsteina). Ocena EV przez NTA generuje oszacowanie rozkładu wielkości i stężenia cząstek przy użyciu rozpraszania światła laserowego i analizy ruchu Browna, przy czym dolna granica wykrywalności jest określana przez współczynnik załamania światła EV. W przypadku korzystania z próbki płynu o znanej lepkości i temperaturze, trajektorie pojazdów elektrycznych są śledzone w celu określenia ich średniego kwadratowego przemieszczenia w dwóch wymiarach. Pozwala to na obliczenie współczynnika dyfuzji cząstek i przekształcenie go w średnicę hydrodynamiczną równoważną kuli za pomocą zmodyfikowanego równania Stokesa-Einsteina^5,6,7. Analiza cząstka-cząstka przez NTA ma mniejszą interferencję ze strony aglomeratów lub większych cząstek w heterogenicznej populacji EV niż inne metody charakteryzacji⁷. Podczas gdy kilka większych cząstek ma minimalny wpływ na dokładność wymiarowania, obecność nawet niewielkich ilości dużych, silnie rozpraszających światło cząstek powoduje znaczne zmniejszenie wykrywania mniejszych cząstek ze względu na zmniejszone wykrywanie i śledzenie EV przez oprogramowanie⁸. Powszechnie uważa się, że NTA jako technika pomiarowa nie jest stronnicza w stosunku do większych cząstek lub agregatów cząstek, ale może rozdzielić populacje o wielu rozmiarach poprzez indywidualną analizę cząstek⁹. Ze względu na wykorzystanie rozpraszania światła przez cząstki, jednym z ograniczeń analizy NTA jest to, że wszelkie cząstki, takie jak kurz, plastik lub proszek o podobnych atrybutach załamania i wielkości w porównaniu z EV, nie mogą być odróżnione od rzeczywistych EV za pomocą tej metody charakteryzacji.

NanoSight LM10 (analizator wielkości nanocząstek) i LM14 (moduł laserowy) są sprzedawane od 2006 roku, i chociaż opracowano nowsze modele tego instrumentu, ten konkretny model znajduje się w wielu podstawowych obiektach i jest uważany za niezawodnego konia roboczego. Potrzebne jest szkolenie, aby prawidłowo zoptymalizować ustawienia NTA dla pomiarów wielkości i stężenia w wysokiej rozdzielczości. Dwa ważne ustawienia potrzebne do optymalnego nagrywania wideo to (1) poziom kamery i (2) próg wykrywania. Muszą one być ustalane przez operatora w oparciu o charakterystykę próbki. Jednym z głównych ograniczeń analizy NTA jest zalecenie stężeń próbki między 10⁷ a 10⁹ cząstek/ml, aby osiągnąć to rozcieńczenie próbki może być wymagane¹⁰. Roztwory stosowane do rozcieńczania, takie jak sól fizjologiczna buforowana fosforanami, sól fizjologiczna 0,15 M lub woda ultraczysta, rzadko są wolne od cząstek o wielkości mniejszej niż 220 μm, które mogą wpływać na pomiary NTA. Charakterystyka NTA roztworów stosowanych do rozcieńczania powinna być przeprowadzana na tym samym poziomie kamery i przy tym samym progu wykrywania, co próbki nanocząstek, które są analizowane. Wielkość i stężenie nanocząstek obecnych w rozcieńczalnikach stosowanych do rozcieńczania próbek EV są rzadko uwzględniane w publikacjach dotyczących analizy NTA EV.

Ten protokół wykorzystuje analizę NTA syntetycznych liposomów podobnych do EV ocenianych przy użyciu wybranych poziomów kamery, progów wykrywania i mechanicznego filtrowania próbek do analizy systematycznych efektów poziomu kamery, progu detekcji lub filtracji próbki na zestaw danych NTA. Liposomy zsyntetyzowano zgodnie z opisem w pliku uzupełniającym S1. W tym eksperymencie użyto syntetycznych liposomów ze względu na ich jednorodność wielkości, właściwości fizyczne i stabilność podczas przechowywania w temperaturze 4 °C. Chociaż można było wykorzystać rzeczywiste próbki pojazdów elektrycznych, niejednorodność i stabilność pojazdów elektrycznych podczas przechowywania mogła skomplikować to badanie i jego interpretację. Podobieństwa w raportach NTA z liposomów (A) i (B) EV wskazują, że systematyczne efekty ujawnione dla liposomów w tym artykule prawdopodobnie będą miały również zastosowanie do charakterystyki EV (Rysunek 1). Łącznie wyniki te wspierają pogląd, że pełne raportowanie krytycznych ustawień oprogramowania i opis przetwarzania próbek, takich jak rozcieńczalnik, rozcieńczanie i filtracja, mają wpływ na odtwarzalność danych NTA.

Celem tego artykułu jest pokazanie, że zmiana ustawień NTA (temperatura, poziom kamery i próg wykrywania) oraz przygotowanie próbki zmienia zebrane wyniki: uzyskano systematyczne, znaczące różnice w wielkości i stężeniu. Ponieważ NTA jest jedną z popularnych opcji spełniania specyfikacji charakterystyki MISEV2018, wyniki te pokazują, jak ważne jest raportowanie przygotowania próbki i ustawień NTA w celu zapewnienia odtwarzalności.

Rysunek 1: Reprezentatywne raporty NTA porównują liposomy z EV. (A) Liposomy: niefiltrowana próbka scharakteryzowana na NTA w dniu 12 marca 2020 r. (B) EVs: niefiltrowana próbka scharakteryzowana na NTA w dniu 26 sierpnia 2021 r. Skróty: NTA = Nanoparticle tracking analysis; EVs = pęcherzyki zewnątrzkomórkowe. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protokół

1. Ogólne wytyczne dotyczące protokołu

1. Mikroskop należy utrzymywać na stole pneumatycznym lub co najmniej na stole bez wibracji. Upewnij się, że zewnętrzne wibracje (np. stukanie stopą o podłogę, dotykanie stołu, zamykanie drzwi, ruch laboratoryjny) są ograniczone do minimum.
2. Ustaw i utrzymuj stałą temperaturę modułu laserowego dla wszystkich nagrań wideo.
   UWAGA: Wybrana temperatura wynosiła 25 °C, ponieważ analizator wielkości nanocząstek został skalibrowany w tej temperaturze. Dlatego ważne jest, aby wszyscy użytkownicy przyrządu znali i używali skalibrowanej temperatury. Temperatura w pomieszczeniu nie jest dopuszczalnym ustawieniem, ponieważ może się różnić.
3. Należy upewnić się, że wszystkie rozcieńczalniki, zwane również kontrolami ujemnymi (np. sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS), ultraczysta woda destylowana [DW]), są scharakteryzowane za pomocą NTA przy użyciu tego samego poziomu kamery i progu wykrywalności, co mierzone próbki nanocząstek. Do płukania modułu laserowego i rozcieńczania próbek należy stosować scharakteryzowany DPBS. Uwzględnia się zanieczyszczenia w DPBS kontroli ujemnej w wynikach próbek, jeżeli ich poziomy są znaczące.
4. Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C przed oceną i nigdy ich nie zamrażać, ponieważ spowodowałoby to degradację próbki liposomowej. Podgrzewać próbki/wzorce/rozcieńczalniki do temperatury pokojowej przez 30 minut przed analizą.
   UWAGA: Postępowanie z próbką było specyficzne dla badanego materiału.
5. Oceń próbkę i wzorce za pomocą szybkiego pomiaru, aby ustalić odpowiednie rozcieńczenie, aby uzyskać 10,⁷ do 10,⁹ cząstek/ml (około 50 do 100 cząstek/ekran wideo NTA), które są optymalne do analiz NTA.
   UWAGA: Autorzy odkryli, że stężenia cząstek na górnym końcu tego zakresu dają bardziej spójne i powtarzalne wyniki.
6. Wypełnij wszystkie odpowiednie pola w polu Przechwytywanie na karcie SOP zarówno dla pomiarów szybkich, jak i standardowych, w tym zastosowane rozcieńczenie i rozcieńczalnik.

2. Przygotowanie wzorców kalibracyjnych wielkości 50 nm i 100 nm

UWAGA: Zobacz Tabelę Materiałów.

1. Wzorce transferu o wielkości 50 nm rozcieńczone w stosunku 1:5 000
   1. Dodać 2 μl wzorców 50 nm do 9 998 μl przefiltrowanego przez 0,22 μm 10 mM chlorku potasu (KCl)/0,03% Tween 20 w ultraczystym DW do dwukrotnie płukanej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Rozcieńczony wzorzec 50 nm należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do roku.
2. Wzorce transferu o wielkości 100 nm rozcieńczone w stosunku 1:333
   1. Dodać 30 μl wzorców 100 nm do 9 970 μl filtrowanego 0,22 μm 10 mM KCl/0,03% Tween 20 w ultraczystym DW do dwukrotnie przepłukanej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Rozcieńczony wzorzec o długości fali 100 nm należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do roku.

3. Czyszczenie i montaż modułu laserowego

1. Sprawdź wzrokowo moduł laserowy i pokrywy komory przepływowej pod kątem zadrapań lub niedoskonałości.
   UWAGA: Jeśli którakolwiek z powierzchni szkła zostanie porysowana, może to mieć wpływ na obrazowanie.
2. Delikatnie wyczyść obie szklane powierzchnie dobrej jakości środkiem do czyszczenia soczewek i papierem do soczewek. Nie używaj chusteczek higienicznych ani ręczników papierowych na szklanych powierzchniach.
3. Przed montażem upewnij się, że uszczelka O-ring jest prawidłowo osadzona w rowku pokrywy komory przepływowej.
4. Umieść pokrywę komory przepływowej na module laserowym, upewniając się, że styki elektryczne są we właściwej orientacji. Umieść 4 sprężynowe skrzydełkowe przez płytkę komory przepływowej i zaczep gwinty modułu laserowego, ale nie dokręcaj pojedynczo.
5. Wywierając równomierny nacisk na pokrywę komory przepływowej, równomiernie dokręcaj skrzydełkowe naprzemiennie po przekątnej, aż będą dobrze dopasowane. Dokręcaj skrzydełkowe tylko do momentu dokręcenia palcami. Nie dokręcaj zbyt mocno.
   UWAGA: Nierównomierne dokręcenie skrzydełkowych może spowodować pęknięcie powierzchni modułu laserowego. Nowsze skrzydełkowe "wyjdą na dno" przy odpowiednim ciśnieniu, unikając ewentualnego nadmiernego dokręcenia.

4. Procedura płukania modułu laserowego przed i pomiędzy próbkami

1. Użyć nowo otwartego pojemnika z DPBS i podwielokrotności do trzykrotnie przepłukanych probówek polipropylenowych o pojemności 15 ml. Przed użyciem należy upewnić się, że produkty używane do przepłukiwania lub rozcieńczania próbek są scharakteryzowane przez NTA (patrz krok 1.3).
2. Przepłukać dwie strzykawki tuberkulinowe o pojemności 1 ml z adapterami Slip Lock 3 razy 1 ml DPBS, aby usunąć wszelkie pozostałości cząstek stałych. Użyj dowolnego portu jako danych wejściowych, ale używaj go konsekwentnie podczas eksperymentu. Nie należy używać większych strzykawek ze względu na niebezpieczeństwo złamania otworów strzykawki z powodu zwiększonej masy i rozmiaru strzykawki.
3. Wyjąć i wyrzucić tłok z pierwszej strzykawki tuberkulinowej i włożyć go do pozostałego portu, aby służył jako opróżniony rozcieńczalnik/zbiornik na próbkę.
   UWAGA: Niewyjęcie tłoka spowoduje wzrost ciśnienia w komorze próbki i nieszczelność wokół uszczelki.
4. Napełnić drugą strzykawkę 1 ml DPBS i przymocować ją do portu wlotowego pokrywy komory przepływowej.
5. Trzymaj moduł laserowy przechylony z wylotowym portem strzykawki podniesionym, aby umożliwić usunięcie powietrza z komory, gdy DPBS jest powoli wstrzykiwany do modułu laserowego.
6. Przepłucz pozostały DPBS z modułu laserowego, wstrzykując 1 ml powietrza do portu wlotowego. Powtórz płukanie jeszcze 2 razy.
7. Opróżnij moduł laserowy tak całkowicie, jak to możliwe po ostatnim płukaniu.
   UWAGA: Po analizie NTA wzorca 50 nm konieczne jest dokładne, ostrożne płukanie, ponieważ cząstki te utrzymują się w module laserowym. Moduł laserowy jest teraz gotowy do użycia.

5. Umieszczenie modułu laserowego na stoliku mikroskopu

1. Zlokalizuj prowadnice ustawiania ostrości modułu laserowego na ramieniu mikroskopu (Rysunek 2) i wyrównaj je za pomocą pokrętła ostrości.

Rysunek 2: Przewodnik po ustawianiu ostrości modułu laserowego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Stojąc przodem do mikroskopu, umieść moduł laserowy w rowkowanym stoliku i delikatnie przesuń go jak najdalej w prawo.
   UWAGA: Jeśli zrobisz to ostrożnie, wyrównanie i ognisko będą łatwiejsze do zlokalizowania między próbkami.
3. Włącz przełącznik kołyskowy na skrzynce sterowniczej lasera.

6. Ogniskowanie i pozycjonowanie modułu laserowego

UWAGA: To musi być wykonane z płynem w komorze.

1. Załaduj oprogramowanie NTA (patrz tabela materiałów) z pulpitu.
   UWAGA: Może pojawić się błąd "Nie znaleziono temperatury H/W w COM3.Po prostu zamknij i ponownie otwórz oprogramowanie, aby to naprawić.
2. Kliknij przycisk Uruchom kamerę na karcie Przechwytywanie w lewym górnym rogu. Jeśli kamera wyłączy się automatycznie po 5 minutach, po prostu kliknij ponownie przycisk Uruchom kamerę, aby ją ponownie uruchomić.
3. W tej samej zakładce dostosuj poziom kamery na 14 do 16, aby rozjaśnić linię lasera i uprościć identyfikację cząstek oraz ostrość.
4. Przekieruj obraz z aparatu do okularów, przesuwając górny suwak po lewej stronie głowicy do środka lub na zewnątrz.
5. Znajdź obszar o zwiększonej gęstości, powszechnie nazywany odciskiem kciuka. Wyśrodkuj i ustaw ostrość odcisku palca pionowo w polu view.
   UWAGA: Linia lasera będzie znajdować się po lewej stronie odcisku kciuka. Zaciemnienie pomieszczenia może ułatwić zlokalizowanie odcisku kciuka i skupienie się na linii lasera.
6. Wyśrodkuj linię lasera w polu view; przesuń górny suwak, aby skierować światło do kamery, jak zaobserwowano na ekranie komputera.
   UWAGA: Linia lasera widoczna teraz na ekranie jest lustrzanym odbiciem okularu view; po lewej stronie okularów będzie po prawej stronie ekranu komputera.
7. Dostosuj ostrość, aby wyostrzyć obraz pojedynczych poruszających się cząstek na ekranie za pomocą pokrętła ostrości.
   UWAGA: Ze względu na głębokość ostrości wszystkie cząstki nie będą ostre, co jest dopuszczalne. Nawet cząsteczki, które są lekko nieostre, zostaną uchwycone przez kamerę i przeanalizowane przez oprogramowanie.

7. Ładowanie wzorców/próbek/rozcieńczalnika do modułu laserowego w celu analizy NTA

1. Pobrać 1 ml wzorca/próbki/rozcieńczalnika do wypłukanej strzykawki tuberkulinowej o pojemności 1 ml i przymocować ją do portu wlotowego pokrywy komory przepływowej. Przesuwać tłok do momentu, aż płyn stanie się widoczny w otwartej strzykawce podłączonej do portu wylotowego.
2. W widoku z kamery przesuń się na prawo od linii lasera do obszaru o jednolitej liczbie cząstek. W razie potrzeby dostosuj orientację pionową, aby wyśrodkować poziome pasma światła. Ustaw ostrość ponownie, aż w polu widzenia znajdzie się największa liczba cząstek. Należy zapewnić, aby w odniesieniu do wszystkich kolejnych środków stanowisko to było jak najściślej utrzymane.
3. Dostosuj poziom kamery do punktu, w którym symbol ciemnych informacji z przerwami w prawym górnym rogu view kamery.
   UWAGA: Pomaga to zapewnić, że dla każdej serii zbierania danych dokonywany jest spójny wybór poziomu kamery na minimalnym poziomie czułości.
   UWAGA: Poziomu kamery nie można zmienić podczas przechwytywania.

8. Walidacja kalibracji

UWAGA: Zaleca się walidację kalibracji modułu przy użyciu wzorców wielkości (patrz sekcja 2) przed analizą próbki. Rutynowa walidacja jest niezbędna do zapewnienia dokładnych pomiarów. W laboratorium z wieloma użytkownikami indywidualne dostosowania ustawień konfiguracyjnych oprogramowania przez poszczególnych użytkowników mogą nieumyślnie spowodować niedokładne gromadzenie danych. W przypadku gromadzenia krytycznych danych codzienna walidacja jest kwestią dobrej praktyki laboratoryjnej. W zgłaszanych wynikach należy uwzględnić codzienną odtwarzalność walidacji. Zazwyczaj kalibracja jest ustawiana przez technika i nie jest regulowana przez indywidualnego użytkownika, chyba że użytkownik ma dostęp administratora. Zapobiega to nieautoryzowanej rekonfiguracji przez poszczególnych użytkowników.

1. Rozcieńczone roztwory ciepła (patrz punkt 2) do temperatury pokojowej przez 30 min.
2. Krótko zawiruj wzorce, a następnie załaduj zgodnie z opisem w rozdziale 7.
3. Wykonać próbkę NTA zgodnie z opisem w sekcji 10 i zapisać wartości w celu późniejszego obliczenia współczynnika zmienności, który powinien być mniejszy niż 2%, jeśli jest prawidłowo skalibrowany.

9. Optymalizacja stężenia próbki dla NTA

UWAGA: Ekran powinien zawierać od 50 do 100 mierzalnych cząstek, jeśli poziom kamery i stężenie próbki są odpowiednio dostosowane. W przypadku jakichkolwiek wątpliwości co do tego, czy próbka ma odpowiednią liczbę cząstek, można w tym momencie przeprowadzić szybki pomiar próbki (patrz kroki od 9.1 do 9.7). Służy do szybkiej oceny charakterystyki próbki przed dłuższymi nagraniami wideo. Karta Szybki pomiar znajduje się na karcie SOP w dolnym środkowym polu.

1. Ustaw czas przechwytywania na 30 s.
2. Zaakceptuj istniejącą podstawową nazwę pliku lub wprowadź nową nazwę pliku, klikając kartę ... dla nowej lokacji magazynu dla wygenerowanych danych.
3. Zaznacz pole Temperatura docelowa i wprowadź żądaną temperaturę.
4. Załaduj przykład zgodnie z wcześniejszym opisem (krok 7.1), a następnie kliknij przycisk Create and Run Script (Utwórz i uruchom skrypt).
5. Poczekaj, aż liczba cząstek na klatkę zostanie wyświetlona w prawym dolnym rogu ekranu wideo po zakończeniu filmu trwającego 30 sekund. Jeśli liczba cząstek jest większa niż 100, przepłucz moduł laserowy 3 razy (jak opisano wcześniej w kroku 4.6).
6. Rozcieńczyć próbkę do pożądanego zakresu stężeń przy użyciu scharakteryzowanego rozcieńczalnika.
7. Załaduj odpowiednio rozcieńczoną próbkę do przepłukanego modułu laserowego i uruchom szybki pomiar, aby sprawdzić, czy próbka mieści się w dopuszczalnym zakresie.

10. Próbka NTA

UWAGA: Zakładka Pomiar standardowy znajduje się w zakładce SOP w dolnym środkowym polu i jest używana do rutynowej analizy próbki (patrz kroki od 10.1 do 10.12).

1. Ustaw czas trwania na 30 lub 60 s, a liczbę filmów na 5.
2. Zaakceptuj istniejącą podstawową nazwę pliku lub wprowadź nową nazwę pliku, klikając kartę ... dla nowej lokacji magazynu dla wygenerowanych danych.
3. Zaznacz pole Temperatura docelowa i wprowadź żądaną temperaturę.
4. Kliknij przycisk Utwórz skrypt, aby ponownie użyć tej miary standardowej.
5. Po załadowaniu przykładu zgodnie z opisem w sekcji 7 i przygotowaniu eksperymentu do uruchomienia kliknij pozycję Utwórz i uruchom skrypt.
6. Wypełnij pola na ekranie podręcznym Ustaw szczegóły raportu, podając informacje o operatorze, opisie próbki, rozcieńczeniu próbki i użytym rozcieńczalniku.
   UWAGA: Informacje te zostaną zapisane i wydrukowane w końcowym raporcie z eksperymentu.
7. Po wypełnieniu wszystkich żądanych pól kliknij przycisk OK, aby zainicjować skrypt.
   UWAGA: Jeśli wybrano temperaturę docelową, grzałka ustabilizuje próbkę w module laserowym do żądanej temperatury na 5 sekund, zanim pozwoli skryptowi kontynuować pomiar. Na panelu diagnostycznym w lewym dolnym rogu ekranu pojawi się napis HEATER ON i wyświetli się temperatura próbki.
8. Przed każdym nagraniem wideo poszukaj monitu, aby ręcznie przesunąć tłok. Wstrzyknij ~0,05 ml próbki do komory laserowej i pozwól, aby cząstki "zatrzymały się" (tj. nie płynęły), a następnie kliknij OK.
9. Poczekaj, aż po zakończeniu 5. przechwytywania wideo pojawi się okno potwierdzenia ustawień i okno Proces zacznie migać. Ustaw próg wykrywania dla przetwarzania próbki, zwracając uwagę na liczbę niebieskich krzyżyków oznaczających cząstki na ekranie, gdy klatki są przesuwane ręcznie od dołu ekranu wideo. Jeśli na każdym ekranie znajdują się więcej niż 3-4 niebieskie krzyżyki oznaczające cząstki w miarę przesuwania się klatek, zwiększ próg wykrywania.
   UWAGA: Niebieskie krzyżyki na poszczególnych cząstkach są analogiczne do efektu "roju" w cytometrii przepływowej i powinny być zminimalizowane w celu uzyskania optymalnej dokładności i odtwarzalności zbierania danych.
10. Kliknij przycisk Ustawienia OK, gdy próg wykrywania jest akceptowalny.
11. Poczekaj, aż filmy zostaną automatycznie przetworzone i zostanie wyświetlony histogram wyników oraz powiadomienie o zakończeniu w oknie dialogowym, zanim klikniesz przycisk OK.
12. Gdy pojawi się okno Eksportuj ustawienia, zapisz wyniki, klikając Export.
    UWAGA: Wszystkie wyniki z filmów i analiz zostaną zapisane w pliku docelowym zdefiniowanym w kroku 10.2. Wymaga to dużej ilości miejsca do przechowywania. W razie potrzeby monitoruj i przenieś na dodatkowe urządzenie pamięci masowej.

11. Ponowna analiza bieżącej próbki przy różnych progach wykrywania

UWAGA: Bezpośrednio po analizie NTA (krok 10), dane mogą być ponownie przeanalizowane przy użyciu różnych ustawień progu wykrywania. Nie można jednak zmienić poziomu kamery po zrobieniu zdjęcia.

1. Wyróżnij wszystkie 5 filmów z nagraniami wideo wymienionych w bieżącym eksperymencie.
2. Kliknij opcję Przetwarzaj wybrane pliki i poczekaj, aż pojawi się okno Potwierdzenie ustawień, a pole Proces zacznie migać, aby zmienić próg wykrywania.
3. Dostosuj próg wykrywania do żądanego poziomu i kliknij przycisk Setting OK (Ustawienia OK).
4. Poczekaj, aż filmy zostaną automatycznie przetworzone i zostanie wyświetlony histogram wyników oraz powiadomienie o zakończeniu w oknie dialogowym, zanim klikniesz przycisk OK.
5. Kliknij przycisk Eksportuj ustawienia. Gdy wykonywane są dodatkowe oceny najnowszej próbki, pamiętaj, aby kliknąć pole Eksportuj wyniki w bieżącym eksperymencie, ponieważ okno podręczne Eksportuj wyniki nie zostanie wyświetlone po ponownej analizie próbki.
   UWAGA: Ponieważ nie ma przypomnień, aby to zrobić, można to łatwo przeoczyć, a analiza zostanie utracona. Jednak dane bazowe pozostaną i mogą być ponownie przeanalizowane później.

12. Analiza zarchiwizowanych plików

UWAGA: Jeśli poprzednio analizowane eksperymenty nie zostały zapisane lub konieczne jest przeprowadzenie dodatkowej analizy na tych próbkach, poszczególne pliki mogą zostać ponownie załadowane do oprogramowania NTA w celu dodatkowych ocen progu wykrywania. Zmiany poziomu kamery nie mogą być modyfikowane po przechwyceniu.

1. Załaduj oprogramowanie NTA z pulpitu.
2. Kliknij kartę Analiza w środkowym dolnym panelu.
3. Kliknij Otwórz eksperyment i przejdź do żądanego pliku .nano.
   UWAGA: Pliki wideo powiązane z wybranym eksperymentem .nano muszą znajdować się w tym samym folderze, co główny plik eksperymentu; W przeciwnym razie pojawi się błąd podczas próby przetworzenia plików. Pierwsze 6 cyfr nazwy pliku to data przeprowadzenia eksperymentu (xx-xx-xx). Ostatnie 6 cyfr nazwy pliku to czas nagrania filmu (xx-xx-xx) oraz indywidualny identyfikator filmu. Plik PDF z każdym połączonym eksperymentem zawiera listę dołączonych plików .nano do tej analizy.
4. Kliknij przycisk Przetwarzaj wybrane pliki, aby uruchomić analizę.
5. Gdy pole Proces zacznie migać, aby zezwolić na zmiany w Progu wykrywania, ustaw próg na żądany poziom i kliknij OK.
6. Poczekaj, aż filmy zostaną automatycznie przetworzone i zostanie wyświetlony histogram wyników oraz powiadomienie o zakończeniu w oknie dialogowym, zanim klikniesz przycisk OK.
7. Kliknij przycisk Eksportuj wyniki. Pamiętaj, aby kliknąć pole Eksportuj wyniki w bieżącym eksperymencie, ponieważ wyskakujące okienko Eksportuj wyniki nie zostanie wyświetlone po ponownej analizie.
   UWAGA: Ponieważ nie ma przypomnień, aby to zrobić, można to łatwo przeoczyć, a analiza zostanie utracona.

13. Czyszczenie i demontaż modułu laserowego

1. Wyłącz skrzynkę kontrolną lasera.
2. Przepłucz całą próbkę z modułu laserowego i wyrzuć ją w odpowiedni sposób.
3. Trzymaj moduł laserowy przechylony z otwartym portem strzykawki podniesionym, aby umożliwić usunięcie powietrza z komory, gdy DPBS jest powoli wstrzykiwany do modułu laserowego i wypłukiwany z wylotowego portu strzykawki.
4. Wypłucz pozostały DPBS z modułu laserowego i wyrzuć.
5. Powtórz płukanie jeszcze 2 razy i opróżnij moduł laserowy tak całkowicie, jak to możliwe po ostatnim płukaniu.
6. Wywierając równomierny nacisk na pokrywę komory przepływowej, równomiernie poluzuj skrzydełkowe naprzemiennie po przekątnej, aż zostaną odłączone od gwintów, wyjmij skrzydełkowe i przechowuj w obudowie modułu laserowego.
7. Zdejmij pokrywę komory przepływowej z modułu laserowego.
8. Delikatnie wyczyść obie szklane powierzchnie dobrej jakości środkiem do czyszczenia soczewek i papierem do soczewek. Nie używaj bibuły ani ręczników papierowych na szklanych powierzchniach.
9. Po użyciu należy sprawdzić wzrokowo moduł laserowy i "okna" pokrywy komory przepływowej pod kątem zadrapań lub niedoskonałości i zgłosić to przełożonemu.
10. Wymień moduł laserowy i pokrywę komory przepływowej w ich obudowach, aby zapobiec uszkodzeniu szklanych powierzchni podczas przechowywania.

14. Protokół analizy próbki

1. Próbki niefiltrowane
   1. Wiruj próbkę przed załadowaniem i nagrywaj filmy 5 x 60 s na poziomie kamery 12 i poziomie progu wykrywania 3, jak opisano powyżej. Ponownie przeanalizuj te filmy przy użyciu progów wykrywania 2 i 5.
   2. Powtórz kolekcje wideo tej samej próbki na poziomach kamery 13 i 14 oraz na poziomie progu wykrywania 3. Ponownie przeanalizuj te 2 dodatkowe filmy, korzystając z progów wykrywania 2 i 5. Powtórz cały proces, używając filmów 5 x 30 s w ustawieniach SOP.
2. Przefiltrowane próbki
   1. Wirować próbkę, a następnie jednocześnie ładować i filtrować ją (filtr strzykawkowy 0,22 μm) bezpośrednio do modułu laserowego.
      UWAGA: Filtr strzykawkowy został przepłukany 2-krotnością objętości martwej przestrzeni filtra przed użyciem w celu usunięcia wszelkich osadzających się cząstek. Filtry strzykawkowe (patrz Tabela materiałów) miały zmierzoną martwą przestrzeń 0,5 ml i zostały przepłukane 1,0 ml próbki przed pomiarami. Zwróć uwagę na typ filtru w polach danych SOP. Przefiltrowana próbka została przetworzona dokładnie tak, jak opisano dla próbek niefiltrowanych w kroku 14.1.

15. Analiza statystyczna wyników NTA

1. W celu analizy głównych efektów lub interakcji należy przeprowadzić analizę wariancji po sprawdzeniu założeń ANOVA (normalność, jednomodalność, jednorodność wariancji). Używaj jednokierunkowej ANOVA Kruskala-Wallisa na rangach w przypadku niepowodzenia założeń ANOVA.
2. Po powrocie znaczących efektów głównych należy zastosować metodę Dunna, aby przeprowadzić badanie środków dla wcześniej zaplanowanych porównań. Uznajmy, że wartość p wynosząca 0,05 jest istotna w testach dwustronnych.
   UWAGA: Wygenerowane tutaj pliki danych są dostępne u autorów po zawarciu umowy o przekazanie materiałów.

Wyniki

Tabela 1 zawiera wyniki filmów NTA dla próbek liposomów (18 filtrowanych i 18 niefiltrowanych) oraz reprezentatywnego rozcieńczalnika DPBS. Porównania między obiema grupami przeprowadzono niezależnie od poziomu kamery lub progu wykrywalności w tym artykule. Przefiltrowane próbki miały średnią średnicę cząstek 108,5 nm, tryb cząstek 86,2 nm i stężenie 7,4 × 10⁸ cząstek/ml. Natomiast próbki niefiltrowane miały średnią średnicę cząstek 159,1 nm, tryb cząstek 105,7 nm i stężenie 7,6 × 10⁸

Dyskusja

Dostępnych jest kilka metod szacowania wielkości i stężenia nanocząstek¹¹. Należą do nich metody zespołowe, które generują oszacowanie wielkości populacji, w tym dynamiczne rozpraszanie światła (DLS), sedymentacja odśrodkowa i analiza na poziomie pojedynczej cząstki - mikroskopia elektronowa, NTA, mikroskopia sił atomowych i przestrajalne wykrywanie impulsów rezystancyjnych. Spośród nich DLS i NTA są szeroko stosowanymi, nieniszczącymi metodami pomiaru wielkości i stężenia, opartymi na ruchu Brown...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
pipeterowe
, stożkowe, Nunc 15 mL	Thermo Sci.	339650
Kimwipes
Papier
			soczewek
NanoSight LM-10	Malvern Panalytical
Moduł laserowy NanoSight LM-14	Malvern Panalytical
Nanosight NTA Software Ver. 3.2	Malvern Panalytical
Ręczniki
Końcówki do pipet, 1-200 i mikro; L, Filtrowane, Sterylne, Niskowiążące	końcówki	P -3243-200X
, 50-1,000 &mikro; L, Filtrowany, Sterylny	BioExpress	P-3243-1250
Sól fizjologiczna, Dulbecco's Phosphate Buffered (No Ca lub Mg)	Gibco	14190-144
Standardy, Transfer lateksowy - 100 nm (3 mL)	Malvern	NTA4088
Standardy, Transfer lateksowy - 50 nm  (3 ml)		Malvern
, 33 mm, .22 i mikro; m, MCE, sterylna	marka Fisher	09-720-004
Strzykawka, TB, 1 mL, końcówka poślizgowa	Becton Dickinson	309659
Pojemnik