Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Poprawa odtwarzalności w celu uzyskania minimalnych informacji do badań pęcherzyków zewnątrzkomórkowych Wytyczne z 2018 r. dotyczące analizy śledzenia nanocząstek

2.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63059

⸱

17 listopada 2021

 ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Physiology, Kansas State University College of Veterinary Medicine, 2Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Kansas Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

Analiza śledzenia nanocząstek (NTA) jest powszechnie stosowaną metodą do charakteryzowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. W artykule przedstawiono parametry eksperymentalne i kontrolne NTA oraz jednolitą metodę analizy i charakterystyki próbek i rozcieńczalników niezbędną do uzupełnienia wytycznych zaproponowanych przez MISEV2018 i EV-TRACK w zakresie odtwarzalności między laboratoriami.

Streszczenie

Analiza śledzenia nanocząstek (NTA) jest jedną z kilku metod charakteryzacji używanych do badań nad pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi (EV) od 2006 roku. Wiele osób uważa, że przyrządy NTA i ich pakiety oprogramowania mogą być łatwo wykorzystywane po minimalnym szkoleniu, a kalibracja rozmiaru jest możliwa we własnym zakresie. Ponieważ zarówno akwizycja NTA, jak i analiza oprogramowania stanowią charakterystykę EV, zostały one omówione w Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 (MISEV2018). Ponadto były one monitorowane w ramach Przejrzystego Raportowania i Centralizacji Wiedzy w Badaniach nad Pęcherzykami Zewnątrzkomórkowymi (EV-TRACK) w celu poprawy niezawodności eksperymentów EV (np. zminimalizowania zmienności eksperymentalnej spowodowanej niekontrolowanymi czynnikami).

Pomimo wysiłków mających na celu zachęcenie do raportowania metod i kontroli, wiele opublikowanych prac badawczych nie informuje o krytycznych ustawieniach potrzebnych do odtworzenia oryginalnych obserwacji NTA. Niewiele prac opisuje charakterystykę NTA kontroli ujemnych lub rozcieńczalników, najwyraźniej zakładając, że dostępne na rynku produkty, takie jak sól fizjologiczna buforowana fosforanami lub ultraczysta woda destylowana, są wolne od cząstek stałych. Podobnie, kontrole pozytywne lub normy wielkości są rzadko zgłaszane przez badaczy w celu weryfikacji wielkości cząstek. Równanie Stokesa-Einsteina obejmuje zmienne lepkości i temperatury próbki w celu określenia przemieszczenia cząstek. Raportowanie stabilnej temperatury w komorze laserowej podczas całego pobierania próbek wideo jest zatem niezbędnym środkiem kontrolnym dla dokładnej replikacji. Filtracja próbek lub rozcieńczalników również nie jest rutynowo raportowana, a jeśli tak, rzadko podaje się specyfikę filtra (producent, materiał membrany, wielkość porów) i warunki przechowywania. Minimalne standardy Międzynarodowego Towarzystwa Pęcherzyków Zewnątrzkomórkowych (ISEV) dotyczące akceptowalnych szczegółów eksperymentalnych powinny obejmować dobrze udokumentowany protokół NTA dotyczący charakterystyki EV. Poniższy eksperyment dostarcza dowodów na to, że protokół analizy NTA musi zostać ustalony przez indywidualnego badacza i włączony do metod publikacji, które wykorzystują charakterystykę NTA jako jedną z opcji spełnienia MISEV2018 wymagań dotyczących charakterystyki pojedynczego pęcherzyka.

Wprowadzenie

Dokładna i powtarzalna analiza EV oraz innych cząstek w skali nanometrycznej stanowi liczne wyzwanie zarówno w badaniach naukowych, jak i w przemyśle. Replikacja badań nad EV była utrudniona, częściowo ze względu na brak jednolitości w raportowaniu niezbędnych parametrów związanych z gromadzeniem danych. Aby zaradzić tym brakom, ISEV zaproponowało wytyczne branżowe jako minimalny zestaw standardów biochemicznych, biofizycznych i funkcjonalnych dla badaczy EV, publikując je w formie oświadczenia stanowiskowego, powszechnie znanego jako MISEV20141. Przyspieszające tempo badań nad EV wymagało zaktualizowania wytycznych, w związku z czym „MISEV2018: a position statement of the ISEV” rozszerzyło wytyczne MISEV20142. Publikacja MISEV2018 zawierała tabele, zarysy sugerowanych protokołów oraz kroki, które należy podjąć w celu udokumentowania specyficznej charakterystyki związanej z EV. Jako kolejny środek mający na celu ułatwienie interpretacji i replikacji eksperymentów, opracowano EV-TRACK jako bazę wiedzy opartą na crowdsourcingu (http://evtrack.org), aby umożliwić bardziej przejrzyste raportowanie biologii EV oraz metodologii stosowanej w publikowanych wynikach3. Pomimo tych zaleceń dotyczących standaryzowanego raportowania metod, dziedzina ta nadal boryka się z problemami w zakresie replikacji i potwierdzania opublikowanych wyników.

W zgodzie z dążeniami National Institutes of Health oraz National Science Foundation do opracowania narzędzi oceny jakości, niniejsza praca sugeruje, że ISEV wymaga standaryzowanego raportowania metod i szczegółów, aby możliwe było zastosowanie narzędzi oceny danych w celu replikacji wyników między laboratoriami. Raportowanie źródeł komórek, procedur hodowli komórkowych oraz metod izolacji EV są istotnymi czynnikami określającymi cechy populacji EV. W przypadku instrumentów NTA czynniki takie jak ustawienia detekcji, współczynnik załamania światła cieczy nośnej, heterogeniczne populacje cząstek przyczyniające się do polidyspersyjności, brak ujednoliconych wymagań dotyczących raportowania oraz brak wyników pomiarów wewnątrz- i międzyobserwatorami sprawiają, że porównanie NTA między laboratoriami jest trudne lub niemożliwe.

NTA, stosowana od 2006 roku, jest popularną metodą określania wielkości i stężenia nanocząstek, z której korzysta obecnie około 80% badaczy EV4. Wytyczne MISEV2018 wymagają zastosowania dwóch form analizy pojedynczych pęcherzyków, z których NTA jest jedną z popularnych opcji. NTA pozostaje w powszechnym użyciu w charakterystyce EV ze względu na szeroką dostępność, niski koszt analizy pojedynczej próbki oraz prostą teorię podstawową (równanie Stokesa-Einsteina). Ocena EV za pomocą NTA generuje rozkład wielkości cząstek i szacunkowe stężenie z wykorzystaniem rozpraszania światła laserowego oraz analizy ruchu Browna, przy czym dolna granica detekcji jest określona przez współczynnik załamania światła EV. Przy użyciu próbki płynnej o znanej lepkości i temperaturze śledzone są trajektorie EV w celu określenia ich średniokwadratowego przesunięcia w dwóch wymiarach. Pozwala to na obliczenie współczynnika dyfuzji cząstek i przeliczenie go na hydrodynamiczną średnicę ekwiwalentu sferycznego za pomocą zmodyfikowanego równania Stokesa-Einsteina5,6,7. Analiza cząstka po cząstce w NTA wykazuje mniejsze zakłócenia spowodowane przez aglomeraty lub większe cząstki w heterogennej populacji EV niż inne metody charakterystyki7. Choć kilka większych cząstek ma minimalny wpływ na dokładność pomiaru wielkości, obecność nawet śladowych ilości dużych cząstek o wysokim rozpraszaniu światła prowadzi do zauważalnego zmniejszenia detekcji mniejszych cząstek ze względu na utrudnione wykrywanie i śledzenie EV przez oprogramowanie8. Jako technika pomiarowa NTA jest ogólnie uznawana za nieobciążoną w stronę większych cząstek lub agregatów cząstek i może rozdzielać populacje o różnych rozmiarach poprzez analizę pojedynczych cząstek9. Ze względu na wykorzystanie rozpraszania światła przez cząstki, jednym z ograniczeń analizy NTA jest fakt, że wszelkie zanieczyszczenia cząsteczkowe, takie jak kurz, plastik lub proszek o podobnych właściwościach załamania i rozmiaru w porównaniu do EV, nie mogą zostać odróżnione od rzeczywistych EV za pomocą tej metody charakterystyki.

Urządzenia NanoSight LM10 (analizator wielkości nanocząstek) i LM14 (moduł laserowy) są sprzedawane od 2006 roku i choć opracowano nowsze modele tego instrumentu, ten konkretny model znajduje się w wielu placówkach badawczych i jest uważany za niezawodny sprzęt roboczy. Szkolenie jest niezbędne, aby prawidłowo zoptymalizować ustawienia NTA dla pomiarów wielkości i stężenia o wysokiej rozdzielczości. Dwiema ważnymi ustawieniami niezbędnymi do optymalnych nagrań wideo są (1) poziom kamery oraz (2) próg detekcji. Muszą one zostać ustawione przez operatora na podstawie charakterystyki próbki. Jednym z głównych ograniczeń analizy NTA jest zalecenie stosowania stężeń próbek od 107 do 109 cząstek/mL; aby to osiągnąć, może być wymagane rozcieńczenie próbki10. Roztwory stosowane do rozcieńczania, takie jak solanka fosforanowa (PBS), solanka 0,15 M lub woda ultrapure, rzadko są całkowicie wolne od cząstek o wielkości mniejszej niż 220 µm, co może wpływać na pomiary NTA. Charakterystyka NTA roztworów stosowanych do rozcieńczania powinna być przeprowadzona przy tym samym poziomie kamery i progu detekcji, co w przypadku analizowanych próbek nanocząstek. Wielkość i stężenie nanocząstek obecnych w rozcieńczalnikach stosowanych do rozcieńczania próbek EV rzadko są uwzględniane w publikacjach dotyczących analizy NTA w odniesieniu do EV.

Niniejszy protokół wykorzystuje analizę NTA syntetycznych liposomów przypominających EV, ocenianych przy użyciu wybranych poziomów czułości kamery, progów detekcji oraz mechanicznego filtrowania próbek, w celu analizy systematycznego wpływu poziomu kamery, progu detekcji lub filtracji próbki na zestaw danych NTA. Liposomy zsyntezowano zgodnie z opisem w Pliku uzupełniającymS1. W tym eksperymencie wykorzystano syntetyczne liposomy ze względu na ich jednolitość rozmiaru, właściwości fizyczne oraz stabilność podczas przechowywania w temperaturze 4 °C. Choć można było użyć rzeczywistych próbek EV, heterogenność i stabilność EV podczas przechowywania mogłyby skomplikować to badanie i jego interpretację. Podobieństwa w raportach NTA dla (A) liposomów i (B) EV wskazują, że efekty systematyczne ujawnione dla liposomów w niniejszej pracy prawdopodobnie będą miały zastosowanie również do charakterystyki EV (Rycina 1). Wspólnie znaleziska te potwierdzają tezę, że pełne raportowanie krytycznych ustawień oprogramowania oraz opis przygotowania próbki, taki jak rodzaj rozcieńczalnika, stopień rozcieńczenia i filtracja, wpływają na powtarzalność danych NTA.

Celem niniejszej pracy jest wykazanie, że zmiana ustawień NTA (temperatury, poziomu kamery oraz progu detekcji) i przygotowania próbki wpływa na zbierane wyniki: uzyskano systematyczne, istotne różnice w wielkości i stężeniu. Ponieważ NTA jest jedną z popularnych metod spełnienia specyfikacji charakterystyki MISEV2018, wyniki te wskazują na znaczenie raportowania przygotowania próbek oraz ustawień NTA w celu zapewnienia powtarzalności.

Raporty z analizy śledzenia nanocząstek; rozkład wielkości i wykresy stężenia próbek liposomów/EV.
Rycina 1: Reprezentatywne raporty NTA służące do porównania liposomów z EV. (A) Liposomy: nieprzefiltrowana próbka scharakteryzowana za pomocą NTA w dniu 12 marca 2020 r. (B) EV: nieprzefiltrowana próbka scharakteryzowana za pomocą NTA w dniu 26 sierpnia 2021 r. Skróty: NTA = analiza śledzenia nanocząstek; EV = pęcherzyki zewnątrzkomórkowe. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Ogólne wytyczne protokołu

  1. Mikroskop należy umieścić na stole pneumatycznym lub co najmniej na stole wolnym od wibracji. Należy dbać o to, aby zewnętrzne drgania (np. tupanie stopą po podłodze, dotykanie stołu, zamykanie drzwi, ruch w laboratorium) były ograniczone do minimum.
  2. Należy ustawić i utrzymywać stałą temperaturę modułu laserowego podczas wszystkich nagrań wideo.
    UWAGA: Wybrano temperaturę 25 °C, ponieważ analizator wielkości nanocząstek został skalibrowany w tej temperaturze. Dlatego ważne jest, aby wszyscy użytkownicy instrumentu znali i stosowali temperaturę kalibracyjną. Temperatura pokojowa nie jest dopuszczalnym ustawieniem, ponieważ może ona ulegać zmianom.
  3. Należy upewnić się, że wszystkie rozcieńczalniki, nazywane również kontrolami negatywnymi (np. solanka fosforanowa Dulbecco (DPBS), ultraczysta woda destylowana [DW]), zostały scharakteryzowane metodą NTA przy użyciu tego samego poziomu kamery i progu detekcji, co mierzone próbki nanocząstek. Do płukania modułu laserowego i rozcieńczania próbek należy używać scharakteryzowanego DPBS. W przypadku istotnego poziomu zanieczyszczeń w kontrolnym DPBS należy uwzględnić je w wynikach próbek.
  4. Próbki przed oceną należy przechowywać w temperaturze 4 °C i nigdy ich nie zamrażać, ponieważ mogłoby to doprowadzić do degradacji próbek liposomów. Próbki/standardy/rozcieńczalniki należy ogrzać do temperatury pokojowej przez 30 min przed analizą.
    UWAGA: Sposób obchodzenia się z próbkami był dostosowany do badanego materiału.
  5. Próbki i standardy należy ocenić za pomocą funkcji Quick measurement, aby ustalić odpowiednie rozcieńczenie pozwalające uzyskać od 107 do 109 cząstek/mL (około 50 do 100 cząstek na ekranie wideo NTA), co uznano za optymalne dla analiz NTA.
    UWAGA: Autorzy stwierdzili, że stężenia cząstek z górnego zakresu tej wartości dają bardziej spójne i powtarzalne wyniki.
  6. Należy wypełnić wszystkie odpowiednie pola w oknie Capture w zakładce SOP zarówno dla pomiarów Quick, jak i Standard, w tym informacje o zastosowanym rozcieńczeniu i rozcieńczalniku.

2. Przygotowanie wzorców kalibracyjnych o rozmiarach 50 nm i 100 nm

UWAGA: Patrz Tabela materiałów.

  1. Standardy transferu wielkości 50 nm rozcieńczone 1:5 000
    1. Do dwukrotnie wypłukanej probówki stożkowej o pojemności 15 mL dodać 2 µL standardów 50 nm do 9 998 µL 10 mM chlorku potasu (KCl)/0,03% Tween 20 w ultraczystej wodzie destylowanej (DW), przefiltrowanego przez filtr 0,22 µm. Rozcieńczony standard 50 nm przechowywać w temperaturze 4 °C do roku.
  2. Standardy transferu wielkości 100 nm rozcieńczone 1:333
    1. Do dwukrotnie wypłukanej probówki stożkowej o pojemności 15 mL dodać 30 µL standardów 100 nm do 9 970 µL 10 mM KCl/0,03% Tween 20 w ultraczystej DW, przefiltrowanego przez filtr 0,22 µm. Rozcieńczony standard 100 nm przechowywać w temperaturze 4 °C do roku.

3. Czyszczenie i montaż modułu laserowego

  1. Wizualnie sprawdź moduł laserowy i okna pokrywy celi przepływowej pod kątem zarysowań lub niedoskonałości.
    UWAGA: Jeśli któraś z powierzchni szklanych jest zarysowana, może to wpłynąć na obrazowanie.
  2. Ostrożnie oczyść obie powierzchnie szklane, używając wysokiej jakości środka do czyszczenia soczewek oraz papieru do soczewek. Nie używaj chusteczek higienicznych ani ręczników papierowych do powierzchni szklanych.
  3. Przed montażem upewnij się, że uszczelka typu O-ring jest prawidłowo osadzona w rowku pokrywy celi przepływowej.
  4. Nałóż pokrywę celi przepływowej na moduł laserowy, dbając o prawidłową orientację styków elektrycznych. Włóż 4 sprężynowe śruby motylkowe przez płytkę celi przepływowej i zakręć je w gwintach modułu laserowego, ale nie dokręcaj ich pojedynczo.
  5. Wywierając równomierny nacisk na pokrywę celi przepływowej, dokręcaj śruby motylkowe sukcesywnie w sposób naprzemienny, na ukos, aż zostaną osadzone. Dokręcaj śruby motylkowe tylko do momentu oporu (ręcznie). Nie dokręcaj zbyt mocno.
    UWAGA: Nierównomierne dokręcanie śrub motylkowych może spowodować pęknięcie powierzchni modułu laserowego. Nowsze modele śrub motylkowych zatrzymują się przy odpowiednim nacisku, co zapobiega możliwości zbyt mocnego dokręcenia.

4. Procedura płukania modułu laserowego przed oraz pomiędzy próbkami

  1. Należy użyć nowo otwartego pojemnika z DPBS i rozdzielić go do trzykrotnie przepłukanych polipropylenowych probówek o pojemności 15 mL. Przed użyciem należy upewnić się, że produkty stosowane do płukania lub rozcieńczania próbek zostały scharakteryzowane metodą NTA (patrz krok 1.3).
  2. Dwie strzykawki tuberkulinowe o pojemności 1 mL z adapterami typu slip lock należy przepłukać 3 razy 1 mL DPBS, aby usunąć wszelkie pozostałości cząsteczkowe. Jako wlot można wykorzystać dowolny port, jednak należy go konsekwentnie stosować przez cały eksperyment. Nie należy używać większych strzykawek ze względu na ryzyko uszkodzenia portów strzykawki spowodowane zwiększoną wagą i rozmiarem strzykawki.
  3. Należy wyjąć i wyrzucić tłok z 1.sz strzykawki tuberkulinowej, a następnie włożyć ją do pozostałego portu, aby służyła jako pusty zbiornik na rozcieńczalnik/próbkę.
    UWAGA: Nieusunięcie tłoka spowoduje wzrost ciśnienia w komorze z próbką i wycieki wokół uszczelki.
  4. Należy napełnić 2.gą strzykawkę 1 mL DPBS i podłączyć ją do portu wlotowego pokrywy celi przepływowej.
  5. Należy trzymać moduł laserowy pod kątem, z uniesionym portem wylotowym strzykawki, aby umożliwić usunięcie powietrza z komory podczas powolnego wtryskiwania DPBS do modułu laserowego.
  6. Pozostały w module laserowym DPBS należy usunąć poprzez wstrzyknięcie 1 mL powietrza do portu wlotowego. Czynność płukania należy powtórzyć jeszcze 2 razy.
  7. Po ostatnim płukaniu należy jak najdokładniej opróżnić moduł laserowy.
    ​UWAGA: Dokładne i staranne płukanie jest niezbędne po analizie NTA standardu 50 nm, ponieważ cząstki te pozostają w module laserowym. Moduł laserowy jest teraz gotowy do użycia.

5. Umieszczenie modułu laserowego na stole mikroskopu

  1. Zlokalizuj prowadnice ustawiania ostrości modułu lasera na ramieniu mikroskopu (Rysunek 2) i ustaw je za pomocą pokrętła ostrości.

Mechanizm ostrzenia mikroskopu z zaznaczoną skalą kalibracyjną dla precyzji optycznej.
Rycina 2: Przewodnik po ustawianiu ostrości modułu laserowego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Stojąc przed mikroskopem, umieść moduł laserowy w rowku stolika i delikatnie przesuń go maksymalnie w prawo.
    UWAGA: Zachowanie ostrożności podczas tej czynności ułatwi późniejsze ustawienie osi i lokalizację plamki ogniskowej pomiędzy próbkami.
  2. Włącz przełącznik kołyskowy na sterowniku lasera.

6. Ustawianie ostrości i pozycjonowanie modułu laserowego

UWAGA: Czynność tę należy przeprowadzić w obecności cieczy w komorze.

  1. Uruchom oprogramowanie NTA (patrz Tabela materiałów) z pulpitu.
    UWAGA: Może pojawić się błąd „Temperature H/W not found on COM3.”. Aby go naprawić, wystarczy zamknąć i ponownie otworzyć oprogramowanie.
  2. Kliknij Start Camera w zakładce Capture w polu w lewym górnym rogu. Jeśli kamera wyłączy się automatycznie po 5 min, ponownie kliknij Start Camera, aby ją uruchomić.
  3. W tej samej zakładce ustaw Camera Level na wartość od 14 do 16, aby rozjaśnić linię lasera i ułatwić identyfikację oraz ogniskowanie cząstek.
  4. Przekieruj obraz z kamery do okularów, przesuwając górny suwak po lewej stronie głowicy do wewnątrz lub na zewnątrz.
  5. Znajdź obszar o zwiększonej gęstości, powszechnie nazywany odciskiem kciuka (thumbprint). Wycentruj i ustaw ostrość odcisku kciuka w pionie w polu widzenia.
    UWAGA: Linia lasera będzie znajdować się po lewej stronie odcisku kciuka. Zaciemnienie pomieszczenia może ułatwić zlokalizowanie odcisku kciuka i ustawienie ostrości na linii lasera.
  6. Wycentruj linię lasera w polu widzenia; przesuń górny suwak, aby przekierować światło do kamery, co będzie widoczne na ekranie komputera.
    UWAGA: Linia lasera widoczna teraz na ekranie jest obrazem lustrzanym widoku w okularach; lewa strona w okularach będzie prawą stroną na ekranie komputera.
  7. Za pomocą pokrętła ostrości wyreguluj ogniskowanie, aby wyostrzyć obraz poszczególnych ruchomych cząstek na ekranie.
    UWAGA: Ze względu na głębię ostrości nie wszystkie cząstki będą ostre, co jest dopuszczalne. Nawet cząstki będące lekko poza zakresem ostrości zostaną zarejestrowane przez kamerę i przeanalizowane przez oprogramowanie.

7. Załadunek wzorców/próbek/rozcieńczalnika do modułu laserowego w celu analizy NTA

  1. Nabrać 1 mL standardu/próbki/rozcieńczalnika do wypłukanej strzykawki tuberkulinowej o pojemności 1 mL i przymocować ją do wlotu pokrywy celi przepływowej. Przesuwać tłok, aż ciecz pojawi się w otwartej strzykawce przymocowanej do wylotu.
  2. W widoku kamery przesunąć się na prawo od linii lasera do obszaru o jednolitej liczbie cząsteczek. W razie potrzeby dostosować orientację pionową, aby wycentrować poziome pasma światła. Ponownie ustawić ostrość, aż w polu widzenia znajdzie się jak największa liczba cząsteczek. Należy upewnić się, że podczas wszystkich kolejnych pomiarów pozycja ta jest utrzymywana jak najdokładniej.
  3. Dostosować Camera Level do momentu, w którym symbol informacji Dark w prawym górnym rogu widoku kamery będzie migał z określoną częstotliwością.
    UWAGA: Pomaga to zapewnić spójny wybór poziomu kamery przy minimalnym poziomie czułości dla każdej serii gromadzenia danych.
    UWAGA: Camera Level nie może być zmieniany podczas przechwytywania obrazu.

8. Walidacja kalibracji

UWAGA: Przed analizą próbek zaleca się walidację kalibracji modułu przy użyciu standardów wielkości (patrz sekcja 2). Rutynowa walidacja jest niezbędna do zapewnienia dokładnych pomiarów. W laboratorium wieloużytkownikowym indywidualne zmiany ustawień konfiguracji oprogramowania przez użytkowników mogą nieumyślnie doprowadzić do nieprawidłowego gromadzenia danych. W przypadku krytycznego zbierania danych, codzienna walidacja jest elementem dobrej praktyki laboratoryjnej. Powtarzalność walidacji z dnia na dzień powinna zostać uwzględniona w raportowanych wynikach. Zazwyczaj kalibracja jest ustawiana przez technika i nie może być zmieniana przez poszczególnych użytkowników, chyba że posiadają oni uprawnienia administratora. Zapobiega to nieautoryzowanej rekonfiguracji przez poszczególnych użytkowników.

  1. Ogrzewać rozcieńczone wzorce (patrz sekcja 2) do temperatury pokojowej przez 30 min.
  2. Krótko wymieszać wzorce w wirówce typu vortex, a następnie nanieść zgodnie z opisem w sekcji 7.
  3. Przeprowadzić analizę NTA próbek zgodnie z opisem w sekcji 10 i zapisać wartości do późniejszego obliczenia współczynnika zmienności, który w przypadku poprawnej kalibracji powinien wynosić mniej niż 2%.

9. Optymalizacja stężenia próbki dla NTA

UWAGA: Przy prawidłowym ustawieniu poziomu kamery i stężenia próbki, na ekranie powinno znajdować się od 50 do 100 mierzalnych cząsteczek. W przypadku wątpliwości co do odpowiedniej liczby cząsteczek w próbce, na tym etapie można przeprowadzić Szybki Pomiar (patrz kroki od 9.1 do 9.7). Służy on do szybkiej oceny charakterystyki próbki przed dłuższymi nagraniami wideo. Karta Szybki Pomiar znajduje się w karcie SOP w dolnym środkowym polu.

  1. Ustaw Capture duration (Czas przechwytywania) na 30 s.
  2. Zaakceptuj istniejącą nazwę pliku bazowego lub wprowadź nową nazwę, klikając kartę ..., aby wybrać nowe miejsce zapisu generowanych danych.
  3. Zaznacz pole Target temperature (Temperatura docelowa) i wprowadź pożądaną temperaturę.
  4. Załaduj próbkę zgodnie z wcześniejszym opisem (krok 7.1) i kliknij Create and Run Script (Utwórz i uruchom skrypt).
  5. Po zakończeniu 30 s nagrania poczekaj, aż w prawym dolnym rogu ekranu wideo pojawi się liczba cząstek na klatkę. Jeśli liczba cząstek przekracza 100, przepłucz moduł laserowy 3 razy (zgodnie z wcześniejszym opisem w kroku 4.6).
  6. Rozcieńcz próbkę do pożądanego zakresu stężeń, używając scharakteryzowanego rozcieńczalnika.
  7. Załaduj odpowiednio rozcieńczoną próbkę do przepłukanego modułu laserowego i uruchom Quick Measurement (Szybki pomiar), aby zweryfikować, czy próbka mieści się w dopuszczalnym zakresie.

10. Analiza NTA próbki

UWAGA: Karta Standard Measurement (Standardowy Pomiar) znajduje się w karcie SOP w dolnym środkowym polu i jest używana do rutynowej analizy próbek (patrz kroki 10.1 do 10.12).

  1. Ustaw czas trwania na 30 lub 60 s oraz liczbę filmów na 5.
  2. Zaakceptuj istniejącą nazwę pliku bazowego lub wprowadź nową nazwę, klikając zakładkę ..., aby wybrać nowe miejsce zapisu wygenerowanych danych.
  3. Zaznacz pole Target temperature (Temperatura docelowa) i wprowadź pożądaną temperaturę.
  4. Kliknij Create Script (Utwórz skrypt), aby ponownie wykorzystać ten Standard Measurement (Standardowy pomiar).
  5. Po załadowaniu próbki zgodnie z opisem w sekcji 7 i przygotowaniu eksperymentu do uruchomienia, kliknij Create and Run Script (Utwórz i uruchom skrypt).
  6. Wypełnij pola w oknie pop-up Set Report Details (Ustaw szczegóły raportu) informacjami o operatorze, opisem próbki, rozcieńczeniem próbki oraz użytym rozcieńczalniku.
    UWAGA: Informacje te zostaną zapisane i wydrukowane w końcowym raporcie z eksperymentu.
  7. Po wypełnieniu wszystkich wymaganych pól kliknij OK, aby uruchomić skrypt.
    UWAGA: Jeśli wybrano Target temperature, grzejnik ustabilizuje próbkę w module laserowym do żądanej temperatury przez 5 s przed przejściem skryptu do pomiaru. Panel diagnostyczny w lewym dolnym rogu ekranu wyświetli komunikat HEATER ON oraz temperaturę próbki.
  8. Przed każdym nagraniem wideo poczekaj na monit o ręczne Advance (Przesunięcie) tłoka. Wstrzyknij ~0.05 mL próbki do komory laserowej i poczekaj, aż cząstki „spoczną” (tj. przestaną płynąć), a następnie kliknij OK.
  9. Po zakończeniu nagrania 5th filmu poczekaj, aż pojawi się okno Settings Confirmation (Potwierdzenie ustawień), a okno Process box zacznie migać. Ustaw Detection Threshold (Próg detekcji) dla przetwarzania próbki, obserwując liczbę niebieskich krzyżyków zaznaczających cząstki na ekranie podczas ręcznego przewijania klatek od dołu ekranu wideo. Jeśli na każdej klatce podczas przewijania pojawia się więcej niż 3-4 niebieskie krzyżyki, zwiększ Detection Threshold.
    UWAGA: Niebieskie krzyżyki na poszczególnych cząstkach są analogiczne do efektu „rojenia” w cytometrii przepływowej i powinny być zminimalizowane w celu uzyskania optymalnej dokładności i powtarzalności gromadzenia danych.
  10. Kliknij Settings OK, gdy próg detekcji będzie akceptowalny.
  11. Poczekaj na automatyczne przetworzenie filmów, wyświetlenie histogramu wyników oraz powiadomienie w oknie dialogowym o zakończeniu procesu, a następnie kliknij OK.
  12. Po pojawieniu się okna Export Settings (Ustawienia eksportu), zapisz wyniki, klikając Export (Eksportuj).
    UWAGA: Wszystkie wyniki z filmów i analiz zostaną zapisane w pliku docelowym zdefiniowanym w kroku 10.2. Wymaga to dużej ilości miejsca na dysku. Monitoruj przestrzeń i w razie potrzeby przenoś dane na zewnętrzny nośnik pamięci.

11. Ponowna analiza bieżącej próbki przy różnych progach detekcji

UWAGA: Bezpośrednio po analizie NTA (krok 10) dane można przeanalizować ponownie, korzystając z różnych ustawień Progu Wykrywania (Detection Threshold). Jednakże Poziom Kamery (Camera Level) nie może zostać zmieniony po wykonaniu obrazowania.

  1. Zaznacz wszystkie 5 filmów z obrazowania wymienionych w sekcji Current Experiment.
  2. Kliknij Process Selected Files i poczekaj, aż pojawi się okno Setting Confirmation, a Process box zacznie migać, sygnalizując możliwość zmiany Detection Threshold.
  3. Ustaw Detection Threshold na pożądanym poziomie i kliknij Setting OK.
  4. Poczekaj na automatyczne przetworzenie filmów, wyświetlenie histogramu wyników oraz powiadomienia w oknie dialogowym o zakończeniu procesu, a następnie kliknij OK.
  5. Kliknij Export Settings. W przypadku przeprowadzenia dodatkowych analiz najnowszej próbki należy pamiętać o kliknięciu pola Export Results w sekcji Current Experiment, ponieważ okno wyskakujące Export Results nie zostanie wyświetlone po ponownej analizie próbki.
    UWAGA: Ponieważ nie ma przypomnień o tej czynności, można ją łatwo przeoczyć, co doprowadzi do utraty analizy. Dane źródłowe zostaną jednak zachowane i będą mogły zostać poddane ponownej analizie w późniejszym terminie.

12. Analiza zarchiwizowanych plików

UWAGA: Jeśli wcześniej analizowane eksperymenty nie zostały zapisane lub w przypadku konieczności przeprowadzenia dodatkowej analizy tych próbek, poszczególne pliki można ponownie załadować do oprogramowania NTA w celu przeprowadzenia dodatkowych ewaluacji progu detekcji (Detection Threshold). Zmiany poziomu kamery (Camera Level) nie mogą zostać wprowadzone po zakończeniu akwizycji.

  1. Uruchom oprogramowanie NTA z pulpitu.
  2. Kliknij kartę Analysis w dolnym środkowym panelu.
  3. Kliknij Open Experiment i przejdź do wybranego pliku .nano.
    UWAGA: Pliki wideo powiązane z wybranym eksperymentem .nano muszą znajdować się w tym samym folderze co główny plik eksperymentu; w przeciwnym razie podczas próby przetwarzania plików pojawi się błąd. Pierwsze 6 cyfr nazwy pliku to data przeprowadzenia eksperymentu (xx-xx-xx). Ostatnie 6 cyfr nazwy pliku to godzina nagrania wideo (xx-xx-xx) oraz indywidualny identyfikator wideo. Plik PDF każdego połączonego eksperymentu zawiera listę dołączonych plików .nano dla danej analizy.
  4. Kliknij Process Selected Files, aby uruchomić analizę.
  5. Gdy pole Process zamiga, umożliwiając zmianę Detection Threshold, ustaw próg na pożądanym poziomie i kliknij OK.
  6. Odczekaj, aż filmy zostaną automatycznie przetworzone, a na ekranie pojawi się histogram wyników oraz okno dialogowe z powiadomieniem o zakończeniu, a następnie kliknij OK.
  7. Kliknij Export Results. Pamiętaj, aby kliknąć pole Export Results w sekcji Current Experiment, ponieważ po ponownej analizie okno wyskakujące Export Results nie zostanie wyświetlone.
    UWAGA: Ponieważ nie ma przypomnień o tej czynności, można ją łatwo przeoczyć, co doprowadzi do utraty wyników analizy.

13. Czyszczenie i demontaż modułu laserowego

  1. Wyłącz sterownik lasera.
  2. Wypłucz całą próbkę z modułu laserowego i zutylizuj ją w odpowiedni sposób.
  3. Trzymaj moduł laserowy pod kątem, z uniesionym otwartym portem strzykawki, aby umożliwić usunięcie powietrza z komory podczas powolnego wstrzykiwania DPBS do modułu laserowego i wypłukiwania go przez wylotowy port strzykawki.
  4. Wypłucz pozostały DPBS z modułu laserowego i zutylizuj.
  5. Powtórz płukanie jeszcze 2 razy i opróżnij moduł laserowy jak najdokładniej po ostatnim płukaniu.
  6. Naciskając równomiernie pokrywę celi przepływowej, poluzuj równomiernie śruby motylkowe, odkręcając je naprzemiennie po przekątnej, aż zostaną całkowicie wykręcone; zdejmij śruby motylkowe i schowaj je do etui modułu laserowego.
  7. Zdejmij pokrywę celi przepływowej z modułu laserowego.
  8. Ostrożnie oczyść obie powierzchnie szklane wysokiej jakości środkiem do czyszczenia soczewek i papierem do soczewek. Nie używaj chusteczek higienicznych ani ręczników papierowych do powierzchni szklanych.
  9. Po zakończeniu pracy dokonaj oględzin modułu laserowego oraz „okien” pokrywy celi przepływowej pod kątem zarysowań lub niedoskonałości i zgłoś je przełożonemu.
  10. Umieść moduł laserowy i pokrywę celi przepływowej w ich etui, aby zapobiec uszkodzeniu powierzchni szklanych podczas przechowywania.

14. Protokół analizy próbek

  1. Próbki niefiltrowane
    1. Wymieszać próbkę w wortexie przed załadowaniem i nagrać 5 filmów po 60 s przy poziomie kamery 12 (Camera Level 12) i poziomie progu detekcji 3 (Detection Threshold Level 3), zgodnie z powyższym opisem. Ponownie przeanalizować te filmy, stosując progi detekcji 2 i 5.
    2. Powtórzyć proces gromadzenia filmów dla tej samej próbki przy poziomach kamery 13 i 14 oraz poziomie progu detekcji 3. Ponownie przeanalizować te 2 dodatkowe filmy, stosując progi detekcji 2 i 5. Powtórzyć cały proces, nagrywając 5 filmów po 30 s w ustawieniach SOP.
  2. Próbki filtrowane
    1. Wymieszać próbkę w wortexie, a następnie jednocześnie załadować i przefiltrować ją (filtr strzykawkowy 0,22 µm) bezpośrednio do modułu laserowego.
      UWAGA: Przed użyciem filtr strzykawkowy przepłukano dwukrotnością objętości martwej przestrzeni filtra, aby usunąć wszelkie obecne cząstki. Filtry strzykawkowe (patrz Tabela materiałów) miały zmierzoną przestrzeń martwą wynoszącą 0,5 mL i zostały przepłukane 1,0 mL próbki przed pomiarami. Odnotować typ filtra w polach danych SOP. Próbkę filtrowaną przetworzono dokładnie tak, jak opisano dla próbek niefiltrowanych w kroku 14.1.

15. Analiza statystyczna wyników NTA

  1. W celu analizy efektów głównych lub interakcji przeprowadź analizę wariancji po sprawdzeniu założeń ANOVA (normalność rozkładu, jednomodalność, homogeniczność wariancji). W przypadku niespełnienia założeń ANOVA zastosuj jednoczynnikową analizę wariancji Kruskala-Wallisa na rangach.
  2. W przypadku uzyskania istotnych efektów głównych zastosuj metodę Dunna do przeprowadzenia testów średnich dla zaplanowanych porównań. W testach dwustronnych wartość p mniejsza od 0,05 uznaj za istotną statystycznie.
    UWAGA: Pliki z danymi wygenerowane w tej procedurze są dostępne od autorów po podpisaniu umowy o przekazaniu materiałów (MTA).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Tabela 1 zawiera wyniki analizy wideo NTA dla próbek liposomów (18 filtrowanych i 18 niefiltrowanych) oraz reprezentatywnego rozcieńczalnika DPBS. W niniejszej pracy porównania między dwiema grupami przeprowadzono niezależnie od poziomu kamery lub progu detekcji. Próbki filtrowane charakteryzowały się średnią średnicą cząstek 108,5 nm, modą średnicy cząstek 86,2 nm oraz stężeniem 7,4 × 108 cząstek/mL. W przeciwieństwie do nich, próbki niefiltrowane miały średnią średnicę cząstek 159,1 nm, modę...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Dostępnych jest kilka metod szacowania wielkości i stężenia nanocząstek11. Należą do nich metody zespołowe, które generują oszacowanie wielkości populacji, w tym dynamiczne rozpraszanie światła (DLS), sedymentacja odśrodkowa i analiza na poziomie pojedynczej cząstki - mikroskopia elektronowa, NTA, mikroskopia sił atomowych i przestrajalne wykrywanie impulsów rezystancyjnych. Spośród nich DLS i NTA są szeroko stosowanymi, nieniszczącymi metodami pomiaru wielkości i stężenia, opartymi na ruchu Brown...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Żaden z autorów nie pozostaje w konflikcie interesów.

Podziękowania

Praca była wspierana przez stan Kansas do Midwest Institute for Comparative Stem Cell Biology (MICSCB), Johnson Cancer Research Center do MLW i NIH R21AG066488 do LKC. OLS otrzymał wsparcie GRA od MICSCB. Autorzy dziękują dr Santoshowi Aryalowi za dostarczenie liposomów użytych w tym projekcie oraz członkom laboratoriów Weiss i Christenson za pomocne rozmowy i informacje zwrotne. Dziękuję doktorowi Hong He za wsparcie techniczne. MLW dziękuje Betti Goren Weiss za jej wsparcie i rady.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
pipeterowe
, stożkowe, Nunc 15 mLThermo Sci.339650
Kimwipes
Papier
soczewek
NanoSight LM-10Malvern Panalytical
Moduł laserowy NanoSight LM-14Malvern Panalytical
Nanosight NTA Software Ver. 3.2Malvern Panalytical
Ręczniki
Końcówki do pipet, 1-200 i mikro; L, Filtrowane, Sterylne, NiskowiążącekońcówkiP -3243-200X
, 50-1,000 &mikro; L, Filtrowany, SterylnyBioExpressP-3243-1250
Sól fizjologiczna, Dulbecco's Phosphate Buffered (No Ca lub Mg)Gibco14190-144
Standardy, Transfer lateksowy - 100 nm (3 mL)MalvernNTA4088
Standardy, Transfer lateksowy - 50 nm  (3 ml)Malvern
, 33 mm, .22 i mikro; m, MCE, sterylnamarka Fisher09-720-004
Strzykawka, TB, 1 mL, końcówka poślizgowaBecton Dickinson309659
Pojemnik
Automatyczne probówki wirówkowe do czyszczeniapapierowe do pipet BioExpress Filtr strzykawkowy NTA4087 na zużyty płyn

Bibliografia

  1. Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).
  2. Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  3. Consortium, E. -T., et al. EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research. Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).
  4. Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 32945(2016).
  5. Maas, S. L., et al. Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics. Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).
  6. Danaei, M., et al. Impact of particle size and polydispersity index on the clinical applications of lipidic nanocarrier systems. Pharmaceutics. 10 (2), 57(2018).
  7. Kestens, V., Bozatzidis, V., De Temmerman, P. J., Ramaye, Y., Roebben, G. Validation of a particle tracking analysis method for the size determination of nano- and microparticles. Journal of Nanoparticle Research. 19 (8), 271(2017).
  8. Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. Critical evaluation of nanoparticle tracking analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates. Pharmaceutical Research. 27 (5), 796-810 (2010).
  9. Hole, P., et al. Interlaboratory comparison of size measurements on nanoparticles using nanoparticle tracking analysis (NTA). Journal of Nanoparticle Research. 15 (12), 2101(2013).
  10. Malvern analytical Ltd. NanoSight LM10 Operating Manual-P550H. , (2013).
  11. Kim, A., Ng, W. B., Bernt, W., Cho, N. J. Validation of size estimation of nanoparticle tracking analysis on polydisperse macromolecule assembly. Scientific Reports. 9 (1), 2639(2019).
  12. Gollwitzer, C., et al. A comparison of techniques for size measurement of nanoparticles in cell culture medium. Analytical Methods. 8 (26), 5272-5282 (2016).
  13. vander Pol, E., et al. Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (7), 1182-1192 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Protokół NTAanaliza wielkości cząstekfiltracja próbekregulacja poziomu kamerypróg detekcjidynamiczne rozpraszanie światłacharakterystyka pęcherzykówstandardy powtarzalności
Poprawa odtwarzalności w celu uzyskania minimalnych informacji do badań pęcherzyków zewnątrzkomórkowych Wytyczne z 2018 r. dotyczące analizy śledzenia nanocząstek
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.